CN109115917B - 一种γ-氨基丁酸含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效液相色谱检测γ‑氨基丁酸的方法，属于产品质量检验领域。具体方案如下：采用Sepax HP‑SCX柱，以0.2 M的磷酸盐缓冲溶液（pH 2.5‑3.5）为流动相，紫外检测器在210nm分别检测γ‑氨基丁酸样品标准品与样品溶液的峰面积，并计算样品含量。本发明的方法克服了传统方法中衍生化试剂易被氧化，衍生物不稳定，随着时间的推移，峰面积极不稳定等缺点，具有回收率、重现性好，精密度高，专属性较强等优点。而且检测物出峰时间短，适合大量高纯度γ‑氨基丁酸样品检验。

Description

一种γ-氨基丁酸含量的测定方法

技术领域

本发明属于产品质量检验领域，具体涉及一种γ-氨基丁酸含量的测定方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)，又称氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，分布非常广泛，在动物、植物和微生物中均有GABA存在。随着研究深入，GABA的生理功能不断得到阐明，已发展成为一种新型功能性因子，具有抗压、促睡眠、祛皱、保湿、美白等功效，正逐渐被广泛用于医药、食品保健、化工及农业等行业，在中国、美国、日本等地被批准为公认安全食品，具有较高的开发利用前景。

目前对γ-氨基丁酸的测定主要采用高效液相色谱法，因γ-氨基丁酸无紫外吸收且酸性极强，需经过柱前衍生过程才能检测，所用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、2,4-二硝基氟苯(FDNB)、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)。由于与邻苯二甲醛衍生法步骤简单、反应快速、过量试剂不干扰结果，2010年版中国药典中采用γ-氨基丁酸与邻苯二甲醛衍生进行定量，生成具有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生物，采用C18柱将其分离出来。由于衍生物极易被氧化，随着时间的推移，峰面积极不稳定，尤其是在长时间大量样品检测的过程中，将直接影响测定结果的准确性和重现性。PITC衍生法所得衍生物稳定，但需在无水条件下进行，容易影响分析柱使用寿命；FDNB衍生法能得到较为稳定的衍生物，但是反应副产物会干扰检测结果。因此，需要寻找一种不需要衍生剂检测γ-氨基丁酸含量的方法。

发明内容

针对目前高效液相色谱法检测γ-氨基丁酸含量均需要衍生剂，影响结果准确性和重现性的问题，本发明提供一种γ-氨基丁酸的检测方法，回收率、重现性好，精密度高，检测时间短。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种高效液相色谱检测γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：

（1）配制标准品溶液：精密称取γ-氨基丁酸标准品，用流动相溶解、定容配制成标准品溶液；

（2）配制样品溶液：精密称取γ-氨基丁酸样品，用流动相溶解、定容配制成样品溶液；

（3）色谱条件：色谱柱：Sepax HP-SCX；

流动相：0.2 M的磷酸盐缓冲溶液，pH 2.5-3.5；

流速：0.5-1.2mL/min；

检测波长：210nm；

（4）含量计算：

样品中γ-氨基丁酸的的含量按下式计算：

式中：

X₁——样品中γ-氨基丁酸的含量；

Ai——样品中γ-氨基丁酸的峰面积；

m_S——γ-氨基丁酸标准品的质量（g）；

C ——γ-氨基丁酸标准品纯度（%）；

A_S——γ-氨基丁酸标准品的峰面积；

m ——称取样品的质量（g）。

所述样品γ-氨基丁酸可以是化学合成法获得的，也可以是生物合成法获得的。优选的，样品中γ-氨基丁酸的含量为20-99.9%；更优选为80%-99%。

作为优选，步骤（1）中还包括标准品溶液配制成系列浓度标准品溶液的步骤；

相应的，步骤（4）中含量计算为：根据系列浓度标准品溶液计算γ-氨基丁酸浓度-峰面积的标准回归曲线y=a+bx，其中，y为γ-氨基丁酸的峰面积，x为γ-氨基丁酸浓度（g/L）；根据γ-氨基丁酸样品的峰面积计算样品中γ-氨基丁酸浓度与含量（%）。

所述流动相的溶质为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸或盐酸。

上述检测方法中，0.01g/L的γ-氨基丁酸的理论峰面积应不低于200。

优选的，步骤（1）和步骤（2）中，溶液过滤膜过滤。所述滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

步骤（3）中，进样量为10-25μL。

本发明具有以下优点：

本发明采用离子交换柱，克服了传统方法中衍生化试剂易被氧化，衍生物不稳定，随着时间的推移，峰面积极不稳定等缺点，具有回收率、重现性好，精密度高，专属性较强等优点。而且检测物出峰时间短，适合大量高纯度γ-氨基丁酸样品检验。

