CN107073474A - 移液枪头及其使用方法 - Google Patents

移液枪头及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107073474A
CN107073474A CN201580060570.2A CN201580060570A CN107073474A CN 107073474 A CN107073474 A CN 107073474A CN 201580060570 A CN201580060570 A CN 201580060570A CN 107073474 A CN107073474 A CN 107073474A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liquid transfer
gun head
transfer gun
chromatin
fluid sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580060570.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107073474B (zh
Inventor
D.R.考维森
S.J.哈钦森
L.弗朗西斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Porvair Filtration Group Ltd
Original Assignee
Porvair Filtration Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Porvair Filtration Group Ltd filed Critical Porvair Filtration Group Ltd
Publication of CN107073474A publication Critical patent/CN107073474A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107073474B publication Critical patent/CN107073474B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0275—Interchangeable or disposable dispensing tips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/64—In a syringe, pipette, e.g. tip or in a tube, e.g. test-tube or u-shape tube
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
    • G01N2035/1053—General features of the devices using the transfer device for another function for separating part of the liquid, e.g. filters, extraction phase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Devices For Use In Laboratory Experiments (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本文描述了含有刚性多孔基质(22)的移液枪头(20)，所述刚性多孔基质(22)上固定有配体，所述配体能够结合与染色质相关的蛋白质；所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，流过该移液枪头的液体样品中的染色质被固定在所述刚性多孔基质上。还描述了使用该移液枪头从液体样品中分离染色质的方法以及所述移液枪头在染色质免疫沉淀测定中的用途。

Description

移液枪头及其使用方法
发明领域
本发明涉及移液枪头(pipette tip)，和使用该移液枪头的吸取方法(例如染色质免疫沉淀测定法)。
背景技术
染色质免疫沉淀(ChIP)是用于研究DNA/蛋白质相互作用的重要技术。ChIP的优点是其可用于分析特定蛋白质或其修饰的同工型与确定的基因组区域的关联。O'Neill等人(2003)在“Immunoprecipitation of native chromatin,NChIP”，Methods:A Companionto Methods in Enzymology 31:76-82中提供了对现有的ChIP技术的综述。ChIP可用于确定蛋白质(例如转录因子和修饰的组蛋白)是否结合于活细胞或组织的内源性染色质的特定区域上。
在ChIP测定中，DNA-蛋白质复合物(即染色质)的片段以能够保留特定的DNA-蛋白质相互作用的方式制备。然后可使用针对存在于该复合物中的蛋白质的抗体使这些染色质片段免疫沉淀。然后可以处理分离的染色质级分以分离DNA和蛋白质组分。然后可以通过聚合酶链反应(PCR)、实时PCR(qPCR)、杂交微阵列、直接测序或用于鉴定具有确定序列的DNA片段的其他技术来确定与特定蛋白质(即用于免疫沉淀的抗体所针对的蛋白质)相关的分离的DNA片段。
因此，染色质免疫沉淀测定通常涉及以下五个关键步骤：(i)从细胞中制备待分析的染色质；(ii)使用抗体对染色质进行免疫沉淀；(iii)分离沉淀的染色质片段；(iv)从沉淀产物中回收DNA；和(v)DNA分析。
ChIP技术有两个主要的变体，区别主要在于如何制备起始(输入)染色质。第一个变体(称为NChIP)使用通过标准方法、通过微球菌核酸酶消化细胞核而制备的天然染色质。第二个变体(称为XChIP)使用通过在染色质分裂(通常通过超声处理)之前将甲醛加至生长细胞中而交联的染色质。一些人员使用了轻度的甲醛交联，随后进行核酸酶消化，且紫外线照射已被成功应用作为替代的交联技术。
通常，使用对与DNA结合的目的蛋白质具有特异性的抗体进行染色质片段的免疫沉淀。可使用固相从样品中分离与抗体结合的染色质片段。
WO 2012/076882描述了一种分离柱，其包括用于容纳包含染色质的液体样品的室和其上固定有配体的刚性多孔基质，其中所述配体能够结合至与所述染色质相关的蛋白质。在使用中，首先可以将液体样品加入到分离柱的室中，例如通过该柱中的上部开口。然后，可将所述液体样品流过刚性多孔基质从而离开该柱，所述基质通常位于柱下端流出口上方。以这种方式，存在于液体样品中的染色质片段可以在流过基质时与配体结合。因此，染色质片段与所述液体样品分离，然后可以将该液体样品丢弃。
然而，当使用描述于WO 2012/076882中的装置时，特别是在旋转柱(spin column)中使用，为了获得在所述染色质与刚性多孔基质上的配体之间的必要接触以确保将其保持在该基质上，需要将含有染色质的液体样品以一定体积添加，使其被所述基质完全吸收，即所述液体样品必须被保留在所述基质的内部空隙空间内。所述液体样品的任何超过基质空隙体积的体积将无法与配体上的官能团接触。
在WO 2012/076882的公开日期时，认为该装置可以操作大致等于刚性多孔基质的内部空隙体积的液体样品。然而，在WO 2012/076882公开之后，本发明人发现，在实践中，当用于旋转柱时，液体样品的量被限制在刚性多孔基质空隙体积的约2-3倍以确保足够的染色质回收。例如，在空隙体积为约40μl的标准旋转柱中，所述装置通常限于体积最多为100μl的含有染色质的液体样品。
在WO 2012/076882中描述的装置的另一缺点是，在实践中通常需要通过离心以使液体样品流过基质：通常需要多次离心方法。这通常需要复杂且昂贵的机器(例如机器手)以执行该方法，特别是当用于涉及多孔板的测定时。
移液管是通常用于各种科学领域的实验室工具，其用于运输所测体积的液体，通常作为介质分配器。通常，移液管是通过在液体保持室上方产生部分真空来工作的，这样，减压能够使液体样品被吸入移液管中并且选择性地释放该真空(即，增加压力)来排出液体。
US 2008/0119637描述了一种由凝胶树脂的填充床组成的移液枪头柱，其中所述凝胶树脂填充床由琼脂糖(agarose或sepharose)组成，并且其中所述凝胶树脂还包含对蛋白质分析物具有亲和力的亲和基团，并且其中所述凝胶树脂缺少残留的离子交换基团。所述琼脂糖凝胶被保持在移液枪头的两个砂芯(frit)之间。蛋白质分析物可以通过将样品溶液穿过该移液枪头柱来提取。琼脂糖凝胶易于将DNA与蛋白质非特异性结合，并且难以提供充分的洗涤步骤来减少所得到的背景信号。当所述琼脂糖凝胶形成移液枪头中提取系统的一部分时也会遇到这些问题。
US 2010/0009845描述了一种移液枪头，其配备有掺杂了活性颗粒的多孔有机整料(monolith)。该移液枪头可用作固相萃取的工具，特别是用于脱盐、分离和纯化生物分子(例如肽和蛋白质)的工具。根据本文描述的方法，聚合可以在原位进行，因此该产品必须为了各应用进行定制，或必须由用户制作。使用该方法，也难以实现整料之间的重现性。
施加减压以吸入液体样品并增加压力以排出液体可以避免对于离心的需要。然而，当该方法在具有通常在WO 2012/076882中描述的标准尺寸的砂芯类型的标准尺寸分离柱上进行时，使用减压或增压驱动液体穿过该柱可能引起起泡。这种起泡可能导致样品的污染或损失，并可阻止液体的进一步流过。
