CN114002352B - 叶酸与其光学异构体的分离检测方法 - Google Patents

叶酸与其光学异构体的分离检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及叶酸与其光学异构体的分离检测方法，属于叶酸的质量控制技术领域。本发明提供了叶酸与其光学异构体的分离检测方法，采用液相色谱法，色谱柱为两性离子交换型手性柱CHIRAL PAK ZWIX(+)，流动相为甲醇‑乙腈‑水＝(49～60)：(38～49)：(1～3)，v/v，且流动相中还添加了甲酸和二乙胺，甲酸：二乙胺摩尔比为2：1，流动相中甲酸的浓度为12.25～60mM。相较于现有技术，本发明提供的反相高效液相色谱检测方法具有流动相和稀释剂配制简单，易于操作，影响因素少，重现性好，灵敏度高，运行时间短，成本低等优点。

Description

叶酸与其光学异构体的分离检测方法
技术领域
本发明涉及叶酸与其光学异构体的分离检测方法，属于叶酸的质量控制技术领域。
背景技术
叶酸是一种水溶性维生素，分子式C19H19N7O6，分子量441.40，化学名为N-[4-[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶)甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸。在生物体中，蛋白质、核苷酸、泛酸的合成及分子的甲基化都需要一碳单位的参与，而叶酸是介导一碳单位转移极其重要的辅助因子，主要参与了嘌呤和嘧啶的从头合成，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。叶酸主要由三氯丙酮、2，4，5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐和对氨基苯甲酰谷氨酸为原料合成，其结构式为：
Figure BDA0003328179050000011
由于叶酸的结构含一个手性碳原子，化学合成过程中不可避免会引入一种光学异构体(D-叶酸)。在制药领域的叶酸不管是作为原料药或起始物料，其构型均为S构型，引入的光学异构体为R构型，化学名为(2R)-2-[4-[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基]苯甲酰基]戊二酸，分子式C19H19N7O6，分子量441.40，结构式为：
Figure BDA0003328179050000012
叶酸光学异构体的性质和结构与叶酸都很相似，光学异构体含量直接影响叶酸作为原料药或作为起始物料后续反应中间体甚至终产物的质量。因此，叶酸光学异构体含量控制对于叶酸的产品质量控制具有重要意义。
目前叶酸光学异构体含量的质量控制方法报道很少。CN112649524A公开了一种分离检测叶酸中叶酸及叶酸光学异构体的方法，其采用以硅胶表面共价键合O-9-(叔丁基氨基甲酰)奎宁为填料的色谱柱，流动相A(甲醇-乙腈＝40～60：40～60)和流动相B(醋酸-三乙胺＝2～4:2～4)进行梯度洗脱(流动相A-流动相B＝80～120:4～8)，检测波长280±10nm，稀释剂：四氢呋喃-甲醇-水-醋酸-三乙胺(10:80:10:2.4:3)，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：20～30℃，进样体积：5μl，供试品溶液浓度：0.3mg/ml，异构体和叶酸出峰时间分别为：约11min和15min，主峰塔板数：5996。该方法存在诸多明显的缺陷：流动相中三乙胺含量较高，易损害色谱柱；并且需要先配制流动相A和流动相B，然后再进行梯度洗脱，操作繁琐；稀释剂组分和配制复杂；柱温25℃，易受环境影响；主峰塔板数只有5996；供试品溶液浓度为0.3mg/ml，而光学异构体的定量限58ng/ml，占供试品溶液浓度的0.019％，检测灵敏度不足，存在漏检光学异构体的可能性。若采用上述方法，可能导致叶酸光学异构体的含量检测结果不够准确。
CN113063889A公开了一种叶酸对映异构体含量的检测方法，其采用阴离子交换手性色谱柱，流动相为甲醇-冰醋酸-三乙胺＝100：1：1，检测波长280nm，溶剂：28.6g/L碳酸钠溶液，稀释剂：0-80％甲醇，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样体积：20μl，供试品溶液浓度：1.0mg/ml，异构体和叶酸出峰时间分别为：约16min和30min，主峰塔板数：3501。该方法所采用的流动相中三乙胺含量同样偏高，易损害色谱柱；主峰塔板数只有3501；主成分和异构体的出峰时间分别是30min和16min，出峰时间太晚。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供叶酸与其光学异构体的分离检测方法。相较于现有技术，本发明提供的反相高效液相色谱检测方法具有流动相和稀释剂配制简单，易于操作，影响因素少，重现性好，灵敏度高，运行时间短，成本低；所用试剂对环境破坏小，对操作人员健康影响小；灵敏度高，检测结果准确上述至少一项优点。
