KR101350481B1 - 생체 분자 검출 장치 및 검출 방법 - Google Patents

생체 분자 검출 장치 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광물질이 배열된 비드 표면에 검출 대상 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 고정화하는 단계; 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산(Guard Nucleic Acid)이 상기 핵산 앱타머와 혼성화하여 형광을 제거하는 단계; 및 검출 대상 생체 분자가 포함된 시료를 핵산 앱타머와 반응시켜서 생체 분자가 핵산 앱타머와 결합하면 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산이 분리되어 회복된 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법과 상기 검출방법을 수행하는 생체 분자 검출장치를 제공한다. 본 발명은 시료 속의 생체 분자를 더욱 효과적으로 간단하고 신속하게 검출할 수 있고, 정량적인 분석이 가능하며, 극소량의 시료라도 쉽게 검출할 수 있는 장점이 있다.

Description

생체 분자 검출 장치 및 검출 방법{DEVICE FOR DETECTING THE BIOMOLECULE AND METHOD OF DETECTION USING THE SAME}
본 발명은 핵산 앱타머를 이용하여 생체 분자를 검출하는 장치 및 방법에 관한 발명이다.
앱타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 가지고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득한 것으로서 생체 분자 검출을 위해 사용되어 왔다. 앱타머는 올리고뉴클레오타이드 기반이므로, 단백질 기반의 항체에 비하여 여러 장점이 있다. 즉, 생체 외에서 수득할 수 있고, 다양한 유기물과 무기물을 표적 분자로 이용할 수 있으며, 특정 표적 분자에 특이적으로 결합하는 특정 앱타머를 확인한 후에는 적은 비용으로 대량 생산이 가능한 장점이 있다.
그러나, 앱타머는 표적 분자를 인식하기는 하지만, 앱타머 자체에는 표적 분자와 결합하였을 때, 신호 변화를 보고해 줄 수 있는 성질이 없다. 앱타머의 이러한 성질을 보완하고, 탐침 분자로서의 기능을 극대화하기 위한 방법을 개발할 필요가 있었다.
종래 생체 분자를 검출하기 위해서 캔틸레버를 이용하는 방법을 개발한 바 있다(대한민국 공개 특허 제10-2011-0055930호). 이 방법은 캔틸레버 센서 및 상기 캔틸레버 상에 고정된 DNA 앱타머를 이용하여 트롬빈을 검출하는 방법으로, 캔틸레버를 사용하지 않고 앱타머를 이용하여 간편하게 생체 분자를 검출할 수 있는 방법을 연구할 필요가 있었다.
한편, 양자점(Quantum dot)은 발명된 것은 1970년대로 거슬러 올라가지만, 이 물질을 생명 과학 분야에 응용하기 시작한 것은 불과 4~5 년 정도이다. CdSe 코어에 ZnS 쉘을 입힌 양자점은 직경이 수 나노미터에서 수십 나노미터에 이르는 구형의 물질로서, 입자의 크기에 따라서 다른 파장의 형광을 방출하는 특징을 가지고 있어서 세포생물학과 같은 기초 생명 과학뿐 아니라 각종 단백질 칩 및 바이오센서 분야와 같은 응용 생명과학에도 다양하게 사용될 수 있다. 양자점은 UV에서 붉은색까지 어느 파장으로도 여기(excitation)가 가능하며, 조절 가능한 좁은 방출 스펙트럼을 갖는다. 무기물이므로 화학반응에 안정하고 표면의 처리에 의하여 생체물질과의 결합이 용이하다. 또한, 양자점은 광안정성이 우수하고 실시간으로 연속적인 모니터링이 가능하기 때문에 바이오센서 분야에서도 매력적인 물질이다. 그러나 소수성에서 친수성 형태로 전환되거나 다른 물질과 포접시 광발광성 양자 수율이 상당히 감소되므로 바이오센서 분야에의 적용이 제한되어 왔다.
종래 각각의 다른 방출(emission) 값을 가지는 양자점에 각각의 분석하고자 하는 단백질들의 앱타머를 고정화하여 다중 단백질을 탐지하는 방법이 개발되었다(Matthew et al. ChemBioChem 2005, 6, 2163-2166). 이 방법은 탐색한 단백질들의 정량화가 어렵고, 형광 검출을 위해 고감도의 형광 검출기를 필요로 하고, 유로를 정밀하게 조절해야 하는 문제점이 있었다. 더욱이 분석 시간이 길거나, 과다한 시료를 사용해야 하는 문제점도 있었다.