具有过滤装置(例如布置在其中的砂芯)的移液枪头在本领域中通常是已知的。然而，在已知的移液枪头中，该过滤装置通常位于该移液枪头的上半部分中，其靠近该移液枪头接合移液管主体的点。这种装置的功能通常是防止液体进入用于吸取液体的抽吸装置中，并保护该设备，而不是用来捕获分析物的(例如存在于液体中的染色质)。
一些已知的移液枪头(例如由Merck Millipore制造的)具有设置在该移液枪头下半部分中的过滤或分析物捕获装置。然而，这些通常包括具有一般吸着剂(例如C8或C18改性二氧化硅)的纤维材料。本领域以前没有公开过含有染色质特异性捕获基质的移液枪头。
因此，需要改进的染色质免疫沉淀测定装置和方法来解决上述一个或多个问题。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了一种移液枪头，其具有：
适于接合移液管的开放上端；
开放下端；和
与上端和下端流体连通的通道；
所述移液枪头被配置为，在使用中使得液体样品能够通过施加减压而被吸入下端以及通过施加增压而从下端排出，从而流过该移液枪头；
所述移液枪头包含固定有配体的刚性多孔基质，所述配体能够结合与染色质相关的蛋白质；
所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，流过所述移液枪头的液体样品中的染色质被刚性多孔基质所固定。
在另一方面，提供了一种配有本发明的移液枪头的移液管(或其他吸取装置)。
在另一方面，提供了一种从液体样品中分离染色质的方法，所述方法包括使液体样品流过本发明的移液枪头或本发明的移液管(或其它吸取装置)，使得所述染色质被固定在该移液枪头的刚性多孔基质上。
在另一方面，提供了进行染色质免疫沉淀测定的方法，包括以下步骤：
(i)从细胞中制备包含待分析的染色质的液体样品；
(ii)根据本发明方法，将液体样品中的染色质免疫沉淀到固定有配体的刚性多孔基质上，从而将染色质与液体样品分离；
(iii)从沉淀的染色质中回收DNA；和
(iv)DNA分析。
在另一方面，提供了进行染色质免疫沉淀测定的方法，包括以下步骤：
(i)从细胞中制备包含待分析的染色质的液体样品；
(ii)使液体样品流过本发明的移液枪头或本发明的移液管，从而将染色质与液体样品分离；
(iii)从沉淀的染色质中回收DNA；和
(iv)DNA分析。
在另一方面，提供了一种试剂盒，其包含本发明的移液枪头或本发明的移液管，以及适于进行染色质免疫沉淀测定的一种或多种缓冲液、溶液或试剂。
在另一方面，提供了本发明的移液枪头或本发明的移液管(或其他提取装置)在用于从液体样品中分离染色质的用途，特别是在染色质免疫沉淀测定中。
优点和惊人发现
本发明的装置和方法赋予了与现有技术相比的许多优点。特别地，本发明的装置和方法不需要使用离心力来驱动缓冲液和试剂流过刚性多孔基质，从而使得更容易进行自动化(甚至手动操作)，并且不需要昂贵的自动化设备。
此外，当与WO 2012/076882中通常描述的装置和方法相比时，本发明的装置和方法显著减少了与免疫沉淀过程相关的培养时间，从而将实施的时间从数小时减少至数分钟。此外，本发明的装置和方法显著提高免疫沉淀过程中洗涤步骤的有效性。
本发明的装置和方法提供了额外的优点，在于，相比于WO 2012/076882中通常描述的装置和方法，将可以对更大量的含有染色质的溶液中实现染色质装载至刚性多孔基质上。此外，染色质与本发明装置的刚性多孔基质的更紧密接触提高了该装置的灵敏度，使得与竞争装置相比，可以利用更少量的染色质。根据本发明方法，可使体积为砂芯(frit)的孔体积数倍的稀染色质溶液来回穿过该装置的刚性多孔基质，以使溶液中吸附的染色质最大化。此外，与WO 2012/076882中通常描述的方法相比，从大量稀染色质溶液中加载染色质，然后使用更小体积的洗脱液从砂芯中除去它们，能够使得洗脱液中的染色质浓度显着增加。
特别地，本发明的方法尽管在免疫沉淀阶段具有比标准ChIP方法更简短的方案，但经过一定范围的染色质添加后仍给出良好的ChIP结果。意外的是，在本发明的方法中，裂解物与官能化多孔基质的接触时间短得多，却并没有不利地影响染色质与固定在刚性多孔基质上的配体的结合效率：令人惊讶的是，其得到了比在WO 2012/076882中通常描述的方法更好的结果。
不希望受理论束缚，认为在本发明的方法中，液体样品流过刚性多孔基质的多重运动可通过随着液体的移动，在刚性多孔基质的内表面补充可用的染色质/抗体，来增强染色质与刚性多孔基质的结合。相比之下，在WO 2012/076882中通常描述的方法中，裂解物被加入到刚性多孔基质中只是填充了孔体积，并且仅依赖于扩散来提供必要的接触。
该装置和方法还具有将染色质在最终洗脱液中浓缩的优点。当用于染色质免疫沉淀测定中时，在包含本发明的刚性多孔基质的移液枪头中进行该方法，使得使用者可以在测定的加载阶段中处理更大体积的含有染色质的溶液。加载后，如果在最终洗脱阶段使用较小体积的洗脱液，则可以同时实现浓缩的效果和增加的灵敏度。这提供了相比于WO2012/076882中通常描述的标准旋转柱方法的优点，因为克服了加载体积的限制问题。
令人惊奇的是，当将本发明的方法直接与WO 2012/076882中描述的方法进行比较时(使用相同批次和大小的砂芯)，结果得到了改善，即对于简短得多的方案而言具有更高百分比的抗体结果。采用了US 2008/0119637中通常描述的技术的琼脂糖凝胶移液枪头(PurespeedTM Pro A)在该测试中未能显示出信号。
附图简述
图1A示出了配有现有技术的砂芯的旋转柱；
图1B示出了本发明的移液枪头；
图1C是图1B的放大图；
图2示出了在本发明的200μl移液枪头中流过3.5mm砂芯的含染色质的样品的％Ab信号；
图3示出了在本发明的200μl移液枪头中流过3.5mm砂芯的含染色质样品的染色质稀释系列；
图4示出了使用WO 2012/076882中描述的方法获得的结果与使用相同砂芯尺寸和类型的本发明的方法之间的比较。
发明详述
移液枪头
本发明装置的一个方面包括移液枪头。该移液枪头具有适于接合移液管(或其他类似的提取装置，例如下面定义和示例的那些，包括但不限于注射器)的开放上端；开放下端；以及与上端和下端流体连通的通道。所述移液枪头被配置使得在使用中，液体样品能够双向流过该移液枪头，这通常通过施加减压(例如施加真空)而从下端被吸入、以及通过施加增压而从下端排出而进行。所述移液枪头包含官能化的刚性多孔基质，在下文进行详细描述。
通常，该移液枪头的横截面面积(特别是在水平横截面观看时)从其上端向下端变窄。在一个实施方案中，所述移液枪头朝着其下端逐渐变细。移液枪头的具体实例包括具有截头圆锥形或截头锥体形状的那些。
所述移液枪头具有上端，其适于接合移液管或类似的提取装置。在一个实施方案中，所述移液枪头是移液管的组成部分。在另一实施方案中，所述移液枪头与移液管分开制造并在使用前连接至该移液管。
移液管可以是本领域已知的任何移液管或类似的提取装置，条件是在其操作期间，液体样品能够双向流过所述移液枪头，例如通过施加减压而被吸入下端以及通过施加增压而从下端排出。本领域技术人员熟知的移液管和类似提取装置的实例包括排气(airdisplacement)移液管、正位移(positive displacement)移液管、移液注射器、玻璃微量移液管、微流体移液管、多通道移液管、微量注射器、注射器和套管。由于一次性移液枪头包含柱塞，因此本发明特别优选正位移移液管。这基本上允许装置像微型注射器那样操作，其中柱塞直接排出液体，使得装置能够运行而没有空气进入刚性多孔基质。
所述移液枪头的体积可以根据要进行的测定、所包含的刚性多孔基质和旨在流过它的液体样品的量而变化。在一个具体实例中，所述移液枪头的体积范围为1μl至10ml，例如5μl至1ml，例如10μl至500μl，例如20至200μl，例如40至100μl。
所述移液枪头包含设置在所述移液枪头内的刚性多孔基质。所述刚性多孔基质被官能化以在该装置的操作过程中结合到液体样品中的分析物(通常是与染色质相关的蛋白质)。下面更详细地描述所述刚性多孔基质。
刚性多孔基质位于在所述移液枪头内，使得在使用中，流过该移液枪头的液体样品中的分析物(通常为染色质)被刚性多孔基质固定(通常是通过能够结合至与染色质相关的蛋白质的配体，所述配体固定在刚性多孔基质上)。通常，所述刚性多孔基质设置在移液枪头内，使得其基本上覆盖该移液枪头的整个横截面积。
所述刚性多孔基质可以位于所述移液枪头内，使得在使用中，所述液体样品能够通过下端的单次吸入和从下端的单次排出以单次流过该移液枪头。然而，根据本发明，优选的是，所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，所述液体样品能够通过下端的多次吸入和从下端的多次排出以多次流过该移液枪头。相比于现有技术，这带来许多优点。多次将含有分析物(通常为染色质)的液体样品上下流过刚性多孔基质的能力增加了刚性多孔基质上的官能化与分析物(通常为染色质)之间的潜在接触量。这使得在刚性多孔基质上官能化的使用最大化，从而解决了相比于WO 2012/076882中通常描述的装置和方法，对样品体积限制的问题。令人惊讶的是，这也有助于将培养期从1小时的数量级显著降低至数分钟，在此期间，刚性多孔基质上可以结合更大量的溶液中的染色质。
