CN114646711B - 一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液；b)将步骤a)得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定；所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱分离模式的色谱柱；所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，包括：弱洗脱剂60％～100％；洗脱调节剂40％～0％。与现有技术相比，本发明提供的检测方法采用优化的色谱条件，能将羟甲基苯妥英与其杂质苯妥英进行有效分离与快速测定，可被广泛应用于羟甲基苯妥英的质量控制以及磷苯妥英钠的体内药动学研究。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，是涉及一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法。
背景技术
磷苯妥英钠，化学名为2,4-咪唑啉二酮-5,5-二苯基-3-[(膦酰氧基)甲基]二钠盐，是由兰伯特公司开发的用于抗癫痫或心律失常的药物，在体内可转化为苯妥英钠而发挥作用。
羟甲基苯妥英钠是一种医药中间体，常出现在磷苯妥英钠原料药的制备工艺中。同时此化合物也属于磷苯妥英钠在人体内生物代谢的中间产物。
韩莹、黄淑云等在天津理工大学学报(第26卷，第2期，2010年)中报道了磷苯妥英钠的合成工艺，以苯妥英为起始原料，先制备了中间体羟甲基苯妥英，再经氯化、缩合、氢化、成盐制得磷苯妥英钠。这几种化合物的结构分别如下：
从此工艺可知，苯妥英是羟甲基苯妥英合成过程中的工艺杂质。从目前公开的文献来看，没有测定羟甲基苯妥英中苯妥英的报道。羟甲基苯妥英与苯妥英的极性极为接近，在普通液相色谱体系中无法得到较好的分离。同时，在多种溶剂中，羟甲基苯妥英有逐渐转变成苯妥英的趋势，因此常规方法无法达到高效、准确检测苯妥英的要求。
羟甲基苯妥英中苯妥英杂质能否被高效、准确的分析检测，直接关系到羟甲基苯妥英的质量评价与工艺评价，也间接影响磷苯妥英钠的经济、安全、有效。对此工艺杂质进行有效分离测定，对提高工艺水平，提升药物经济价值与质量水平有着重大意义。
Valentino J.Stella在《Prodrugs:Challenges and Rewards(Part 2，2007年)》一书中提到体内磷苯妥英钠可在碱性、磷酸酶作用下转化为羟甲基苯妥英，进而自发转化为苯妥英。在药物的体内研究领域，一种能高效分离羟甲基苯妥英与苯妥英并定量检测的技术，也有较大的应用潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，本发明提供的检测方法可以测定磷苯妥英钠合成过程中，中间体羟甲基苯妥英的杂质苯妥英的含量，有利于筛选反应条件，控制中间产品的质量，从而解决磷苯妥英钠中间体工艺评估与质量控制问题。
本发明提供了一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，包括以下步骤：
a)将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液；
b)将步骤a)得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定；
所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱分离模式的色谱柱；
所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，包括：
弱洗脱剂60％～100％；
洗脱调节剂40％～0％。
优选的，步骤a)中所述酸性溶剂由体积比为100：(0.001～10)的有机溶剂和酸性添加剂组成；所述酸性添加剂选自磷酸、甲酸、高氯酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或多种。
优选的，所述色谱柱的填充剂为经修饰的化学基团键合硅胶，这些基团包括氨基型、酰胺型和两性离子型中的一种或多种。
优选的，所述色谱柱选自TSKgel Amide-80、InfinityLab Poroshell 120HILIC-Z、Acchrom XAmide、AdvanceBio、XBridge Amide或Venusil HILIC。
优选的，所述弱洗脱剂为乙腈和/或丙酮；所述洗脱调节剂为异丙醇、甲醇、乙醇和水中的一种或多种。
优选的，步骤b)中所述高效液相色谱检测的流动相流速为0.3ml/min～1.5ml/min。
优选的，步骤b)中所述高效液相色谱检测的柱温为20℃～50℃，进样量为1μl～100μl。
优选的，步骤b)中所述高效液相色谱检测的检测器包括紫外-可见分光检测器、质谱检测器、蒸发光散射检测器、电雾式检测器、示差折光检测器、电化学检测器和荧光检测器中的一种或多种。
优选的，步骤b)中所述高效液相色谱检测的检测波长为190nm～250nm。
优选的，所述检测方法既可用于羟甲基苯妥英中苯妥英的测定，也可用于磷苯妥英钠生物代谢样本中羟甲基苯妥英、苯妥英的同时测定。
本发明提供了一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液；b)将步骤a)得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定；所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱分离模式的色谱柱；所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，包括：弱洗脱剂60％～100％；洗脱调节剂40％～0％。与现有技术相比，本发明提供的检测方法采用优化的色谱条件，能将羟甲基苯妥英与其杂质苯妥英进行有效分离与快速测定，可被广泛应用于羟甲基苯妥英的质量控制以及磷苯妥英钠的体内药动学研究。
附图说明
图1为实施例1中空白溶液的高效液相色谱图；
图2为实施例1中对照品的高效液相色谱图；
图3为实施例1中供试品的高效液相色谱图；
图4为实施例3中供试品的高效液相色谱图；
图5为实施例5中供试品的高效液相色谱图；
图6为实施例6中供试品的高效液相色谱图；
图7为实施例7中供试品的高效液相色谱图；
图8为实施例8中供试品的高效液相色谱图；
图9为实施例9中供试品的高效液相色谱图；
图10为实施例10中供试品的高效液相色谱图；
图11为实施例11中供试品的高效液相色谱图；
图12为实施例12中供试品的高效液相色谱图；
图13为实施例13中供试品的高效液相色谱图；
图14为实施例14中供试品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，包括以下步骤：
a)将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液；