또한, 종래의 단백질 탐지를 위해 앱타머를 기반으로 한 형광 분석방법과 정량화 시스템인 샌드위치 엘리사(sandwich ELISA) 원리를 이용하여 개발된 앱타머 기반의 샌드위치 분석방법이 있다(Yolanda et al. Anal . Chem. 2010, 82, 5591-5597). 이 방법은 분석 프로토콜이 매우 복잡하고, 분석하고자 하는 단백질에 대해 두 가지 이상의 에피토프 연구를 필요로 하는 문제점이 있다.
대한민국 공개 특허 제10-2011-0055930호 Matthew et al. ChemBioChem 2005, 6, 2163-2166 Yolanda et al. Anal. Chem. 2010, 82, 5591-5597
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 시료 속의 생체 분자를 더욱 효과적으로 간단하게 검출할 수 있도록 하는 생체 분자 검출방법 및 검출 장치를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시예는 생체 분자 검출방법으로서, 형광물질이 배열된 비드 표면에 검출 대상 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 고정화하는 단계; 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산(Guard Nucleic Acid)을 상기 핵산 앱타머와 혼성화하여 형광을 제거하는 단계; 및 검출 대상 생체 분자가 포함된 시료를 핵산 앱타머와 반응시켜서 생체 분자가 핵산 앱타머와 결합하면 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산이 분리되어 회복된 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 비드는, 자성 코어; 상기 코어를 감싸는 기공체 비드; 및 상기 기공체 비드의 표면에 배열된 형광 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 형광신호를 검출하는 단계는, 미세유체 장치에 자석을 배열하여 형성시킨 자기영동(magnetophoresis) 존(zone) 내에 상기 자성비드를 고정하여 형광신호를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 자성 비드는, 형광 물질이 배열된 기공체 비드 표면을 감싸는 기공체 층을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 기공체는, 실리카, 티타니아, 지르코니아 및 지올라이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 형광물질은, 양자점, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), Cy 5, Cy 3 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 소광물질은, 댑실(dabcyl) 또는 블랙 소광물질(black quencher)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 생체 분자는, DNA, RNA, 항체, 리간드, 리셉터, 천연 화합물, 합성 펩타이드, 단백질, 세균(bacteria), 바이러스(virus) 및 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 핵산 앱타머는 DNA 앱타머, RNA 앱타머 및 변형된(modified) RNA 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 g-핵산은 g-DNA, g-RNA 및 g-PNA로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 상기 생체 분자 검출방법을 수행하는 생체 분자 검출장치로서, 미세 채널을 포함하는 기판; 및 상기 기판에 배열된 자석을 포함하는 생체 분자 검출장치를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 생체 분자 검출장치는, 버퍼 주입구, 시료 주입구 및 배출구를 포함할 수 있다.
본 발명의 생체 분자 검출방법 및 검출장치는 검출대상의 생체 분자를 더욱 효과적으로 간단하고 신속하게 검출할 수 있고, 정량적인 분석이 가능하며, 극소량의 시료라도 쉽게 검출할 수 있다. 또한, 분석시 최소한의 시료를 사용하여 분석 비용을 최소화하는 장점이 있다.
도 1은 소광물질이 표지된 g-핵산을 핵산 앱타머에 혼성화시켜서 연결한 자성 비드를 사용하여 생체 분자를 검출하는 과정으로, (a)형광물질이 배열된 비드 표면에 핵산 앱타머를 고정화하고, (b)소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산을 핵산 앱타머와 혼성화시켜서 형광을 제거하고, (c)생체 분자를 핵산 앱타머와 반응시켜서 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산이 분리되어 형광을 회복시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 핵산 앱타머가 고정화된 자성 비드의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 DNA 앱타머와 g-DNA가 혼성화된 DNA 앱타머-g-DNA duplex로서, g-DNA 말단에는 소광물질이 연결되어 있는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 소광물질이 표지된 g-DNA를 DNA 앱타머에 혼성화시켜서 연결한 자성 비드로 트롬빈을 검출하여 측정한 형광 강도의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 자성 비드를 사용하여 트롬빈을 검출한 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 생체 분자 검출장치의 단면 예를 나타낸 것이다.
도 7은 자성 비드에 DNA 앱타머를 고정화하고, 소광물질이 표지된 g-DNA를 DNA 앱타머에 혼성화시키는 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 자성 비드 표면에 고정된 DNA 앱타머와 트롬빈이 결합되어 있는 모습을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서 검출방법에 따라 측정한 형광 강도(Photoluminescence: PL)의 변화를 나타낸 것으로 TBA는 트롬빈 바인딩 DNA 앱타머이다.