在一个实施方案中，所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，刚性多孔基质下方的移液枪头中的液体比例小于该移液枪头中液体的总体积的50％(例如小于40％、例如小于30％、例如小于20％、例如小于10％、例如小于5％、例如小于3％、例如小于2％、例如小于1％)。通常，这是通过将刚性多孔基质放置在移液枪头的下半部分，优选最下面的四分之一处来完成的。在一个实施方案中，所述刚性多孔基质设置在移液枪头下端或附近。将所述刚性多孔基质置于该移液枪头中是特别有利的，因为在使用中使所述刚性多孔基质下面的液体比例最小化，从而使得在每次吸入和排出液体时流过所述刚性多孔基质的液体含量最大化，并使得在每次流过时增加了配体结合染色质的能力。
刚性多孔基质
本发明移液枪头包含刚性多孔基质。在本发明的方法中，包含染色质(任选结合抗体)的液体样品流过所述刚性多孔基质，使得所述染色质，或结合抗体的染色质被所述刚性多孔基质保留。
所述基质通常是多孔的，即在液体可流过的基质内存在孔或空间。本发明的基质可以采取任何方便的物理形式，例如薄片、滤纸、膜、圆筒、纤维或管。在一个优选实施方案中，所述基质包括滤纸、圆盘或砂芯。该基质通常用作吸附剂(即通过其表面上的配体结合与染色质相关的蛋白质)。因此，尽管在一些实施例中，所述基质可以是滤纸的物理形式(例如圆盘或砂芯)，但是该基质不需要作用为典型的滤纸。在一个实施方案中，所述基质包括吸附剂盘或砂芯。
所述刚性多孔基质(例如圆盘或砂芯)的尺寸被设计成适合在该移液枪头内，通常占据移液枪头的整个横截面积。圆盘或砂芯的精确形状和尺寸取决于该移液枪头的的形状和尺寸。然而，在一个实施方案中，圆盘或砂芯的横截面为圆形或多边形。在一个具体实例中，圆盘或砂芯的直径为0.01mm至2cm，例如0.1mm至2cm，例如0.5mm至1cm，例如1至8mm，例如2至5mm或5至8mm。
所述刚性多孔基质(例如圆盘或砂芯)的厚度可以根据为了结合样品中的分析物(例如染色质)所需的官能化材料(例如配体)的量、以及与其匹配的移液枪头的尺寸而变化。在一个具体实例中，圆盘或砂芯的厚度范围为0.01mm至2cm，例如0.1mm至2cm，例如0.5mm至1cm，例如1至8mm，例如1至4mm。
在一个具体实例中，使用插入到200μl移液枪头中的3.5mm直径×2mm厚度的小蛋白A砂芯、或插入到经修饰的旋转柱中的7.4mm直径×2mm厚的蛋白质A砂芯进行ChIP测定。
在一个实施方案中，所述刚性多孔基质包括烧结的热塑性聚合物。WO2005/018803中描述了合适的基质的具体实例。基质可以具有化学反应性或官能化的改性表面，例如，其提供适于连接配体的侧链官能团，其任选地经由连接基连接。本发明的基质基本上是刚性的。
如本文所用，术语“聚合物”通常包括但不限于均聚物、共聚物(例如嵌段、接枝、无规和交替共聚物)、三聚物等，及其共混物和改性物。此外，除非另有特别限制，否则术语“聚合物”还包括该分子所有可能的几何构型。这些构型尤其包括全同立构、间同立构、无规和随机对称。
用于本发明方法和材料的聚合物通常是热塑性聚合物。热塑性塑料，也称为热软化塑料(thermosoftening plastic)，是在特定温度以上变得柔软或可成型并且在冷却时返回固态的的聚合物。
在本发明的方法和材料中使用的聚合物通常是有机聚合物。大量有机聚合物是本领域已知的。适合本发明用途的特定类别的有机聚合物的实例包括聚烯烃、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚砜及其混合物或衍生物。
在一个实施方案中，所述有机聚合物是通过聚合烯键式不饱和单体(即具有C＝C键的化合物)形成的聚合物。在一个实施方案中，烯键式不饱和单体可以是烯烃：换句话说，未取代的不饱和烃(例如乙烯、丙烯、1-丁烯、1-己烯、4-甲基-1-戊烯或苯乙烯)。在本说明书中，通过聚合这种单体形成的聚合物被称为“聚烯烃”。在另一实施方案中，烯键式不饱和单体是被一个或多个卤素原子，特别是一个或多个氟原子取代的烯键式不饱和烃(如偏二氟乙烯或四氟乙烯)，或被其它取代基取代的烯键式不饱和烃，其在聚合后对吸附剂材料是惰性的。在本说明书中，通过聚合这种单体形成的聚合物称为“取代的聚烯烃”。
在一个实施方案中，热塑性有机聚合物选自聚烯烃和取代的聚烯烃。合适的聚烯烃的实例包括，但不限于：聚乙烯；聚丙烯；聚(1-丁烯)；聚(1-戊烯)；聚(1-己烯)；聚(甲基戊烯)；聚苯乙烯；及其混合物。合适的取代聚烯烃的实例包括，但不限于：聚(偏二氟乙烯)；聚(四氟乙烯)(PTFE-)；聚(甲基丙烯酸甲酯)；及其混合物。优选地，所述热塑性有机聚合物选自聚乙烯和聚丙烯。
在一个实施方案中，所述聚烯烃是聚乙烯。聚乙烯通常以其密度和线性为特征。极低密度聚乙烯(VLDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)和高密度聚乙烯(HDPE)和超高分子量聚乙烯(UHMWPE)均可用于本发明。UHMWPE是分子量为数百万的聚乙烯，通常为310万至567万。它通常具有0.930–0.935g/cm3的密度。HDPE由大于或等于0.941g/cm3的密度定义。MDPE的密度范围为0.926-0.940g/cm3。LLDPE被定义为密度为0.915–0.925g/cm3。LLDPE是通常通过乙烯与短链α-烯烃(例如1-丁烯、1-己烯和1-辛烯)的共聚制备的具有大量短枝的基本上线性的聚合物。LDPE被定义为密度为0.910–0.940g/cm3。VLDPE被定义为密度为0.880–0.915g/cm3。VLDPE是具有高水平短链分支的基本上线性的聚合物，其通常通过乙烯与短链α-烯烃(例如1-丁烯、1-己烯和1-辛烯)的共聚制备。所有上述形式的聚乙烯可以通过本领域技术人员熟知的标准技术制备。
在一个实施方案中，所述聚烯烃是聚丙烯。所述聚丙烯可以是立体规则的(全同立构或间同立构)、无规立构的聚丙烯，或其混合物。所有上述形式的聚丙烯可以通过本领域技术人员熟知的标准技术制备。
在一个实施方案中，所述热塑性聚合物是聚乙烯；或包含聚乙烯，优选至少80％聚乙烯，特别优选至少90％聚乙烯和最优选至少95％聚乙烯的共聚物或共混物。
可用的聚乙烯的实例包括高密度聚乙烯和超高分子量聚乙烯，由英国PorvairFiltration Group Ltd使用以制造商标为或的产品。所述热塑性聚合物还可以包含本领域常规的流动改性剂、添加剂等。
要烧结以形成基质的热塑性聚合物颗粒通常具有一定范围内的尺寸，其适于该基质的最终用途。所述颗粒可以是球形的，通常是球形的或可以是任何其它合适的规则或不规则形状。本领域技术人员将理解，流体流过所述基质的速率将至少部分地由包含所述基质的颗粒的尺寸和这些颗粒烧结的条件来决定。在这方面要考虑的其他变量包括与所述基质连接的任何材料的分子大小和其它性质。
如本文所用,术语“烧结热塑性聚合物”是指许多热塑性聚合物颗粒，其在热和振动的影响下已大体聚结成单一单元，而实际上不会液化该聚合物。因此，该基质包含许多具有限定结构的熔融热塑性聚合物颗粒，其在施加流体时被保持。由于构成颗粒的熔合性质，所述“烧结热塑性聚合物”一般是基本上刚性的，即它基本上是不可压缩的，并且它不会在水溶液中收缩或溶胀。但是，本发明的一些实施方案例如包含本发明基质的薄片或膜可以是柔性的。
热塑性塑料的烧结方法是本领域熟知的。这些方法包括例如US2002/0064413和GB2369796中公开的方法。
烧结后的基质的孔径可以在其制造过程中被预先确定以适用于所需用途。通常，该基质中孔的尺寸可为1-1000μm，例如1-500μm、例如500-1000μm、例如200-700μm、例如5-100μm、例如5-20μm、例如20-40μm或40-80μm。
烧结后，对基质进行修饰以提供化学反应性表面，例如，官能化表面，优选不规则表面。该修饰增加了基质的表面积。其还在表面上提供了官能团，这有助于配体连接。换句话说，所述化学反应性表面是经修饰的表面，其提供了适于将配体任选地经由连接基连接到该表面的侧链官能团。
已知有许多用于热塑性聚合物的表面改性的技术。在这方面可以使用的三种优选的技术是如WO 2005/018803中所述的气体等离子体胺化(gas plasma amination)、γ照射和化学氧化。
优选地，所述基质具有通过化学氧化产生的改性表面。化学氧化技术通过破坏热塑性塑料中的碳键导致产生中间不规则反应性官能团。优选地，通过用一种或多种氧化性酸处理来改变所述基质的表面，例如选自以下的酸：三氟乙酸、三氟甲磺酸、高锰酸钾和硫酸、三氧化铬和硫酸；任选地在重铬酸盐例如K2Cr2O7的存在下。
热塑性塑料的化学氧化通常采用许多策略。如果仅需要修饰热塑性表面，则可以通过使用在H2SO4中的铬酸盐或重铬酸盐和酸(例如K2Cr2O7)的相对温和的化学氧化来实现，而不会对该表面的物理结构造成显著破坏。热塑性塑料的物理侵蚀(在修饰塑料材料表面之前，塑料材料内产生通道和孔以增加其结合能力)可以通过以较高浓度和较高的温度施用更具侵蚀性的酸或酸性混合物来完成，如三氟乙酸或高锰酸钾、硫酸和三氟乙酸。
存在于基质表面的官能团的类型取决于用于产生它们的反应的类型。在大多数情况下，产生羧基或羟基。也可以产生醛和酮基作为反应的副产物。羧基或羟基官能团可以被更稳定和潜在反应性的官能团取代，例如胺。氨基可以被直接化学引到热塑性表面上，或通过间隔分子(连接基)连接。
在基质的表面已被官能化之后，表面可以与一个或多个连接基或间隔区(spacer)反应。这些实体的功能是：(i)促进所需配体连接到所述基质的表面；和/或(ii)如果需要，允许将配体放置在离所述基质表面一定距离处。
