JPH11507437A

JPH11507437A - 準ゼプトモルの量の分析物を検出または定量化するための光学的トラップ

Info

Publication number: JPH11507437A
Application number: JP9502148A
Authority: JP
Inventors: ヘイヤムウェートール，ハワード; ピーターヘルマーソン，クリスチアン; バクルーキショアー，ロニ
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-29
Also published as: WO1996041154A1; AU6271996A; US5620857A; CA2223576A1; EP0871861A4; EP0871861A1; CA2223576C

Abstract

(57)【要約】レーザー光のぴったりと焦点の合ったビームが４．５μｍの程度の直径を有するガラスまたはラテックスの微小球のような極性化可能な対象物を捕獲し且つ操作するための“光学的ピンセット”として使用される。分析物が該微小球に接着することが可能であるときに、少量のこれらの分析物が取り扱われることが出来、かくして分析物の量および濃度が極度に小さいときでさえ、それらの検出および定量化が可能にする。例示的例は抗体−抗原結合を破るのに必要とされる強度の測定およびＤＮＡ配列の検出を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】準ゼプトモルの量の分析物を検出または定量化するための光学的トラップ発明の分野この発明は光学的捕獲（トラップ）により、核酸、（可溶性あるいは細菌またはウィルスの成分としての）抗原、抗体、受容分子、レクチンおよび他の結合対（たんぱく質、炭水化物、有機分子、等）を包含する分析物の準ゼプトモル（ｓｕｂ−ｚｅｐｔｍｏｌａｒ）の量を検出するための方法および装置に向けられている。発明の背景レーザー光のぴったりと焦点を合わされたビームは、極性化可能な対象物を捕獲しそして遠隔的に取り扱うために使用されることができる。ミクロン寸法範囲のラテックスおよびガラス球のような肉眼的な、極性化可能な対象物並びに２０ｎｍ〜１００ミクロンの寸法範囲のウィルス、細菌、酵母および原生動物のような生物学的物質を捕獲することができるその様な装置はまた、最初は原子の捕獲のために提案されている。非侵襲的な捕獲およびそのような対象物の取扱は、そのような装置のために名称“光学的ピンセット（ｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ）”に導いた。光学的ピンセットについての基本的原理は、周囲の媒体より大きい屈折率を有する透明な物質が光強度グラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）に置かれるときに、それ自体現れる光のグラジエント力である。光が極性化可能な対象物中を通過するにつれて、それは物質中でゆらいでいる双極子（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇｄｉｐｏｌｓ）を誘導する。これらの双極子は電磁界グラジエントと相互作用し、光のより明るい領域の方に向けられた力を生ずる。したがって，光照射野の局所最大であるレーザービームの焦点に対象物は引き入れられる。典型的には、捕獲力の強度が光の強さに比例するように（波長の位数で）レーザービームの焦点が固定された状態でいる。光学的ピンセットの一層の有意義な適用の一つは張力計としてである。光学的ピンセットを用いて引っ張ることにより、細菌べん毛の捻転順応性（ｔｏｒｓｉｏｎａｌｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）のような或る種の生体分子の相互作用に伴う力あるいはミオシンおよびキネシンのような単一運動分子の力を測定することができる。後者の場合において、キネシン分子は、平均して１つだけの分子が微小管に接触するような十分に希薄な表面被覆量でミクロン寸法のシリカビーズに付着された。光学ピンセットを用いて引っ張るためのハンドルとしてシリカビーズを用いて、単一のキネシン分子により発揮された力が観察された。この業界において使用される装置および他の関連する研究の例が以下の文献において示される：１９９０年１月１６日付けのＡｓｈｋｉｎ等への米国特許第４，８９３，８８６号；１９９２年３月３１日付けのＢｕｉｃａｎ等への米国特許第５，１００，６２７号；Ｍｏｌｌｏｙ，Ｊ．