本发明提供了叶酸与其光学异构体的分离检测方法，采用液相色谱法，色谱柱为两性离子交换型手性柱CHIRAL PAK ZWIX(+)，流动相为甲醇-乙腈-水＝(49～60)：(38～49)：(1～3)，v/v，且流动相中还添加了甲酸和二乙胺，甲酸：二乙胺摩尔比为2：1，流动相中甲酸的浓度为12.25～60mM。
进一步地，流动相为甲醇-乙腈-水＝60：38：(1～3)，v/v。
优选地，流动相为甲醇-乙腈-水＝60：38：2，v/v。
进一步地，流动相中甲酸的浓度为49～60mM。
优选地，流动相中甲酸的浓度为60mM。
进一步地，CHIRAL PAK ZWIX(+)的填料粒径3μm，内径3mm，长度250mm。
进一步地，检测波长设定为278～287nm。
优选地，检测波长设定为283～287nm。
进一步优选地，检测波长设定为285nm。在现有检测方法采用280±10nm的波长范围内，本发明进一步优选出285nm，检测结果证明有助于提高检测异构体的灵敏度。
进一步地，流动相流速为0.3～0.6ml/min。
优选地，流动相流速为0.45～0.55ml/min。
进一步优选地，流动相流速为0.5ml/min。
进一步地，柱温为38～42℃。在38～42℃的柱温条件下，高效液相色谱分离过程不易受环境影响，系统更加稳定。
优选地，柱温为40℃。
进一步地，配制供试品溶液的浓度为0.2～1.0mg/ml。
优选地，配制供试品溶液的浓度为0.3～0.6mg/ml。
更优选地，配制供试品溶液的浓度为0.4mg/ml。
进一步地，进样量为5～30μL。
优选地，进样量为5～10μL。
更优选地，进样量为5μl。
本发明优选供试品溶液的配制方法如下：先用氨试液溶解供试品，然后用甲醇稀释，得到供试品溶液。前期在尝试配制供试品溶液时总结得出，叶酸在碱性条件下易于溶解，但不能使用高强度的碱，否则损害色谱柱；叶酸在酸性条件下不稳定，易降解。发明人最终优选氨试液溶解叶酸。另一方面，经过多次试验优选出甲醇作稀释剂，由此有利于减小溶剂效应。上述配制方法既能充分溶解样品，同时能保证样品溶液的稳定性(可参见实施例3)，还有利于减小溶剂效应。
其中，所述氨试液由氨水根据《中国药典》2020版配制得到。
本发明优选采用主成分自身对照法测定叶酸和/或其光学异构体的含量。现有技术均采用面积归一化法，受其余杂质含量和主成分峰型影响，会导致异构体检测含量不准确，并不是最合适的叶酸光学异构体含量检测方法。
本发明提供了叶酸与其光学异构体的分离检测方法，至少具有以下有益技术效果：
1、采用本发明检测方法，流动相中甲酸和二乙胺的添加量低，可以减少色谱柱损害，延长色谱柱寿命。此外，流动相的组分简单常用，毒性低，配制简单，而且等度洗脱，系统稳定，操作更加简便。
2、叶酸和异构体出峰时间提前，减少运行时间，节约流动相和仪器色谱柱损耗成本。
3、叶酸和异构体的分离度和拖尾因子均符合要求，主峰理论板数大幅提高，柱效更高。
4、灵敏度大幅提高。供试液浓度0.4mg/ml，叶酸异构体定量限42.5ng/ml，仅占供试液浓度的0.001％，检测限21.2ng/ml，仅占供试液浓度的0.0005％，可有效检出叶酸异构体，且能够实现异构体的定量检测。
附图说明
图1为实施例1中初始色谱条件的系统适用性溶液典型色谱图；
图2为实施例1中色谱条件2的系统适用性溶液典型色谱图；
图3为实施例1中色谱条件3的系统适用性溶液典型色谱图；
图4为实施例1中色谱条件4的系统适用性溶液典型色谱图；
图5为实施例1中色谱条件5的系统适用性溶液典型色谱图；
图6为实施例1中色谱条件6的系统适用性溶液典型色谱图；
图7为实施例2中系统适用性溶液的色谱图；
图8为实施例3中供试品溶液放置0h的色谱图；
图9为实施例3中供试品溶液放置6h的色谱图；
图10为实施例3中供试品溶液放置12h的色谱图；
图11为实施例3中供试品溶液放置24h的色谱图；
图12为实施例4中定量限检测结果图；
图13为实施例4中检测限检测结果图；
图14为实施例6中标准曲线图；
图15为实施例7中叶酸样品溶液的色谱图；
图16为实施例7中对照品溶液的色谱图；
图17为实施例7中50％回收率溶液的色谱图；
图18为实施例7中100％回收率溶液的色谱图；
图19为实施例7中150％回收率溶液的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1色谱条件优化