도 10은 생체 분자 검출장치를 제조하고, 버퍼와 자성 비드를 미세 채널 내에 주입한 후 유량을 변화시켜 자성 비드의 채널 내 흐름 속도를 조절하는 것을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 형광물질이 배열된 비드 표면에 검출 대상 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 고정화하는 단계(도 1(a)); 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산(Guard Nucleic Acid)을 상기 핵산 앱타머와 혼성화하여 형광을 제거하는 단계(도 1(b)); 및 검출 대상 생체 분자가 포함된 시료를 핵산 앱타머와 반응시켜서 생체 분자가 핵산 앱타머와 결합하면 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산이 분리되어 형광을 회복시키고(도 1(c)), 회복된 형광신호를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법을 제공한다.
상기 형광물질은 자가배열(self-assembly) 방식으로 비드 표면에 배열될 수 있다. 자가배열이란 형광물질들이 자발적으로 비드 표면에 일정한 패턴으로 배열하는 것을 의미한다. 상기 형광 물질은 비드의 표면에 분포하는 것이 좋다. 형광물질이 비드의 내부 깊숙한 곳에 분포하게 되면 외부로부터 흡수되거나 방출되는 광 특성이 너무 약해지기 때문이다.
상기 비드는, 바람직하게는 자성비드일 수 있고, 더욱 바람직하게는 자성 코어; 상기 코어를 감싸는 기공체 비드; 및 상기 기공체 비드의 표면에 배열된 형광 물질을 포함하는 구조일 수 있다. 또한, 상기 자성 비드는, 형광 물질이 배열된 기공체 비드 표면을 감싸는 기공체 층을 더 포함하는 구조가 더욱 더 바람직하다. 형광물질이 양자점인 경우를 예를 들면, 기공체 비드의 표면에 분포시킨 양자점이 생존 주기(life cycle)가 짧을 수도 있고, 양자점이 생체 분자와 직접 결합하게 되면 안정성이 떨어지는 문제가 있기 때문에, 양자점 표면을 감싸는 기공체 층을 포함하면 안정성이 개선되는 장점이 있다.
상기 기공체는, 굴절율이 높은 무기 물질로 이루어진 것으로, 예를 들어, 실리카, 티타니아, 지르코니아 및 지올라이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어질 수 있고, 실리카로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 표면에 형광물질이 배열된 자성비드에 핵산 앱타머를 고정화하고, 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산을 핵산 앱타머와 혼성화하여 형광을 제거한 모습의 일례를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 본 발명에서 자성 비드(300)는, 자성 코어(310); 상기 코어를 감싸는 기공체 비드(330); 및 상기 비드의 표면에 형광 물질(320)이 배열되고, 형광물질의 표면에 기공체 층(330)이 형성된 구조이다. 상기 자성비드에 핵산 앱타머 (400)가 고정화시키고, 소광물질(510)이 표지된 g-핵산(500)을 핵산 앱타머 (400)와 혼성화시키면 소광물질(510)에 의하여 형광물질(320)의 형광이 제거된다.
상기 형광물질은, 당업자에게 공지된 형광물질이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, 양자점, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), Cy 5, Cy 3 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있고, 양자점이 바람직하다.
양자점(Quantum dot)은 나노크기의 반도체 결정체 입자로서 Ⅱ~Ⅳ의 반도체(예를 들어, CdSe, CdTe, CdS 등)가 코어(core)를 이루고, 전도대(conduction band)에서 가전자대(valence band)로 들뜬 상태의 전자가 내려오면서 형광을 발생시킨다. 양자점은 입자의 크기에 따라 형광 파장이 달라지는데, 입자 크기가 작아질수록 짧은 파장의 형광을 내므로, 크기를 조절하여 모든 파장 영역의 형광을 거의 다 낼 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서는 양자점의 크기를 조절하여 방출 파장을 조절할 수 있고, 방출되는 파장의 형광을 흡수하는 소광물질을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 검출 대상이 되는 생체 분자는 특정 핵산 앱타머와 특이적으로 결합하는 것이면 무방하고, 제한되지 않는다. 예를 들어, DNA, RNA, 항체, 리간드, 리셉터, 천연 화합물, 합성 펩타이드, 단백질, 세균(bacteria)이나 바이러스(virus)와 같은 미생물 또는 세포를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "핵산 앱타머"는 단일 사슬 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)로서, 10~90뉴클레오티드 정도의 크기를 가지고, 다양한 3차원 구조를 가지고, 특정 물질과 높은 친화력을 가지는 특성을 가지는 모든 단일 사슬 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 핵산 앱타머는 세포 내에서는 표적이 되는 생체 분자와 결합하여 그 기능을 억제하는 역할을 한다.
