JPH05244989A - 抗体および免疫化学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の
ムテイン（ＣＳ２３）を治療薬として用いた場合の、体
液、臓器および組織中のＣＳ２３の検出・測定法を提供
する。 【構成】ＣＳ２３を免疫した動物の脾臓細胞とミエロー
マ細胞株の細胞融合によりＣＳ２３に特異的に結合し、
成熟型ｂＦＧＦとは反応しないモノクローナル抗体を取
り出した。 【効果】本発明の抗体の使用によるＣＳ２３測定系は、
ＣＳ２３を用いたヒトあるいは動物での試験結果の解析
において内因性のｂＦＧＦを考慮する必要がなく、正確
にＣＳ２３をとらえることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト塩基性繊維芽細胞
成長因子ムテインＣＳ２３（式（Ｉ）；以下ＣＳ２３と
略すこともある）に対する抗体および該抗体を用いてな
るＣＳ２３の免疫化学的測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｂＦＧＦは主として下垂体より分泌され
る分子量約１７０００の塩基性ポリペプチドホルモンで
あり、当初ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞などの線維芽細胞に
強い増殖促進作用を示す因子として分離された［D.Gosp
odarowicz;ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２４９：１２３
（１９７４）］。しかし、その後中胚葉由来の殆ど全て
の細胞に対して増殖促進作用を示すことが判明した［D.
Gospodarowicz ら：ナショナル・キャンサー・インス
ティテュート・モノグラフ（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ）４
８；１０９（１９７８）］。中でもｂＦＧＦの血管新生
作用は細胞増殖促進作用と相まって損傷の治療薬および
血栓症、動脈硬化症などの予防治療薬としての可能性を
示すものである。最近、Ｓｅｎｏらはそのアミノ酸配列
を修飾することによってｂＦＧＦの安定性、細胞におけ
る産生能、分子当りの細胞増殖活性の上昇、さらに未知
の生物活性の賦活化がなされるであろうと考え、組換え
ＤＮＡ技術および特定部位指向性変異（Sitedirected m
utagenesis）により、修飾されたｂＦＧＦのムテインを
構築した（バイオケミカル バイオフィジカル リサー
チ コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Com
mun.)151,701(1988)，ヨーロッパ特許出願公開第２８
１，８２２号公報）。中でも式（Ｉ）（配列番号１） Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His- Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu- Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp- Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser- Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly- Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu- Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr- Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser- Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala- Lys-Ser で示されるＣＳ２３はその安定性、細胞における産性能
等について優れており、毒性は低いので火傷、創傷、術
後組織などの治癒促進剤、あるいは血管新生作用による
血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用いることがで
きる。この際、ＣＳ２３を投与した後の血中あるいは組
織中濃度を測定することは、その治療効果を検討する上
で非常に重要である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＣＳ２
３はｂＦＧＦとアミノ酸配列がよく似ており、ＣＳ２３
を選択的に認識できる抗体はこれまでに得られておら
ず、又ＣＳ２３を内因性のｂＦＧＦと区別して測定する
方法も確立されていなかった。このためＣＳ２３を用い
たヒトあるいは動物での試験結果の解析においては内因
性のｂＦＧＦの影響を考慮する必要があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記実情に鑑み、本発明
者らはＣＳ２３の実質的な測定手段を見出すべく種々検
討した結果、その測定を可能ならしめるＣＳ２３に対す
るモノクローナル抗体を作成し、これに基づいてさらに
研究を行った結果、本発明を完成した。本発明は(1) 次
の（ａ）〜（ｄ）の性質 (a) 分子量：約１４×１０⁴〜１６×１０⁴、(b) 成熟型
塩基性線維芽細胞成長因子との交差反応性が約０．３％
以下である、(c) 塩基性線維芽細胞成長因子蛋白質の生
物活性を中和しない、(d) 免疫グロブリンクラスがＩｇ
Ｇ２ａに属する、を有し、式（Ｉ） Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His- Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu- Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp- Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser- Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly- Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu- Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr- Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser- Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala- Lys-Ser で表されるヒト塩基性繊維芽細胞成長因子ムテインＣＳ
２３に特異的に結合する、即ちＣＳ２３に高感度に結合
するモノクローナル抗体、および（２）上記（１）記載
のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒトｂ
ＦＧムテインＣＳ２３の免疫化学的測定法に関する。

【０００５】ＣＳ２３としては、上記した如く、Ｓｅｎ
ｏ等、バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ
コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commu
n.)151,701(1988)，ヨーロッパ特許出願公開第２８１，
８２２号公報に記載された方法で製造され、式（Ｉ）で
示されるアミノ酸配列を有する。ＣＳ２３蛋白質を免疫
するに際してはＳ２３をキャリー蛋白との複合体として
から、これを免疫に用いてもよい。該キャリー蛋白とし
ては、例えばウシ血清アルブミン、ウシサイブログロブ
リン、ヘモシアニンなどが挙げられる。キャリー蛋白複
合体を用いる場合に、キャリー蛋白とＣＳ２３蛋白との
カップリング比率は約０．１〜３０倍（キャリー／ＣＳ
２３蛋白質：重量比）で用いられる。望ましくは約０．
５〜５倍が用いられる。又、ハプテンとキャリーとのカ
プリングには、種々の縮合剤を用いることが出来るが、
グルタルアルデヒドやカルボジイミド等が好都合に用い
られる。

【０００６】ＣＳ２３蛋白質又は蛋白複合体を用いて免
疫するに際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、うさ
ぎ、モルモット、ラット、マウス等の実験動物が使われ
るが、モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マ
ウスが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する
場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれ
のルートからでも可能であるが、主として皮下、腹腔
内、静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。
又、免疫間隔、免疫量等の可変度は高く、種々の方法が
可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最
終免疫後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出
した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量は
１回にペプチド量として、マウス当り約０．１μｇ以
上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇ用いることが望
ましい。又、脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血
中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融
合実験を行うことが望ましい。