b)将步骤a)得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定；
所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱分离模式的色谱柱；
所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，包括：
弱洗脱剂60％～100％；
洗脱调节剂40％～0％。
本发明首先将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液。在本发明优选的实施例中，所述待测样品为羟甲基苯妥英粗品，其中残留有少量苯妥英杂质；本发明使用这种样品可以更好地展示本发明的特点，同时在计算回收率时，将这些残留杂质作为背景值进行了扣除。在此基础上，该检测方法优选为羟甲基苯妥英中苯妥英的检测方法。
在本发明中，所述酸性溶剂优选由体积比为100：(0.001～10)的有机溶剂和酸性添加剂组成，更优选由体积比为100：(0.01～1)的有机溶剂和酸性添加剂组成。本发明对所述有机溶剂的种类和来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的、能够与流动相互溶且不影响检测结果的有机溶剂即可；优选为乙腈或与所述流动相相同的有机溶剂。
在本发明中，所述酸性添加剂优选为磷酸、甲酸、高氯酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或多种，更优选为磷酸和/或甲酸。本发明对所述酸性添加剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的上述磷酸、甲酸、高氯酸、盐酸和三氟乙酸的市售商品即可。
本发明对所述混合的方式没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的将待测样品用酸性溶剂定容的技术方案即可。在本发明优选的实施例中，所述供试品溶液的制备过程具体为：
取羟甲基苯妥英，加稀释剂(取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀)适量，用稀释剂稀释至刻度，溶解制成每1ml中含20～200μg的溶液，优选为每1ml中含100μg的溶液；摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。此外，另取苯妥英适量，用上述稀释剂稀释制成每1ml中含0.2～2μg的溶液(相对于羟甲基苯妥英的1％)，作为对照品溶液。上述优选的实施例中，所述稀释剂即上述技术方案中所述的酸性溶剂。
得到所述供试品溶液后，本发明将得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定。在本发明中，所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)分离模式的色谱柱；所述色谱柱的填充剂优选为经修饰的化学基团键合硅胶，这些基团包括氨基型、酰胺型和两性离子型中的一种或多种。
在本发明中，所述色谱柱优选为TSKgel Amide-80、InfinityLab Poroshell120HILIC-Z、Acchrom XAmide、AdvanceBio、XBridge Amide或Venusil HILIC，更优选为TSKgel Amide-80或AdvanceBio。本发明对所述色谱柱的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的上述可以实现HILIC模式的分离技术的色谱柱的市售品即可。
在本发明中，所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，优选包括：
弱洗脱剂60％～100％；
洗脱调节剂40％～0％。本发明通过上述流动相采用等度洗脱，本发明对此没有特殊限制。
在本发明一个优选的实施例中，所述流动相为弱洗脱剂，记为流动相A；所述弱洗脱剂优选为乙腈和/或丙酮，更优选为乙腈；本发明对所述弱洗脱剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的上述乙腈和丙酮的市售商品即可。
在本发明另一个优选的实施例中，所述流动相为：
弱洗脱剂70％～95％；
洗脱调节剂30％～5％；其中，弱洗脱剂记为流动相A，洗脱调节剂记为流动相B；所述弱洗脱剂优选为乙腈和/或丙酮，更优选为乙腈，本发明对所述弱洗脱剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的上述乙腈和丙酮的市售商品即可；所述洗脱调节剂优选为异丙醇、甲醇、乙醇和水中的一种或多种，更优选为甲醇，本发明对所述洗脱调节剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的上述异丙醇、甲醇和乙醇的市售商品即可。
在本发明中，所述高效液相色谱检测的流动相流速优选为0.3ml/min～1.5ml/min，更优选为0.6ml/min～1.2ml/min。
本发明对所述高效液相色谱检测的柱温和进样量没有特殊限制；其中，所述柱温可按照色谱柱的使用要求范围来选用，优选为20℃～50℃，更优选为25℃～35℃；在本发明优选的实施例中，所述高效液相色谱检测的柱温为30℃；所述进样量优选为1μl～100μl，更优选为1μl～3μl；在本发明优选的实施例中，所述高效液相色谱检测的进样量为2μl。
在本发明中，所述高效液相色谱检测的检测器优选包括紫外-可见分光检测器(包括二极管阵列检测器)、质谱检测器、蒸发光散射检测器、电雾式检测器、示差折光检测器、电化学检测器和荧光检测器中的一种或多种，更优选为紫外-可见分光检测器、质谱检测器、蒸发光散射检测器、电雾式检测器、示差折光检测器、电化学检测器或荧光检测器。
在本发明中，所述高效液相色谱检测的检测波长优选为190nm～250nm，更优选为205nm～230nm。
本发明提供的检测方法采用高效液相色谱仪(HPLC)进行测定，其具体操作步骤主要包括：(1)取待测样品制成供试品溶液；(2)取供试品溶液采用仪器检测。该检测方法既可用于羟甲基苯妥英中苯妥英的测定，也可用于磷苯妥英钠生物代谢样本中羟甲基苯妥英、苯妥英的同时测定。
本发明的优势在于，将极性近似难于分离的羟甲基苯妥英与苯妥英有效分离，并能快速准确的给予定量；主要解决的技术问题包括：
(1)羟甲基苯妥英与苯妥英难以有效分离的问题：在液相色谱法中，利用不同化合物极性的不同，在流动相的作用下可以达到分离混合物的效果；因羟甲基苯妥英与苯妥英极性相近，在绝大部分市面常见色谱柱，如C18柱、C8柱、CN柱、phenyl柱、硅胶柱、凝胶柱、离子交换柱等上均无法获得足够的分离；采用具有特殊填料的色谱柱与适宜的流动相才能达到可接受的分离效果。