상기 핵산 앱타머는 DNA 앱타머, RNA 앱타머 및 변형된(modified) RNA 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 g-핵산(Guard Nucleic Acid)은 상기 핵산 앱타머의 말단 부분 및 연장된 부분을 포함하는 부분에 상보적인 단일 사슬 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 g-핵산은 검출하고자 하는 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 가지는 것을 사용한다. 상기 g-핵산은 g-DNA(guard deoxyribonucleic acid), g-RNA(guard ribonucleic acid) 및 g-PNA(guard peptide nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.
상기 소광물질(quencher)은 형광의 세기를 감소시키는 모든 물질을 포함하며, 예를 들어, 댑실(dabcyl) 또는 블랙 홀 소광물질(black hole quencher)을 사용할 수 있다. 상기 소광 물질은 g-핵산의 말단, 구체적으로 5'-말단 또는 3'-말단에 결합될 수 있다. 도 3을 보면 g-DNA의 말단에 소광물질이 표지된 것을 확인할 수 있다.
상기 소광물질은 자성 비드에 고정된 핵산 앱타머와 혼성화되는 g-핵산에 표지되어서 자성 비드 표면에 배열된 형광물질의 형광을 소멸시키는 역할을 한다. 도 4의 (a)를 보면, 미세 채널 내에 자석에 의해 형성된 자성 존에 자성 비드가 배열되어 있고, 소광물질이 표지된 g-DNA가 DNA 앱타머와 혼성화되어 자성 비드에 고정되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이때, 형광의 세기를 측정하면 형광이 방출되지 않는 것을 알 수 있다. 또한, 도 5(a)를 보면 소광물질이 표지된 g-DNA가 혼성화되기 전에는 형광이 나타난 것을 확인할 수 있고, 도 5(b)를 보면 소광물질이 표지된 g-DNA가 DNA 앱타머와 결합한 후이기 때문에 형광이 소멸된 것을 확인할 수 있다. 형광물질로 양자점을 사용할 경우, 양자점의 특정 파장을 흡수할 수 있는 소광물질을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 핵산 앱타머와 특이적으로 반응하는 생체 분자와 반응하면 그와 동시에 핵산 앱타머와 혼성화되어 있었던 g-핵산이 분리되고, 이때 g-핵산에 결합되어 있던 소광물질도 함께 분리되게 된다. 그러면, 소광물질에 의해 소멸되어 있던 형광이 회복되어 형광이 방출된다. 도 4의 (b)와 도 5의 (c)를 보면, 형광이 회복되어 나타나는 것을 확인할 수 있다.
도 5(c)를 보면 일례로 5분 이내 형광이 회복되는 것을 확인할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 검출방법에 의하면 실시간으로 검출을 확인할 수 있어서, 빠르고 간편한 검출이 가능하다는 장점이 있다. 이는 본 발명이 비드 기반 반응이고 비드 표면에 형광물질이 전체적으로 배열되어 있고, 핵산 앱타머가 비드 표면에 연결되어 있어서, 비드 표면 전체적으로 특정 생체 분자의 검출반응이 가능하기 때문이다. 따라서, 검출 반응 표면적이 넓기 때문에 반응 속도가 빠른 것이고, 실시간으로 검출 확인이 가능한 것이다.
본 발명의 검출방법에서 상기 형광신호를 검출하는 단계는, 미세유체 장치에 자석을 배열하여 형성시킨 자기영동(magnetophoresis) 존(zone) 내에 자성비드를 고정하여 형광신호를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 미세유체 장치는 미세 유체가 흐를 수 있는 채널을 포함하는 구조에 자석을 배열시킨 것을 사용할 수 있다.
상기 형광신호의 검출은 형광검출기를 이용할 수 있다. 도 4와 도 5를 보면, DNA 앱타머와 특이적으로 반응하는 생체 분자가 반응한 후에 형광이 회복되어 나타나는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 검출방법은 자석이 배열된 위치에 형성된 자기영동 존에서 형광신호를 판독하면 되기 때문에, 자석이 배열되지 않은 경우에 비하여 분석이 더욱 용이한 장점이 있다. 자석에 의해 형성된 자기영동 존에 자성 비드가 고정되고, 자기영동 존에서 생체 분자와 핵산 앱타머의 반응이 일어나게 되기 때문이다. 또한, 자기영동 존에 일정량의 비드를 배열하게 하는 장점이 있으므로, 생체 분자의 검출에 있어서, 정량적인 분석이 가능하게 된다.