【０００７】上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融
合は例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損
（ＨＧＰＲＴ~）やチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ~)の様
なマーカーを持った適切な同種または異種（好ましくは
同種）のミエローマ［例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８Ｕ１
（市森 他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッド ８０ ５５（１９８５））］等の、リンパ球様細
胞株との間で融合させる。例えばケラーおよびミルスタ
インらの方法［ネイチャー（Nature)２５６：４９５
（１９７５）］に準じて融合させることにより製造され
る。たとえばミエローマ細胞と脾臓細胞とを約１：５の
割合で、たとえばイスコフ培地とハムＦ−１２培地を
１：１に混合した培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸
濁させ、センダイウイルス，ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）等の融合剤が用いられる。もちろんジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加える
ことも可能である。ＰＥＧの重合度は、ふつう約１００
０〜６０００，時間は約０．５〜３０分，濃度は約１０
％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例とし
て、ＰＥＧ６０００を約３５〜５５％で約４〜１０分処
理することにより、効率よく融合させることが出来る。
融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン培地［ＨＡＴ培地：ネイチャー，２５６，４９５（１
９７５）］等を用いて、選択的に増殖させることができ
る。増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産
生があるか否かについてスクリーニングを行うことがで
きるが、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが
出来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫
した蛋白質に対する抗体産生の有無を、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ
（ＥＩＡ）法等の方法で調べることが出来るが、これら
の方法についても種々の変法が可能である。好ましい測
定法の一例として、ＥＩＡを用いる一つの方法について
述べる。セルロースビーズ等の担体に、ＣＳ２３蛋白質
あるいはｂＦＧＦ蛋白質を常法に従ってカプリングさせ
ておき、それぞれに測定したい培養上清を加え、一定時
間、定温（約４〜４０゜Ｃを示す。以下においても同
様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、
例えば酵素で標識したウサギ抗マウスイムノグロブリン
抗体を加え、一定時間、定温で反応させる。反応物をよ
く洗った後、酵素基質を加え、一定時間定温で酵素反応
させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等で測
定することが出来る。

【０００８】選択培地で増殖を示し、かつｂＦＧＦ蛋白
質よりもＣＳ２３蛋白質をカップリングさせた担体を用
いた方が、上記酵素反応の生成発色物の吸光度または蛍
光度等が高いウエルを選択する。選択したウエルの細胞
は、限界稀釈法等によりクローニングを行うことが望ま
しい。クローン化された細胞の培養上清について、ＣＳ
２３をカップリングした担体を用いて同様にスクリーニ
ングを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことによ
り、ｂＦＧＦよりもＣＳ２３により強い反応性を示すモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られ
る。

【０００９】このようにしてクローン化されたハイブリ
ドーマを、液体培地中で増殖させる。具体的には例え
ば、液体培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０［Moore, G.
E. ,et.al. ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（J. Am.Med. Assoc.)１９９，５
４９（１９６７）］に約０．１〜４０％の牛胎児血清を
加えた培地等で約２〜10日間、好ましくは約３〜５日間
培養することにより、培養液から該モノクローナル抗体
を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種
し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を
取得することが出来る。このためには、例えばマウスの
場合、ミネラルオイル等を前もって接種したBALB／c等
のマウスに約１×10⁴〜１×10⁷個、好ましくは約５×10
⁵〜２×10⁶個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約７
〜20日後、好ましくは約10〜14日後に腹水液を採取す
る。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、DEAE
-セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することができる。このようにして、ＣＳ２３蛋白質
に対するモノクローナル抗体が得られる。なお、本発明
のモノクローナル抗体は、製造時に用いた免疫原のペプ
チドとは異なるｂＦＧＦムテインと結合する場合もあ
る。また本発明のモノクローナル抗体は、ｂＦＧＦ蛋白
質の生物活性を中和しないという性質を有する。該ｂＦ
ＧＦ蛋白質としては、ｂＦＧＦ、そのムテインが挙げら
れる。本発明のモノクローナル抗体は、ＣＳ２３蛋白質
に特異的に結合する、即ち高感度に結合することから、
ＣＳ２３蛋白質測定用試薬として極めて有用である。さ
らにＣＳ２３をヒトあるいは動物での試験に用いた場
合、生体臓器、組織、各種体液中のＣＳ２３の測定を容
易にすることは、ＣＳ２３に関する基礎知見（例えば血
中動態）を得る上からも極めて有用である。

【００１０】ＣＳ２３を検出、定量するために用いられ
る抗体分子は、ＩｇＧでもよく、または、そのフラクシ
ョン｛例、Ｆ（ａｂ’）₂，Ｆａｂ’もしくはＦａｂ｝
であってもよい。なかでも、標識剤を直接結合させる抗
体分子はＦａｂ’であることが好ましい。本発明のモノ
クローナル抗体は、ＣＳ２３の免疫化学的測定法におけ
る試薬として用いることができる。該ＣＳ２３蛋白質の
免疫化学的測定法によって、生体組織や体液中のＣＳ２
３蛋白質の量を測定することができ、ＣＳ２３の治療効
果の検討を可能にする。