附图说明

图1为实施例1中γ-氨基丁酸标准品（0.5g/L）的谱图；

图2为实施例1中γ-氨基丁酸样品的谱图；

图3为实施例3中添加谷氨酸的γ-氨基丁酸样品的谱图；

图4为实施例3中添加吡咯烷酮的γ-氨基丁酸样品的谱图；

图5为实施例3中检测方法的线性范围。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 γ-氨基丁酸含量检测

（1）配置标准品溶液：精密称取γ-氨基丁酸标准品适量，用流动相配制成0.5024g/L的溶液，0.45μm滤膜过滤后，作为标准品溶液；

（2）配制样品溶液：精密称取生物合成法获得的样品0.5020g，用流动相溶解转入100mL容量瓶中以流动相定容，作为样品溶液；

（3）色谱条件：

色谱柱：Sepax HP-SCX（4.6×250mm）；

柱温：30℃；

流动相：0.2 M的磷酸缓冲溶液，pH 3.0；

流速：0.8mL/min；

进样量10μL；

检测波长：210nm；

（4）含量计算：

样品中氨基丁酸的的含量按下式计算：

式中：

X₁——样品中γ-氨基丁酸的含量；

Ai——样品中γ-氨基丁酸的峰面积；

m_S——γ-氨基丁酸标准品的质量（g）；

C ——γ-氨基丁酸标准品纯度（%）；

A_S——γ-氨基丁酸标准品的峰面积；

m ——称取样品的质量（g）；

计算结果保留小数点后一位有效数字。

将同一样品连续检测10次，根据峰面积计算得出γ-氨基丁酸的含量。结果见表1：

表1 γ-氨基丁酸含量测定结果

从表1可以看出氨基丁酸含量的测定结果比较稳定，没有明显的波动或者下降趋势。

实施例2 γ-氨基丁酸含量检测

参照实施例1中的步骤测定另一样品，不同在于步骤（2）中精密称取样品1.027g，用流动相溶解转入100mL容量瓶中以流动相定容，作为样品溶液。将同一样品连续检测10次，根据峰面积计算得出γ-氨基丁酸的含量。结果见表2：

表2 γ-氨基丁酸含量测定结果

从表2可以看出低含量的氨基丁酸的测定结果也比较稳定，没有明显的波动或者下降趋势。

实施例3 方法验证

（1）专属性

配制浓度为约0.5g/L的谷氨酸标准溶液。精密量取谷氨酸标准溶液和实施例1中标准品溶液各600μL混合成混合液（1:1）。取实施例1中同一样品溶液、上述谷氨酸溶液和混合液，用高压液相色谱按实施例1中所述色谱条件测定，结果如图3所示，其中，a为谷氨酸，b为γ-氨基丁酸，c为谷氨酸和γ-氨基丁酸的混合；其分离度R=2(tR₂-tR₁)/ (Y₁+Y₂)= 2(6.955-0.651)/ (0.1133+0.1089)= 3.906.其中，tR表示保留时间，Y表示峰宽，R大于1.5才算是完全分开，结果显示R=3.906，能够完全将谷氨酸与γ-氨基丁酸分离，符合检测要求。

配制浓度为约0.5g/L的吡咯烷酮标准溶液。精密量取吡咯烷酮标准溶液和实施例1中标准品溶液各600μL混合成混合液（1:1）。取实施例1中同一样品溶液、上述吡咯烷酮溶液和混合液，用高压液相色谱按实施例1中所述色谱条件测定，不同在于，流速为1mL/min；结果如图4所示，其中，a为γ-氨基丁酸，b为吡咯烷酮，c为γ-氨基丁酸与吡咯烷酮的混合；其分离度R=2(tR₂-tR₁)/ (Y₁+Y₂)= 2(5.906-5.135)/ (0.1067+0.1034)= 7.34.其中，tR表示保留时间，Y表示峰宽，R大于1.5才算是完全分开，结果显示R=7.34，能够完全将吡咯烷酮与γ-氨基丁酸分离，符合检测要求。

（2）线性关系

精密称取8 g γ-氨基丁酸标准品置1 L容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准品储备液。精密量取不同体积的标准品储备液置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，使终浓度分别为0.25g/L，0.5g/L，1.0g/L，2.0g/L，4.0g/L，摇匀后，按照实施例1中的色谱条件检测。色谱图以峰面积积分值（Y）与进样浓度（X）进行线性回归，如图5所示，回归方程为y = 4231x + 18.855，R² = 0.9998 （n=6）。结果表明，氨基丁酸进样浓度在0.25-8.0g/L的范围内，与峰面积线性关系良好。

（3）稳定性

取实施例1中样品溶液，每隔24h进样，按照实施例1中的色谱条件测定峰面积，结果如表2所示：峰面积相对标准偏差（RSD）为0.28%：

表2 方法稳定性（n=6）

。

（4）精密度

取实施例1中的样品溶液，重复进样6次，按照实施例1中的色谱条件测定峰面积，结果如表3所示：峰面积RSD为0.286%：

表3 方法精密度（n=6）

。

（5）重复性

精密称取6份0.1g的实施例1中的样品，按实施例1中所述的方法制备样品溶液，分别进样10μL，按照实施例1中的色谱条件测定峰面积，结果如表4所示：峰面积的RSD为0.312%（n=6）：