本实施例中通过优化流动相中甲酸和二乙胺的浓度、甲醇和乙腈的比例以及稀释剂种类，有助于获得更好的分离检测效果。
配制系统适用性溶液：称取叶酸光学异构体杂质(以下也称杂质G、D-叶酸)对照品1.062mg，加氨试液0.1ml，用水溶解并定容至10ml，摇匀，作为杂质G储备液。称取叶酸5.38mg，加氨试液0.1ml，加杂质G储备液1ml，用水溶解并定容至10ml。
配制样品溶液：称取叶酸10.25mg，加氨试液0.1ml，用水溶解并定容至10ml，摇匀。
以下色谱柱均采用CHIRAL PAK ZWIX(+)(0.3cm*25cm，3μm)。另外，以初始色谱条件举例说明，“(25mM甲酸，12.5mM二乙胺)甲醇”表示甲醇中添加了25mM甲酸和12.5mM二乙胺；当流动相组成为甲醇：乙腈：水＝49:49:2时，流动相中甲酸浓度为12.25mM，二乙胺浓度为6.125mM。
表1不同色谱条件的系统适用性结果
Figure BDA0003328179050000051
Figure BDA0003328179050000061
Figure BDA0003328179050000071
从以上色谱条件及检测结果可以看出，采用本发明提供的液相色谱检测方法，流动相中二乙胺的添加量较低，每100mL流动相中只需添加大约0.1～0.5mL的二乙胺即可实现叶酸与其光学异构体的分离检测。相较于现有检测方法中1～3mL左右的三乙胺含量，本发明方法显然更有利于保护色谱柱。
其中，提高流动相中甲酸、二乙胺的浓度分别至24.5mM、12.25mM以上，叶酸及其光学异构体的出峰时间均较现有检测方法明显提前(参见色谱条件3～6)，使得本发明检测方法具有运行时间短，节约流动相和仪器色谱柱损耗成本的优势。
对比色谱条件2～4可以看出，随着流动相中甲酸和二乙胺的浓度增大，能够逐渐缩短叶酸及其光学异构体的出峰时间。流动相中甲酸、二乙胺的浓度分别提高至60mM、30mM时，出峰时间最短。
在此基础上，对比色谱条件4、色谱条件5可以看出，降低流动相中乙腈的比例，叶酸及其光学异构体的出峰时间进一步提前，且分离度略有增大，同时可以降低柱压。
对比色谱条件5、色谱条件6可以看出，稀释剂用甲醇替代水后，有利于减小溶剂效应，基线噪音波动更小，色谱峰峰型更好，叶酸及其光学异构体的分离度增大。
另外，前期在尝试配制供试品溶液时总结得出，叶酸在碱性条件下易于溶解，但不能使用高强度的碱，否则损害色谱柱；叶酸在酸性条件下不稳定，易降解。发明人最终优选氨试液溶解叶酸。另一方面，经过多次试验优选出甲醇作稀释剂，由此有利于减小溶剂效应。上述配制方法既能充分溶解样品，同时能保证样品溶液的稳定性(可参见实施例3)，还有利于减小溶剂效应。。
实施例2本发明检测方法的系统适用性
色谱柱：两性离子手性固定相为填充剂，CHIRAL PAK ZWIX(+)，3μm，3mm×250mm；
流动相：甲醇-乙腈-水＝(60：38：2)，其中含60mM甲酸+30mM二乙胺；
流速：0.5ml/min；
柱温：40℃；
检测波长：285nm；
进样量：5μl；
定量方法：主成分自身对照法。
供试品溶剂：氨试液；稀释剂：甲醇；供试液浓度：0.4mg/ml；先用氨试液溶解供试品，然后用甲醇稀释至0.4mg/ml，得到供试品溶液。
系统适用性溶液：取杂质G对照品约1mg，置100ml量瓶中，加氨试液0.1ml使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，用供试品溶液稀释至刻度，摇匀。
检测结果见表2。系统适用性溶液色谱图见图7。
表2系统适用性实验结果
组分 杂质G 叶酸
RT(min) 7.386 8.789
RRT 0.84 1.00
拖尾因子 1.32 1.19
分离度 N/A 4.449
理论板数 9184 11902
可以看出，按照实施例2的方法检测叶酸样品，主峰理论板数大幅提高至11902；光学异构体和叶酸的保留时间分别为7.386min、8.789min，出峰时间较现有检测方法大幅提前。
实施例3本发明检测方法的溶液稳定性
检测条件参照实施例2。
供试品溶液的配制参照实施例2。
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
对照溶液、供试品溶液于5℃放置0h、6h、12h、24h时分别各进一次样，供试品溶液的色谱图见图8～图11。
表3稳定性试验结果
Figure BDA0003328179050000091
Figure BDA0003328179050000101
结果显示，对照溶液和供试品溶液于5℃放置24h，对照溶液主峰面积和供试品溶液杂质G峰面积与0h原始峰面积比值在99.4％～101.8％，说明对照溶液和供试品溶液的稳定性较好。