【００１１】上述の免疫化学的測定方法において、一般
的には次に示す方法に大別することができ、これらのい
ずれの方法を用いてもよいが、（２）のサンドイッチ法
を用いるのが好ましい。 （１）競合法：未知量の抗原を含む被検液と標識剤で標
識した抗原の一定量とを対応する抗体の一定量に対して
競合反応させ、抗体と結合した標識剤もしくは抗体と結
合しなかった標識剤の活性を測定する。 （２）サンドイッチ法：未知量の抗原を含む被検液に担
体上に保持された過剰量の抗体を加えて反応させ（第１
反応）、次に標識剤で標識した過剰量の抗体の一定量を
加えて反応させる（第２反応）。担体上に保持された標
識剤もしくは担体上に保持されなかった標識剤の活性を
測定する。第１反応、第２反応は同時に行なってもよい
し時間をずらして行なってもよい。

【００１２】本発明の上記モノクローナル抗体を担体上
に保持させた場合には標識剤で標識する抗体は上記モノ
クローナル抗体とは抗原決定部位を異にし、ＣＳ２３蛋
白質に結合性を有する抗体を用いる。あるいは、上記モ
ノクローナル抗体を標識剤で標識する場合には、担体上
に保持させる抗体として、上記モノクローナル抗体とは
抗原決定部位を異にし、ＣＳ２３蛋白質に結合性を有す
る抗体を用いる。ＣＳ２３蛋白質の測定方法において用
いられる担体上に保持された抗体における担体として
は、例えば、ゲル粒子（例、アガロースゲル〔例、セフ
ァロース４B、セファロース６B、（ファルマシア・ファ
インケミカル社（スウェーデン）製）〕、デキストラン
ゲル〔例、セファデックスG-75、セファデックスG-10
0、セファデックスG-200（ファルマシア・ファインケミ
カル社（スウェーデン）製）〕、ポリアクリルアミドゲ
ル〔例、バイオゲルP-30、バイオゲルP-60、バイオゲル
P-100（バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）
製）〕、セルロース粒子〔例、アビセル（旭化成製）、
イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロース）〕、物質的吸着
剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノ
アルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッド）、シ
リコン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリ
スチレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌン
ク社（デンマーク）製）〕、イオン交換樹脂｛例、弱酸
性イオン交換樹脂〔例、アンバーライト IRC-50（ロー
ム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ226
（パームチット社（西ドイツ）製）、弱塩基性陰イオン
交換樹脂〔例、アンバーライト IR-4B、ダウエックス3
（ダウケミカル社(米国)製)〕｝などが挙げられる。担
体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し得
るが、例えば、“代謝”、第８巻（1971年）、第696頁
に記載されているブロムシアン法、グルタールアルデヒ
ド法などが挙げられる。また、より簡便な方法として物
理的に抗体表面に吸着させてもよい。

【００１３】標識剤を結合させた抗体における標識剤と
しては、放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質な
どが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。酵素と
しては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-D-ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることがで
きるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダー
ゼとしては、種々の起源のものを用いることができる
が、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナップ
ル、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなどから
得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさび
から抽出されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ
（ horseradish peroxidase ）( HRP ）が好ましい。ペ
ルオキシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子と
してのＦab´のチオール基を利用するために、あらかじ
めペルオキシダーゼにマレイミド基を導入したものを用
いると好都合である。マレイミド基をペルオキシダーゼ
に導入する方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基
を介してマレイミド基を導入することができる。そのた
めには、N-サクシニミジル-マレイミド-カルボキシレー
ト誘導体を用いることができ、好ましくは、N-（γ-マ
レイミドブチルオキシ）サクシイミド（ GMBS と略称す
ることもある）などが良い。従って、マレイミド基とペ
ルオキシダーゼとの間に一定の基が入っていることとな
ってもよい。

【００１４】ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させる
には、両者を、ｐＨ約６ないし８の緩衝液中で約10ない
し50℃の温度で約10分ないし24時間反応させることによ
って行われる。該緩衝液としては、たとえば、ｐＨ7.0
の0.1Mリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして
得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、たとえばゲ
ルクロマトグラフィーなどにより精製することができ
る。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用いられる担
体としては、例えば、セファデックスG-25〔ファルマシ
ア・ファインケミカル社（スウェーデン）製〕、バイオ
ゲルP-2〔バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）
製〕などが挙げられる。

【００１５】マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃の温度
で、約１ないし48時間反応させることにより行うことが
できる。該緩衝液としては、例えば、ｐＨ6.0の５mM エ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム塩をふくむ0.1Ｍリン
酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得られたペ
ルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルクロマトグラ
フィーなどにより精製することができる。該ゲルクロマ
トグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例え
ば、セファデックスG-25〔ファルマシア・ファインケミ
カル社（スウェーデン）製〕、バイオゲルP-2〔バイオ
ラッド・ラボラトリーズ社（米国）製〕などが挙げられ
る。さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を導入し、
マレイミド化された抗体分子と反応させてもよい。ペル
オキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるには、
ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことができ、ま
た、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法，
水溶性カルボジイミド法などが用いられる。

【００１６】本発明の免疫化学的測定系における被検試
料としては、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるい
は、動物細胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げ
られる。本発明の測定方法の例として、標識剤がペルオ
キシダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ペルオキシダーゼに限定されるものではない。