有利地，所述改性表面保持化学惰性，从而显著降低非特异性背景结合。连接基技术有助于在很大程度上维持任何固定化蛋白质以及在这些基质上纯化的任何蛋白质的天然构象。利用所述基质上不可切割的连接基，使得蛋白质与基质永久共价偶联，从而彻底地减少任何被固定的分子从该基质流失(leaching)。
优选地，连接基结合到该基质的表面。最优选地，所述连接基在基质表面被修饰后立即与该表面结合。合适的连接基的选择将取决于所述基质的表面官能化和旨在结合所述基质的配体。许多这样的连接基是本领域已知的。特别地，可用于将多肽或DNA/RNA分子偶联到一些连接基或直接与固体支持物结合的反应是本领域熟知的。方便地，官能团可以在其化学合成期间被掺入配体中。潜在的官能团包括醚、酯、硫醇、二烷基酰胺、酰肼、二胺等。适当的连接基将是包含能够与一个或多个上述官能团反应的基团的那些。例如，利用在配体和连接基之间形成硫醚键的连接基可以在一个(配体)末端具有硫醇基团，而在另一个(连接基)上具有溴乙酰基基团。
通常，固定在基质上的配体是生物分子，通常是蛋白质(例如抗体、蛋白质A或蛋白G)。一旦结合到基质上，保持生物分子的活性就很重要。这限制了连接基方案的选择，因为必须使用非变性的(即生理学上的或温和的)条件将所述蛋白质连接到该连接基上。并不是所有的连接基都可以在这种条件下使用。蛋白质的生物活性可取决于特定官能团(对底物)的可及性；因此，这样的基团一定不能被用于连接所述蛋白质和所述基质。此外，许多潜在的官能团可以被翻译后修饰(例如通过磷酸化、乙酰化等)，因此不能实现连接反应。
用于将生物活性分子与连接基结合的优选反应包括：
1)氨基连接，或通过连接基末端的酯官能团与蛋白质的伯胺和/或仲胺之间的反应，在连接基与配体(例如蛋白质)之间形成酰胺键。这些反应通常是可靠的，并且被固定的蛋白质的活性很少受到影响。此外，该反应可以在中性pH(对于伯胺)至约pH 8.3(对于仲胺)进行。此外，该反应在反应混合物中不需要游离胺。
2)硫基连接，或在基质上的硫醇和源自蛋白质的另一硫醇之间形成共价键。在该反应中，结合反应是可逆的，即用2-巯基乙醇或DTT还原后可将配体移除回流动相。例如，这对于研究蛋白质之间的相互作用是非常方便的。该反应需要一些特殊的结合条件，即，在溶液中不存在二价金属；并且在结合之前蛋白质的SH基团必须被还原。
3)羧基连接，或在基质上的官能团与蛋白质的羧基末端之间形成共价键。这种类型的反应的效率和可靠性较低，因为许多蛋白质具有天然修饰(即闭锁)的C-末端。
在一个实施方案中，与染色质相关的蛋白质结合的配体被固定在基质的表面上。在该实施方案中，烧结后，该基质提供有非胺化或基本上非胺化的表面。在该方法中，氧化后(优选刚刚氧化后)，在基质上的羧基官能团与6-氨基己酸之间的反应中产生了间隔区。该反应产生具有锚定羧酸官能团的连接基。重要的是，该方法不涉及在表面上产生未结合的胺，这显著降低了与修饰表面的非特异性背景结合。
所述连接基优选足够长，以防止支持物与结合配体的蛋白质之间的任何空间位阻。还可以引入连接基以在配体连接位点之间产生足够大的距离，从而提供配体与试剂的非限制性通路，并且还防止配体在聚合物表面上的聚集。
在生物活性分子的结合中，所述连接基的长度将决定配体和固体支持物之间的距离。已经表明，该长度可显著影响通过所述连接基连接的生物分子的功能活性。优选地，所述连接基将包含3至11个碳原子，最优选3、4、5、6、7或8个碳原子。所述连接基可以是可切割的连接基或不可切割的连接基。术语“可切割连接基”旨在表示在不影响通过该连接基与基质结合的配体的活性的条件下为可切割的连接基。
任选通过连接基连接至所述基质的配体可以是结合至与染色质相关的蛋白质的任何试剂。通常，所述配体是蛋白质、多肽、肽、肽模拟物、抗体或其片段(例如单克隆、多克隆、Fab、scFv)。优选地，所述配体包含与抗体结合的试剂，例如抗免疫球蛋白(例如抗-IgG)抗体、蛋白A或蛋白G。或者，所述配体可以包含结合至目标蛋白质的抗体，例如所述配体可以是抗组蛋白抗体。
在一个实施方案中，所述配体是蛋白质A。蛋白质A是最初在金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的42kDa的表面蛋白质。它由spa基因编码，且其调控是由DNA拓扑、细胞渗透压和称为ArlS-ArlR的双组分系统控制的。蛋白A及其结合免疫球蛋白的能力是本领域技术人员熟知的。
在一个实施方案中，所述配体是蛋白质G。如本领域技术人员已知的，蛋白质G与蛋白质A极其类似，是在C组和G组链球菌中表达的免疫球蛋白-结合蛋白，但具有不同的特异性。它是65kDa(G148蛋白质G)和58kDa(C40蛋白质G)的细胞表面蛋白，已经发现其在通过将其与Fab和Fc区的结合来纯化抗体上的应用。
在一个方面，本发明涉及从样品中分离染色质的方法。“分离染色质”，通常是指染色质结合至基质上，例如，使得其可以方便地从所述液体样品中分离。
染色质
染色质由DNA和蛋白质(主要是组蛋白)的复合物组成，并构成真核细胞中发现的染色体。染色质以两种状态存在，常染色质和异染色质，其具有不同的染色特性，而在细胞分裂过程中，其会缠绕并折叠形成中期染色体。染色质在本文中用于表示核酸(通常为DNA)和相关蛋白质的任何此类复合物，包括通过染色体的断裂产生的染色质片段或其他染色质制剂。
染色质免疫沉淀
通常，该方法作为染色质免疫沉淀(ChIP)测定的一部分进行。术语“染色质免疫沉淀测定”是本领域技术人员熟知的，并且优选至少包括以下步骤：
(i)从细胞制备包含待分析的染色质的液体样品；
(ii)使用抗体将液体样品中的染色质免疫沉淀到基质上；
(iii)从所述沉淀的染色质中回收DNA；
(iv)DNA分析。
所述ChIP测定可为如上所述的NChIP或XChIP。
样品
所述液体样品可以由包含分析物(通常为染色质)的任何生物来源制备，例如包含细胞的任何制剂。所述细胞可以衍生自组织样品，或来自培养物中生长的细胞。优选地，所述细胞包含哺乳动物细胞，优选人或小鼠细胞。
通常，该方法可以在包含103至109个细胞(例如优选小于107个细胞、小于106个细胞或小于105个细胞，优选约104-106个细胞)的染色质的样品上进行。一个细胞通常含有约6pg(6×10-12g)DNA/细胞，并且在染色质中含有等量的DNA和蛋白质。在一个实施方案中，所述方法可以在含有小于100μg(例如小于50μg、例如小于20μg、例如小于10μg、例如小于5μg、例如小于2μg、例如小于1μg、例如小于500ng、例如小于200ng、例如小于100ng、例如小于5ng、例如小于20ng、例如小于10ng)染色质的样品上进行。因此，该方法可以在例如包含约0.6μg DNA或1.2μg染色质(这等于大约100,000个细胞中的DNA或染色质的质量)的样品上进行。
染色质制备
在本发明的实施方案中，将包含细胞的制剂进行染色质免疫沉淀测定(ChIP)。通常，首先从制剂中提取染色质以制备包含染色质片段的液体样品。
在一个实施方案中，首先使用标准技术从制剂中收获细胞，然后从其中获得细胞核。例如，细胞可能被破坏(例如使用细胞裂解缓冲液或超声处理)，这导致细胞核从中释放出来。在核释放后，该方法优选包括消化细胞核以便释放染色质的步骤，例如使用微球菌核酸酶或进一步超声处理。
在另一实施方案中，该方法可以包括交联染色质的步骤。这可以通过任何合适的方法实现，例如通过加入合适的交联剂，例如甲醛，优选在染色质断裂之前加入。断裂可以通过超声处理进行。然而，在断裂后可以加入甲醛，然后进行核酸酶消化。
在一个实施方案中，首先用甲醛固定细胞或组织片段以交联蛋白质-DNA复合物。细胞可用甲醛在室温或37℃培养，温和摇动5-20分钟，优选10分钟。组织片段需要用甲醛培养更长时间，例如10-30分钟，例如15分钟。甲醛的浓度可以为0.5-10％，例如1％(v/v)。
一旦完成了交联反应，就可以使用交联剂(如甘氨酸)的抑制剂来停止所述交联反应，该抑制剂的摩尔浓度等于交联剂浓度。在室温，停止交联反应的适当时间范围可以为2-10分钟，优选约5分钟。然后可以收集细胞并用含有钠盐、EDTA和洗涤剂如SDS的裂解缓冲液裂解。在裂解前可将组织片段匀化。
然后可以将细胞或匀化的组织混合物机械剪切或酶剪切以产生适当长度的DNA片段。通常，ChIP测定需要200-1000个碱基对的剪切染色质或DNA。DNA的机械剪切可以通过雾化(nebulization)或超声处理进行，优选超声处理。可以通过在Mn盐的存在下使用DNAseI、或在Mg盐的存在下使用微球菌核酸酶来进行DNA的酶剪切以产生随机DNA片段。可以基于细胞以及超声波仪器或消化酶浓度来优化交联DNA剪切条件。
在一个实施方案中，一旦DNA剪切完成，可通过离心除去细胞碎片，并收集含有DNA-蛋白质复合物的上清液。产生了包含染色质片段的液体样品，其中蛋白质被固定在DNA上(例如其中DNA和蛋白质是交联的)，其可用于本发明的方法。在替代的实施方案中，可以省略离心步骤，即在DNA剪切后直接进行以下步骤。
免疫沉淀
一旦将蛋白质固定在染色质上，然后可将该蛋白质-DNA复合物进行免疫沉淀。因此，一旦制备了包含染色质的样品，该方法优选包括免疫沉淀所述染色质的步骤。优选地，通过加入合适的针对感兴趣的蛋白质的抗体来进行免疫沉淀，所述感兴趣的蛋白质可能存在于染色质中。
在一个实施方案中，抗体可以固定在刚性多孔基质上，即所述抗体是与染色质相关的蛋白质结合的配体。在该实施方案中，与染色质相关的蛋白质是感兴趣的蛋白质，例如，其与染色质中的DNA结合。
