CN112730844A - 一种替考拉宁检测试剂组合及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种替考拉宁检测试剂组合及其制备方法和应用。具体地,所述试剂组合包括:(i)第一测试液,包括替考拉宁‑载体蛋白质复合物;和(ii)第二测试液,包括替考拉宁多抗。本发明的试剂组合可用于在免疫抑制比浊法中检测替考拉宁的浓度,特异性强,分析速度快,且准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域,具体地,涉及一种替考拉宁检测试剂组合及其制备方法和应用。
背景技术
替考拉宁(Teicoplanin)又名太古霉素,1975年首次发现,为游动放线菌属发酵产生的一种新型杀菌性糖肽类抗菌药物。它是特定的游动放线菌经发酵、提取后得到的一种万古霉素族糖肽类抗生素,为多个化学结构非常相似的化合物组成的抗生素混合物。临床上被广泛用于革兰氏阳性菌感染如金葡菌及链球菌属等敏感菌所致的严重感染,如心内膜炎、骨髓炎、败血症及呼吸道、泌尿道、皮肤、软组织等的感染。替考拉宁具有以下特点:1、侧链基团保护,分子空间结构致密,结合位点处于裂缝处,不易被水解失活;2、蛋白结合率高更有利于血药浓度稳定,提高杀菌疗效;3、生理pH条件下水溶性好;使得替考拉宁与同类别药物比较有明显的临床优势。
替考拉宁药物谷浓度大于10mg/L,针对不同的病症,替考拉宁药物谷浓度有很大的区别。替考拉宁药物谷浓度小于10mg/L时,未达到有效治疗浓度;药物谷浓度在10~20mg/L是针对非复杂革兰氏阳性菌感染;药物谷浓度在20~60mg/L是针对复杂革兰氏阳性菌感染如严重金黄色葡萄球菌感染包括心内膜炎等;当替考拉宁药物谷浓度大于60mg/L时中毒风险高。而且不同患者对替考拉宁的吸收和代谢往往表现出很大的个体差异,及时使用相同的药物剂量,不同患者的替考拉宁血药浓度也常差异显著。因此,准确检测替考拉宁血药浓度对于提高个体化用药方案增加药物疗效以及控制替考拉宁药物毒性具有重要的参考价值。
目前,检测替考拉宁血药浓度的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、荧光偏振免疫分析法(FPIA)、微生物法以及胶乳比浊法等。HPLC法能准确测定替考拉宁血药浓度,但是需要对临床样本进行前处理并且HPLC法测定一个样本通常需要近一个小时的时间,效率低下,操作繁琐,不适用于常规的临床检测。荧光偏振免疫分析法由于试剂成本高,临床上很难推广。微生物法需要进行细菌培样14-15h,耗时而且准确度不高。胶乳比浊法需要把抗体偶联到胶乳微球表面,操作复杂,试剂开发耗时费力。
因此,急需提供特异性强、分析速度快、准确度高的替考拉宁检测方法和/或检测试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、分析速度快、准确度高的替考拉宁检测试剂组合。
本发明第一方面,提供了一种替考拉宁检测试剂组合,所述试剂组合包括:
(i)第一测试液,包括替考拉宁-载体蛋白质复合物;和
(ii)第二测试液,包括替考拉宁多抗。
在另一优选例中,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物中,所述载体蛋白选自下组:血清白蛋白、血清γ球蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
在另一优选例中,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物是可溶性的。
在另一优选例中,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物与所述替考拉宁多抗能够结合并产生不可溶复合物。
在另一优选例中,所述第二测试液中不含所述载体蛋白的抗体。
在另一优选例中,待检测的所述替考拉宁选自下组:替考拉宁TA2-1、替考拉宁TA2-2、替考拉宁TA2-3、替考拉宁TA2-4、替考拉宁TA2-5,或其组合。
在另一优选例中,所述替考拉宁多抗选自:替考拉宁TA2-1多抗、替考拉宁TA2-2多抗、替考拉宁TA2-3多抗、替考拉宁TA2-4多抗、替考拉宁TA2-5多抗,或其组合。
在另一优选例中,所述替考拉宁多抗是动物来源的,较佳地,哺乳动物,更佳地,兔子、羊、马、狗或鼠。