【００１７】本発明のＣＳ２３の免疫化学的測定法によ
るキットとしては、例えば （１）担体上に保持された該モノクローナル抗体、
（２）標識化された該モノクローナル抗体とは認識部位
を異にする抗体、（３）０〜100ｎｇの標準ＣＳ２３、
（４）上記（１）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に用い
ることができる緩衝液であり、その一例としてはｐＨ６
〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。）、（５）インキュベーション後、担体の洗浄に用
いる緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩衝液
であればいずれでもよいが、その一例としてはリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）、（６）標
識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測定に必要な試
薬。その一例として、酵素にペルオキシダーゼを用いた
場合、ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬、比色法
を利用する場合、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水
素、酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好ましくはクエン
酸緩衝液）および反応停止液が挙げられる。上記キット
は例えば下記の方法（２ステップ法）により使用するこ
とができる。標準ＣＳ２３もしくは被検液約10ないし20
0μｌに試薬（４）を加えて希釈し、一定量の試薬
（１）と接触させて約０ないし40℃で約１ないし48時間
反応させる。担体を水洗後、試薬（２）の約10ないし30
0μｌを加えたのち、約０ないし40℃で反応させる。約
１ないし48時間反応後、試薬（５）で洗浄し担体上に結
合している標識剤の活性を測定する。標識剤が放射性同
位元素である場合、ウエルカウンターもしくは液体シン
チレーションカウンターで測定する。標識剤が酵素であ
る場合、基質液約10〜1000μｌを加えて約20〜40℃で約
0.2〜24時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反
応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測定する。また下記
の方法（１ステップ法）により実施することもできる。
すなわち、試薬（１）と試薬（２）を同時に加え、中間
の水洗操作を省略することができる。

【００１８】実施例 以下に実施例および参考例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもので
はない。

【００１９】後述の実施例で得られたマウスＡＴＩ３−
１細胞は、平成３年１月１４日から財団法人発酵研究所
（IFO）に受託番号 IFO ５０３０６として寄託され、ま
た該細胞は平成３年２月２６日から通商産業省工業技術
院微生物工業研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３２９６として寄託されている。以下の実施例に記
載の、ヒトリコンビナントbFGF(rhbFGF)はIwaneら、バ
イオケミカル バイオフィジカル リサーチ コミュニケ
ーション(Biochem. Biophys.Res. Commun.) 146, 470(1
987)、ヨーロッパ特許出願公開第237,966号公報に記載
の方法で製造されたものを用いた。rhbFGFムテインCS23
は、形質転換体Escherichia coli MM294/pTB762(IFO 14
613, FERM BP-1645)を用いて、Senoら、バイオケミカル
バイオフィジカル リサーチ コミュニケーション(Bioc
hem. Biophys. Res. Commun.) 151, 701(1988)、ヨーロ
ッパ特許出願公開第281,822号公報に記載の方法で製造
されたものを用いた。上記 E. coli MM294/pTB762は198
7年5月27日からIFOに受託番号IFO 14613として寄託され
ており、また本形質転換体はFRIに1987年6月11日から受
託番号FERM P-9409として寄託され、該寄託はブダペス
ト条約に基づく寄託に切り換えられて、受託番号FERM B
P-1645としてFRIに保管されている。後述の参考例１で
得られたマウス3H3細胞は、平成元年11月10日から財団
法人発酵研究所（IFO）に受託番号 IFO 50216 として寄
託されており、さらにこの細胞は通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所 (FRI) に、平成元年11月14日か
ら受託番号 FERM BP-2658 として寄託されている。

【００２０】参考例１ 抗ｂＦＧＦ抗体３Ｈ３産生細胞
３Ｈ３の取得 （１）免疫 BALB／cマウス（♀８週令）に対し、フロインド完全ア
ジュバント(Difco社製)に溶解させた50μｇの抗原ヒトr
hbFGFムテインCS23を腹腔に注射した。２週間後に、フ
ロインド完全アジュバント0.4mｌにとかした50μｇの抗
原rhbFGFムテインCS23を腹腔に再投与した。さらに２週
間後にフロインド不完全アジュバント0.4mｌにとかした
50μｇの抗原rhbFGFムテインCS23の追加免疫を行い、そ
の２週間後に生理食塩水に溶かした50μｇのヒトrbFGF
ムテインCS23をマウス尾静脈内に接種した。

【００２１】（２）細胞融合 （１）で示した免疫マウスより、抗原最終投与の３日後
脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この細胞
は、イスコフ培地とハムF-12培地を１：１の比率で混合
した培地（以下IH培地と略す）に懸濁した。マウス骨髄
腫様細胞SP2／0-Ag14は、10％ウシ胎児血清を含むDMEM
培地で５％炭酸ガス、95％空気の条件で継代培養した。
細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立した
方法〔ケーラー， G.およびミルスタイン, C. ：ネイチ
ャー（Nature）256, 495(1975)〕に準じて行った。上記
ミエローマ細胞２×10⁷個と上述した方法で得られた免
疫されたリンパ球1.5×10⁸個を混合、遠沈し、１mｌのI
H培地に溶解した45％ポリエチレングリコール6000（以
下PEG 6000）を滴下した。PEG6000溶液は、予め37℃に
温め、ゆっくりと１分間かけて滴下した。次にIH培地１
mｌを１分間、１mｌを１分間、８mｌを３分間かけて滴
下した。その後室温で1,000回転５分遠心し上清を除去
した。この細胞沈殿物を20％仔牛血清を含むIH培地30m
ｌに懸濁し、96穴マイクロプレート（ヌンク社）に100
μｌずつ植えつけた。１日後、HAT（ヒポキサンチン１
×10~⁴M、アミノプテリン４×10~⁷M、チミジン1.6×10~
⁵M）を含んだIH培地（20％仔牛血清含有）(以下HAT培地
と称する。）を各ウエルに100μｌずつ添加し、さらに
３日おきに、培地の1／2量をHAT培地と交換した。この
ようにして生育した細胞は雑種細胞である。