Ｅ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｅ．、Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｃ．、Ｔｒｅｇｅａｒ，Ｒ．Ｔ．による、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．４（１９９５）ｐ．２９８における“Ｓｉｎｇｌｅ−ＭｏｌｅｃｕｌｅＭｅｃｈａｎｉｃｓｏｆＨｅａｖｙＭｅｒｏｍｙｏｓｉｎａｎｄＳｌＩｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＲａｂｂｉｔｏｒＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＡｃｔｉｎｓＵｓｉｎｇＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．、Ｍｉｙａｔａ，Ｈ．、ＹｏｓｈｉｋａｗａＨ．、Ｉｓｈｉｗａｔａ，Ｓ．による、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．４（１９９５）ｐ．７５における“ＭｅｃｈａｎｉｃａｌＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳｉｎｇｌｅＰｒｏｔｅｉｎＭｏｔｏｒｏｆＭｕｓｃｌｅＳｔｕｄｉｅｄｂｙＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｋｕｏ，Ｓ．Ｃ．、Ｒａｍａｎａｔｈａｎ、Ｋ．、Ｓｏｒｇ，Ｂ．によるＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．４（１９９５）ｐ．７４における“ＳｉｎｇｌｅＫｉｎｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌｅｓＳｔｒｅｓｓｅｄｗｉｔｈＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ａｍｏｓ，Ｇ．、Ｇｉｌｌ，Ｐ．によるＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｙ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．２（１９９５）ｐ．２４８における“ＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｈ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｏ．、Ｓｃｈｌｉｗａ，Ｍ．によるＡｐｐｌｉｅｄＯｐｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６（１９９５）ｐ．９７７における“ＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｆｏｒｃｅｓｉｎＯｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｌｉａｎｇ，Ｈ．、ＷｒｉｇｈｔＷ．Ｈ．、Ｒｉｅｄｅｒ，Ｃ．Ｌ．、Ｓａｌｍｏｎ，Ｅ．Ｄ．によるＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２１３，Ｎｏ．１（１９９４）ｐ．３０８における“ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｏｖｅｍｅｎｔｏｆＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＡｒｍｓａｎｄＦｒａｇｍｅｎｔｓｉｎＭｉｔｏｔｉｃＮｅｗｔＬｕｎｇＣｅｌｌｓＵｓｉｎｇＯｐｔｉｃａｌＳｃｉｓｓｏｒｓａｎｄＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｈ．、Ｓｏｎｅｋ，Ｇ．Ｊ．、Ｂｅｒｎｓ，Ｍ．Ｗ．によるＡｐｐｌｉｅｄＯｐｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．９（１９９４）ｐａｇｅ１７３５における“Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｆｏｒｃｅｓｏｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｈｅｌｄｂｙｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｈ．、Ｓｏｎｅｋ，Ｇ．Ｊ．、Ｂｅｒｎｓ，Ｍ．Ｗ．によるＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｓｉｃｓＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．６３Ｎｏ．６（１９９３），Ｐ．７１５における“Ｒａｄｉａｔｉｏｎｔｒａｐｐｉｎｇｆｏｒｃｅｓｏｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｉｔｈｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｋｕｏ，Ｓ．Ｃ．、Ｓｈｅｅｔｚ，Ｍ．Ｐ．によるＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６０，Ｎｏ．５１０５（１９９３），ｐ．２３２における“ＦｏｒｃｅｏｆＳｉｎｇｌｅＫｉｎｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌｅｓＭｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｂｌｏｃｋ，Ｓ．Ｍ．によるＮａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６０，Ｎｏ．６４０３（１９９２），ｐ．４９３における“Ｍａｋｉｎｇｌｉｇｈｔｗｏｒｋｗｉｔｈｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｈｏｎｇ，Ｌ．、ＷｒｉｇｈｔＷ．Ｈ．、Ｗｅｉ，Ｈ．、Ｂｅｒｎｓ，Ｍ．Ｗ．の、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９７，Ｎｏ．１（１９９１），ｐｐ．２１−３５における“ＭｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＭｉｔｏｔｉｃＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｉｎＰＴＫｓｕｂ２ＣｅｌｌｓＵｓｉｎｇＬａｓｅｒ−ＩｎｄｕｃｅｄＯｐｔｉｃａｌＦｏｒｃｅｓ（‘ＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ’），”；ＩＥＥＥＭｉｃｒｏ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．４（１９９３），ｐｐ．８８− ８９における“Ａｔｏｍｉｃｆｏｕｎｔａｉｎｓ；ｌａｓｅｒｔｗｅｅｚｅｒｓ；ｏｐｔｉｃａｌｍｏｌａｓｓｅｓ，”；Ｂｌｏｃｋ，Ｓ．Ｍ．によるＭｏｄｅｒｎＣｅｌｌＢｉｏ１ｏｇｙ，Ｖｏｌ．９（１９９０），ｐ．３７５における“１５．ＯｐｔｉｃａｌＴｗｅｅｚｅｒｓ”；Ｄａｉ，Ｊ．、Ｓｈｅｅｔｚ，Ｍ．Ｐ．によるＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．３（１９９５），ｐ．９８８における“Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｎｅｕｒｏｎａｌｇｒｏｗｔｈｃｏｎｅｍｅｍｂｒａｎｅｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｔｅｔｈｅｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈｌａｓｅｒｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ”；Ａｆｚａｉ，Ｒ．Ｓ．、Ｒｒｅａｃｙ，Ｅ．Ｂ．によるＲｅｖｉｅｗｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．４（１９９３），ｐｐ．２１５７−２１６３における“Ｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓｕｓｉｎｇａｄｉｏｄｅｌａｓｅｒ”；Ａｓｈｋｉｎ，Ａ．によるＰｈｙｓｉｃａｌＲｅｖｉｗＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４０（１９７８），ｐｐ．７２９−２３２における“Ｔｒａｐｐｉｎｇｏｆａｔｏｍｓｂｙｒｅｓｏｎａｎｃｅｒａｄｉａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅ”；Ａｓｈｋｉｎ，Ａ．