在另一优选例中,第一测试液中,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物的浓度为10μg/L-10mg/L,较佳地,50μg/L-5mg/L,更佳地,100μg/L-1mg/L,最佳地,200μg/L-1mg/L。
在另一优选例中,所述替考拉宁多抗以抗血清形式加入所述第二测试液,且第二测试液中,所述抗血清的浓度为0.01-10g/L,较佳地,0.05-5g/L,更佳地,0.1-1g/L,最佳地,0.2-0.5g/L。
在另一优选例中,第一测试液中替考拉宁-载体蛋白质复合物的摩尔浓度与第二测试液中替考拉宁多抗的摩尔浓度之比为1:5-20,较佳地,1:8-15,较佳地,1:9-12。
在另一优选例中,所述第一测试液的溶剂为水或基本为水,较佳地,溶剂中水重量含量≥80%,更佳地,≥90%或≥95%。
在另一优选例中,所述第二测试液的溶剂为水或基本为水,较佳地,溶剂中水重量含量≥80%,更佳地,≥90%或≥95%。
在另一优选例中,所述第一测试液和/或第二测试液还包括促聚剂。
在另一优选例中,所述促聚剂选自:聚乙二醇,较佳地,聚乙二醇35000、20000、12000、10000、8000、6000、4000、2000,或其组合,更佳地,聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000,或其组合。
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述促聚剂含量各自独立地为1-200g/L,较佳地,10-100g/L,更佳地,20-80g/L。
在另一优选例中,所述第一测试液和第二测试液各自独立地还包括:渗透压调节剂、助溶剂、pH调节剂、防腐剂,或其组合。
在另一优选例中,所述渗透压调节剂选自:氯化钠、氯化钾,或其组合。
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述渗透压调节剂含量各自独立地为50-300mmol/L,较佳地,100-200mM。
在另一优选例中,所述防腐剂选自:叠氮钠、Proclin300,硫柳汞、硫酸庆大霉素,或其组合。
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述防腐剂含量各自独立地为0.01-0.2wt%,较佳地,0.02-0.1wt%,更佳地,0.04-0.08wt%,以测试液总重量计。
在另一优选例中,所述助溶剂选自:吐温20、吐温40、吐温60、吐温80,或其组合
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述助溶剂含量各自独立地为0.01-0.2v/v%,较佳地,0.02-0.1v/v%较佳地,0.04-0.08v/v%,以测试液总重量计。
在另一优选例中,所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲溶液,或其组合。
在另一优选例中,所述第一测试液中所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
在另一优选例中,所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液浓度为10-50mmol/L,较佳地,20-40mmol/L,更佳地,25-30mmol/L。
在另一优选例中,所述第一测试液的最终pH值为7-9,较佳地,7-8.5,更佳地,7.5-8.5。
在另一优选例中,所述第二测试液中所述pH调节剂为磷酸盐缓冲液。
在另一优选例中,所述磷酸盐缓冲液浓度为10-80mmol/L,较佳地,30-70mmol/L,更佳地,40-60mmol/L。
在另一优选例中,所述第二测试液的最终pH值为6.5-9,较佳地,7-8.5,更佳地,7-8。
在另一优选例中,所述第一测试液和第二测试液分别放置。
本发明第二方面,提供了一种替考拉宁检测试剂盒,所述试剂盒包括:
如本发明第一方面所述的试剂组合,以及分别容纳所述第一测试液和第二测试液的至少两个容器。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括:替考拉宁校准品。
在另一优选例中,所述替考拉宁校准品为替考拉宁标准品或替考拉宁标准品溶液。