【００２２】（３）抗体産生細胞の検索 200nｇ／mｌのrhbFGFムテインCS23を含む固定緩衝液(0.
1M炭酸水素ナトリウム（PH9.6)、0.02％アジ化ナトリウ
ム）をポリスチレン製96穴マイクロプレート（ヌンク
社）に100μｌ／穴加えた。２時間後、洗浄液（0.05％
トウィーン20、生理的リン酸緩衝液)で洗った後、培養
上清50μｌと希釈用緩衝液〔0.05Mトリス・塩酸(PH8.0
1、１mM塩化マグネシウム、0.15M塩化ナトリウム、0.05
％トウィーン20、0.02％アジ化ナトリウム、0.3％ゼラ
チン)〕50μｌを混合した溶液100μｌをマイクロプレー
トに加えた。２時間後培養上清を洗浄液で洗った後、２
次抗体としてアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス
IgG抗体（バイオラッド社）を加えた。２時間後２次抗
体を洗浄液で洗った後、反応基質を加えた呈色反応を行
った（ELISA法)。この方法により４つのウエルにrhbFGF
ムテインCS23結合活性が認められた。

【００２３】（４）bFGF中和抗体産生細胞の検索 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を2.5％牛胎児血清を含むGIT
培養液に懸濁し、96穴マイクロプレートに2,000個／穴
で100μｌ播種した。翌日種々の濃度のハイブリドーマ
培養上清、４nｇ／mｌ rhbFGF、2.5％牛胎児血清を含む
GIT培養液100μｌ／穴添加し３日間37℃、５％CO₂、７
％O₂下で培養した。３日後培養液を除去した後１mｇ／m
ｌ MTT（4,5ジメチル２チアゾリル）-2,5-ジフェニル-
２Hテトラゾリウムブロマイド）を含む2.5％牛胎児血清
を含むGIT培養液100μｌ／穴加えた。４時間、37℃、５
％CO₂、７％O₂下で培養した後、10％Sodium Dodecyl Su
lfate (SDS) を100μｌ／穴加えた。４時間後、OD590nm
の吸光度を96穴用分光光度計（タイターテック社）で測
定した（MTT法)。この方法により１つのウエルに強い中
和活性が観察された。

【００２４】（５）雑種細胞のクローニング このウエル中の細胞を、１ウエルあたり0.5個となるよ
うに、予めマウス胸腺細胞を栄養細胞としてまいておい
た96穴マイクロプレートにまき、クローニングを行っ
た。その結果、ハイブリドーマ マウス3H3細胞（IFO 50
216, FERM BP-2658）を得た。

【００２５】クローニングされた細胞は、10％仔牛血清
を含むIH培地に10％となるようジメチルスルホキシド
（DMSO）を加え液体窒素内に貯蔵した。

【００２６】参考例２（モノクローナル抗体３Ｈ３の免
疫グロブリンクラス） 参考例１−（４）で得られた3H3細胞の培養上清を、マ
ウス抗体サブクラス検出キット（バイオラッド社）によ
り各種標品免疫グロブリンと反応させた。その結果を表
１に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】表中、＋は反応陽性を、−は反応陰性を示
す。表１より、3H3細胞培養上清中の３Ｈ３抗体は免疫
グロブリンクラスIgG₁サブクラスに属する。

【００２９】参考例３（腹水からのモノクローナル抗体
３Ｈ３の精製） マウス3H3細胞株を、マウス(Balb/c）にて腹水化した。
腹水からのIgGの精製は、常法に従った。すなわち、腹
水５mｌを45％飽和の硫酸アンモニウムにて塩析し、沈
澱を0.15M NaClを含むホウ酸緩衝液（BBS、pH8.5）に溶
解し、BBSに対して４℃で20時間透析した。これを、DE-
50（英国、Whatman社製、１×60cm）カラムに付し、0.1
Mリン酸緩衝液（pH8.0）中のNaCl濃度を0.1Mから0.35M
に直線的に変化させる濃度勾配溶出法により、腹水５m
ｌからモノクローナル抗体3H3抗体を７mg得た。

【００３０】参考例４ 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化3H3抗体の調製 精製3H3抗体（７mg／mｌ）を0.1M NaClを含む0.1M酢酸
緩衝液（pH4.5）に対して４℃で20時間透析し、ペプシ
ン（シグマ社製、米国）(0.1mg）を加え、37℃で８時間
消化した。１M TrisでpHを８にして反応を止め、Ultrog
el AcA44（IBF社製、フランス）のカラムで0.15M NaCl
を含む0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）を溶出液として分離
し、F(ab')₂を得た。これを、１mｌに濃縮後、0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.0）に対して４℃で20時間透析し、0.2M
メルカプトエチルアミン、５mM EDTA、0.1Mリン酸緩衝
液(pH6.0）0.1mｌを加えて、37℃、90分間還元した。反
応液をSephadex G-25 fine（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製、スエーデン）(φ１×60cm）で５mM EDTA、
O.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）を溶出液として分離し、Fa
b'画分を得た。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HR
P)（ベーリンガーマンハイム社製、西ドイツ）10mgを1.
5mｌの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0)に溶かし、N-（γ-マ
レイミドブチルオキシ）サクシイミド（GMBS）3.5mgを
N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）100μｌに溶かして加
え、30℃で60分間攪拌後、Sephadex G-25 fine（φ1.2
×60cm）で0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）を溶出液として
分離し、マレイミド基の導入されたHRPを得た（マレイ
ミド化HRP)。Fab'とマレイミド化HRPをモル比で１：１
になるように混ぜ、４℃で20時間反応した。反応液を、
Ultrogel AcA44のカラムで0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）
を溶出液として分離し、酵素標識抗体（3H3-HRP）を得
た。

【００３１】実施例１ （１）免疫 BALB／cマウス（♀８週令）に対し生理食塩水０．３ｍ
ｌに溶解させた100μｇの抗原ＣＳ２３と同量のフロイ
ンド完全アジュバント(Difco社）を混合して皮下に注射
した。３週間後に同量の抗原と０．３ｍｌのフロインド
不完全アジュバントの混合物を皮下に再投与した。さら
に３週間後に同様の追加免疫を行い、その２週間後に生
理食塩水に溶かした100μｇのＣＳ２３を静脈内に接種
した。