在另一实施方案中，首先将溶液中游离的抗体应用于含有染色质的样品。然后可以使用结合所述抗体的试剂分离结合抗体的染色质片段，所述试剂与刚性多孔基质结合。在该实施方案中，与所述刚性多孔基质结合的配体可以是结合所述抗体的任何试剂，例如蛋白质A、蛋白质G或抗免疫球蛋白(例如抗-IgG)抗体。与染色质相关的蛋白质是对感兴趣的蛋白质具有特异性的抗体。
抗体可以结合任何与染色质相关的蛋白质。在一个实施方案中，抗体对非组蛋白(如转录因子或其他DNA结合蛋白)是免疫特异性的。或者，所述抗体可以针对任何组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4及其各种翻译后修饰的同工型和变体具有免疫特异性。或者，所述抗体可对参与染色质修饰的酶(例如组蛋白乙酰化酶或脱乙酰酶，或DNA甲基转移酶)具有免疫特异性。此外，应当理解，组蛋白可以通过定义的酶(例如通过限定的氨基酸残基的乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP-核糖基化、sumoylation和泛素化)在体内进行翻译后修饰。因此，抗体可对任何这些翻译后修饰具有免疫特异性。
使用方法
本发明还涉及本发明的装置在刚性多孔基质上结合分析物(通常为染色质)的用途。然后可以将染色质从刚性多孔基质中洗脱出来用于随后的分析。
因此，本发明还包括从液体样品中分离染色质的方法，包括使液体样品流过本发明的移液枪头，使得染色质固定在移液枪头的刚性多孔基质上。该方法使得当染色质穿过该移液枪头时从液体样品中分离。
根据本发明，液体能够双向流过移液枪头；通常，施加减压导致液体样品在一个方向上流过所述刚性多孔基质，并且施加增压导致所述液体样品沿相反方向流过所述刚性多孔基质。因此，当染色质双向流过移液枪头时，染色质可从液体样品中分离。
在本发明方法的一个实施方案中，所述液体样品经历了单次流过所述刚性多孔基质的循环，即通过施加减压将液体样品由移液枪头下端抽吸一次，并通过施加增压从该移液枪头的下端一次排出。根据本发明的方法，优选液体样品进行多次流过刚性多孔基质的循环，即通过施加减压将液体样品通过移液枪头下端进行多次抽吸并通过施加增压从该移液枪头的下端多次排出。与现有技术的方法相比，液体样品流过刚性多孔基质的多次循环为固定在所述刚性多孔基质上的配体提供了多次结合机会，从而允许更大体积的染色质被加载到所述刚性多孔基质上。以这种方式，可将体积数倍于所述刚性多孔基质的孔体积的稀染色质溶液来回穿过所述刚性多孔基质，以最大限度地从溶液中吸附染色质。
该方法具有其他优点，即可以用更小体积的洗脱液将染色质从刚性多孔基质中洗脱，从而允许更浓的染色质溶液从该装置中洗脱。以这种方式，与所述刚性多孔基质的孔体积相似的洗脱缓冲液可以被吸到所述刚性多孔基质中，然后从其中分配，以使洗脱缓冲液中染色质的浓度最大化。
允许试剂和缓冲液多次来回流过刚性多孔基质，从而提高免疫沉淀过程的灵敏度和有效性。
在一个实施方案中，液体样品以不使空气进入所述刚性多孔基质的方式从移液枪头下端被吸入。在一个实施方案中，液体样品以不使空气进入所述刚性多孔基质的速率从移液枪头下端被吸入。在一个实施方案中，液体样品在不使空气进入所述刚性多孔基质的时刻被终止通过移液枪头下端吸入。
使用移液枪头来回抽吸，使得空气不进入砂芯，从而克服了起泡的问题，因此可以在不使用离心的情况下进行该过程。这大大改善了本发明对于自动化高通量过程的效用。
可以使用任何合适的减压和增压方法以用于使液体样品流过基质。优选地，所述液体样品可以通过部分真空或减压的方式被吸入基质中。然后可在增压时将液体样品从基质中排出。对本发明方法可以操作的压力没有特别限制。但是，优选在空气可被强制通过刚性多孔基质之前除去驱动力(排出步骤中的增压或吸入步骤中的减压)。使用一次性移液枪头的最常见的实验室移液管中所用的活塞式排气系统可以很好地用于此方法。但是，正位移移液管可更好地适用于该方法，因为一次性移液枪头包含柱塞，基本上使得该装置能够作为微型注射器操作，其中柱塞直接置换液体，从而使得所用的装置能够不会使空气进入所述刚性多孔基质中。
在一些实施方案中，将液体样品与基质一起培养合适的一段时间，例如在将样品添加到柱后以及在将样品从柱中拉出之前。根据本发明，在液体样品与基质培养了比WO2012/076882中通常描述的方法短得多的时间之后，所述配体就可以结合至染色质。这是因为在WO 2012/076882中描述的方法中，培养是静态的；即，样品液体要么保留在所述刚性多孔基质的孔结构内，要么保留在足够接近的位置以允许扩散，从而将分析物(特别是染色质)移动到刚性多孔基质中。相比之下，在本发明优选的方法中，培养是动态的，即样品液体连续来回穿过所述刚性多孔基质：与WO 2012/076882中所述的方法相比，这种动态培养显著降低了培养时间。培养时间的实例范围是1秒至1小时，例如2秒至20分钟、5秒至10分钟、10秒至5分钟或20秒至2分钟或约1分钟。该培养的长度可以变化，以便给配体足够的时间与染色质结合，这取决于该反应的动力学。
液体样品的体积可以根据在柱中的室体积和基质(例如砂芯)的尺寸而变化。该基质是多孔的，且通常可以具有约0.5的孔隙率，即该基质总体积的约50％是内部空隙空间。
在使液体样品流过刚性多孔基质以使得染色质固定在该基质上之后，所述染色质可以通过任何合适的方式从基质中除去。在一个实施方案中，所述染色质可以通过洗脱从该基质中除去。适用于从基质中洗脱染色质的溶剂是本领域技术人员熟知的。
洗涤
在将液体样品流过基质之后，在一个实施方案中，洗涤柱以减少与该基质的非特异性结合。可以采用一个或多个洗涤步骤，通常通过将洗涤溶液加入到柱中并使洗涤溶液流过该基质。
例如，可以用高严紧度(stringency)缓冲液洗涤基质以消除非共价相互作用。高严紧度缓冲液可以包含例如20-50mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl(pH 8.0)、1-5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1-0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5-1M NaCl和0.5-1％Triton X-100。或者，所述洗涤缓冲液可包括：磷酸缓冲盐溶液(PBS)，其含0.5％聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨酯20；)；或100mM磷酸钠，其含200mM NaCl和洗涤剂例如Tween-20或2-(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基)乙醇(Triton)。通常，洗涤步骤可涉及具有不同严紧度的一系列缓冲液，例如包含相对较低的盐浓度的低严紧度缓冲液和具有较高盐浓度的高严紧度缓冲液。
优选地，所述洗涤缓冲液包含至少0.1％的SDS，更优选约0.2％的SDS。在一个实施方案中，该方法包括1、2或3个洗涤步骤，优选3个洗涤步骤。优选地，洗涤缓冲液包含NaCl，其中LiCl不太优选。
交联的逆转
在其中样品包含交联的DNA-蛋白质复合物的实施方案中，交联可以在洗涤后逆转。可以优化用于交联逆转的缓冲液，以最大化该交联反应的逆转，并最小化由化学、生物化学和热力学作用引起的DNA降解。
例如，在一个实施方案中，用于交联逆转的缓冲液包括乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS和蛋白酶K，其应有效降解与DNA复合的蛋白质并防止由核酸酶(例如DNAse I)造成的DNA降解。另外的缓冲液也可以包含高浓度的钠盐和钾盐，例如1M的氯化钠或0.5M的氯化钾。已证明这样的缓冲液有效地降低了化学和热力学作用造成的DNA降解(Marguet，E.Forturre，P，Extremophiles，2:115-122，1998)并提高了甲醛交联的逆转率。通常交联的逆转发生在升高的温度下，例如50-85℃，持续5分钟-4小时，优选65-75℃，持续0.5-1.5小时。
优选地，结合到基质的染色质首先在逆转交联之前从移液枪头上洗脱出来。在本发明的一些实施方案中，逆转交联的步骤可以在该移液枪头内进行。或者，可以将所述刚性多孔基质(例如过滤器或砂芯的形式)从该移液枪头移除(例如在洗涤之前或之后)，使得交联的逆转发生在不同的容器中。
在一个实施方案中，使用动态培养方法在柱上进行逆转交联，其通过使用减压将液体沿着一个方向流过柱并且通过增压以促使该液体在相反方向流过所述刚性多孔基质，从而连续来回抽取液体。不希望受理论束缚，据信使用这种动态培养方法也可以减少逆转交联的潜伏期。
DNA捕获和分析
一旦完成了交联的DNA-蛋白质复合物的逆转，就可以捕获并清洁DNA。这可以通过苯酚-氯仿提取的标准技术或通过在另外的固相(例如在高浓度的非离液盐的存在下的二氧化硅或硝化纤维素)上捕获DNA来实现。
纯化步骤后，可分析所分离的DNA片段，然后确定其特性。这优选通过聚合酶链反应(PCR)来实现。例如，该分析步骤可以包括使用合适的引物，其在PCR期间将导致一段长度的核酸的扩增。术语“PCR”包括本领域技术人员通常已知的技术的所有变体，包括等位基因特异性PCR、dial-out PCR、数字PCR、热启动PCR、逆转PCR、连接介导PCR、甲基化-特异性PCR、微型引物PCR、多重PCR、纳米PCR、嵌套式PCR、定量PCR(qPCR)、逆转录PCR、固相PCR和降落PCR。本领域技术人员将理解，该方法可以应用于检测基因或检测可以制备特异性PCR引物的基因组的任何区域。所述PCR结果可以例如在电泳凝胶上观察。qPCR将提供存在的DNA的定量分析，并且是该方法的优选形式的PCR。可以使用的其他技术是DNA片段的直接测序或微阵列杂交。
