CN114137092A - 一种测定丙酚替诺福韦异构体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效液相法测定丙酚替诺福韦异构体的方法，所述高效液相色谱条件为：使用手性C18反相硅胶色谱柱，检测波长为260nm，流速为0.1‑1.0ml/min，柱温为20‑40℃，进样量为5‑50μl，流动相由A相和B相组成；其中，所述A相为有机溶剂，B相为pH6‑9的水溶液，所述A相:B相的体积比为10:90‑50:50。本发明采用普适性强的手性C18反相硅胶色谱柱对丙酚替诺福韦难以分离的对应异构体杂质进行高效液相色谱检测，对设备要求低，通用性高，成本低廉，适合大规模工业检测；同时，优化洗脱条件，能够同步检测对应异构体杂质1和其他非对映异构体，简化了操作步骤，减少了检测频次，节省了检测时间及费用，大大节约了产业化质量控制成本。

Description

一种测定丙酚替诺福韦异构体的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体而言，本发明涉及一种高效液相色谱法(HPLC法)测定丙酚替诺福韦(TAF)异构体的方法。
背景技术
丙酚替诺福韦(简称TAF)由吉利德公司研发，2019年5月9日获得国家药品监督管理局(NMPA)批准上市，用于治疗伴有代偿性肝病的慢性乙肝(HBV)感染的患者。
Figure BDA0002665361040000011
CHAPMAN等(Nucleosides and Nucleic Acids，(20(4-7):621-628,20010401)公开了丙酚替诺福韦的合成方法，步骤如下：
Figure BDA0002665361040000012
在上述路线中，步骤3生成具有3个手性中心的TAF，共有8个异构体可能产生，因此，有必要对可能产生的异构体杂质进行测定，以保障丙酚替诺福韦的产品质量。
CN107179355A公开了一种分离检测丙酚替诺福韦有关物质的方法，采用C18键合亚乙基桥杂化硅胶色谱柱，以pH值1.0-7.0的缓冲盐作为流动相进行梯度洗脱，能够对特定的非对映异构体杂质进行分离，但是并未对对映异构体进行全面检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相法测定丙酚替诺福韦异构体的方法，所述高效液相色谱条件为：使用手性C18反相硅胶色谱柱，检测波长为260nm，流速为0.1-1.0ml/min，柱温为20-40℃，进样量为5-50μl，流动相由A相和B相组成；其中，所述A相为有机溶剂，B相为pH6-9的水溶液，所述A相:B相的体积比为10:90-50:50。
本发明优选技术方案中，所述洗脱方式选自等度洗脱或梯度洗脱，优选为等度洗脱。
本发明优选技术方案中，所述洗脱时间≥40min，更优选为≥45min。
本发明优选技术方案中，所述手性C18反相硅胶色谱柱的柱长为250mm×4.6mm，填料粒径为3-10μm，优选为5μm。
本发明优选技术方案中，所述手性C18反相硅胶色谱柱的填料选自硅胶表面共价键合有纤维素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)。
本发明优选技术方案中，所述A相：B相的体积比为20:80-40:60。
本发明优选技术方案中，所述流动相A选自乙腈、甲醇、乙醇的一种或其组合。
本发明优选技术方案中，所述流动相B含有pH调节剂，所述pH调节剂选自二乙胺、三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种或其组合。
本发明优选技术方案中，所述流动相B选自纯化水。
本发明优选技术方案中，所述柱温为25-35℃，优选为30℃。
本发明优选技术方案中，所述进样量优选为5-15μl，优选为10μl。
本发明优选技术方案中，所述异构体选自表1中杂质1。
本发明的优选技术方案中，所述异构体选自表1中杂质1和/或2中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述异构体选自表1中杂质1-5的任一种或其组合。
表1
Figure BDA0002665361040000031
Figure BDA0002665361040000041
本发明的另一目的在于提供所述杂质1在丙酚替诺福韦或其中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述杂质1和/或2在丙酚替诺福韦或其中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述杂质1-5的任一种或其组合在丙酚替诺福韦或其中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述测定丙酚替诺福韦异构体的方法在丙酚替诺福韦或中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
本发明具有下述有益技术效果：
1.采用普适性强的手性C18反相硅胶色谱柱对丙酚替诺福韦难以分离的对映异构体杂质1进行高效液相色谱检测，对设备要求低，通用性高，成本低廉，适合大规模工业检测。
2.优化洗脱条件的同时(等度洗脱)，能够同步检测对映异构体杂质1和其他非对映异构体，简化了操作步骤，减少了检测频次，节省了检测时间及费用，大大节约了产业化质量控制成本。同时，为丙酚替诺福韦药品质量控制及安全用药提供了有力保障，具有广阔的产业推广前景。
附图说明
图1实施例2系统适用性HPLC色谱图
具体实施方式
下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例“杂质1-5”所对应的化合物及结构式如表1所示。
实验例1流动相的优化
色谱柱：Chiralpak IC反相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)
检测波长260nm，流速：0.5ml/min，柱温：30℃，进样量：10μl；
对不同的流动相进行考察，结果如表2。
表2
Figure BDA0002665361040000051
由上表可知，采用乙腈:水的流动相即可对峰进行良好分离，也可采用pH值调节剂对洗脱时间及峰形进行调整，皆可满足分离度要求(≥1.5)。
实验例2系统适用性考察
色谱柱：Chiralpak IC反相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)
流动相(A相:B相)：乙腈：水＝28：72，等度洗脱，洗脱时间45min
检测波长260nm，流速：0.5ml/min，柱温：30℃，进样量：10μl。
系统适用性溶液：取TAF对照品和杂质1对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中分别约含1mg和2μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。供试品溶液：取本品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每lml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，详见附图1。
检测结果如表3所示。
表3系统适用性测定结果
Figure BDA0002665361040000061
实施例3其他方法学考察
(1)定量限与检测限
取主成分TAF及杂质1对照品母液(0.002mg/ml)，用甲醇逐级稀释，进行分析，当信噪比为10：1时为定量限，当信噪比约为3:1时为检测限，检测灵敏度均符合要求。
表4
成分 定量限(μg/ml) 检测限(μg/ml)
TAF 0.082 0.024
杂质1 0.080 0.024
(2)线性与范围
取TAF和杂质1对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成每1ml含有10.0μg的溶液，用甲醇逐级稀释成系列溶液，分别精密量取10μl，进样。主成分TAF及杂质1的峰面积与浓度在1ug-10ug范围内呈良好的线性关系，r均大于0.9999。
(3)精密度与重复性
取TAF和杂质1对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成每1ml含有2.0μg的溶液，连续进样6次，分别精密量取10μl，进样。测定结果RSD％分别为0.51％和0.50％，方法精密度及重复性良好。
(4)回收率与准确度
取TAF供试品25mg，置于25ml容量瓶中，分别精密加入浓度为0.025mg/ml的杂质1母液(0.002mg/ml)1ml、2ml和5ml，作为分别含杂质1为限度浓度50％、100％、250％的回收率溶液。每次浓度溶度平行配置3份，平均回收率为98.9％，RSD4.7％。
(5)溶液稳定性
取TAF供试品溶液(0.002mg/ml)在室温条件下分别于0h、1.5h、3h、6h、9h、12h、15h、21h、27h进样检测，各考察时间点测得的峰面积和面积归一化含量无显著变化，且未检出新的杂质，表明供试品溶液室温放置27小时，溶液稳定性良好。
(6)耐用性
TAF供试品溶液耐用性考察表明，流速和流动相的pH值的微小变化对测定结果无显著影响，各个杂质在不同条件下测定结果基本一致。
实施例4 TAF样品中异构体的检测
采用CHAPMAN等(Nucleosides and Nucleic Acids，(20(4-7):621-628,20010401)中的合成方法合成TAF样品，分别取步骤3的TAF粗品及步骤4的TAF精制品作为待测样品1和2。
精密称取待测样品适量，加流动相A溶解并定量稀释制成1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，用流动相A定量稀释制成1μg/ml的溶液，作为对照溶液。
精密量取对照溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，采用实施例2的色谱条件进行检测，检测结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002665361040000081