、Ｄｚｉｅｄｚｉｃ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｊｏｒｋｈｏｌｍ，Ｊ．Ｅ．、Ｃｈｕ，Ｓ．によるＯｐｔｉｃｓＬｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１１，（１９８６），ｐｐ．２８８−２９０における“Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆａｓｉｎｇｌｅ−ｂｅａｍｇｒａｄｉｅｎｔｆｏｒｃｅｏｐｔｉｃａｌｔｒａｐｆｏｒｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓ”；Ａｓｈｋｉｎ，Ａ．、Ｄｚｉｅｄｚｉｃ，Ｊ．Ｍ．、Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．によるＮａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３０（１９８７），ｐｐ．７６９−７７１の、“Ｏｐｔｉｃａｌｔｒａｐｐｉｎｇａｎｄｍｉｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｉｎｆｒａｒｅｄｂｅａｍｓ”：Ａｓｈｋｉｎ，Ａ．、Ｄｚｉｅｄｚｉｃ，Ｊ．Ｍ．によるＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３５（１９８７），ｐｐ．１５１７−１５２０における“Ｏｐｔｉｃａｌｔｒａｐｐｉｎｇａｎｄｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｂａｃｔｅｒｉａ”；Ｂｌｏｃｋ，Ｓ．Ｍ．、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｓ．Ｂ．、Ｓｃｈｎａｐｐ，Ｂ．Ｊ．によるＮａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４８（１９９０），ｐｐ．３４８− ３５２における“Ｂｅａｄｍｏｖｅｍｅｎｔｂｙｓｉｎｇｌｅｋｉｎｅｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌｅｓｓｔｕｄｉｅｄｗｉｔｈｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓ”。これらの文献の開示はそれらの全体において参照することによりこの明細書に組み入れられる。発明の概要本発明の目的は、核酸、抗原および抗体、受容体およびレクチンのような分析物の微小量を検出しそして定量化するための装置および方法を提供することである。本発明の追加の目的は、それらが非常に低い濃度にある場合のその様な微小量を検出しそして定量化するための装置および方法を提供することである。これらのおよびし他の目的のために、本発明は、その方法が以下の工程：レーザー光のビームを放射するためのレーザー光源を用意し；第１体および第２体を用意し、その第１体および第２体の少なくとも１つはレーザー光のビームにより操作されるのに適合されており；第１体に分析物を接着させ；分析物と反応性である試薬を第２体に接着させ；該分析物と該試薬との間で反応を起こさせるのに十分に近接した状態に第１体と第２体とをもたらし；レーザー光のビームの使用により第１体と第２体とを分離させ：該分離工程を行うのに必要とする力を測定し；そして該測定工程において測定された力から該分析物の量を決定する、工程を包含する少量の分析物を検出しそして定量化する方法を包含する、分析物を検出しそして定量化する方法を包含する。本発明は、また少量の分析物を検出しそして定量化するための装置を包含し、その装置は以下の構成要素を含む：レーザー光のビームを放射するためのレーザー光源；第１体および第２体（それらの第１体および第２体の少なくとも１つはレーザー光のビームの通路に配置されておりそしてレーザー光のビームにより操作されるのに適合されている）；第１体への分析物の接着を生じさせるための手段；分析物と反応性である試薬（その試薬は第２体に接着されている）：分析物と試薬とが反応した後に、レーザー光のビームの使用により、第１体と第２体とを分離させるための手段；該分離のための手段が第１体と第２体とを分離させるために発揮しなければならない力を測定するための手段；および該力に基づいて分析物の量を計算するための手段。それらの実験において、本出願人は、４．５ミクロンのラテックス球を抗原で被覆した。