본 발명은 상기 생체 분자 검출방법을 수행하는 생체 분자 검출장치로서, 미세 채널을 포함하는 기판; 및 상기 기판에 배열된 자석을 포함하는 생체 분자 검출장치를 제공한다. 상기 생체 분자 검출장치의 예시를 도 6에 나타내었다. 상기 검출장치는, 미세 채널(200)을 포함하는 기판(100); 상기 기판에 배열된 자석(40)을 포함하고, 형성된 버퍼 주입구(10), 시료 주입구(20), 및 배출구(30)가 기판상에 형성되어 있다. 도 6(a)는 기판(100)이 일체로 형성되고, 미세 채널(200)의 한 측면 기판에 자석(40)이 일정 간격으로 이격되어 배치된 예를 나타낸 것이다. 도 6(b)는 제1 기판(110) 및 제2 기판(120)이 결합되어 기판을 형성하고, 제1 기판(110) 및 제2 기판(120) 중 어느 하나에 자석(40)이 일정 간격으로 이격되어 배치된 예를 나타낸 것이다.
상기 기판은 예를 들어, 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 형성될 수 있고, 상기 플라스틱으로는 구체적으로 시클로올레핀코폴리머(Cyclo olefin copolymer:COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate:PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate:PC), 시클로올레핀폴리머(cyclo olefin polymer:COP), 액체 결정 폴리머(liquid Crystalline Polymers:LCP), 폴리아미드(polyamide:PA), 폴리에틸렌(polyethylene:PE), 폴리이미드(polyimide:PI), 폴리프로필렌(polypropylene:PP), 폴리페닐렌에테르(polyphenylene ether:PPE), (polystyrene:PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene:POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone:PEEK), 폴리에테르술폰(polyethersulfone:PES), 폴리에틸렌프탈레이트(polyethylenephthalate:PET), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene:PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride:PVC), 폴리비닐리덴플루오라이드(polyvinylidene fluoride:PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate:PBT), 플루오르화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene:FEP), 퍼플루오르알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane:PFA) 및 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane: PDMS)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나를 사용할 수 있다.
상기 버퍼 주입구(10)를 통하여 미세 채널 내에 버퍼를 주입할 수 있고, 시료 주입구(20)를 통하여 미세 채널 내에 자성 비드와 검출하려는 생체 분자를 포함하는 시료를 주입할 수 있다. 한편, 배출구(30)에는 흡입기(syringe)를 연결하여 검출을 원하는 특정 생체 분자를 제외한 시료와 버퍼, 생체 분자와 핵산 앱타머의 반응에 의해 분리된 소광물질이 표지된 g-핵산 등을 배출시킬 수 있다. 이 예시는 도 10에 도시되어 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 자성 비드 표면에 DNA 앱타머 고정 및 소광물질이 표지된 g-DNA 혼성화
표면에 양자점을 배열한 자성 비드에 트롬빈 바인딩 DNA 앱타머를 고정하고, 소광물질이 표지된 g-DNA를 앱타머에 혼성화시켰다. 상기 DNA 앱타머가 연결된 자성비드는 도 2에 나타내었고 그 제조 과정은 도 7에 나타내었다. 도 7에서 (a)는 4-phenylene dusitguictabate(PDITC) 를 N,N-dimethylformamide(DMF)sp 녹여서 아민 프로필기가 형성되어 있는 자성 비드에 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. (b) 아이소티오사이네이트(isothiocynate)가 형성된 자성 비드에 결합할 수 있도록 아민기를 변형하여 디자인한 트롬빈 바인딩 앱타머를 10 μM 1×PBS에 희석하여 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. (c) 그리고, 소광 물질인 Iowa Black RQ 가 결합되어 있는 DNA를 하이브리디제이션 버퍼(Tris-HCl 20mM, MgCl2 20mM)에 희석하여 1시간 동안 반응시켰다.
본 발명에서 사용한 자성 비드는 450nm에서 여기(excitation)되었고, 610nm에서 방출(emission)되었기 때문에 500~700nm의 파장을 흡수하는 Iowa Black RQ Quencher 를 사용하였다.