(2)羟甲基苯妥英在测定过程中不稳定的问题：在溶液状态中，羟甲基苯妥英有转变为苯妥英的倾向，这给准确定量造成困难；采用酸性溶剂制备供试品溶液，可以抑制这种转变，使羟甲基苯妥英在测定过程中保持相对稳定的状态，这避免了检测结果不准确的问题；需要说明的是，通常在处理含药血浆样品时，有加入磷酸的做法，这是为了使药物能更好的从血浆蛋白中释放游离，这与本发明中加入酸性溶剂的目的是完全不同的。
(3)本法采用高效液相色谱法的技术路线，供试品溶液的配制方法简单，流动相仅使用最常见的色谱溶剂，不需要添加缓冲盐或者三氟乙酸等扫尾剂；整个实验过程耗时约0.5小时，对操作技能没有苛刻要求；因而达到耗时短、定量快的效果。
上述问题的综合解决，获得了一个理想的检测方法，能快速将极性近似不易分离的羟甲基苯妥英与苯妥英有效分离，检测过程中羟甲基苯妥英能保持相对稳定，从而确保了结果稳定重现；同时此法还具有高效液相色谱法普遍具有的灵敏度高的特点，至少能监测到供试品中0.01％(m/m)含量水平的杂质；此外，此法既可用于羟甲基苯妥英的杂质测定，也可用于磷苯妥英钠的体内药动学研究。
本发明提供了一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液；b)将步骤a)得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定；所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱分离模式的色谱柱；所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，包括：弱洗脱剂60％～100％；洗脱调节剂40％～0％。与现有技术相比，本发明提供的检测方法采用优化的色谱条件，能将羟甲基苯妥英与其杂质苯妥英进行有效分离与快速测定，可被广泛应用于羟甲基苯妥英的质量控制以及磷苯妥英钠的体内药动学研究。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的主要实验仪器包括：
HPLC：安捷伦1260Ⅱ；
输液泵：1260Quat Pump；
检测器：1260VWD；
色谱分析处理系统：OpenLAB CDS Version：2.2。
实施例1
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置100ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取苯妥英10mg，置25ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为苯妥英贮备液，精密量取0.5ml，置100ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取稀释剂作为空白溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图1、图2、图3，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为5.8min，苯妥英的保留时间约为7.1min。
实施例2
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置10ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为未加标供试品溶液。
取苯妥英10mg，置25ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置20ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为苯妥英贮备液。精密量取苯妥英贮备液1.0ml，置10ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取羟甲基苯妥英粗品10mg，平行3份，分别置10ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml容量瓶中，各精密加入苯妥英贮备液0.8ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液(1～3)。
取羟甲基苯妥英粗品10mg，平行3份，分别置10ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml容量瓶中，各精密加入苯妥英贮备液1.0ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液(4～6)。
取羟甲基苯妥英粗品10mg，平行3份，分别置10ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml容量瓶中，各精密加入苯妥英贮备液1.2ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液(7～9)。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、未加标供试品溶液、对照品溶液、加标供试品溶液分别进样，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算未加标供试品溶液、加标供试品溶液(1～9)中苯妥英的含量，依次作为背景值，测得值(1～9)。再结合苯妥英加入量，计算各加标回收率。
表1回收率结果
实施例3
色谱条件：
色谱柱：AdvanceBio(4.6×250mm，2.7μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置100ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图4，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为10.2min，苯妥英的保留时间约为11.9min。
实施例4
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸10μl，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为6.0min，苯妥英的保留时间约为7.3min。
实施例5
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入甲酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图5，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为5.9min，苯妥英的保留时间约为7.2min。
实施例6