ハンドルとしてそのラテックス球を用いて、光学的ピンセットで抗原分子を引っ張ることが可能である。トラップ（ｔｒａｐ）中に球を引き入れそして抗原とガラスカバースリップ上に被覆された非特異性たんぱく質または特異性抗体のいずれかとの間の結合を破るのに必要とされる平均の最小のレーザーの力が測定された。得られた実験データは、次の非特異的結合ケースに対して特異性抗原／抗体結合を破るのに一層大きいレーザー力、したがって一層大きい力が必要とされたことを示した。これは、本発明者が単一の抗原／抗体結合を測定した水準でさえ、数位数の抗原濃度にわたって観察された。同様に、この同じ方法はラテックス粒子およびガラススライド上の相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡプローブの相互い作用について行われることが出来た。ビーズ上の抗原またはＤＮＡ配列と、添加サンプル中の同様な物質との間で競合性状態を開始することにより、この技術を用いて感受性のある検定が開発された。これら成分はガラススライドに付着された結合用成分を競合する。この明細書を検討した当業者は、たんぱく質、有機分子、受容体、および核酸配列についての非常に鋭敏なアッセイがこの技術を用いて可能であることを容易に認識するだろう。このアッセイは、細菌、ウィルスおよび細胞成分のような特定の抗原を検出することが当業者にまた、明らかであろう。当業者は、特定の分析物についてのアッセイの最適化の際に達成できる一層鋭敏な定量化とともに、このアッセイが或る位数の大きさ内で分析物を定量化することが可能であることをさらに認識するだろう。この技術は疾患特異性抗原、抗体または核酸配列の検出により、感染性疾患の検出のための主要な適用を見い出すであろう。それはまた、ＰＣＲ、ＤＮＡプローブ技術または免疫学的検出法により現在検出できるが、しかしほんの２、３の分子の水準で検出できる任意の他の成分の検出に適用を見い出すであろう。図面の簡単な記載さて、本発明の好ましい態様が図面に関連して一層詳細に記載されるだろう。図面において：図１は、本発明に従う装置の概要図を示し、そして図２は、本発明に従う、ガラスカバースリップ上の一定の抗体（Ａｂ）濃度とともに、ＢＳＡの減少させていく濃度でのＢＳＡ（６７，０００平均分子量）で被覆されたビーズを用いる滴定濃度曲線（ＴｉｔｅｒＣｕｒｖｅ）実験においてＢＳＡ被覆ビーズを捕獲するのに必要とされる力の棒グラフである。図３は、ビーズ当たりの抗原分子の平均数に対する、ＢＳＡ被覆ビーズを捕獲するのに必要とされる力を示すために再計算された図２のデータの棒グラフである。図４は、ガラスカバースリップに抗体をカップリングさせるために混合シランを用いて特異性および非特異性結合成分を有するＢＳＡ被覆ビーズを捕獲するのに必要とされる力の棒グラフである。図５は、ビーズ上に固定された抗原の２種の濃度で、固定化抗体／抗原ビーズに対する可溶性抗原の競合性結合の変位曲線を示すグラフである。好ましい態様の詳細な記載本発明に従う装置が図１に示される。この図は概要図を示しそして縮尺製図するようには描かれていない。図１において見ることができるように、レーザー３のようなレーザー光源からの焦点の合ったビームおよびビーズ７を捕獲するためのレンズ５を使用する。レーザーは可視スペクトルまたは赤外スペクトル内で作動するであろう。好ましい可視光線周波数は３７５〜８００オングストロームであろう。赤外周波数は８００〜２５００オングストロームであろう。ビーズの寸法は直径において約０．５ μ〜約１０００μであってよい。また、ビーズは、装置の操作中にビーズの加熱を防止するためにレーザービームの波長を吸収しない材料からなるべきである。ビーズは可動手段９のコントロール下にレーザーとともに移動されることができる。ビーズを移動させるために必要とされる力は力測定用手段１１により測定される。測定された力は、下に一層詳細に説明されるように、分析物の存在および量を決定するためにその測定された力を使用する、計算手段１３に出力される。ビーズおよびガラスカバースリップのような第２体１５はウェル１７中に置かれている分析物を含有する溶液にさらされる。溶液の好ましくない加熱を防止するために、溶液はレーザービームの波長を吸収すべきでない。装置の操作中溶液の望ましくない加熱を防止するために溶液はレーザービームの波長を吸収すべきではない。ガラスカバースリップは分析物と反応する試薬の分子（図示せず）をそれに接着させて有する。分析物の分子（図示せず）は、好ましくは第２の試薬（図示せず）を有する、ビーズに接着させる。