본 발명에서 제조한 DNA 앱타머-g-DNA duplex는, 5'-말단 연장된 트롬빈 바인딩 DNA 앱타머 (21-mer: 5'-CAC TGT GGT TGG TGT GGT TGG-3': 서열번호 1, 밑줄 부분인 5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3'이 트롬빈 바인딩 서열(서열번호 2)이다.) 및 g-DNA (5'-CCA ACC ACA GTG-3': 서열번호 3) 를 사용하였다(도 3, 도 5, 도 8).
<실시예 2> 트롬빈 주입 및 형광 측정
10μg/m 농도의 타겟 물질인 트롬빈을 시료 주입구(20)를 통하여 미세채널 내에 주입하여 자성 비드와 반응시켰을 때, 현미경 상에서 어두운 부분이 붉은 색으로 변하는 것을 확인할 수 있었다. 도 5를 보면, 트롬빈 도입 후에 5분 이내가 형광 강도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 양자점이 포집된 자성 비드를 사용하여 트롬빈을 검출한 이미지를 나타낸 것이다. (a)는 밝은 부분(위)과 형광 부분(아래)에서 앱타머에 트롬빈이 바인딩한 것이고, (b)는 guard-DNA와 혼성화된 것이며, (c)는 트롬빈이 반응한 형광 이미지를 나타낸 것이다.
500~700nm의 파장의 광을 조사하였더니, 양자점의 형광 신호가 보이지 않았다. 소광물질(Quencher)이 표지된 g-DNA 는 앱타머와 트롬빈이 결합되면, 앱타머에서 떨어져 나와 유속과 함께 흘러나감으로써, 양자점의 방출 파장인 610nm에서 형광 신호가 회복됨을 확인할 수 있었다(도 9).
<실시예 3> 검출장치의 제조
검출 대상 생체분자와 DNA 앱타머와의 반응에 의해 회복되는 형광을 검출하기 위하여, 본 발명자들은 생체 분자 검출장치를 제조하였다(도 10). 길고, 직선 모양의 미세유체 채널을 폭(width)ⅹ높이(height)ⅹ길이(length)=500μmⅹ85μmⅹ40mm의 크기로 제작하였다. 채널의 한 측면 기판에 자석을 일정 간격으로 배치하여 자성 비드를 붙잡기 위한 자성 존(magnetic zone)을 만들었다. 유량을 10 ~ 20μL/min로 하여 평균 비드의 흐름 속도를 3.91~ 7.84mm/s로 변화시켰다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
10: 버퍼 주입구 20: 시료 주입구
30: 배출구 40: 자석
100: 기판 110: 제1 기판
120: 제2 기판 200: 미세 채널
300: 자성 비드 310: 자성 코어
320: 형광물질 330: 기공체
400: 핵산 앱타머 500: g-핵산
510: 소광물질
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 생체 분자 검출방법으로서,
    형광물질이 배열된 자성 비드 표면에 검출 대상 생체 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 고정화하는 단계;
    소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산(Guard Nucleic Acid)을 상기 핵산 앱타머와 혼성화하여 형광을 제거하는 단계; 및
    검출 대상 생체 분자가 포함된 시료를 핵산 앱타머와 반응시켜서 생체 분자가 핵산 앱타머와 결합하면 소광물질(quencher)이 표지된 g-핵산이 분리되어 회복된 형광신호를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 자성 비드는 자성 코어; 상기 코어를 감싸는 기공체 비드; 및 상기 기공체 비드의 표면에 배열된 형광 물질을 포함하는 것이고, 상기 기공체는 실리카, 티타니아, 지르코니아 및 지올라이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형광신호를 검출하는 단계에서,
    미세유체 장치에 자석을 배열하여 형성시킨 자기영동(magnetophoresis) 존(zone) 내에 상기 자성비드를 고정하여 형광신호를 검출하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자성 비드는, 형광 물질이 배열된 기공체 비드 표면을 감싸는 기공체 층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형광물질은, 양자점, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), Cy 5, Cy 3 및 텍사스 레드(Texas Red)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 소광물질은, 댑실(dabcyl) 또는 블랙 소광물질(black quencher)인 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생체 분자는, DNA, RNA, 항체, 리간드, 리셉터, 천연 화합물, 합성 펩타이드, 단백질, 세균(bacteria), 바이러스(virus) 및 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 앱타머는 DNA 앱타머, RNA 앱타머 및 변형된(modified) RNA 앱타머로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 g-핵산은 g-DNA, g-RNA 및 g-PNA로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자 검출방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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