在另一优选例中,所述替考拉宁标准品中替考拉宁含量>wt90%,较佳地,95wt%,更佳地,98wt%,最佳地,99wt%。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括说明书。
本发明第三方面,提供了一种如本发明第一方面所述的试剂组合与本发明第二方面所述的试剂盒的用途,用于制备一试剂盒,所述试剂盒用于通过免疫比浊法检测替考拉宁。
本发明第四方面,提供了一种如本发明第一方面所述的试剂组合的制备方法,包括步骤:
A)制备第一替考拉宁-载体蛋白复合物;
B)使用所述第一替考拉宁-载体蛋白复合物制备第一测试液;
C)制备第二替考拉宁-载体蛋白复合物;和
D)将所述第二替考拉宁-载体蛋白复合物做为免疫原免疫动物获得替考拉宁多抗,并使用所述替考拉宁多抗制备第二测试液;
其中,所述第一替考拉宁-载体蛋白复合物与第二替考拉宁-载体蛋白复合物中的载体蛋白不相同。
在另一优选例中,步骤A)或步骤C)中,所述第一或第二替考拉宁-载体蛋白复合物的制备方法包括步骤:
i)以EDCI或EDCI-NHS活化替考拉宁;和
ii)将活化后的替考拉宁与载体蛋白偶联,获得替考拉宁-载体蛋白复合物。
在另一优选例中,所述活化为活化替考拉宁分子上的羧基。
在另一优选例中,步骤D)中,将所述第二替考拉宁-载体蛋白复合物做为免疫原免疫动物获得替考拉宁多抗,包括步骤:
i)使用替考拉宁-载体蛋白复合物与弗氏完全佐剂的混合溶液对动物进行首次免疫;
ii)然后用替考拉宁-载体蛋白复合物与弗氏不完全佐剂的混合溶液对同一动物进行一次或多次免疫;和
iii)收集抗血清。
在另一优选例中,所述抗血清直接使用或分离出替考拉宁多抗后使用。
在另一优选例中,每次免疫间隔5-15天,较佳地,7-14天。
在另一优选例中,所述动物为哺乳动物,较佳地,兔子、羊、马、狗或鼠。
本发明第五方面,提供了一种检测替考拉宁的免疫抑制比浊法,包括步骤:
1)提供如本发明第一方面所述的试剂组合或本发明第二方面所述的试剂盒;
2)将替考拉宁校准品或样本与第一测试液混合,孵育混合液;和
3)将所述混合液分别与第二测试液混合,测试混匀后初始吸光度A1,孵育一定时间后测试吸光度A2,计算得ΔA=A2-A1。
在另一优选例中,所示检测为定性检测或定量检测。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
将不同浓度的校准品进行步骤(1)-(3),制作浓度-ΔA标准标准曲线,得到标准曲线方程;和
将样本进行步骤(1)-(3),得到ΔA样本,代入所述标准曲线方程,计算得样本中替考拉宁浓度。
在另一优选例中,上述吸光度为在330-350nm处的吸光度,较佳地,335-345nm,更佳地,340nm。
在另一优选例中,步骤2)中,所述孵育的时间为1-10min,较佳地,2-8min,更佳地,3-5min。
在另一优选例中,步骤3)中,所述孵育的时间为1-10min,较佳地,2-8min,更佳地,4-6min。
在另一优选例中,步骤3)中,所述吸光度A1为混合后1-10s时的吸光值,优选地,3-5s。
在另一优选例中,所述孵育的温度为常温,较佳地,10-40℃,更佳地,25-40℃,最佳地,35-38℃。
在另一优选例中,所述标准曲线的浓度范围为0-500mg/L,较佳地,0-200mg/L,更佳地,0-150mg/L,最佳地,0-100mg/L。
在另一优选例中,所述样本选自:全血、血浆、血清。
在另一优选例中,所述方法为非诊断非治疗的。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为替考拉宁结构式;
图2为基于替考拉宁-BSA的校准曲线;
图3为替考拉宁试剂盒与HPLC法测50份临床样本的相关性图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量筛选和测试,提供了一种替考拉宁检测试剂组合。本发明的试剂组合可用于在免疫抑制比浊法检测替考拉宁的浓度,特异性强,分析速度快,准确度高,安全环保。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
替考拉宁、蛋白复合物、多抗
替考拉宁通常为多个化学结构非常相似的化合物组成的抗生素混合物(如图1)。本发明的替考拉宁是指替考拉宁TA2-1、替考拉宁TA2-2、替考拉宁TA2-3、替考拉宁TA2-4、替考拉宁TA2-5中的一种或多种的组合。