【００３２】（２）細胞融合 上記（１）で得られた免疫マウスより、抗原最終投与の
３日後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。こ
の細胞は、イスコフ培地とハムF-12培地を１：１の比率
で混合した培地（以下IH培地と略す）に懸濁した。マウ
スミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩは、10％
ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ 1640培地で５％炭酸ガ
ス、95％空気の条件で継代培養した。細胞融合は、ケー
ラーおよびミルスタインらが確立した方法〔ケーラー，
Ｇ．およびミルスタイン， Ｃ． ：ネイチャー（Na
ture）256, 495(1975)〕に準じて行った。上記ミエロー
マ細胞３．２×10⁷個と上述した方法で得られた免疫さ
れたリンパ球1.6×10⁸個を混合、遠沈し、0.3mｌのIH培
地に溶解した45％ポリエチレングリコール6000（以下PE
G 6000）を滴下した。PEG6000溶液は、予め37℃に温
め、ゆっくりと滴下した。８分後３７℃に予温したＩＨ
培地を１分間に０．５ｍｌずつ加え１０mｌとした後、
室温で600回転15分遠心し上清を除去した。この細胞沈
殿物を20％仔牛血清を含むＩＨ培地200mｌに懸濁し、96
ウェルマイクロプレート（ヌンク社）に100μｌずつ960
ウエル植えつけた。１日後、HAT（ヒポキサンチン１×1
0~⁴M、アミノプテリン４×10~⁷M、チミジン1.6×10~
⁵M）を含んだＩＨ培地（20％仔牛血清含有）(以下ＨＡ
Ｔ培地と称する。）を各ウエルに100μｌずつ添加し、
さらに３日おきに、培地の1／2量をＨＡＴ培地と交換し
た。このようにして生育した細胞は雑種細胞である。

【００３３】（３）抗体産生細胞の検索 ＣＳ２３あるいはリコンビナントｂＦＧＦを10μｇ／ｍ
ｌになるよう0.01Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈
し、その100μｌを96ウエルイムノプレート（ヌンク社
製）の各ウエルに入れ４℃一夜放置し、固相にＣＳ２３
あるいはｂＦＧＦを結合させた。0.15Ｍ ＮａＣｌを含
有する0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した
後、余剰の結合部位をふさぐため、１％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含有する0.01Ｍリン酸緩衝液を200μ
ｌずつウエルに注入して、使用時まで冷所に保存した。
以上のようにして得られたＣＳ２３あるいはｂＦＧＦを
結合した９６ウエルイムノプレートに、雑種細胞培養上
清をそれぞれ50μｌずつ加え室温で２時間インキュベー
トした。培養上清を除去、洗浄後２次抗体として西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体マウスＩｇＧ
ヤギ抗体（カッペル社）を加え室温で２時間インキュベ
ートした。２次抗体を除去し、よくウエルを洗浄した
後、ペルオキシダーゼ基質溶液（0.02％Ｈ₂Ｏ₂と0.15％
ｏ−フェニレンジアミンを含むｐＨ５．５のクエン酸ナ
トリウム緩衝液）を100μｌ加え、25℃で10分反応さ
せ、２Ｎ−硫酸100μｌを加えることにより酵素反応を
停止した後、マイクロプレート用自動比色計（ＭＴＰ−
３２，コロナ社製）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度
を測定した（ＥＬＩＳＡ法）。この方法により１ウエル
において、ＣＳ２３結合固相で１．５１５の吸光度をと
り、ｂＦＧＦ結合固相では０．１３４の吸光度であるも
のが見出された。すなわち、これは、このウエルにｂＦ
ＧＦよりもＣＳ２３に対する結合力が１０倍以上強い抗
体が存在していることを示している。

【００３４】（４）雑種細胞のクローニング （３）で見出されたウエル中の細胞を、１ウエルあたり
0.5個となるように、予め５×１０⁵個／ウエルのマウス
胸腺細胞をフィーダー細胞としてまいておいた96ウエル
マイクロプレートにまき、クローニングを行った。その
結果、クローン細胞ＡＴＩ３−１（IFO 50306）が得ら
れた。

【００３５】（５）抗体の製造：上記（４）においてク
ローニングによって得られたハイブリドーマクローンＡ
ＴＩ３−１をあらかじめ０．５ｍｌのミネラルオイルを
腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に
１匹あたり１×１０⁶個接種することにより腹水化を行
なった。ハイブリドーマを腹腔に投与して１０日後、腹
水を採取した。得られたそれぞれの腹水約１０ｍｌか
ら、ステーリンら〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー，２５６，９７５０−９７５４（１９８
１）〕の方法に準じてモノクローナル抗体を精製した。
まず腹水からフィブリン様物質を除去するため１０，０
００回１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（Ｐ
ＢＳ：８．１ｍＭ−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１．５ｍＭ ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄，２７ｍＭ ＫＣｌ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ
７．２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａ₂₈₀）が１２〜
１４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプルに飽和
硫酸アンモニウム溶液を４７％の濃度になるように加
え、４℃で撹拌しながら６０分間塩析を行ない、その後
遠心（１０，０００回転、１５分間）を行なって沈殿物
を得た。沈殿物を５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．９）に溶遊し、同溶液２リットルに
対して透析を行なった。２時間後、２リットルの新しい
同じ透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。透
析後、沈殿を除去するため１０，０００回転１５分間遠
心を行ない、上清をＡ₂₈₀の値が２０〜３０の濃度にな
るように調製した。このサンプルを充分量の５０ｍＭ
ＮａＣｌ含有トリス緩衝液で平衡化した２０ｍｌのＤＥ
ＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥ₅₂）にかけ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ含有トリス緩衝液でよく洗った後、５
０ｍＭ−５００ｍＭ ＮａＣｌを含む同緩衝液の濃度勾
配塩溶液を用いて１．５ｍｌ／分の流出速度で分画を行
なって素通り分画を濃縮し、精製モノクローナル抗体Ａ
ＴＩ３−１を得た。