分析物を試薬と反応させそして次にガラスカバースリップからビーズを分離させるために必要とされる力を測定することにより、分析物の量が測定されることができる。さて、本発明は以下の例示的例に関連して、さらに詳細に記載される。例１：抗体被覆ガラスカバースリップの製造１０％硝酸中で予め沸騰されそして蒸留水中で洗浄されたガラスカバースリップを、ガラス表面上に予め付着されたシランカップリング剤によりマウス単クローン抗−ＢＳＡまたは非特異性抗体にカップリングさせた。固定化された抗体を含有するカバースリップを洗浄して非結合抗体を除去しそして追加の使用まで適当な条件下貯蔵させることが出来た。ガラスカバースリップへの抗原被覆ビーズの非特異的結合を減少させるために、カバースリップはたんぱく質のカップリングのために官能化されたシランを含む混合シラン溶液を用いて造られるのが好ましい。そのような薬剤は当業界において周知である。カバースリップを造るこの好ましい方法は例１Ａに一層詳細に記載される。例１Ａ：抗体の共有カップリングのためのカバースリップの製造ガラスカバースリップは１時間１０％硝酸中で沸騰させることにより清浄化されそして洗浄水が中性ｐＨを有するまで蒸留水中で洗浄された。清浄化されたカバースリップは５０％の４−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ）および５０％のオルト珪酸テトラメチルを含有し、ｐＨ４．０である混合シラン溶液中に浸漬されそして次に室温で乾燥された。次にそれらを９０分間、１１０℃で真空オーブン中で加熱した。得られた被覆カバースリップは次に抗体の共有結合のために使用された。ガラスカバースリップへの抗原の非特異的結合における減少は図４におけるデータを図２と比較することにより見られる。例２：ＢＳＡ被覆ラテックスビーズの製造カルボキシル基を担持する、（直径において約０．５μ〜約１００μに変化させての）ポリスチレンビーズが水溶性カルボジイミドを用いてＢＳＡにカップリングされた。カップリングされた量は１．４９ｘ１０^-5Ｍから１．４９ｘ１０^-15Ｍの最終濃度までに１０回段階で減少された。これらのビーズを洗浄してカップリングされていないＢＳＡを除き、そして使用するまで、０．０５Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）中に貯蔵した。例３：単一の抗原／抗体結合の検出（例２からの）抗原被覆ラテックスビーズを（例１または例１Ａからの）抗体 −被覆カバースリップ上に置きそしてビーズを光学的に捕獲するために必要とされる力を測定した。抗原／抗体対は、特異性結合対を表すためのＢＳＡ／抗−ＢＳＡであるかあるいは非特異性対照としてＢＳＡ／非特異性の免疫グロブリンのいずれかであった。各々の抗原の濃度で、最小の１０のビーズが試験された。結果は図２〜４において示される。図４において見ることができるように、ＢＳＡ／抗−ＢＳＡアッセイにおいてＢＳＡ被覆ビーズを動かすために必要とされる力についての平均値は非特異性対照アッセイにおいて必要とされる値より大きかった。したがって、一定のＢＳＡ濃度でのＢＳＡ／抗−ＢＳＡの力の値と対照の力の値との間の特定の差は、そのＢＳＡ濃度での特定の抗原−抗体結合を破るのに必要とされる力を表し、ビーズ当たり１つのＢＳＡ分子を表すＢＳＡの濃度での特定の差（図３と図４とを比較せよ）は単一の、特定の抗原／抗体結合を破るのに必要とされる力を表す。特定の抗原−抗体結合を検出するための能力はまた、ＢＳＡ／抗体−ＢＳＡを、他の非特定的対照、即ちＢＳＡ／シラン、非被覆ビーズ／抗−ＢＳＡそしてＢＳＡ／非常に過剰なＢＳＡで予め処理された抗−ＢＳＡと比較することにより試験された。これらのアッセイは同様な結果を与えた（データは示されない）。例４：準ゼプトモルの抗原の検出例３において記載されたＢＳＡ／抗−ＢＳＡシステムは、ウェル（ｗｅｌｌ）中の１００μｌの緩衝液に加えられた１ミクロリットルのサンプルを用いて溶液中の減少させていく濃度のＢＳＡの存在下に操作された。１分子のＢＳＡ／１ミクロリットルのサンプルの濃度を用いて、そのシステムは、競合性結合により、１．６ｘ１０^-18モルのＢＳＡを検出することが出来た。この方法は、抗原の種類に無関係に、任意の抗原−抗体システムに適用できるだろう。異なるＢＳＡ濃度を有するＢＳＡ被覆粒子を用いて、図５における変位棒グラフ（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｂａｒｇｒａｐｈｓ）により示されるように異なる感度を生じた。例４Ａ：血清中の抗原の検出ヒトの血清がこのセットの実験のための希釈剤として選ばれた。