相应的,本发明检测的替考拉宁的浓度是指样品中存在的一种或多种的替考拉宁的总浓度(浓度之和)。
术语“替考拉宁-载体蛋白复合物”为一种或多种替考拉宁与载体蛋白复合后的产物,当为多种替考拉宁与载体蛋白复合后的产物的情况下,所述替考拉宁-载体蛋白复合物为混合物。优选地,所述替考拉宁-载体蛋白复合物是可溶性的。
典型地,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物中,所述载体蛋白选自下组:血清白蛋白、血清γ球蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
术语“替考拉宁多抗”是指对替考拉宁TA2-1、替考拉宁TA2-2、替考拉宁TA2-3、替考拉宁TA2-4、替考拉宁TA2-5都存在抗性的一种或多种抗体的组合。且本发明的替考拉宁多抗还能够和替考拉宁-载体蛋白复合物形成免疫复合物。
替考拉宁与替考拉宁-载体蛋白复合物竞争性结合所述替考拉宁多抗,优选地,替考拉宁与替考拉宁多抗结合后形成可溶性复合物,而替考拉宁-载体蛋白复合物与所述替考拉宁多抗结合后产生不可溶性复合物。优选地,所述替考拉宁多抗不与单独的载体蛋白发生复合。
优选地,所述替考拉宁多抗选自:替考拉宁TA2-1多抗、替考拉宁TA2-2多抗、替考拉宁TA2-3多抗、替考拉宁TA2-4多抗、替考拉宁TA2-5多抗,或其组合。
在另一优选例中,所述替考拉宁多抗是动物来源的,较佳地,哺乳动物,更佳地,兔子、羊、马、狗或鼠。
替考拉宁检测试剂组合、试剂盒
一种替考拉宁检测试剂组合,所述试剂组合包括:(i)第一测试液,包括替考拉宁-载体蛋白质复合物;和(ii)第二测试液,包括替考拉宁多抗。
在另一优选例中,第一测试液中,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物的浓度为10μg/L-10mg/L,较佳地,50μg/L-5mg/L,更佳地,100μg/L-1mg/L,最佳地,200μg/L-1mg/L。
在另一优选例中,所述替考拉宁多抗以抗血清形式加入所述第二测试液,且第二测试液中,所述抗血清的浓度为0.01-10g/L,较佳地,0.05-5g/L,更佳地,0.1-1g/L,最佳地,0.2-0.5g/L。
在另一优选例中,第一测试液中替考拉宁-载体蛋白质复合物的摩尔浓度与第二测试液中替考拉宁多抗的摩尔浓度之比为1:5-20,较佳地,1:8-15,较佳地,1:9-12。
在另一优选例中,所述第一测试液的溶剂为水或基本为水。
在另一优选例中,所述第一测试液和/或第二测试液还包括促聚剂。
典型地,所述促聚剂选自:聚乙二醇,较佳地,聚乙二醇35000、20000、12000、10000、8000、6000、4000、2000,或其组合,更佳地,聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000,或其组合。
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述促聚剂含量各自独立地为1-200g/L,较佳地,10-100g/L,更佳地,20-80g/L。
在另一优选例中,所述第一测试液和第二测试液各自独立地还包括:渗透压调节剂、助溶剂、pH调节剂、防腐剂,或其组合。
所述渗透压调节剂用于调节测试液的渗透压。渗透压调节剂的选择没有特别要求,如选用各种无机盐。优选地,渗透压调节剂选自:氯化钠、氯化钾,或其组合。渗透压调节剂浓度优选将稀释液调节至接近人血浆渗透压,如接近生理盐水的浓度。
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述渗透压调节剂含量各自独立地为50-300mmol/L,较佳地,100-200mM。
所述防腐剂用于抗菌防霉,防止微生物(如细菌或霉菌)对药物分子的分解和/或对测试液的污染,可延长测试液的存储时间。
本发明的测试液对防腐剂没有特别的要求,可采用本领域常用的防腐剂,优选的防腐剂选自:叠氮钠、Proclin300,硫柳汞、硫酸庆大霉素,或其组合。
在另一优选例中,所述助溶剂选自:吐温20、吐温40、吐温60、吐温80,或其组合