应用
本方法可以具有许多应用，包括目前使用ChIP测定的任意那些，并且可应用于多种生物样品类型。例如，该方法可用于各种研究应用中以表征DNA/蛋白质相互作用。例如组蛋白修饰、非组蛋白修饰和/或DNA甲基化的变异是基因表达的关键调节，并且它们的变化与改变的细胞功能或功能障碍以及因此导致的疾病相关。由于ChIP测定可用于研究这些表观遗传标记物的变异，本方法可应用于诊断和预后应用，并作为适当治疗方案的指南。
因此，在一个方面，本方法可用于疾病病症的诊断或预后。该方法可用于，例如，癌症(例如前列腺癌、宫颈癌或霍奇金淋巴瘤)和自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎)的诊断或预后。优选地，该诊断方法在体外进行。
在一个实施方案中，该方法可包括采取第一和第二样品，并在各样品上进行根据本发明的ChIP测定。例如，第一样品可包含正常(对照)细胞，而第二样品可包含疑似患病的细胞。通过比较该分析的结果，该方法可用于将样品分类为患病或非患病。
试剂盒
用于本方法的组分可以以试剂盒的形式提供，其任选地包含用于实施该方法的说明书。这样的试剂盒可以包括例如如上所述的分离柱，以及任选的一种或多种用于进行染色质免疫沉淀测定的其它试剂。包含在试剂盒中的典型试剂包括一种或多种缓冲液或溶液，其用于制备液体样品、交联染色质、洗涤基质、逆转交联和/或DNA纯化。
图1A总体上示出了现有技术的旋转柱10。该柱具有砂芯12；液体14可以保持在砂芯中并且可以通过离心驱动以单一向下流过的方式流过该柱。
图1B总体上示出了本发明的移液枪头20；图1C提供了放大图。该移液枪头通常具有砂芯22，其位于在所述移液枪头的下半部(特别是最下面的四分之一处)，该砂芯22由刚性多孔基质形成，液体24a、24b可以穿过该刚性多孔基质。在使用中，液体可以保持在砂芯中或者沿任一方向被吸入，减压用于沿着一个方向抽取液体流过该移液枪头，使其流过砂芯；增压用于向另一个方向流过该砂芯排出液体。
现在将参考以下非限制性实施例描述本发明。
实施例
旋转柱形式用于通常在WO 2012/076882中描述的ChIP测定，其中聚乙烯烧结的砂芯已经被化学氧化且用蛋白质A或蛋白质G官能化。该柱中使用的砂芯尺寸为约7.4mm直径和2mm厚。这些砂芯的孔体积约为40μl。
在以下实验中，使用移液枪头或修饰的旋转柱中的官能化砂芯以进行ChIP测定(使用移液管使液体上下流过砂芯)：将结果与在WO 2012/076882中通常描述的ChIP测定(使用离心来使液体流过砂芯)进行比较。为了比较，在类似的ChIP测定中使用了也配有移液枪头(通常在US 2008/0119637中描述的设计)的产品。
材料
ChIP试剂盒–CHIP100100–获自Porvair Filtration Group Ltd
Rainin 200μl移液器，获自Mettler Toledo
Rainin 1000μl移液器，获自Mettler Toledo
针对Purespeed移液枪头的Rainin 1000μl移液器，获自Mettler Toledo
微量离心机–Fisher Scientific Accuspin micro 17R
qPCR机–BIORAD CFX Connect
HepG2染色质(Active Motif，53019)
H3抗体(Active Motif，61277)
阴性抗体–兔IgG，Sigma I5006
GAPDH引物(人启动子区)–Sigma
Purespeed Pro A移液枪头，Rainin PT-10-A20
Purespeed IP稀释溶液：16.7mM的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-HCl(pH8.0)，0.01％十二烷基硫酸钠(SDS)、1.1％2-(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基)乙醇(Triton-X100)、1.2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、167mM NaCl和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)
Purespeed平衡缓冲液(44.4mM Tris-HCl(pH 8.0)、4.1mM EDTA、0.04％SDS、0.73％Triton-X100、111mM NaCl、1mM PMSF)
Purespeed洗涤缓冲液1(50mM Tris-HCl(pH 8.0)、2mM EDTA和1mM PMSF)
Purespeed洗涤缓冲液2(100mM Tris-HCl(pH 9.0)、500mM LiCl、1％NP40、1％脱氧胆酸钠和1mM PMSF)
Purespeed洗脱缓冲液(50mM NaHCO3和1％SDS)
方法
使用WO 2012/076882中通常描述的试剂盒进行比较ChIP测定，其使用旋转柱形式并遵循该试剂盒的方案。
根据本发明的ChIP测定是使用插入200μl移液枪头中的3.5mm直径x2mm厚度的小蛋白质A砂芯，或插入经修饰的旋转柱中的7.4mm直径x 2mm厚的蛋白质A砂芯来进行的。该移液枪头的末端被切掉，使得该砂芯尽可能接近该移液枪头的末端。液体在移液枪头内缓慢上下抽吸(手动操作)，确保没有空气进入砂芯(一个循环)。该方案的每个阶段都与孔中的新鲜溶液有关，所用溶液和循环次数如下：
200μl移液枪头：
1. 150μl蒸馏水x3个循环
2. 150μl柱调节缓冲液x3个循环
3. 150μl柱调节缓冲液x3个循环
4. 150μl水x3个循环
5. 150μl水x3个循环
6. 100μl裂解液x20个循环
7. 150μl洗涤缓冲液1x5个循环
8. 150μl洗涤缓冲液2x5个循环
9. 150μl洗涤缓冲液3x5个循环
10. 150μl水x6个循环
11. 150μl水x6个循环
12. 100μl洗脱缓冲液x20个循环，然后在移液枪头处形成气泡之前将液体排回到Eppendorf中。
经修饰的旋转柱
1. 300μl蒸馏水x3个循环
2. 300μl柱调节缓冲液x3个循环
3. 300μl柱调节缓冲液x3个循环
4. 300μl水x3个循环
5. 300μl水x3个循环
6. 100μl裂解液x20个循环
7. 300μl洗涤缓冲液1x5个循环
8. 300μl洗涤缓冲液2x5个循环
9. 300μl洗涤缓冲液3x5个循环
10. 300μl水x6个循环
11. 300μl水x6个循环
12. 100μl洗脱缓冲液x20个循环，然后在移液枪头处形成气泡之前将液体排回到Eppendorf中。
每个实验中的抗体:染色质的比例为2:1。将洗脱的溶液按照WO 2012/076882中通常所述的方案进行反向交联。将所有样品进行反向交联，并使用GAPDH引物通过qPCR进行分析。
结果
移液阶段大约需要8-10分钟才能完成。由于该方法的时间短，包含染色质/抗体混合物的裂解液与砂芯的培养时间比在WO 2012/076882中通常描述的方法更短：裂解液与用于移液枪头方法的砂芯接触不到1分钟，相比之下WO 2012/076882中通常描述的需要离心的方法要1小时。
实验1(200μl移液枪头，3.5mm直径的砂芯)
500ng染色质/1000ng抗体–根据本发明方法。结果如图2所示。实现了三次合理的重复并且具有良好的％Ab信号。R2的背景略高，导致免疫沉淀的比例降低。
实验2(200μl移液枪头，3.5mm直径的砂芯)
根据本发明的方法处理500ng、250ng、125ng、62.5ng染色质(分别载有1000ng、500ng、250ng、125ng的抗体)的连续稀释。结果如图3所示。实现了良好的ChIP结果：只有250ng染色质具有略高的背景(即降低了免疫沉淀结果的百分比)。
实验3
实验在具有7.4mm直径砂芯的修饰旋转柱(如上所述)中进行。这是为了尽可能复制在WO 2012/076882中通常描述的方法中使用的砂芯尺寸和类型，但是是在修改的“移液枪头”中进行的。使用1000ng染色质和2000ng抗体进行。作为比较，在使用离心机的WO2012/076882中通常描述的方法中所用的标准旋转柱中也进行了相同的测定。
结果如图4所示。可以看出，使用移液管在修饰的旋转柱中处理7.4mm的移液枪头比旋转柱中的标准离心机方法得到更好的结果。
实验4：Purespeed Pro A移液枪头
根据Rainin方案，使用移液器和Purespeed缓冲液中的编程方法，用1000ng染色质和2000ng抗体进行Purespeed Pro A移液枪头(US 2008/0119637中描述的一般设计)。对WO2012/076882中通常描述的方法和本发明的方法进行比较。
对于阳性或阴性抗体，在qPCR阶段不发生DNA的复制。
结果表明，本发明的方法在免疫沉淀阶段具有比标准ChIP方法更简短的方案，并且在一系列染色质添加物中仍然给出良好的ChIP结果。在本发明的方法中，裂解液与官能化砂芯的接触时间短得多，但并没有不利地影响染色质/抗体对蛋白质A砂芯的结合效率，并令人惊奇地得出比标准方法更好的结果。这是由于实现了染色质/抗体与BioVyon上的配体的更紧密接触。此外，据信，本发明的方法中，液体多次流过砂芯的运动可以通过随着液体的移动，补充砂芯内表面上可用的染色质/抗体来增强结合。在通常在WO2012/076882中描述的标准方法中，将裂解物加入到砂芯中仅填充孔体积，并仅依赖于扩散以提供必要的接触。当与标准方法直接比较时(利用相同的批次和大小的砂芯)，结果得到了改善，即更简短的方案具有较高％抗体结果：这是令人惊讶的结果。竞争对手产品(Purespeed Pro A)未能显示信号。