研究のために使用された抗体は他の例において使用されたのと同じ単クローン抗体であった。既知の量のＢＳＡが次のとおりに血清中に希釈された：１μｌの容量中のＢＳＡが１００μｌのヒトの血清に加えられて最終の選ばれた濃度にされた。その血清サンプルが例＃４において用いられたとおりの緩衝液中に希釈されたＢＳＡの代わりに用いられた以外は前の例において記載されたとおりにして、アッセイを行った。これらの実験の結果は表に表される。標準曲線は棒グラフ（図５）を再プロットすることにより誘導される。１．４９ｘ１０^-7モル／ＢＳＡのｌを含有するＢＳＡ被覆ビーズが、他のように示されない限り、用いられた。＊水準１．４９ｘ１０^-13モル／ＢＳＡのｌで被覆されたビーズを用いて行われたアッセイこのデータは、特異性抗原を含有する血清サンプルを検定しそしてその中の分析物を検出しそして定量化することが可能であることを示す。同様なアッセイで抗原を抗体に置き換えて同様な結果を得ることができることは、また当業者にとって明らかである。この場合において、加えられた抗体はビーズに付着された有効抗原のための固定化抗体と競合するであろう。例５：直接競合によるＤＮＡ配列の検出末端アミンを含有する４０塩基の第１オリゴマーを例１Ａにおける抗−ＢＳＡについて記載されたとおりのシラン処理ガラスカバースリップに共有的にカップリングされた。また末端アミンを含有しそして第１オリゴマーの配列に相補的な配列を有する第２オリゴマーは相補的オリゴマーの１つだけのハイブリッド分子の形成を可能にするために予め決められた濃度で例２におけるようにラテックスビーズにカップリングされた。このハイブリッドを分離するために必要な力が実験的に測定された。競合するオリゴマーの検出は１〜１０００分子／ミクロリットルの濃度で、カバーストリップ上に固定化されたオリゴマーまたはラテックスビーズ上のオリゴマーのいずれかの配列に相補的な配列を有する単一ストランドオリゴマーの溶液を、そのシステムに加えることにより行われた。この加えられたオリゴマーはカバースリップまたはビーズ上に固定化されたその相補的オリゴマーとハイブリッド形成され、それにより、ラテックスビーズまたはカバースリップのそれぞれの上に固定化された競合性オリゴマーの結合を遮断する。例６：ＤＮＡの大きなピースの検出一方のオリゴマーがガラススライドに付着されそして他方のオリゴマーがビーズに付着されている、異なる、非相補的配列を有する２種の単一ストランドＤＮＡオリゴマーを用いて、本発明者は、ストランド上の異なる位置において両方の配列を含有する、溶液中の単一ストランドＤＮＡの大きなピースにおける特有な配列を検出することが出来た。そのストランドは、カバースリップ上のオリゴマーに結合しそしてビーズ上のオリゴマーに結合してその２者間でキャッチされることが出来た。これらの結合を破るのに必要とされる力はバックグラウンドを超えた。溶液中の単一−ストランドＤＮＡの量の定量化は、ビーズまたはカバースリップのそれぞれの上に固定化されたオリゴマーへのＤＮＡストランドの結合を競合するために、カバースリップ上のオリゴマーまたはビーズ上のオリゴマーのいずれかの配列に相補的な配列を有するＤＮＡオリゴマーを用いる競合結合アッセイを用いて行われることができる。１〜１００ＤＮＡコピーの検出はこの様式で行われることができる。それ故に、当業者に容易に明らかなように、本発明の装置は、既知の配列を有する核酸分子を検出しそして定量化するために使用されることができる。上記例は限定よりはむしろ、例示であることが意図される。この明細書を再検討した当業者は、本明細書に記載された技術が、本発明の範囲から離れることなしに、他の分析物の検出および定量化に適合されることができることを容易に認識するだろう。これらの技術の使用により極度に低い濃度、即ちサンプルのミクロリットル当たり約１分子の分析物ほど低い濃度で任意のそしてあらゆる核酸配列、抗原、抗体および他の分析物を検出しそして定量化することが可能であることが当業者に容易に明らかになるだろう。ミクロリットル当たり１分子より低い濃度で存在する分析物の検出は、特定の結合反応を起こさせるために十分な時間をかけることにより、あるいはリガンドを移動させて、その対応するリガンド結合剤と接触させる手段を包含することにより、本発明の装置を用いて行われることができる。リガンドおよびリガンド結合剤が別々のビーズ上にあることができることそしてリガンドおよびそれらの対応する結合剤が、所望の分析物、例えば抗原、抗体、ＤＮＡ標的、等について複合分析を可能にするために“チップ（ｃｈｉｐ）”上に配置されることができることがまた、容易に明らかであろう。