可以看出，本发明选择的供试品溶剂和稀释剂得当，既能充分溶解样品，同时也能保证样品溶液的稳定性。
实施例4本发明检测方法的定量限和检测限
检测条件参照实施例2。
步骤(1)：取叶酸异构体(D-叶酸)对照品约1mg，置100ml量瓶中，加氨试液0.1ml使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤(2)：取步骤(1)溶液1ml，置10ml量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置50ml量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀。精密量取5μl，注入液相色谱仪，S/N大于等于10:1时，作为叶酸异构体的定量限，浓度为42.5ng/ml，与供试品浓度的比值106ppm。定量限检测图谱见图12。
步骤(3)：取步骤(2)溶液5ml，置10ml量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀。注入液相色谱仪，S/N大于等于3:1时，作为叶酸异构体的检测限，浓度为21.2ng/ml，与供试品浓度的比值53ppm。检测限检测图谱见图13。
可以看出，采用本发明检测方法，叶酸异构体的定量限(42.5ng/ml)较现有技术(56～58ng/ml)更低，检测灵敏度提高，可有效地定量检测叶酸异构体。
实施例5本发明检测方法的耐用性
本实施例中通过更换同类型同品牌不同批号的色谱柱，改变流动相组成比例、流速和柱温考察本发明检测方法的耐用性。
表4耐用性实验结果
Figure BDA0003328179050000102
Figure BDA0003328179050000111
Figure BDA0003328179050000121
Figure BDA0003328179050000131
结果表明：改变流速、柱温和水相比例等参数对叶酸杂质G含量无明显影响，对杂质G的RRT也无明显影响，说明本发明方法耐用性良好。
实施例6本发明检测方法的线性与范围
检测条件参照实施例2。
步骤(1)：取叶酸异构体对照品约1mg，置100ml量瓶中，加氨试液0.1ml使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤(2)：精密量取步骤(1)溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置10ml量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为50％、100％、150％、200％、250％的线性溶液。
精密量取实例2中的定量限及各线性溶液各5ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C(μg/ml)为横坐标，以峰面积A为纵坐标，进行线性回归，标准曲线如图14所示。
实施例7本发明检测方法的准确度
检测条件参照实施例2。
步骤(1)：取叶酸样品约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加氨试液0.1ml使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤(2)：精密量取步骤(1)溶液2ml，置10ml量瓶中，加入稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤(3)：取杂质G对照品约1mg，置100ml量瓶中，加氨试液0.1ml使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤(4)：精密量取1ml骤(3)溶液，置5ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。
步骤(5)：50％回收率溶液：精密量取步骤(1)2ml，置10ml量瓶中，加入杂质G溶液1ml，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，同法制备3份。
步骤(6)：100％回收率溶液：精密量取步骤(1)2ml，置10ml量瓶中，加入杂质G溶液2ml，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，同法制备3份。
步骤(7)：150％回收率溶液：精密量取步骤(1)2ml，置10ml量瓶中，加入杂质G溶液3ml，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，同法制备3份。