上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于化学、生物化学、生物学、材料科学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (22)

1.一种移液枪头，其具有：
适于接合移液管的开放上端；
开放下端；和
与上端和下端流体连通的通道；
所述移液枪头被配置为，在使用中液体样品能够既通过施加减压而从下端被吸入又通过施加增压而从下端被排出，从而流过该移液枪头；
所述移液枪头包含固定有配体的刚性多孔基质，所述配体能够结合与染色质相关的蛋白质；
所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，流过所述移液枪头的液体样品中的染色质被所述刚性多孔基质保留。
2.根据权利要求1所述的移液枪头，其中所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，所述液体样品能够多次流过所述移液枪头，其中所述液体样品被多次从下端抽吸以及多次从该下端排出。
3.根据权利要求1所述的移液枪头，其中所述刚性多孔基质位于所述移液枪头内，使得在使用中，移液枪头中在所述刚性多孔基质下方的液体比例小于该移液枪头中液体总体积的50％。
4.根据前述权利要求中任一项所述的移液枪头，其中所述官能化的刚性多孔基质包含烧结热塑性聚合物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的移液枪头，其中所述刚性多孔基质为过滤盘或砂芯的形式。
6.根据前述权利要求中任一项所述的移液枪头，所述移液枪头的横截面积向其下端变窄。
7.根据权利要求6所述的移液枪头，所述移液枪头向其下端逐渐变细。
8.根据权利要求7所述的移液枪头，其具有截头圆锥形或截头锥体形状。
9.一种移液管，其具有前述权利要求中任一项所述的移液枪头。
10.根据权利要求9所述的移液管，其中所述移液枪头是所述移液管的组成部分。
11.根据权利要求9所述的移液器，其中所述移液枪头与所述移液管分开制造并在使用之前被连接到所述移液管。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的移液管，其选自：排气移液管、正位移移液管、多通道移液管、移液注射器、玻璃微量移液管、微流体移液管、微量注射器、注射器和套管。
13.一种从液体样品中分离染色质的方法，其包括使液体样品流过根据权利要求1至8中任一项所述的移液枪头或根据权利要求9至12中任一项所述的吸移管，使得所述染色质被保留在移液枪头的刚性多孔基质上。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过施加减压将所述液体样品由所述移液枪头的下端多次抽吸，并且通过施加增压将所述液体样品从所述移液枪头的下端多次排出。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中流过所述移液枪头的下端的所述液体样品的抽吸在一定时间终止，使得没有空气进入所述刚性多孔基质。
16.根据权利要求13的方法，其中所述配体是抗体。
17.根据权利要求13的方法，其中所述配体包括免疫球蛋白、蛋白质A或蛋白质G。
18.一种进行染色质免疫沉淀测定的方法，包括以下步骤：
(i)从细胞制备包含待分析的染色质的液体样品；
(ii)根据权利要求13至17中任一项所述的方法，将液体样品中的染色质免疫沉淀到固定有配体的刚性多孔基质上；
(iii)从沉淀的染色质中回收DNA；和
(iv)DNA分析。
19.一种进行染色质免疫沉淀测定的方法，包括以下步骤：
(i)从细胞制备包含待分析的染色质的液体样品；
(ii)使液体样品流过根据权利要求1至8中任一项所述的移液枪头或根据权利要求9至12中任一项所述的移液管，从而将所述染色质从所述液体样品中分离；
(iii)从沉淀的染色质中回收DNA；和
(iv)DNA分析。
20.一种试剂盒，其包含如权利要求1至8中任一项所述的移液枪头或根据权利要求9至12中任一项所述的移液管，以及适于进行染色质免疫沉淀测定的一种或多种缓冲液、溶液或试剂。
21.根据权利要求1至8中任一项所述的移液枪头或根据权利要求9至12中任一项所述的移液管用于从液体样品中分离染色质的用途。
22.根据权利要求20所述的用途，其中所述移液枪头用于染色质免疫沉淀测定。
CN201580060570.2A 2014-11-28 2015-11-27 移液枪头及其使用方法 Active CN107073474B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1421197.3 2014-11-28
GB1421197.3A GB2532790B (en) 2014-11-28 2014-11-28 Modified pipette tips for chromatin immunoprecipitation assay
PCT/GB2015/053619 WO2016083823A1 (en) 2014-11-28 2015-11-27 Pipette tip and method of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107073474A true CN107073474A (zh) 2017-08-18
CN107073474B CN107073474B (zh) 2020-03-03

Family

ID=52349646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580060570.2A Active CN107073474B (zh) 2014-11-28 2015-11-27 移液枪头及其使用方法

Country Status (7)

Country Link
US (2) US10471423B2 (zh)
EP (1) EP3223949A1 (zh)
JP (1) JP2018504089A (zh)
CN (1) CN107073474B (zh)
CA (1) CA2960775A1 (zh)
GB (1) GB2532790B (zh)
WO (1) WO2016083823A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111097560A (zh) * 2019-11-22 2020-05-05 安徽工业大学 一种基于二次成形的移液器吸头、制备方法及应用
CN113495086A (zh) * 2020-04-03 2021-10-12 深圳市帝迈生物技术有限公司 Poct血细胞分析仪及试剂盒
CN114441663A (zh) * 2020-11-04 2022-05-06 中国科学院上海药物研究所 一种使用固相微萃取亲和选择质谱筛选蛋白质阳性化合物的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117822128A (zh) * 2016-07-22 2024-04-05 俄勒冈健康与科学大学 单细胞全基因组文库及制备其的组合索引方法
MX2019015013A (es) 2018-05-17 2021-01-08 Illumina Inc Secuenciación de células individuales de alto rendimiento con sesgo de amplificación reducido.
CN113196822A (zh) 2018-12-26 2021-07-30 索尼集团公司 终端设备、基站、方法和记录介质

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5079170A (en) * 1989-05-18 1992-01-07 Quidel Corporation Method of sample transfer using a filter applicator
EP1533015A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-25 Eppendorf Ag Porous media
US20100047921A1 (en) * 2005-08-03 2010-02-25 The University Of Tokyo Method for isolation of biopolymer by using re-circulating chromatography
US20110107855A1 (en) * 2008-03-28 2011-05-12 Pelican Group Holdings, Inc. Sample preparation devices and methods for processing analytes