【００３６】（６）抗体のサブクラスの測定 抗体のサブクラスは次の方法で測定した。即ち、ＣＳ２
３をコートした９６ウエルイムノプレートにクローン化
されたハイブリドーマ培養上清を１００μｌ入れ室温で
２時間インキュベートした。培養上清を除去、洗浄後ウ
サギ抗マウスＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，Ｉｇ
Ｇ３，κ鎖、λ鎖に対する抗体（カッペル社）をそれぞ
れ１００μｌ入れ室温で２時間インキュベートした。そ
れぞれの抗体を除去、洗浄後ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ抗体（カッペル社）を加え室温で２時間インキュベ
ートした。標識抗体を除去し、よく洗浄した後、上記
（３）記載の方法で酵素反応を行ない吸光度を測定し
た。その結果、モノクローナル抗体ＡＴＩ３−１はＩｇ
Ｇ２ａ，κ型であることが判明した。

【００３７】実施例２ 抗体感作プレートの調製 モノクローナル抗体ＡＴＩ３−１を0.1M炭酸緩衝液（pH
9.6）にて10μｇ／mｌとなるように希釈し、EIA用イム
ノプレート（マキシソープ：ヌンク社製、デンマーク）
の各ウエルに100μｌずつ注入して４℃で一夜放置して
感作させた。0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH
7.0）にて洗浄した後、0.1％BSAを含む0.01Mリン酸緩衝
液（pH7.0）を各ウエルに注入して用時まで冷所保存し
た。

【００３８】実施例３ ＣＳ２３とｂＦＧＦとの交差反応性 実施例２で得られたモノクローナル抗体ＡＴＩ３−１を
固相化したイムノプレートに、ＣＳ２３またはｂＦＧＦ
を０〜２ｎｇ／ｍｌの範囲で、各々１００μｌずつ各ウ
エルに入れた。これを２０℃で２時間放置した後０．１
５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）で洗浄後、参考例４で得られた酵素標識抗体３Ｈ３
−ＨＲＰを１００μｌずつ各ウエルに入れた。２０℃で
２時間放置した後、ＰＢＳで洗浄し、実施例４と同様に
発色基質を加えて、２０℃で３０分発色させた。２Ｎ−
Ｈ₂ＳＯ₄を１００μｌずつ加えて、反応を停止した後、
４９２ｎｍの吸光度を測定し、図１に示す結果が得られ
た。該結果よりモノクローナル抗体ＡＴＩ３−１および
３Ｈ３を用いたサンドイッチＥＩＡの系においてはｂＦ
ＧＦとは反応しない（交差反応性０．３％以下）ことが
示された。

【００３９】実施例４ ＣＳ２３の測定感度 (1) 検量線の作成 (a) 試薬 参考例４で得られた酵素標識３Ｈ３抗体（３Ｈ３−
ＨＲＰ） 実施例２で得たモノクローナル抗体ＡＴＩ３−１感
作マイクロプレート ＣＳ２３ ０〜50nｇ／mｌ 緩衝液A（0.15M NaClを含むpH7.0の0.02Mリン酸緩
衝液)緩衝液B（25％ブロックエース（雪印乳業）、0.15
M NaClを含むpH7.0の0.02Mリン酸緩衝液) ペルオキシダーゼ基質溶液（0.02％過酸化水素と0.
15％ o-フェニレンジアミンを含むpH5.5のクエン酸ナト
リウム緩衝液)酵素反応停止溶液（2N-硫酸) (b) 測定 実施例２で得られた抗体感作プレートの各ウエルに、緩
衝液Bに溶解させたＣＳ２３溶液100μｌを注入し、４℃
で24時間反応させた。各ウエルを緩衝液Aで洗浄後、緩
衝液Bで200倍に希釈した酵素標識抗体溶液100μｌを加
えて25℃でさらに２時間反応させた。各ウエルを緩衝液
Aで洗浄し、ペルオキシダーゼ基質溶液を100μｌ加え25
℃で30分反応させ、酵素反応停止溶液100μｌ加えて反
応させた後、マイクロプレート用自動比色計（MTP-32、
コロナ社製）を用い、492nmにおける吸光度を測定し
た。対照実験としてハイブリドーマ ８，209〜221（198
9），ヨーロッパ特許公開第２８８，６８７号公報記載
の抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体ＭｏＡｂ５２をＡＴＩ
３−１の代りに用いて実施例２記載と同じ方法で製造し
た抗体感作プレートおよび酵素（ＨＲＰ）標識抗体とし
てＭｏＡｂ７８を３Ｈ３の代りに用い上述と同様の操作
を行なった。ＣＳ２３の濃度と吸光度との関係を図２に
示す。図２において−○−はＡＴＩ３−１感作プレート
およびＨＲＰ標識抗体として３Ｈ３を、−●−はＭｏＡ
ｂ５２抗体感作プレートおよびＨＲＰ標識抗体としてＭ
ｏＡｂ７８を用いた場合のＣＳ２３濃度と吸光度の関係
をそれぞれ示す。ＡＴＩ３−１感作プレートおよび３Ｈ
３−ＨＲＰを用いた方が約１０〜５０倍感度が高く、１
０ｐｇ／ｍｌのＣＳ２３蛋白質を定量できることが判明
した。。