在另一优选例中,第一测试液和/或第二测试液中,所述助溶剂含量各自独立地为0.01-0.2v/v%,较佳地,0.02-0.1v/v%较佳地,0.04-0.08v/v%,以测试液总重量计。
本发明的对pH调节剂没有特别的要求,可采用本领域常用的pH调节剂,将测试液的pH保持在一定范围内。典型地,所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲溶液,或其组合。
在另一优选例中,所述第一测试液的最终pH值为7-9,较佳地,7-8.5,更佳地,7.5-8.5。
在另一优选例中,所述第二测试液的最终pH值为6.5-9,较佳地,7-8.5,更佳地,7-8。
根据本发明试剂组合的使用方法,使用前所述第一测试液和第二测试液分别放置,使用时混合。
本发明的试剂组合还可制成替考拉宁检测试剂盒,上述试剂盒包括上述试剂组合。
在另一优选例中,所述试剂盒还包括:替考拉宁校准品。
制备方法
本发明还提供了所述的试剂组合的制备方法,包括步骤:
A)制备第一替考拉宁-载体蛋白复合物;
B)使用所述第一替考拉宁-载体蛋白复合物制备第一测试液;
C)制备第二替考拉宁-载体蛋白复合物;和
D)将所述第二替考拉宁-载体蛋白复合物做为免疫原免疫动物获得替考拉宁多抗,并使用所述替考拉宁多抗制备第二测试液;
其中,所述第一替考拉宁-载体蛋白复合物与第二替考拉宁-载体蛋白复合物中的载体蛋白不相同。
在另一优选例中,步骤A)或步骤C)中,所述第一或第二替考拉宁-载体蛋白复合物的制备方法包括步骤:
i)以EDCI或EDCI-NHS活化替考拉宁;和
ii)将活化后的替考拉宁与载体蛋白偶联,获得替考拉宁-载体蛋白复合物。
在另一优选例中,所述活化为活化替考拉宁分子上的羧基。
在另一优选例中,步骤D)中,将所述第二替考拉宁-载体蛋白复合物做为免疫原免疫动物获得替考拉宁多抗,包括步骤:
i)使用替考拉宁-载体蛋白复合物与弗氏完全佐剂的混合溶液对动物进行首次免疫;
ii)然后用替考拉宁-载体蛋白复合物与弗氏不完全佐剂的混合溶液对同一动物进行一次或多次免疫;和
iii)收集抗血清。
在另一优选例中,所述抗血清直接使用或分离出替考拉宁多抗后使用。
在另一优选例中,每次免疫间隔5-15天,较佳地,7-14天。
在另一优选例中,所述动物为哺乳动物,较佳地,兔子、羊、马、狗或鼠。
免疫抑制比浊法检测替考拉宁
检测过程中,样本中的替考拉宁小分子与试剂中的替考拉宁-载体蛋白复合物竞争结合替考拉宁多抗,样本中的替考拉宁浓度越高,替考拉宁多抗被其结合的程度越大,替考拉宁-载体蛋白复合物与替考拉宁多抗结合引发的免疫复合物形成的浊度程度就越低,反应体系浊度大小与样本中的替考拉宁浓度呈负相关,通过测定一定波长(如340nm)处的吸光度,建立校准曲线,从而通过样本吸光度测定值,计算样本中替考拉宁的浓度。
典型地,检测替考拉宁的免疫抑制比浊法,包括步骤:
1)提供如本发明第一方面所述的试剂组合或本发明第二方面所述的试剂盒;
2)将替考拉宁校准品或样本与第一测试液混合,孵育混合液;和
3)将所述混合液分别与第二测试液混合,测试混匀后初始吸光度A1,孵育一定时间后测试吸光度A2,计算得ΔA=A2-A1。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
将不同浓度的校准品进行步骤(1)-(3),制作浓度-ΔA标准标准曲线,得到标准曲线方程;和
将样本进行步骤(1)-(3),得到ΔA样本,代入所述标准曲线方程,计算得样本中替考拉宁浓度。
在另一优选例中,上述吸光度为在330-350nm处的吸光度,较佳地,335-345nm,更佳地,340nm。
在另一优选例中,步骤2)中,所述孵育的时间为1-10min,较佳地,2-8min,更佳地,3-5min。
在另一优选例中,步骤3)中,所述孵育的时间为1-10min,较佳地,2-8min,更佳地,4-6min。
在另一优选例中,步骤3)中,所述吸光度A1为混合后1-10s时的吸光值,优选地,3-5s。
在另一优选例中,所述孵育的温度为常温,较佳地,10-40℃,更佳地,25-40℃,最佳地,35-38℃。
在另一优选例中,所述标准曲线的浓度范围为0-500mg/L,较佳地,0-200mg/L,更佳地,0-150mg/L,最佳地,0-100mg/L。
在另一优选例中,所述样本选自:全血、血浆、血清。
本发明的主要优点包括:
1.本发明的替考拉宁检测试剂原料简单易得,成本低、稳定性好、均一性好。