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈-甲醇(95：5)。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈-甲醇(95：5)1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图6，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为5.3min，苯妥英的保留时间约为6.3min。
实施例7
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.6ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图7，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为8.4min，苯妥英的保留时间约为10.3min。
实施例8
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：230nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图8，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为5.9min，苯妥英的保留时间约为7.2min。
实施例9
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈-甲醇(90：10)。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图9，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为4.0min，苯妥英的保留时间约为4.6min。
实施例10
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈-甲醇(70∶30)。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图10，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为3.3min，苯妥英的保留时间约为3.4min。
实施例11
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.3ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图11，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为20.3min，苯妥英的保留时间约为26.7min。
实施例12
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：1.2ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：205nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图12，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为5.0min，苯妥英的保留时间约为6.5min。
实施例13
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：190nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图13，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为6.0min，苯妥英的保留时间约为7.9min。
实施例14
色谱条件：
色谱柱：TSKgel Amide-80(4.6×250mm，5μm)。
流动相：乙腈。
流速：0.8ml/min。
柱温：30℃。
检测波长：250nm。
进样量：2μl。
稀释剂：取乙腈1000ml，加入磷酸1.0ml，混匀。
溶液配制：取羟甲基苯妥英粗品10mg，置50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
测定法：按上述色谱条件试验，取空白溶液、供试品溶液照上述方法分别进样，记录色谱图，见图14，其中，羟甲基苯妥英的保留时间约为6.6min，苯妥英的保留时间约为9.1min。
综上，本发明提供的检测方法，可以检测羟甲基苯妥英中的杂质苯妥英，色谱峰分离度、峰形等均良好，填补了分离检测磷苯妥英钠关键合成中间体的杂质的技术空白，可有效用于磷苯妥英钠合成过程中羟甲基苯妥英质量的监测和控制。
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (2)
1.一种羟甲基苯妥英相关杂质的检测方法，包括以下步骤：
a）将待测样品与酸性溶剂混合，得到供试品溶液；所述酸性溶剂由体积比为100：（0.001~10）的有机溶剂和酸性添加剂组成；所述酸性添加剂选自磷酸、甲酸、高氯酸、盐酸和三氟乙酸中的一种或多种；
b）将步骤a）得到的供试品溶液进行高效液相色谱检测，实现羟甲基苯妥英与其相关杂质的分离与测定；
所述高效液相色谱检测的色谱柱为支持亲水相互作用色谱分离模式的色谱柱；
所述高效液相色谱检测的流动相按体积百分比计，包括：
弱洗脱剂70%~100%；
洗脱调节剂30%~0%；
所述色谱柱选自TSKgel Amide-80或AdvanceBio；
所述弱洗脱剂为乙腈；所述洗脱调节剂为甲醇；
所述高效液相色谱检测的流动相流速为0.3ml/min~1.2ml/min；
所述高效液相色谱检测的柱温为30℃，进样量为2μl；
所述高效液相色谱检测的检测器为紫外-可见分光检测器；
所述高效液相色谱检测的检测波长为190nm~250nm；
所述羟甲基苯妥英相关杂质为苯妥英。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法既可用于羟甲基苯妥英中苯妥英的测定，也可用于磷苯妥英钠生物代谢样本中羟甲基苯妥英、苯妥英的同时测定。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101105479A (zh) * | 2007-08-10 | 2008-01-16 | 复旦大学附属华山医院 | 一种测定人血浆中苯妥英及其前体药物和代谢物的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 磷苯妥英钠合成工艺的研究;韩莹 等;天津理工大学学报;第26卷(第02期);第61-62页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114646711A (zh) | 2022-06-21 |
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