【００４０】(2) ＣＳ２３の免疫化学的測定キットおよ
びＣＳ２３の測定 下記のＣＳ２３免疫化学的測定キットを用い、下記の操
作法に従って、被検試料中のＣＳ２３量を測定した。

【００４１】(a) 試薬 参考例４で得られた酵素標識抗体（3H3抗体-HRP) 実施例２で得られた抗体感作マイクロプレート ＣＳ２３ ０〜50ｎｇ／mｌ 緩衝液A（0.15M NaClを含むpH7.0の0.02Mリン酸緩
衝液) 緩衝液B（25％ブロックエース、0.15M NaClを含むpH7.0
の0.02Mリン酸緩衝液) o-フェニレンジアミン 上記の溶解に用いる緩衝液D（0.02％過酸化水
素、0.005％チメロサールを含むpH5.5の0.1Mクエン酸緩
衝液) 酵素反応停止液（２N-硫酸) (b) 測定 緩衝液Bに溶解させたＣＳ２３標準溶液あるいは緩衝液B
で希釈された被検試料溶液100μｌを、緩衝液Aで洗浄さ
れたの各ウエルに注入し、４℃で24時間反応させた。
各ウエルを緩衝液Aで洗浄後、緩衝液Bで100倍に希釈し
た試薬100μｌを加えて、25℃でさらに２時間反応さ
せた。各ウエルを緩衝液Aで洗浄後、試薬で溶解した
0.15％の試薬100μｌを加えて25℃で30分反応させ
た。各ウエルに試薬100μｌを添加して反応を停止さ
せ、492nmの吸光度をマイクロプレート用自動比色計（M
TP-32、コロナ社製) を用いて測定した。標準ＣＳ２３
の検量線を作成し、被検試料で得られた吸光度から、Ｃ
Ｓ２３濃度を得た。

【００４２】実施例５ ＣＳ２３測定系でのヘパリンの影響 実施例４(1)において、標準ＣＳ２３を希釈する際の緩
衝液Bに、０、10、100μｇ／mｌとなるようにヘパリン
を加え、以下は実施例４-(1)と同様の方法でＣＳ２３の
測定を行なった場合、図３に示すように、ヘパリンの存
在によって標準曲線に大きな変化は見られなかった。

【００４３】図３において、−●−、−〇−、−□−
は、順次ヘパリンの濃度が０、10、100μｇ／mｌの場合
を示す。

【００４４】実施例６ ＡＴＩ３−１抗体の中和活性の検討 抗体の中和活性はＣＳ２３刺激によるマウスＢＡＬＢ／
ｃ ３Ｔ３細胞のＤＮＡの合成誘起の阻害を指標として
測定した。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞（２×
１０³個）を０．５％ Ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍを含むＤＭ
ＥＭ溶液１５０μｌに浮遊させ、種々の濃度（２．５，
１０，５０μｇ／ｍｌ）の精製ＡＴＩ３−１抗体溶液を
４０μｌ加え、さらに０．２ｎｇ／ｍｌのＣＳ２３溶液
（ヘパリン２５μｇ／ｍｌを含む）１０μｌを加え、３
７℃で１８時間培養を行なった後、ウエル当り１μＣｉ
になるよう³Ｈ−チミジンを加え４時間後の³Ｈ−チミジ
ンの取り込みを測定した。結果は、いずれの濃度の抗体
を添加した場合も阻害が認められなかった。したがっ
て、ＡＴＩ３−１抗体は中和活性を保持しないことが判
明した。

【００４５】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体を用いたＣ
Ｓ２３の免疫化学的測定法はｂＦＧＦと反応せず、ＣＳ
２３を用いたヒトあるいは動物での試験結果の解析に内
因性のｂＦＧＦを考慮する必要がなく、正確にＣＳ２３
を定量することができるため、極めて有用な手段であ
る。

【００４６】

【００４７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：146 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３における、本発明抗体を固相に用い、
ＣＳ２３もしくはｂＦＧＦとの反応性を見たグラフであ
り、−●−がＣＳ２３を、−○−がｂＦＧＦを示す（何
れもＨＲＰ標識抗体は３Ｈ３）。

【図２】実施例４におけるＣＳ２３濃度と吸光度との関
係を示すグラフであり、−○−がＡＴＩ３−１固相プレ
ートおよび３Ｈ３−ＨＲＰ標識抗体を用いた場合、−●
−がＭｏＡｂ５２固相プレートおよびＭｏＡｂ７８−Ｈ
ＲＰ標識抗体を用いた場合を示す。

【図３】実施例５におけるＣＳ２３測定系でのヘパリン
の影響をみたグラフであり、−●−、−〇−、−□−
は、ヘパリンの濃度が０、10、100μｇ／mｌの場合を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（ａ）〜（ｄ）の性質 (a) 分子量：約１４×１０⁴〜１６×１０⁴、 (b) 成熟型塩基性線維芽細胞成長因子との交差反応性が
   約０．３％以下である、 (c) 塩基性線維芽細胞成長因子蛋白質の生物活性を中和
   しない、 (d) 免疫グロブリンクラスがＩｇＧ２ａに属する、を有
   し、式（Ｉ） Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His- Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu- Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp- Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser- Ile-Lys-Gly-Val-Ser-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly- Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Ser-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu- Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr- Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser- Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala- Lys-Ser で表されるヒト塩基性繊維芽細胞成長因子ムテインＣＳ
   ２３に特異的に結合するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を用い
   ることを特徴とするヒト塩基性繊維芽細胞成長因子ムテ
   インＣＳ２３の免疫化学的測定法。