Claims (10)

1.一种高效液相法测定丙酚替诺福韦异构体的方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件为：使用手性C18反相硅胶色谱柱，检测波长为260nm，流速为0.1-1.0ml/min，柱温为20-40℃，进样量为5-50μl，流动相由A相和B相组成；其中，所述A相为有机溶剂，B相为pH6-9的水溶液，所述A相:B相的体积比为10:90-50:50。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的洗脱方式选自等度洗脱或梯度洗脱；优选地，所述方法的所述洗脱时间≥40min，更优选为≥45min。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述手性C18反相硅胶色谱柱的柱长为250mm×4.6mm，填料粒径为3-10μm，优选为5μm；优选地，所述填料选自硅胶表面共价键合有纤维素-三(3，5-二氯苯基氨基甲酸酯)。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述A相：B相的体积比为20:80-40:60；优选地，所述流动相A选自乙腈、甲醇、乙醇的一种或其组合；所述流动相B选自纯化水或者所述流动相B含有pH调节剂，所述pH调节剂选自二乙胺、三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种或其组合。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述柱温为25-35℃，优选为30℃；优选地，所述进样量优选为5-15μl，优选为10μl。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述异构体选自如下结构的杂质1
Figure FDA0002665361030000011
优选地，所述异构体选自杂质1和/或如下结构的杂质2中的任一种或其组合
Figure FDA0002665361030000021
更优选地，所述异构体选自杂质1-5的任一种或其组合
Figure FDA0002665361030000022
7.一种如权利要求1-6任一项所述的杂质1在丙酚替诺福韦或其中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
8.一种如权利要求1-6任一项所述的杂质1和/或2在丙酚替诺福韦或其中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
9.一种如权利要求1-6任一项所述的杂质1-5的任一种或其组合在丙酚替诺福韦或其中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
10.一种权利要求1-6任一项所述测定丙酚替诺福韦异构体的方法在丙酚替诺福韦或中间体质量控制和/或安全用药中的应用。
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