表4 方法重复性

。

（6）回收率

取不含γ-氨基丁酸的磷酸盐缓冲液，作为回收率实验的空白溶液，分别精密称取氨基丁酸加空白溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，使其浓度分别为0.8 g/L、1.0g/L、1.2g/L，备用；按照实施例1中的色谱条件进行检测，计算回收率，结果如表5所示：平均回收率为99.97%：

表5 回收率

。

（7）检测限和定量限

按照实施例1所述的色谱条件，当基线基本稳定之后，注入适量流动相，记录色谱图20分钟，检测的噪音为2.3。根据线性方程，将实施例1中的样品溶液精密稀释，摇匀，使浓度为约0.2×10^-4g/mL。进行液相色谱检测，记录色谱图，计算信噪比为2.7，介于2和3之间，符合规定，确定其检测限为0.2×10^-4g/mL。根据线性方程，将实施例1中的样品溶液精密稀释，摇匀，使浓度为约0.8×10^-4g/mL。进行液相色谱检测，记录色谱图，计算信噪比为9.5，介于9和11之间，符合规定，确定其定量限为0.8×10^-4g/mL。

对比例1 衍生化-色谱法检测γ-氨基丁酸含量

采用衍生化-色谱法，检测γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：

（1）标准品溶液配制：准确称取0.05 g γ-氨基丁酸标准品，用水溶解定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液；

（2）样品酸溶液配制：准确称取实施例1中同一样品0.1g，用水溶解定容至100mL，用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液；

（3）衍生试剂的制备：称取0.1g邻苯二醛（OPA）用1mL乙腈溶解，加130 μL巯基乙醇，用0.4 mol/L硼酸缓冲液定容至10 mL；

（4）柱前衍生化：精密量取规定体积样品溶液及5.0μL衍生试剂，混合反应约2min后进样；

（5）色谱条件：

色谱柱：Hypersil ODS C18，5μm，4.6×250mm；柱温：40 ℃；

检测波长：338 nm；

流动相：

A相：称取8.0 g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000 mL；然后加入220 μL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸调pH调至7.20±0.02；最后加入5mL四氢呋喃，混合后过滤，备用。

B相：称取8.0 g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000 mL；然后滴加2%的醋酸将pH调至7.20±0.02；再按乙酸钠溶液:乙腈:甲醇=1:2:2（体积比）混合后过滤，备用。

流速：1.0 mL/min；

梯度洗脱程序见下表6：

表6 梯度洗脱程

；

（6）检测：取已制备好的试样进行测定，连续测定10次，记录色谱峰的保留时间和峰面积，试样与标准溶液的衍生化处理至进样的时间应保持一致。根据色谱峰的峰面积，以外标法计算出相应的γ-氨基丁酸的浓度。结果见表7：

表7 衍生法测定γ-氨基丁酸含量测定结果

从表7可以看出氨基丁酸含量的测定结果从第七个数值开始就不稳定了，而且有逐渐下降的趋势。

Claims (7)

1.一种高效液相色谱检测γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配制标准品溶液：精密称取γ-氨基丁酸标准品，用流动相溶解、定容配制成标准品溶液；

（2）配制样品溶液：精密称取γ-氨基丁酸样品，用流动相溶解、定容配制成样品溶液；

（3）色谱条件：色谱柱：Sepax HP-SCX；

流动相：0.2 M的磷酸盐缓冲溶液，pH 2.5-3.5；

流速：0.5-1.2mL/min；

检测波长：210nm；

（4）含量计算：

样品中γ-氨基丁酸的含量按下式计算：

式中：

X₁——样品中γ-氨基丁酸的含量；

Ai——样品中γ-氨基丁酸的峰面积；

m_S——γ-氨基丁酸标准品的质量/ g；

C ——γ-氨基丁酸标准品纯度/ %；

A_S——γ-氨基丁酸标准品的峰面积；

m ——称取样品的质量/ g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中还包括标准品溶液配制成系列浓度标准品溶液的步骤；

步骤（4）中含量计算替换为：根据系列浓度标准品溶液计算γ-氨基丁酸浓度-峰面积的标准回归曲线y=a+bx，其中，y为γ-氨基丁酸的峰面积，x为γ-氨基丁酸浓度g/L；根据γ-氨基丁酸样品的峰面积计算样品中γ-氨基丁酸浓度与含量%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，样品中γ-氨基丁酸的含量为20-99.9%。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，0.01g/L的γ-氨基丁酸的理论峰面积不低于200。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相的溶质为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾-磷酸或盐酸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，溶液过滤膜过滤；所述滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，进样量为10-25μL。

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