精密量取上述步骤(2)、(4)、(5)、(6)、(7)配制的溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，分别见图15、图16、图17、图18、图19。
表5准确度实验结果
Figure BDA0003328179050000141
可以看出，本发明检测方法准确度高，符合中国药典2020版四部通则中的准确度要求。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (22)

1.叶酸与其光学异构体的分离检测方法，其特征是：采用液相色谱法，色谱柱为两性离子交换型手性柱CHIRAL PAK ZWIX(+)，流动相为甲醇-乙腈-水＝(49～60)：(38～49)：(1～3)，v/v，且流动相中还添加了甲酸和二乙胺，甲酸：二乙胺摩尔比为2：1，流动相中甲酸的浓度为12.25～60mM。
2.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相为甲醇-乙腈-水＝60：38：(1～3)，v/v。
3.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相为甲醇-乙腈-水＝60：38：2，v/v。
4.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相中甲酸的浓度为24.5～60mM。
5.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相中甲酸的浓度为49～60mM。
6.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相中甲酸的浓度为60mM。
7.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：CHIRAL PAK ZWIX(+)的填料粒径3μm，内径3mm，长度250mm。
8.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：检测波长设定为278～287nm。
9.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：检测波长设定为283～287nm。
10.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：检测波长设定为285nm。
11.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相流速为0.3～0.6ml/min。
12.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相流速为0.45～0.55ml/min。
13.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：流动相流速为0.5ml/min。
14.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：柱温为38～42℃。
15.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：柱温为40℃。
16.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：配制供试品溶液的浓度为0.2～1.0mg/ml；进样量为5～30μL。
17.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：配制供试品溶液的浓度为0.3～0.6mg/ml。
18.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：配制供试品溶液的浓度为0.4mg/ml。
19.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：进样量为5～10μL。
20.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：进样量为5μl。
21.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：先用氨试液溶解供试品，然后用甲醇稀释，得到供试品溶液。
22.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：采用主成分自身对照法测定叶酸和/或其光学异构体的含量。
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