2.本发明的替考拉宁检测试剂组合特异性强,检测结果准确度高,操作简单、快速、可提高检测效率,且检测产生的废液少,更加环保安全。
3.本发明的替考拉宁试剂组合可与全自动生化分析仪联合使用,实现自动化分析,适用于大规模样本的及时准确检测。
下面结合具体实施,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
试剂
缩略词说明:
BSA:牛血清白蛋白;
KLH:钥孔血蓝蛋白;
EDCI:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride;
NHS:N-羟基琥珀酰亚胺1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione;
PBS:磷酸盐缓冲液。
实施例1
替考拉宁-载体蛋白复合物的合成
替考拉宁-BSA复合物的制备
称取20mg替考拉宁溶于10mL 0.1M PBS(pH 8.0)中,加入10mg EDCI和50mg NHS,室温下搅拌反应1小时,使替考拉宁的羧基完全活化。然后分批缓慢加入100mg BSA,室温下磁搅拌反应16小时。以0.45μm的滤膜过滤,交联后产物经超滤或透析纯化,得到替考拉宁-BSA复合物。
实施例2
替考拉宁-KLH复合物的制备
与实施例1基本相同,不同之处在于用KLH替代BSA,制备替考拉宁-KLH复合物。
实施例3
替考拉宁多抗的制备
取实施例1合成得到的替考拉宁-BSA复合物,去免疫兔子。兔子选用新西兰大白兔,按照每只兔子0.5mg替考拉宁-BSA复合物与等体积弗氏完全佐剂混合充分,对新西兰大白兔进行皮下多点注射。每隔两个礼拜进行下一次免疫,首次免疫之后佐剂选用弗氏不完全佐剂,第四次免疫之后一个礼拜,进行兔子颈动脉放血收集全血。将血液置室温中凝固约1h,然后置4℃过夜,使血块收缩。2500g离心10分钟,弃沉淀收集血清,即得替考拉宁兔抗血清(兔多抗)。
根据本发明,若测试液R1中添加的是替考拉宁-BSA复合物,则测试液R2中的替考拉宁多抗就不能是替考拉宁-BSA复合物免疫的,应该是用另一种载体蛋白偶联的复合物免疫得到的多抗。这样做是因为替考拉宁-BSA复合物免疫得到的多抗有可能还有抗BSA的抗体,如果测试液R2用替考拉宁-BSA复合物免疫得到的多抗,这样信号值有一部分是抗BSA的抗体与替考拉宁-BSA复合物引起的结果,不完全是抗替考拉宁多抗与替考拉宁-BSA复合物引起的结果。
实施例4
使用常规溶液配制方法,根据表1制备测试液R1,百分比以测试液R1总重量计:
表1
实施例5
使用常规溶液配制方法,根据表2制备测试液R2,百分比以测试液R2总重量计,其中替考拉宁多抗用量指实施例3所得抗血清直接使用的用量。
表2
磷酸氢二钠 | 50mM |
磷酸二氢钠 | 50mM |
氯化钠 | 150mM |
替考拉宁多抗 | 0.3g/L |
吐温20 | 0.05%(v/v%) |
叠氮钠 | 0.05%(wt%) |
pH | 7.4 |
实施例6
校准品:
替考拉宁小分子用校准品测试液(磷酸盐缓冲液30mM、氯化钠150mM、吐温200.05%、叠氮钠0.05%)溶解并稀释成0、6.25、12.5、25、50、100mg/L的浓度。然后用0.22μm的滤膜过滤除菌,放置2~8℃保存。
实施例7
方法学验证
检测过程中,样本中的替考拉宁小分子与试剂中的替考拉宁-载体蛋白复合物竞争结合替考拉宁多抗,样本中的替考拉宁浓度越高,替考拉宁多抗被其结合的程度越大,替考拉宁-载体蛋白复合物与替考拉宁多抗结合引发的免疫复合物形成的浊度程度就越低,反应体系浊度大小与样本中的替考拉宁浓度呈负相关(即浊度越小替考拉宁浓度越高),通过测定340nm处的吸光度,建立校准曲线,计算血浆样本中替考拉宁的浓度。
表3 7080型日立全自动生化分析仪实验参数
波长 | 340nm/无(主/副) | 标本 | 6μL | 反应方向 | 两点终点法 |
比色杯光径 | 1cm | R1 | 180μL | 校准类型 | Spline |
反应温度 | 37℃ | R2 | 60μL | 反应方向 | 向下 |
检测过程中各试剂用量如表4:
表4试剂用量
校准品 | 测定 | |
校准品 | 6μL | - |
样本 | - | 6μL |
R1 | 180μL | 180μL |
R2 | 60μL | 60μL |
