CN105806966B - 一种用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析及质量控制技术领域，本发明提供一种用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法。本发明具有专属性强、分离度好、灵敏度高及可操作性强等特点。采用本发明严格控制对氨基苯甲酰‑L‑谷氨酸的光学纯度，可获得光学纯度大于99.9％的叶酸，有利于整个叶酸原料生产过程中的质量控制；同时，在该质量控制体系下，副反应发生少，叶酸光学纯度高，且稳定性好，可用于叶酸原料药制备过程的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，属于药物分析及质量控制技术领域。
背景技术
叶酸，又名蝶酰L-谷氨酸，是一种水溶性B族维生素。叶酸是人体不可缺少的营养元素之一，孕期补充叶酸制剂可以有效预防子代神经管畸形等出生缺陷。其次，叶酸还有防治贫血、抗动脉粥样硬化、防治心脑血管病、抗衰老、防治消化道癌、缓解糖尿病、减少骨质疏松性骨折发生率等功效。
叶酸的化学合成方法有多种，但大多都是通过各种途径获得对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(叶酸前体)，然后采用叶酸前体和2，4，5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐以及三氯丙酮对接，一步制备叶酸粗品，再经酸溶精制和碱精制来制备叶酸纯品。具体反应过程如下：
根据上述反应机理，叶酸结构式中的手性碳来源于对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(叶酸前体)。其中，对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度会直接影响叶酸的光学纯度。通过控制对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度进而控制叶酸光学纯度，可获得高光学纯度的叶酸。
获得高光学纯度叶酸的意义在于：不同立体构型的叶酸在体内产生不同的生物活性，参与调解人体相关生命活动中的作用也不相同。通过叶酸合成过程中叶酸前体及叶酸光学纯度的严格控制，获得高光学纯度的叶酸，可提高叶酸在体内的生物活性，降低不良反应发生的概率。
目前，叶酸光学异构体检测方法未收入美国药典(USP)、英国药典(BP)、欧盟药典(EP)、日本药典(JP)及中国药典(CP)等各国药典，也未见有关对氨基苯甲酰-L-谷氨酸及叶酸光学异构体测定方法的文献报道及专利申请。因而，目前迫切需要系统地建立一种叶酸前体及叶酸光学纯度控制的分析方法。基于此，本专利提供了一种能够有效检测并控制叶酸及其前体光学异构体的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，用于控制高光学纯度叶酸的分析检测，该方法具有灵敏度高、专属性强、分离度好、可操作性强等特点。通过合成过程控制对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度，降低光学杂质的含量，减少副反应，获得光学纯度较高的，光学纯度大于99.9％叶酸。
本发明的技术方案是：采用高效液相手性色谱柱法，选用离子交换手性色谱柱，以低级醇-酸-碱溶液作为流动相，洗脱条件为低级醇∶酸∶碱的体积比为10～100∶1～90∶1～5；洗脱速度为0.3～2.0ml/min；检测波长选用270～290nm，柱温选用15～45℃，进样体积10～20μl。取叶酸及其异构体、对氨基苯甲酰-L-谷氨酸及其异构体各适量，用适量有机溶剂进行溶解，再用流动相稀释制成浓度约0.1～2mg/ml的溶液，分别注入高效液相色谱仪，通过保留时间分别对各峰进行定位；以面积归一化法计算对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中异构体的含量；以主成分自身对照法或外标法计算叶酸光学异构体的含量。
在本发明的具体实施方案中，所述离子交换手性色谱柱首选0-9-(叔丁基氨基甲酯)奎宁为填充剂的色谱柱(如CHIRALPAK QN-AX，规格150mm×4.6mm，5μm)；流动相首选甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶2∶3)，等度洗脱；检测波长选择280nm；流速选择0.8～1.0ml/min，柱温选择30℃。溶解样品的适量有机溶剂优选甲醇，或用对样品及其异构体测定无干扰的其他有机溶剂。
高光学纯度叶酸的制备过程最后一步采用对氨基苯甲酰-L-谷氨酸和2，4，5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐以及三氯丙酮对接制备叶酸，制备过程中需要严格控制对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中对氨基苯甲酰-D-谷氨酸的量(小于0.1％)，可最终获得光学纯度大于99.9％的叶酸原料。
通过上述方法制备的叶酸原料，经过温度25±2℃、湿度60％±10％条件下，长期24月稳定性考察，同时与未经本法制得的叶酸原料的稳定性结果进行对比，本法制得的叶酸原料稳定性较好。
本发明首次提出控制叶酸光学纯度的分析方法，填补现有技术关于对氨基苯甲酰-L-谷氨酸光学异构体及叶酸光学异构体检测分析方法的空白，其优点在于：
1、上述分析条件容易实现，具有专属性强、分离度好、灵敏度高及可操作性强等特点，且分析方法的重现性好。
2、通过本法控制而得的叶酸光学纯度高，可达99.9％以上。
3、通过本法控制而得的高光学纯度的叶酸，有关物质变化小，稳定性好。
附图说明
图1对氨基苯甲酰-L-谷氨酸及对氨基苯甲酰-D-谷氨酸定位及分离高效液相色谱图
图2叶酸及叶酸异构体定位及分离高效液相色谱图
图3对氨基苯甲酰-L-谷氨酸光学纯度的高效液相色谱图
图4叶酸光学纯度的高效液相色谱图
具体实施方式
下面结合附图详述本发明：一种用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，包括了对氨基苯甲酰-L-谷氨酸及叶酸的光学纯度控制方法。具体如下：
实施例1.
1.1 色谱条件
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
色谱柱：CHIRALPAK QN-AX(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱
流动相：甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶2∶3)
流速：0.8ml/min
检测波长：280nm
柱温：30℃
进样量：20μl
1.2 样品制备
1.2.1定位溶液制备
取对氨基苯甲酰-L-谷氨酸、对氨基苯甲酰-D-谷氨酸各约10mg，精密称定，置不同的100ml量瓶中，用甲醇各约1ml分别使其溶解，再用上述流动相定容至刻度，得定位溶液1，2；取叶酸、叶酸异构体各约10mg，精密称定，置不同的100ml量瓶中，用二甲基亚砜各约1ml分别使其溶解，再用上述流动相定容至刻度，即得定位溶液3，4；同时制备空白溶液。
1.2.2供试品溶液制备
取对氨基苯甲酰-L-谷氨酸适量，精密称定，照上述定位溶液配制方法，制得浓度约为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液1；取叶酸适量，精密称定，照上述定位溶液配制方法，制得浓度约为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液2；再精密量取上述叶酸异构体定位溶液5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液2的对照溶液。
1.3 定位、测定及结果
1.3.1定位
精密量取上述定位溶液1～4及相应空白溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，以各峰的保留时间(RT)对其进行定位，结果对氨基苯甲酰-L-谷氨酸RT为6.741min、对氨基苯甲酰-D-谷氨酸RT为4.988min，两者分离度为4.9；叶酸RT为13.026min、叶酸异构体RT为8.083min，两者分离度为6.3；空白溶剂均不干扰上述成分测定。
1.3.1供试品测定
精密量取供试品1溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以面积归一化法计算对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中异构体含量，结果对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度为99.97％，异构体含量0.03％。同时，精密量取上述供试品2及供试品溶液2的对照溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，按外标法以峰面积计算叶酸中光学异构体的含量，结果异构体含量0.02％。
1.4 典型谱图见图1～4。
实施例2.
2.1 色谱条件
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
色谱柱：CHIRALPAK CROWNPAK CR(+)(150mm×4.0mm，5μm)色谱柱
流动相：甲醇-0.1mol/L高氯酸-二乙胺(10∶90∶5)
流速：2.0ml/min
检测波长：274nm
柱温：15℃
进样量：20μl
2.2 样品制备
2.2.1定位溶液制备
取对氨基苯甲酰-L-谷氨酸、对氨基苯甲酰-D-谷氨酸各约10mg，精密称定，置不同的100ml量瓶中，用甲醇各约1ml分别使其溶解，再用上述流动相定容至刻度，即得定位溶液1～2；取叶酸、叶酸异构体各约10mg，精密称定，置不同的100ml量瓶中，用二甲基亚砜各约1ml分别使其溶解，再用上述流动相定容至刻度，即得定位溶液3～4；同时制备空白溶液。
2.2.2供试品溶液制备
取对氨基苯甲酰-L-谷氨酸适量，精密称定，照上述定位溶液配制方法，制得浓度约为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液1；取叶酸适量，精密称定，照上述定位溶液配制方法，制得浓度约为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液2；再精密量取供试品2溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液2的自身对照溶液。
2.3定位、测定及结果
2.3.1定位
精密量取上述定位溶液及空白溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，以各峰的保留时间(RT)对其进行定位，结果对氨基苯甲酰-L-谷氨酸RT为3.012min、N-对氨基苯甲酰-D-谷氨酸RT为3.421min，两者分离度1.8；叶酸RT为4.152min、叶酸异构体RT为4.523min，两者分离度1.7；空白溶剂均不干扰上述成分测定。但分离效果不及实施例1，且各成分出锋均较早。
2.3.2供试品测定
精密量取供试品1溶液20μl，注入高效液相色谱仪，按面积归一化法计算对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中光学异构体的含量，结果对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度为99.98％，异构体含量0.02％。同时，精密量取上述供试品2及供试品溶液2的自身对照溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，采用主成分自身对照法以峰面积计算叶酸中光学异构体的含量，结果异构体含量0.03％。
实施例3.
3.1 色谱条件
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
色谱柱：CHIRALPAK AD-H(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱
流动相：异丙醇(含乙醇20％)-冰醋酸-二乙胺(100∶1∶5)[相当于异丙醇∶乙醇∶冰醋酸∶二乙胺＝80∶20∶1∶5]；
流速：0.3ml/min
检测波长：290nm
柱温：40℃
进样量：10μl
3.2 样品制备
3.2.1定位溶液制备
取对氨基苯甲酰-L-谷氨酸、对氨基苯甲酰-D-谷氨酸各约10mg，精密称定，置不同的100ml量瓶中，用上述流动相溶解至刻度，即得定位溶液1～2；取叶酸、叶酸异构体各约10mg，精密称定，置不同的100ml量瓶中，用二甲基亚砜约1ml分别使其溶解，再用上述流动相定容至刻度，即得定位溶液3～4；同时制备空白溶液。
3.2.2供试品溶液制备
取对氨基苯甲酰-L-谷氨酸适量，精密称定，照上述定位溶液配制方法，制得浓度约为2mg/ml的溶液，作为供试品溶液1；取叶酸适量，精密称定，照上述定位溶液配制方法，制得浓度约为2mg/ml的溶液，作为供试品溶液2；再精密量取供试品2溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液2的自身对照溶液。
3.3定位、测定及结果分析
3.3.1定位
精密量取上述定位溶液及空白溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，以各峰的保留时间(RT)对其进行定位，结果对氨基苯甲酰-L-谷氨酸RT为4.578min、N-对氨基苯甲酰-D-谷氨酸RT为4.786min，两者分离度仅1.5；叶酸RT为5.152min、叶酸异构体RT为5.343min，两者分离度仅1.5；空白溶剂均不干扰上述成分测定。但分离效果不佳。
3.3.2供试品测定
精密量取供试品1溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按面积归一化法计算对氨基苯甲酰-L-谷氨酸中光学异构体的含量，结果对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度为99.98％，异构体含量0.02％。再精密量取上述供试品2及供试品溶液2的自身对照溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按主成分自身对照法，以峰面积计算叶酸中光学异构体的含量，结果异构体含量0.02％。
根据上述实施例1～3的结果可以明显得出，实施例1的方法为最佳的叶酸光学异构体控制方法。