CN103347578A (zh) * 2010-12-10 2013-10-09 波瓦尔过滤集团有限公司 方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0024046D0 (en) 2000-10-02 2000-11-15 Porvair Technology Ltd Method of making porous articles
US20120164750A1 (en) * 2003-07-14 2012-06-28 Gjerde Douglas T Method and Device for Sample Preparation
US7722820B2 (en) * 2004-11-19 2010-05-25 Phynexus, Inc. Method and device for sample preparation
GB0319604D0 (en) 2003-08-20 2003-09-24 Wivenhoe Technology Ltd Immobilization matrix for peptides and proteins
US20080119637A1 (en) 2006-11-21 2008-05-22 Gjerde Douglas T Pipette tip column, resin and method of use for extracting an analyte
US8105513B2 (en) 2008-06-06 2012-01-31 Alexander Bonn Pipette tip containing particle-filled polymer monolith
MX2008008749A (es) * 2008-07-04 2010-03-01 Sensa Control Digital S A De C V Dispositivo de adquisicion, control y medicion.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5079170A (en) * 1989-05-18 1992-01-07 Quidel Corporation Method of sample transfer using a filter applicator
EP1533015A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-25 Eppendorf Ag Porous media
US20100047921A1 (en) * 2005-08-03 2010-02-25 The University Of Tokyo Method for isolation of biopolymer by using re-circulating chromatography
US20110107855A1 (en) * 2008-03-28 2011-05-12 Pelican Group Holdings, Inc. Sample preparation devices and methods for processing analytes
CN103347578A (zh) * 2010-12-10 2013-10-09 波瓦尔过滤集团有限公司 方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111097560A (zh) * 2019-11-22 2020-05-05 安徽工业大学 一种基于二次成形的移液器吸头、制备方法及应用
CN111097560B (zh) * 2019-11-22 2021-06-04 安徽工业大学 一种基于二次成形的移液器吸头、制备方法及应用
CN113495086A (zh) * 2020-04-03 2021-10-12 深圳市帝迈生物技术有限公司 Poct血细胞分析仪及试剂盒
CN114441663A (zh) * 2020-11-04 2022-05-06 中国科学院上海药物研究所 一种使用固相微萃取亲和选择质谱筛选蛋白质阳性化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11020737B2 (en) 2021-06-01
US20170333890A1 (en) 2017-11-23
CA2960775A1 (en) 2016-06-02
GB2532790B (en) 2017-10-04
US20200030788A1 (en) 2020-01-30
EP3223949A1 (en) 2017-10-04
JP2018504089A (ja) 2018-02-15
WO2016083823A1 (en) 2016-06-02
GB201421197D0 (en) 2015-01-14
GB2532790A (en) 2016-06-01
CN107073474B (zh) 2020-03-03
US10471423B2 (en) 2019-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107073474A (zh) 移液枪头及其使用方法
Kline Handbook of affinity chromatography
Yigzaw et al. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification
US20090289213A1 (en) Method of processing a biological and/or chemical sample
CN105377881A (zh) 突变的免疫球蛋白结合多肽
US20130171658A1 (en) Isolation and deglycosylation of glycoproteins
US9695216B2 (en) Materials and methods for removing endotoxins from protein preparations
US20110313147A1 (en) Chromatographic material for the absorption of proteins at physiological ionic strength
CN104334725A (zh) 生物分子分离
AU2016219569A1 (en) Novel affinity chromatography media for removal of anti-A and/or anti-B antibodies
Pichon Aptamer-based and immunosorbents
Mustafaoglu et al. Antibody purification via affinity membrane chromatography method utilizing nucleotide binding site targeting with a small molecule
WO2008028218A1 (en) Affinity separation methods and systems
CN103347578B (zh) 用于实施染色质免疫沉淀测定的方法
US8993334B2 (en) Protein separation via ion-exchange chromatography and associated methods, systems, and devices
WO2005018803A1 (en) Immobilization matrix for peptides and proteins
WO2013121216A1 (en) High efficiency cell capture
US20170137773A1 (en) Cell strainer with functionalized mesh to separate biological components
Ward The art of protein purification
CN112979770A (zh) 一种蛋白a突变体、融合蛋白和应用
González-González et al. Aqueous two-phase systems for the recovery of bioparticles
CN1923864A (zh) 一种氨基化高分子微球制备技术及其应用
US7589183B2 (en) Prevention of leaching of ligands from affinity-based purification systems
US11472836B2 (en) Selective removal of a protein from a mixture of proteins using activated carbon by adjusting solution conditions
Shurko et al. Application of dye-ligand chromatography for purification of coagulation factor VIII

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant