CN109946396B - 一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法 - Google Patents
一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种采用高效液相色谱法测定比阿培南含量和/或有关物质的方法，所述方法采用由A液和B液组成的体系进行梯度洗脱，其中所述A液为磷酸盐水溶液，B液为乙腈或甲醇‑乙腈的混合溶液。相比现有技术，本发明所述方法在使比阿培南与杂质、杂质与杂质实现基线分离的同时，能够分离、检测到尽可能多的杂质。采用本发明的方法得到的测定结果准确，并能同时测定比阿培南有关物质和聚合物杂质的含量。此外，本发明的方法具有优良的批与批之间和柱与柱之间的重现性，适合工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法。
背景技术
比阿培南(Biapenem)是一种由日本Lederle公司和美国氰胺公司共同研发的具有广谱的抗菌活性的1-β甲基型碳青霉烯类抗生素。比阿培南于2002年在日本批准上市，商品名为“Omegacin”，化学名为(1R,5S,6S)-2-[(6,7-二氢-5H-吡唑[1,2-a][1,2,4]-三唑鎓-6-基)硫代]-6-[(R)-1-羟乙基]-1-甲基碳青霉-2-烯-3-羧酸盐，结构如(I)所示：
有关物质(也称为杂质)，其主要是指在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。然而，存在于碳青霉烯类抗生素中的开环降解物、酸解产物、聚合物等杂质是引起过敏的主要原因。因此，比阿培南中的有关物质研究是其质量研究中的关键性项目之一。理想的比阿培南质量检测方法，应该在保证比阿培南与杂质实现基线分离的同时，分离、检测到尽可能多的杂质。
在现有技术中，由于高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法具有简便、灵敏、快速、准确和重现性好等特点，已将其广泛用于比阿培南的含量测定和质量控制，其中：
公开号为CN 105277630 A的中国发明专利申请公开了一种比阿培南的含量及有关物质的测定方法，其采用高效液相色谱仪、紫外检测器、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱检测，分别采用不同的流动相和色谱柱对比阿培南药物中的总杂、聚合物杂质以及有关物质A和有关物质B进行测定。
张菁、邢亮彬，中国抗生素杂志2006年9月第31卷第9期，p565-566，公布了HPLC法测定注射用比阿培南的含量及有关物质的方法，其采用高效液相色谱仪，Agilent 1100色谱系统，使用十八烷基硅烷化硅胶(ODS)色谱柱，以0.02mol/L乙酸钠溶液(用10％乙酸调节至pH 7.0±0.1)和乙腈体积比＝100:3为流动相，检测波长为220nm。
然而，上述公开的两种方法均采用等度洗脱，其不足之处在于：1)部分杂质会残留在色谱柱内，影响检测结果的准确度，降低色谱柱的使用寿命；2)杂质峰与杂质峰之间不能实现良好的基线分离，导致检测结果不准确；3)不能同时检测比阿培南药物中的有关物质和聚合物杂质的含量。
Xia M等，J Pharm Biomed Anal 2009年第49卷第4期，p937-944，《The stabilityof biapenem and structure identification of impurities in aqueous solution》对比阿培南水溶液的稳定性以及杂质结构鉴定进行了研究，同时给出了杂质分析的色谱条件，以0.01mol/L的醋酸铵水溶液和乙腈为流动相，采用梯度洗脱，检测波长为220nm。
虽然该方法采用了梯度洗脱，但仍存在以下不足之处：1)基线不平稳，有明显的向下漂移趋势，导致检测数据不准，影响检测结果的准确度；2)该方法不适用于比阿培南有关物质的测定。
因此，在现有技术公开的利用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法中，存在部分杂质检测不出，杂质峰与杂质峰不能实现良好的基线分离，检测结果不准确的缺陷。另外，本领域缺少可同时检测比阿培南药物中的有关物质和聚合物杂质的含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法。本发明的方法采用磷酸盐水溶液-有机相体系进行梯度洗脱，在使比阿培南与杂质、杂质与杂质实现良好的基线分离的同时，能够分离、检测到尽可能多的杂质。采用本发明的方法得到的测定结果准确，并能同时测定比阿培南有关物质和聚合物杂质的含量。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法，所述方法采用由A液和B液组成的体系进行梯度洗脱，其中所述A液为磷酸盐水溶液，B液为乙腈或甲醇-乙腈的混合溶液；
优选地，所述A液为磷酸的钠盐或钾盐水溶液；更优选地，所述A液为NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、KH2PO4、K2HPO4或K3PO4；进一步优选地为KH2PO4；
优选地，所述A液的浓度为0.01～0.02mol/L，更优选地为0.01mol/L；
优选地，采用KOH、NaOH或磷酸来调节所述A液的pH值；进一步优选地，将所述A液的pH调节为5.0～7.0，优选地调节为5.7～6.5，更优选地为调节为6.5；
优选地，所述B液为乙腈；
优选地，洗脱开始时，所述A液与B液的体积比为98:2～100:0，进一步优选为99:1；
优选地，所述梯度洗脱的流速为0.6ml/min～1.0ml/min，进一步优选为0.8ml/min；
优选地，所述方法的检测柱温为30～40℃；进一步优选为35℃；
优选地，所述方法采用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶或者辛烷基硅烷键和硅胶；
优选地，所述方法中采用的色谱柱选自ZORBAX SB-C18色谱柱、Ultimate AQ-C18色谱柱、Inertsil ODS-3-C18色谱柱和Ultimate XB-C8色谱柱；更优选地为Ultimate AQ-C18色谱柱；
优选地，所述方法的检测波长为220nm；
优选地，所述梯度洗脱按照如下进行：
0min时，A液与B液的体积比为99:1；
第10min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为90:10，持续到第25min；第25min开始，A液与B液的体积匀速地调整为10:90，持续到第45min，并保持到洗脱终点；
在本发明的一些实施方案中按下表程序进行所述梯度洗脱：
| t(min) | 0 | 10 | 25 | 45 |
| A(体积：％) | 99 | 99 | 90 | 10 |
| B(体积：％) | 1 | 1 | 10 | 90 |
作为一个优选的具体实施方式，本发明提供一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和/或有关物质的方法，采用紫外检测器进行测定，包括：
色谱条件：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：A液为用KOH调节pH＝6.5的0.01mol/L KH2PO4水溶液，B液为乙腈，按如下程序进行梯度洗脱：
0min时，A液与B液的体积比为99:1；
第10min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为90:10，持续到第25min；第25min开始，A液与B液的体积匀速地调整为10:90，持续到第45min，并保持到洗脱终点；
即按下表程序进行所述梯度洗脱：
| t(min) | 0 | 10 | 25 | 45 |
| A(体积：％) | 99 | 99 | 90 | 10 |
| B(体积：％) | 1 | 1 | 10 | 90 |
流速：0.8ml/min；
柱温：35℃；
紫外检测器，检测波长220nm；
供试品溶液：
精密称取比阿培南原料药、粗品或比阿培南注射用冻干粉15mg，置于10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照品溶液：
精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质的含量。
以下对比阿培南有关物质和聚合物杂质进行说明：
比阿培南药物中的杂质主要是指生产、运输和贮藏过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物以及降解产物等，其中对比阿培南的质量有较大影响，需要严格限定含量的杂质有：
具有如(II)所示结构的开环杂质A；具有如(III)所示结构的开环杂质B；具有如(IV)所示结构的聚合物杂质B。
由于现有技术中有多种比阿培南的制备方法，各种制备方法使用的中间体不尽相同，本发明所述的比阿培南中间体(P10)，其结构如(V)所示：
其中PNB为羧基保护基，其结构如(VI)所示：
本发明所述测定方法相对于现有技术的优点在于：
1)本发明的方法采用磷酸盐-乙腈流动相梯度洗脱，能检测出更多的杂质，且基线平稳，主峰峰形良好，主峰与杂质峰、杂质与杂质之间能够实现良好的分离；
2)本发明的方法能同时检测比阿培南中的开环降解物、酸解产物、聚合物、中间体等杂质，实现了更全面、快速了解比阿培南产品的质量，操作简便，检测结果更准确；
3)本发明所述方法具有优良的批与批之间和柱与柱之间的重现性；
4)本发明所述方法以220nm作为检测波长，能够检测到更多的杂质，从而可以更加全面的了解、检测比阿培南产品的质量；
5)本发明所述方法适用范围宽，流动相A液的浓度在0.01～0.02mol/L、pH 5.7～6.5、流动相初始比例98:2～100:0的范围内都可以用于测定。
附图说明
图1是实施例1中，不同缓冲盐种类-洗脱比例测定的比阿培南粗品HPLC图谱；其中
图1A色谱条件是磷酸氢二钾-甲醇(97:3)，等度洗脱，
图1B色谱条件是乙酸钠-乙腈(100:3)，等度洗脱，
图1C色谱条件是乙酸铵-乙腈，梯度洗脱，
图1D色谱条件是磷酸二氢钾-乙腈，梯度洗脱。
图2是实施例2中同一洗脱程序不同缓冲盐种类检测比阿培南粗品的HPLC图谱，其中图2A中采用乙酸钠盐，图2B中采用乙酸铵盐，图2C中采用磷酸氢二钾盐，图2D中采用磷酸二氢钾盐，图2E中采用磷酸二氢钠盐，图2F中采用磷酸氢二钠盐。
图3是实施例3中不同缓冲盐pH值检测比阿培南的HPLC图谱，其中图3A-3I分别是pH值为3.0、4.0、4.7、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、8.0的溶液做流动相A液时的检测图谱。
图4是实施例3中不同缓冲盐pH值检测杂质2(开环杂质B)的HPLC图谱，其中图4A-4I分别是pH值为3.0、4.0、4.7、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、8.0的溶液做流动相A液时的检测图谱。
图5是实施例3中不同缓冲盐pH值检测杂质1(开环杂质A)的HPLC图谱，其中图5A-5I分别是pH值为3.0、4.0、4.7、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、8.0的溶液做流动相A液时的检测图谱。
图6是实施例5中在不同波长下检测的HPLC谱图；其中图6A的检测波长为220nm，图6B的检测波长为230nm，图6C的检测波长为254nm，图6D的检测波长为294nm。
图7是实施例6中不同柱温时，比阿培南粗品的HPLC图谱，其中7A为柱温30℃的图谱，7B为柱温35℃的图谱，7C为柱温40℃的图谱。
图8是实施例7中不同流速时，比阿培南粗品的HPLC图谱，其中图8A为流速0.6ml/min的图谱，图8B为流速0.7ml/min的图谱，图8C为流速0.8ml/min的图谱，图8D为流速0.9ml/min的图谱，图8E为流速1.0ml/min的图谱。
图9是实施例8中流动相B液分别为甲醇、乙腈、甲醇乙腈混合液(35:65)时，比阿培南粗品的HPLC图谱，其中图9A是B液为甲醇得到的图谱，图9B是B液为乙腈得到的图谱，图9C是B液为甲醇乙腈混合液(35:65)得到的图谱，图9D是B液为甲醇乙腈混合液(50:50)得到的图谱，图9E是甲醇乙腈混合液(65:35)得到的图谱。
图10是实施例9中不同流动相初始比例，比阿培南粗品的HPLC图谱，其中图10A是A液与B液初始比例为98:2时的图谱，图10B是A液与B液初始比例为99:1时的图谱，图10C是A液与B液初始比例为100:0时的图谱。
图11是实施例10中不同色谱柱，比阿培南粗品的HPLC图谱，其中图11A是色谱柱为Welch Ultimate XB-C8时得到的图谱，图11B是色谱柱为岛津Inertsil ODS-3时得到的图谱，图11C是色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18时得到的图谱，图11D是色谱柱为UltimateAQ-C18时得到的图谱，图11E是色谱柱为Agilent ZORBAX SB-CN时得到的图谱，图11F是色谱柱为Ultimate XB-NH2时得到的图谱。
图12是实施例11中检测比阿培南的HPLC图谱，其中图12A-12E分别为第1次至第5次的检测得到的图谱。
图13是实施例12得到的HPLC图谱。
图14是实施例13得到的HPLC图谱。
图15是实施例14得到的HPLC图谱。
图16是实施例15得到的HPLC图谱。
图17是实施例16得到的HPLC图谱。
图18是对比例1得到的HPLC图谱。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例及对比例中所用比阿培南原料药、粗品或比阿培南注射用冻干粉如无特殊说明，均为深圳市海滨制药有限公司自制(参照公开号US5241073A或US5424069A的发明专利申请记载的方法制备)。仪器：安捷伦高效液相色谱仪Agilent 1260；Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪；
色谱柱：(1)十八烷基硅烷键和硅胶色谱柱，即C18柱，可以选择但不限于ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Inertsil ODS-3-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；(2)辛烷基硅烷键和硅胶色谱柱，即C8柱，可以选择但不限于Ultimate XB-C8色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。
缓冲盐种类、缓冲盐pH值、检测波长、流动相洗脱比例等因素，都影响比阿培南及有关物质的分离。因此，通过下述实施例对色谱条件进行优选。
实施例1缓冲盐种类-洗脱比例的选择
本实施例考察了不同缓冲盐种类-洗脱比例对比阿培南粗品及有关物质检测的影响
1.1磷酸氢二钾-甲醇
参照公开号为CN 105277630A的中国发明专利所述方法：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：35℃；流动相：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(磷酸调节pH＝5.6)：甲醇体积比为97:3；流速：1.0ml/min，检测波长：220nm；等度洗脱程序，检测结果见图1A和表3。
1.2乙酸钠-乙腈
参照张菁、邢亮彬，中国抗生素杂志2006年9月第31卷第9期，p565-566，所述方法：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：35℃，流动相：0.02mol/L乙酸钠溶液(10％乙酸调节pH＝7.0)：乙腈体积比为100:3；流速：1.0ml/min，检测波长：220nm；等度洗脱程序，检测结果见图1B及表3。
1.3乙酸铵-乙腈
参照Xia M等，J Pharm Biomed Anal 2009年第49卷第4期，p937-944，所述方法：
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：35℃，流动相：以0.01mol/L的乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B。流速：1.0ml/min，检测波长：220nm；采用表1梯度洗脱程序，检测结果见图1C及表3。
表1乙酸盐梯度洗脱程序
| t(min) | 0 | 27 | 30 | 31 | 36 |
| A(体积：％) | 99 | 70 | 70 | 99 | 99 |
| B(体积：％) | 1 | 30 | 30 | 1 | 1 |
1.4磷酸盐-乙腈
色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温：35℃，流动相：以0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液(KOH调pH值为6.5)为流动相A，乙腈为流动相B。流速：0.8ml/min，检测波长：220nm；采用表2梯度洗脱程序，检测结果见图1D及表3。
表2磷酸盐梯度洗脱程序
| t(min) | 0 | 10 | 25 | 45 |
| A(体积：％) | 99 | 99 | 90 | 10 |
| B(体积：％) | 1 | 1 | 10 | 90 |
表3不同缓冲盐种类-洗脱比例对检测结果的影响
在缓冲盐种类-洗脱比例的选择过程中，尝试了多种体系，由实验可看出采用等度洗脱，部分杂质未检出，导致未洗脱下来的杂质残留在色谱柱内，影响色谱柱的使用和重复检测样品的准确度。乙酸铵-乙腈体系梯度洗脱，基线不平稳，向下漂移趋势明显，杂质检测结果不准确。而磷酸盐-乙腈体系梯度洗脱能检测出最多杂质，具有良好的峰形，且主峰与杂质峰、杂质与杂质之间能够实现良好的基线分离，所以初步考虑磷酸盐-乙腈体系梯度洗脱更适合比阿培南及有关物质的检测。
实施例2缓冲盐种类的验证
为了排除流动相洗脱比例对分离效果的影响，统一按表2进行梯度洗脱，考察不同缓冲盐对比阿培南及有关物质的检测效果。
选取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)，以KOH或磷酸调节pH＝6.5的0.01mol/L乙酸钠盐、乙酸铵盐、磷酸的钠盐或钾盐缓冲溶液为流动相A液，以乙腈为流动相B液，按表2进行梯度洗脱；柱温：35℃，流速：0.8ml/min，检测波长：220nm。
实验结果：参见图2和表4。
表4不同磷酸盐对色谱行为的影响
由实验结果可看出，醋酸盐易产生基线向下飘移，影响杂质的有效检出，而无论是哪种磷酸钾盐或钠盐，都可以实现基线平稳，比阿培南与杂质间良好的分离，并且保留时间适中，故优选磷酸盐作为本发明所述方法的流动相A液。但是磷酸的钾盐水溶液，尤其是KH2PO4配制的流动相，分离、检测到的杂质最多。因此，优选磷酸盐为磷酸的钾盐，更优选的是KH2PO4。
实施例3缓冲盐pH值的选择
3.1测试对象
配制0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，分别用磷酸或氢氧化钾调节pH值为3.0、4.0、4.7、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、8.0的溶液做流动相A液。
3.2实验方法
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；
用上述的各pH值磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相A，以乙腈为流动相B液；采用表5所示梯度洗脱程序。柱温：35℃，流速：0.8ml/min，检测波长：220nm。
表5梯度洗脱程序
| t(min) | 0 | 10 | 25 | 45 |
| A(体积：％) | 100 | 100 | 90 | 10 |
| B(体积：％) | 0 | 0 | 10 | 90 |
供试液的配制：
比阿培南供试品溶液：精密称取比阿培南原料药约20mg,置10mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(分别现配现进和室温放置1.5h进样)
开环杂质A-定位溶液的配制：精密称取比阿培南开环杂质A 5.36mg，置20mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
开环杂质B-定位溶液的配制：精密称取比阿培南开环杂质B 5.18mg，置20mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
上述供试液20μl注射入液相色谱仪，进行洗脱和检测。
3.3实验结果：不同的缓冲盐pH值比阿培南与开环杂质的出峰时间检测结果，见图3、图4、图5、表6和表7。
表6不同缓冲盐pH值各成分保留时间(min)
表7不同的流动相缓冲盐pH比阿培南供试品溶液室温放置0h和1.5h开环杂质A含量
从上述实验结果看出，1)开环杂质B出峰时间不稳定，随着流动相缓冲盐pH的变化，开环杂质B出峰时间变化较大，pH值从低到高，出峰位置从后往前飘移，从主峰后飘到主峰前。2)比阿培南在水溶液中不稳定，容易产生降解杂质开环杂质A，在偏酸和偏碱的水溶液中室温放置1.5h显著增长，最不稳定。
由表6可得，开环杂质B在pH 5.0至PH 8.0范围内在主峰后面出峰，出峰时间相对较稳定。由表7可得，比阿培南溶液在pH 4.0至PH 7.0范围内相对较稳定，开环杂质A的增长较小。综上所述，流动相缓冲盐的pH值应选在5.0至7.0之间，优选5.7至6.5之间，更优选为6.5。
实施例4流动相A液的浓度的选择
选取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；波长：220nm；样品：1.5mg/mL的比阿培南水溶液(现配现进)；进样量：20μl；流速：0.8ml/min；流动相A液为KH2PO4水溶液(用KOH调节pH 6.5)，流动相B液为乙腈，按表2进行梯度洗脱；不同浓度的A液的检测结果见表8。
表8 A液浓度对比阿培南出峰时间(RT)的影响
| A液浓度(mol/L) | 0.005 | 0.01 | 0.15 | 0.02 |
| 出峰时间RT | 14.13min | 14.92min | 14.91min | 14.95min |
| 柱效 | 18795 | 21793 | 21786 | 20795 |
由实验结果可看出，KH2PO4水溶液浓度在0.01mol/L～0.02mol/L时保留时间适中、柱效高，均可以进行分析，考虑到浓度太高有可能损伤色谱柱，优选KH2PO4水溶液(A液)浓度为0.01mol/L。
实施例5检测波长的选择
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；
样品：1.5mg/mL的比阿培南水溶液(现配现进)；
进样量：20μl；
流速：0.8ml/min；
柱温：35℃；
流动相A为KH2PO4水溶液(0.01mol/L，用KOH调节pH 6.5)，流动相B为乙腈，按表2进行梯度洗脱；
同一份样品分别在220nm、230nm、254nm和294nm波长下检测。
实验结果：参见图6。对图谱中的每个杂质峰进行峰面积积分，采用归一化法计算各杂质的百分含量，结果见图6及表9。
表9不同波长下检测到的杂质状况
比阿培南的最大紫外吸收在294nm，但在该波长下仅检测到8个杂质；230nm、254nm下检测，也有些杂质未能检出。而在220nm波长下检测到的杂质最多，为了更好地检测有关物质，选择220nm为检测波长。
实施例6柱温的选择
选取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；波长：220nm；样品：1.5mg/mL的比阿培南水溶液(现配现进)；进样量：20μl；流速：0.8ml/min；流动相A液为KH2PO4水溶液(0.01mol/L，用KOH调节pH 6.5)，流动相B液为乙腈，按表2进行梯度洗脱；
分别于柱温30℃、35℃、40℃考察柱温对有关物质检测的影响，检测结果见表10，HPLC图谱见图7。
表10柱温对有关物质检测的影响
| 柱温(℃) | 30 | 35 | 40 |
| 比阿培南(％) | 96.85 | 96.85 | 96.97 |
| 杂质个数 | 11 | 12 | 11 |
由实验结果可看出当柱温分别为30℃、35℃、40℃时，检测出的有关物质总量和个数基本相同，由于缓冲盐梯度洗脱，增加有机相比例洗脱时低温更容易导致盐析出，所以选择检测柱温为30～40℃，优选35℃下进行检测。
实施例7流速的选择
选取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；波长：220nm；样品：1.5mg/mL的比阿培南水溶液(现配现进)；进样量：20μl；柱温：35℃；流动相A液为KH2PO4水溶液(0.01mol/L，用KOH调节pH 6.5)，流动相B液为乙腈，按表2进行梯度洗脱；
分别于流速0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、考察流速对有关物质检测的影响，检测结果见表11，HPLC图谱见图8。
表11流速对有关物质检测的影响
由实验结果可看出流速0.6ml/min～1.0ml/min时，检测出的有关物质总量和个数基本相同，但不同的流速影响主峰的保留时间，为使主峰的保留时间适中，选择流速为0.7ml/min～0.9ml/min，优选0.8ml/min进行检测。
实施例8流动相B液的选择
选取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；波长：220nm；样品：1.5mg/mL的比阿培南水溶液(现配现进)；进样量：20μl；柱温：35℃；流速：0.8ml/min；流动相A液为KH2PO4水溶液(0.01mol/L，用KOH调节pH 6.5)，按表2进行梯度洗脱；
分别于流动相B液为甲醇、乙腈、甲醇：乙腈＝35:65、甲醇：乙腈＝50:50、甲醇：乙腈＝(65:35)考察不同有机相对有关物质检测的影响，检测结果见表12，HPLC图谱见图9。
表12不同有机相对有关物质检测的影响
由实验结果可看出选择甲醇做有机相梯度洗脱时，基线不平稳，向上漂移明显，影响杂质的有效检出；而乙腈或甲醇与乙腈混合溶液，当混合比例为甲醇：乙腈＝65：35～0：100时，基线较平稳，主峰出峰时间适中，所以选择乙腈或甲醇与乙腈混合溶液为B液，优选乙腈。
实施例9流动相初始洗脱比例的选择
选取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；波长：220nm；样品：1.5mg/mL的比阿培南水溶液(现配现进)；进样量：20μl；柱温：35℃；流速：0.8ml/min；流动相A液为KH2PO4水溶液(0.01mol/L，用KOH调节pH 6.5)，流动相B液为乙腈，按表2进行梯度洗脱；另外，将表2中t＝0min和t＝10min时的A:B的体积比同时改为98:2或100:0，分别进行两组实验。即分别采用流动相初始洗脱比例为98:2、99:1、100:0，考察不同流动相初始洗脱比例对有关物质检测的影响，检测结果见表13，HPLC图谱见图10。
表13不同初始比例对有关物质检测的影响
| 初始洗脱比例 | 初始A:B(98:2) | 初始A:B(99:1) | 初始A:B(100:0) |
| 归一含量％ | 96.65 | 96.80 | 96.50 |
| 杂质个数 | 10 | 12 | 11 |
| 出峰时间RT | 10.37min | 14.92min | 19.39min |
由实验结果可看出初始比例从98:2～100:0范围内，检测出的有关物质总量和个数大致相同，但初始比例的变动对主峰的保留时间影响较大，为使主峰保留时间适中，优选初始洗脱比例为99:1。
实施例10色谱柱的选择
为了排除流动相对分离效果的影响，统一以磷酸盐溶液-乙腈为流动相，考察不同固定相对比阿培南及有关物质的分离效果。
10.1测试对象
C8柱：Welch Ultimate XB-C8(4.6mm×250mm，5μm)；
C18柱：岛津Inertsil ODS-3C18(4.6mm×250mm，5μm)；Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)
CN柱：Agilent ZORBAX SB-CN(4.6mm×250mm，5μm)；
NH2柱：Ultimate XB-NH2(4.6mm×250mm，5μm)。
10.2实验方法
用新鲜配制的KOH调节pH＝6.5的0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相A，以乙腈为流动相B液；采用表2所示梯度洗脱程序。柱温：35℃，流速：0.8ml/min，检测波长：220nm。
供试液的配制：
精密称取比阿培南原料药约25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(现配现进)
上述供试液20μl注射入液相色谱仪，进行洗脱和检测。考察四种色谱柱对有关物质检测的影响，检测结果见表14，HPLC图谱见图11。
表14不同色谱柱对有关物质检测的影响
由实验结果可看出使用氰基柱(CN柱)和氨基柱(NH2)时，比阿培南出峰时间过早，且检测出的杂质总数明显较C18和C8色谱柱少，而所选的C18柱和C8柱，检测出的有关物质总量和个数大致相同，故选择色谱柱为C18和C8色谱柱，优选C18色谱柱。
因此，通过上述实施例1-10的研究，建立了本发明的采用高效液相色谱法测定比阿培南(原料药或比阿培南注射用冻干粉末)和/或有关物质的方法：
色谱条件：
固定相：烷基硅烷键合硅胶，粒径5径硅；
流动相：A液为用KOH调节pH＝6.5的0.01mol/L KH2PO4水溶液，B液为乙腈，按如下程序进行梯度洗脱，
0min时，A液与B液的体积比为99:1；
第10min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为90:10，持续到第25min；第25min开始，A液与B液的体积匀速地调整为10:90，持续到第45min，并保持到洗脱终点；
即按下表程序进行梯度洗脱：
流速：0.8ml/min；
柱温：35℃；
紫外检测器，检测波长220nm；
供试品溶液：
精密称取比阿培南原料药、粗品或比阿培南注射用冻干粉15mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照品溶液：
精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质的含量。
下面，以本发明所述检测方法，尤其是上述优选的方法，对同批次的比阿培南原料药进行比阿培南和有关物质的含量重复测定5次(即实施例11)。
实施例11
取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速：0.8ml/min；
检测波长：220nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH＝6.5为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表2梯度洗脱程序；
精密称取比阿培南粗品(参照公开号为US5241073A的发明专利申请记载的方法制备)约15mg，置10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。(平行配制5份，每份现配现进)进样20μl，记录色谱图，检测结果见表15，HPLC图谱见图12。
表15重复测定5次检测结果
| 名称 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 |
| 归一含量％ | 96.80 | 96.83 | 96.85 | 96.85 | 96.87 |
| 杂质个数 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| 出峰时间RT | 14.92min | 14.90min | 14.91min | 15.02min | 14.98min |
由实验结果可看出，重复测定5次，杂质个数和杂质总量基本一致，说明本方法稳定性和重复性良好。
实施例12
取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速：0.8ml/min；
检测波长：220nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH＝6.5为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表2梯度洗脱程序；
分别精密称取比阿培南(参照公开号为US5424069A的发明专利申请记载的方法制备)、杂质1(开环杂质A)、杂质2(开环杂质B)、杂质3(聚合物杂质B)、杂质4(中间体P10)各30.36mg、2.12mg、2.04mg、1.98mg、2.87mg、置同一20ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。(现配现进)进样20μl，记录色谱图，HPLC图谱见图13。
其中，1号峰为开环杂质A峰(RT＝5.93min)，2号峰为开环杂质B峰(RT＝9.64min)，3号峰为比阿培南峰(RT＝15.05min)，4号峰为聚合物杂质B峰(RT＝32.18min)，5号峰为中间体P10峰(RT＝37.33min)。
由实施例12谱图可以看出，采用本发明方法，能同时检测比阿培南中主要的降解产物开环杂质和聚合物，还可以同时检测中间体P10的残留，更全面、快速、高效的体现其中的杂质信息，并能达到一定的分离效果。
实施例13
取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速：0.8ml/min；
检测波长：220nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH＝6.5为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表2梯度洗脱程序；
精密称取比阿培南原料药粗品(参照公开号为US5241073A的发明专利申请记载的方法制备)30.26mg,置20mL容量瓶中，加流动相A液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(现配现进)；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样20μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量为96.85％，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质的含量为开环杂质A为1.57％，开环杂质B为0.35％，中间体P10为0.15％，聚合物杂质B未检出，其他最大单杂为0.10％，总杂含量为2.42％。HPLC图谱见图14。
实施例14
取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速：0.8ml/min；
检测波长：220nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH＝6.5为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表2梯度洗脱程序；
精密称取比阿培南原料药(参照公开号为US5424069A的发明专利申请记载的方法制备)30.37mg,置20mL容量瓶中，加流动相A液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(现配现进)；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样20μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量为99.70％，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质的含量为开环杂质A为0.19％，开环杂质B未检出，中间体P10未检出，聚合物杂质B未检出，其他最大单杂为0.03％，总杂含量为0.23％。HPLC图谱见图15。
实施例15
取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速：0.8ml/min；
检测波长：220nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH＝6.5为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表2梯度洗脱程序；
精密称取市售注射用比阿培南(厂家：正大天晴，批号180403125)30.18mg,置20mL容量瓶中，加流动相A液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(现配现进)；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样20μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量为99.61％，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质的含量为开环杂质A为0.16％，开环杂质B为0.03％，中间体P10未检出，聚合物杂质B未检出，其他最大单杂为0.03％，总杂含量为0.27％。HPLC图谱见图16。
实施例16
取十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温35℃；流速：0.8ml/min；
检测波长：220nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH＝6.5为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表2梯度洗脱程序；
精密称取比阿培南(参照公开号为US5424069A的发明专利申请记载的方法制备)30.24mg,置20mL容量瓶中，加0.1M盐酸1ml破坏5min，加0.1M氢氧化钠中和，再加流动相A液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(现配现进)；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样20μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量为91.23％，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质的含量为开环杂质A为5.43％，开环杂质B为未检出，中间体P10未检出，聚合物杂质为0.35％，其他最大单杂为0.65％，总杂含量为7.66％。HPLC图谱见图17。
其中，1号峰为开环杂质A峰(RT＝5.697min)，2号峰为比阿培南峰(RT＝15.05min)，10号峰为聚合物杂质B峰(RT＝32.24min)，其余为未知杂质峰。
对比例1：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,5μm)；检测波长：220nm；流动相A液：0.05mol/L磷酸氢二钾缓冲液用NaOH调至PH＝5.60；流动相B液：乙腈；等度洗脱：A：B＝97：3；流速：1.0ml/min；
与实施例15同法配制的供试品溶液(现配现进)，进样20μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算比阿培南归一含量为97.62％，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质的含量为开环杂质A为1.84％，开环杂质B为未检出，中间体P10未检出，聚合物杂质未检出，其他最大单杂为0.35％，总杂含量为2.47％。HPLC图谱见图18。
其中,2号峰为开环杂质A峰(RT＝3.591min)，3号峰为比阿培南峰(RT＝7.493min)，其余为未知杂质峰。
由实施例16与对比例1谱图可以看出，即使是针对强酸破坏后杂质情况较多的样品，采用对比例1方法检测出比阿培南的杂质数量较少，且主峰与杂质峰、杂质与杂质之间不能实现良好的分离；而采用本发明方法，可以更好的体现其中的杂质信息，并能达到一定的分离效果。
综上所述，本发明所述的检测方法，可以实现比阿培南与杂质、杂质与杂质的良好分离，能够更好地控制比阿培南原料药、粗品、制剂的质量。
Claims (8)
1.一种采用高效液相色谱法测定比阿培南和有关物质的方法，所述方法采用由A液和B液组成的体系进行梯度洗脱，其中所述A液为KH2PO4水溶液，B液为乙腈；
其中，将所述A液的pH调节为6.5；所述方法的检测柱温为35℃；
其中，所述梯度洗脱按照如下进行：
0min时，A液与B液的体积比为99:1；
第10min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为90:10，持续到第25min；第25min开始，A液与B液的体积匀速地调整为10:90，持续到第45min，并保持到洗脱终点；
其中，所述方法采用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶或者辛烷基硅烷键合硅胶；
其中所述有关物质包括开环杂质A、开环杂质B、聚合物杂质B、中间体P10，所述开环杂质A具有如(II)所示结构，所述开环杂质B具有如(III)所示结构，所述聚合物杂质B具有如(IV)所示结构，所述中间体P10具有如(V)所示结构：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述A液的浓度为0.01~0.02mol/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述A液的浓度为0.01 mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，采用KOH、NaOH或磷酸来调节所述A液的pH值。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述梯度洗脱的流速为0.6ml/min~1.0ml/min。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述梯度洗脱的流速为0.8ml/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法中采用的色谱柱选自ZORBAX SB- C18色谱柱、Ultimate AQ-C18 色谱柱、Inertsil ODS-3-C18色谱柱和Ultimate XB-C8色谱柱。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述方法中采用的色谱柱为Ultimate AQ-C18 色谱柱。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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