结果分析
(1)通过控制对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度(纯度大于99.9％)，可最终制得纯度大于99.9％的叶酸；对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度与叶酸的光学纯度相关性结果如下表所示：
| 批次 | 对氨基苯甲酰-L-谷氨酸光学纯度 | 叶酸光学纯度 | 相关性 |
| 120501 | 99.97％ | 99.97％ | 良好 |
| 120502 | 99.96％ | 99.96％ | 良好 |
| 120503 | 99.98％ | 99.98％ | 良好 |
由上述结果可知，对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的光学纯度与叶酸光学纯度呈良好的相关性。
(2)通过上述实施例1方法控制得到的叶酸的光学纯度(样品批次120501、120502、120503)与未控制光学纯度控制得到的叶酸(样品批次120301、120302、120303)相比，结果如下表所示：
(3)将经过上述方法严格控制光学纯度制备而得的叶酸(批次：120501批)与未经光学纯度控制制备得到的叶酸(批次：120301批)分别同时进行长期稳定性(温度25±2℃、湿度60％±10％条件下)留样考察，按上述实施例1方法计算叶酸的光学异构体含量。
长期24月稳定性考察结果如下：
由上述稳定性结果可知，经过严格光学纯度控制制备而得的叶酸原料药(120501批)，经长期24月稳定性考察，光学异构体的量在0.03％～0.04％范围波动，基本无明显增长：有关物质由0.32％～0.40％小幅增长。
未经光学纯度控制制备而得的叶酸原料药(120301批)，经长期24月稳定性考察，光学异构体的量由0.25％～0.43％范围内，明显增长；有关物质由0.54％～0.96％范围内，明显增长。
综上，长期24月稳定性试验结果表明：经过光学纯度控制而得的叶酸原料稳定性较未经光学纯度控制的叶酸稳定性好。
同时，根据稳定性考察结果，本发明人意外的发现：叶酸光学异构体的存在能够导致有关物质的显著变化。光学纯度高的叶酸在长期稳定性考察中，有关物质变化不明显；反之，有关物质变化明显。
通过以上实施例表明：本发明在制备叶酸时，根据合成路线，首先对对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(叶酸前体)的光学纯度进行严格控制，控制其光学纯度大于99.9％以上，进而制备出光学纯度大于99.9％的叶酸原料。该光学纯度控制方法专属性强，灵敏度高，操作简便。通过上述方法控制得到的叶酸原料药纯度高、稳定性好。
以上所述内容仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，而依据本发明的技术方案所作任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括对氨基苯甲酰-L-谷氨酸及叶酸光学纯度的控制方法：采用高效液相手性色谱法，以低级醇-酸-碱溶液作为流动相，洗脱条件为低级醇：酸：碱的体积比为10～100:1～90:1～5；洗脱速度为0.3～2.0ml/min；检测波长为270～290nm；柱温为15～45℃；进样体积10～20μl；
所述手性色谱法包括手性色谱柱法、手性流动相添加剂法；所述手性色谱柱法涉及的色谱柱是O-9-(叔丁基氨基甲酯)奎宁为填充物的离子交换手性色谱柱、冠醚手性色谱柱或多糖衍生物涂敷型手性色谱柱；所述冠醚手性色谱柱为CHIRALPAK CROWNPAK CR(+)色谱柱；所述多糖衍生物涂敷型手性色谱柱为CHIRALPAK AD-H色谱柱。
2.根据权利要求1所述的用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，其特征在于，离子交换手性色谱柱为CHIRALPAK或其他品牌的QN-AX色谱柱。
3.根据权利要求1所述的用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，其特征在于，所述流动相中低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或一种以上组合物；酸为盐酸、磷酸、高氯酸、甲酸、冰醋酸、丙酸中的一种或一种以上组合物；碱为三乙胺、二乙胺或乙二胺中的一种或一种以上组合物。
4.根据权利要求3所述的用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，其特征在于，所述流动相中低级醇为甲醇，酸为冰醋酸；碱为三乙胺。
5.根据权利要求1所述的用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，其特征在于，所述控制方法能够检出0.01％以下的对氨基苯甲酰-L-谷氨酸和叶酸的光学异构体，获得光学纯度大于99.9％的叶酸。
6.根据权利要求1所述的用于高光学纯度叶酸制备过程的质量控制方法，其特征在于，离子交换手性色谱柱法，控制对氨基苯甲酰-L-谷氨酸及叶酸的光学纯度，以甲醇-冰醋酸-三乙胺100:2:3为流动相，流速为0.8～1.0ml/min，波长为280nm，柱温300℃，进样体积10～20μl。
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