したがって異なる色のビーズ上に付着された異なる抗原を有する混合ビーズを用いて１つのサンプルについて幾種かのアッセイを行うことで可能である。この技術は、分析化学者および臨床化学者にとって関心のある各々の分子を検出するための迅速な、費用のかからない自動化可能な方法を提供する。それはＨＩＶおよび他のウィルスのような感染性生物、オンコ遺伝子、成長因子および感度が問題である他の物質の低い濃度を検出するために適用できる。それはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ−ベータレプリカーゼおよび核酸物質の非常に低い濃度のアッセイのための同様な技術のための主要な競合物質であることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者キショアー，ロニバクルーアメリカ合衆国 20878 メリーランド州ノースポトマック，セットラーズランディングウエイ 14421

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）レーザー光のビームを放射するためのレーザー光源を用意し；（ｂ）第１体および第２体を用意し、該第１体および該第２体の少なくとも１つはレーザー光のビームにより操作されるために適合されており；（ｃ）分析物を該第１体と接着させ；（ｄ）該分析物と反応性である試薬を該第２体と接着させ；（ｅ）該分析物と該試薬との反応を生じさせるのに十分な近接状態に該第１体と該第２体をもたらし；（ｆ）レーザー光のビームの使用により、該第１体と該第２体とを分離させ；（ｇ）工程（ｆ）を行うのに必要な力を測定し；そして（ｈ）工程（ｇ）において測定された力から分析物の量を決定する、ことを包含する、分析物を検出しそして定量化する方法。２．第１体が直径において約０．５μ〜約１００μのビーズでありそしてレーザー光のビームの波長での光を吸収しない材料からなる、請求項１の方法。３．第２体がガラスカバースリップおよびガラススライドからなる群から選ばれる、請求項２の方法。４．第２体が、分析物又は試薬との共有結合を形成することができるカップリング剤で被覆されており、該カップリング剤がたんぱく質と共有結合を形成するために官能化されたシランを含む混合シラン溶液を含む、請求項３の方法。５．分析物が抗原であり；そして試薬がその抗原に特異的に結合することができる抗体である、請求項１の方法。６．分析物及び試薬が相補的配列を有する核酸からなる、請求項１の方法。７．工程（ｃ）が、（ｉ）分析物と反応性である第２試薬を体１体に接着させ；そして（ｉｉ）該第２試薬を分析物にさらして該第２試薬に分析物との反応を生じさせる、ことを含む、請求項１の方法。８．第２試薬がカルボキシル基を含む、請求項７の方法。９．試薬と第２試薬との両方が核酸を含む；そして分析物が、該試薬および該第２試薬のそれぞれの核酸配列に相補的である部分を有する配列を有する核酸を含む、請求項７の方法。 10．レーザー光のビームを放射するためのレーザー光源；第１体および第２体、ただしこれらの第１体および第２体の少なくとも１つはレーザー光のビームの通路に配置されておりそしてレーザー光のビームにより操作されるために適合されている；分析物を第１体に接着させることを生じさせるための手段；分析物と反応性である試薬、ただしこの試薬は第２体に接着されている；分析物と試薬とが反応した後に、レーザー光のビームの使用により、第１体と第２体とを分離させるための手段；該分離のための手段が第１体と第２体とを分離させるために発揮しなければならない力を測定するための手段；および該力に基づいて、該分析物の量を計算するための手段、を含む、分析物を検出しそして定量化するための装置。 11．第１体がガラスビーズおよびラテックスビーズからなる群から選ばれる、請求項１０の装置。 12．第２体がガラスカバースリップおよびガラススライドからなる群から選ばれる、請求項１０の装置。 13．分析物が抗原であり；そして試薬がその抗原に対応する抗体である、請求項１０の装置。 14．分析物および試薬が相補的配列を有する核酸を含む、請求項１０の装置。 15．分析物に接着を起こさせるための手段が、分析物と反応性であって、第１体に接着されている第２試薬を含む、請求項１０の装置。 16．第２試薬がカルボキシル基を含む、請求項１５の装置。 17．試薬と第２試薬との両方が核酸配列を含み；そして分析物が該試薬および該第２試薬のそれぞれの核酸配列に相補的である部分を有する配列を有する核酸を含む、請求項１５の装置。