向校准液中加入上述测试液R1,37℃孵育5分钟,然后加入测试液R2,37℃孵育5秒,在一定波长下测定样本吸光度A1;继续37℃孵育5分钟,然后在上述波长下测定吸光度A2,计算ΔA=A2-A1;总共测定了六组校准液浓度值(0、6.25、12.5、25、50、100mg/L)与对应的校准液的吸光度值ΔA进行非线性拟合,得到拟合方程即为校准曲线。用同样的方法测定血浆样本的吸光度值ΔA。将测试血浆样本得到的吸光度值ΔA代入上述拟合方程,计算所得到的浓度值即为样本中替考拉宁的含量。
实施例8
相关性实验:
根据实施例1-6得到的试剂,和实施例7所示的方法,对50份天津第一人民医院(HPLC法)具有替考拉宁测值的血浆样本与本发明所述方法进行替考拉宁含量测定进行对照性测定,结果如图3所示。结果显示本发明准确度高,与HPLC方法一致性很高,相关性系数r=0.982(y=0.9001x+2.1788),说明本发明的替考拉宁试剂组合能满足临床性能要求(一般地,相关性r>0.975就认为满足临床要求)。
综上所述,本发明的试剂组合在满足替考拉宁检测的准确性要求的基础上,本试剂组合能专一的测定替考拉宁,而不受其他物质的影响,特异性强,还具有检测成本低、检测速度快、操作简便的优点,可满足自动化分析的要求(如可与全自动生化分析仪等仪器联合使用,实现自动化分析),适用于大规模样本的及时准确检测,且与HPLC方法相比,本发明的试剂组合在检测过程中产生的废液很少,更加环保安全。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种替考拉宁检测试剂组合,其特征在于,所述试剂组合包括:
(i)第一测试液,包括替考拉宁-载体蛋白质复合物;和
(ii)第二测试液,包括替考拉宁多抗。
2.如权利要求1上述的检测试剂组合,其特征在于,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物中,所述载体蛋白选自下组:血清白蛋白、血清γ球蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白或钥孔血蓝蛋白。
3.如权利要求1上述的检测试剂组合,其特征在于,待检测的所述替考拉宁选自下组:替考拉宁TA2-1、替考拉宁TA2-2、替考拉宁TA2-3、替考拉宁TA2-4、替考拉宁TA2-5,或其组合。
4.如权利要求1上述的检测试剂组合,其特征在于,第一测试液中,所述替考拉宁-载体蛋白质复合物的浓度为10μg/L-10mg/L,较佳地,50μg/L-5mg/L,更佳地,100μg/L-1mg/L,最佳地,200μg/L-1mg/L。
5.如权利要求1上述的检测试剂组合,其特征在于,所述替考拉宁多抗以抗血清形式加入所述第二测试液,且第二测试液中,所述抗血清的浓度为0.01-10g/L,较佳地,0.05-5g/L,更佳地,0.1-1g/L,最佳地,0.2-0.5g/L。
6.如权利要求1上述的检测试剂组合,其特征在于,所述第一测试液和/或第二测试液还包括促聚剂。
7.如权利要求1上述的检测试剂组合,其特征在于,所述第一测试液和第二测试液各自独立地还包括:渗透压调节剂、助溶剂、pH调节剂、防腐剂,或其组合。
8.一种替考拉宁检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:如权利要求1所述的试剂组合,以及分别容纳所述第一测试液和第二测试液的至少两个容器。
9.一种如权利要求1所述的试剂组合的制备方法,包括步骤:
A)制备第一替考拉宁-载体蛋白复合物;
B)使用所述第一替考拉宁-载体蛋白复合物制备第一测试液;
C)制备第二替考拉宁-载体蛋白复合物;和
D)将所述第二替考拉宁-载体蛋白复合物做为免疫原免疫动物获得替考拉宁多抗,并使用所述替考拉宁多抗制备第二测试液;
其中,所述第一替考拉宁-载体蛋白复合物与第二替考拉宁-载体蛋白复合物中的载体蛋白不相同。
10.一种检测替考拉宁的免疫抑制比浊法,包括步骤:
1)提供如本权利要求1所述的试剂组合或权利要求8所述的试剂盒;
2)将替考拉宁校准品或样本与第一测试液混合,孵育混合液;和
3)将所述混合液分别与第二测试液混合,测试混匀后初始吸光度A1,孵育一定时间后测试吸光度A2,计算得ΔA=A2-A1。
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