CN103389347B - 高效液相色谱法测定多尼培南的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效液相色谱法测定多尼培南含量和/或有关物质的方法，用紫外检测器进行测定，检测波长230nm，使用键合极性基团的硅烷键合硅胶为固定相，以pH4.7-6.0的0.01-0.2mol/L磷酸的钠盐或钾盐水溶液和乙腈复配为流动相，等度或梯度洗脱。相比现有技术，本发明所述方法能够检测到更多的杂质，对多尼培南及有关物质具有很好的分离度和峰形，可使多尼培南与杂质、杂质与杂质之间实现良好的基线分离；而且本方法具有优良的批与批之间和柱与柱之间的重现性，适合工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及高效液相色谱法测定多尼培南和/或有关物质的方法。
背景技术
多尼培南(Doripenem)，化学名：(+)-(4R,5S,6S)-6-[(1R)-1-羟基乙基]-4-甲基7-氧代-3-[[(3S,5S)-5-[(氨基磺酰氨基)-甲基]-3-吡咯烷基]硫]-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-甲酸，结构如(I)所示，由日本盐野义公司(Shionogi)研发，2005年首次在日本上市，商品名为“Finibax”，属1-β甲基型碳青霉烯类抗生素，具有广谱的抗菌活性。
有关物质，也称为杂质，主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。碳青霉烯类抗生素中的开环降解物、酸解产物、聚合物等杂质是引起过敏的主要原因。因此，有关物质研究是多尼培南质量研究中关键性的项目之一。理想的多尼培南质量检测方法，应该在保证多尼培南与杂质实现基线分离的同时，分离、检测到尽可能多的杂质。
现有技术中测定多尼培南含量及纯度的方法都使用通用型的C18或C8柱。如中国发明专利申请（公开号CN1432016A）中公开了一种多尼培南的含量测定方法，其采用高效液相色谱仪、紫外吸收光度计、十八烷基硅烷化硅胶（L-columnODS）色谱柱检测，色谱条件以对乙酰氨基苯为内标物质，流动相为：pH5.8的2mmol/L磷酸盐缓冲液/丙烯腈混合溶液（191:9），检测波长为240nm。
中国发明专利申请（公开号为CN102977101A）公开了多尼培南一水合物纯度检测方法，其HPLC实验条件/参数：色谱柱为ZorbaxSB-C18，4.6×250mm5μm；流动相为水∶甲醇(90∶10)，加入三乙胺0.3％，以磷酸调节PH5.0；流速为1.5mL/min；检测波长为220nm；柱温为30℃；进样量20μL。
上述两种方法的不足之处在于：1）所用L-columnODS和ZorbaxSB-C18色谱柱都采用通用型十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。在流动相含水量高的情况下会发生C18层链倒伏塌陷，损失柱效和寿命；2）主峰与杂质峰、杂质与杂质之间不能实现良好的分离，结果不准确，不能用于有关物质的检测；3）使用内标物质，操作繁琐。
公开号为CN101191787A的中国发明专利申请还公开了一种多尼培南含量测定的方法，其采用高效液相色谱法、紫外检测器、辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱检测（C8柱），流动相为pH为5.0～6.0的0.01～0.2mol/L的磷酸钠盐水溶液/乙腈混合溶液（100:10～100:1），检测波长为292nm。该方法的不足之处在于：1）主峰与杂质峰、杂质与杂质之间不能实现良好的基线分离，测定结果不准确；2）多尼培南出峰时间不稳定，批间相差约5min，不利于杂质研究。3）该方法不适用于多尼培南有关物质的测定。
因此，现有技术中利用高效液相色谱法测定多尼培南的方法，存在主峰与杂质峰、杂质与杂质之间不能实现良好的基线分离，批间多尼培南出峰时间不稳定，批与批之间和柱与柱之间的重现性差，测定结果不准确的缺陷，且缺少能用于测定有关物质的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱法测定多尼培南和/或有关物质的方法。该方法实现了批间多尼培南吸收峰保留时间稳定、各峰良好的基线分离，从而使测定结果准确，并能同时测定多尼培南及有关物质的含量。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高效液相色谱法测定多尼培南和/或有关物质的方法，采用紫外检测器进行测定，所述方法采用的固定相为键合极性基团的烷基硅烷键合硅胶。
优选的，所述固定相选自键合极性基团的八烷基硅烷键合硅胶或键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶；优选为键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶。
优选的，本发明所述方法的色谱柱选自ODS-AQ色谱柱、Polar-RP色谱柱、Hydro-RP色谱柱或AQ-C18极限柱。
更优选的，本发明所述方法采用的色谱柱选自优选UltimateAQ-C18柱，WelchPolar-RPC18色谱柱，ZORBAXSB-AqC18色谱柱，YMC-PackODS-AQC18色谱柱，ProntoSILC18AQ色谱柱，CenturySILC18AQ色谱柱，SynergiHydro-RPC18色谱柱或VertexAQ-C18色谱柱；更优选WelchPolar-RPC18色谱柱。
优选的，所述方法的检测波长为230nm。
优选的，所述方法的流动相由A液和B液组成；A液为浓度为0.01～0.2mol/L，优选为0.02mol/L的磷酸的钠盐或钾盐水溶液，B液为乙腈；
本发明所述方法可以采用等度洗脱，A液与B液的体积比为90:10～97:3，优选为94:6～97:3，更优选为94:6～95:5，进一步优选为94:6；
或者也可以采用梯度洗脱：
0min时，A液与B液的体积比为97:3；
第15min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为85:15，持续到第40min；
第41min开始至第45min，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为97:3，并保持到洗脱终点；即按下表程序进行梯度洗脱：
| t（min） | 0 | 15 | 40 | 45 | 50 |
| A（%） | 97 | 97 | 85 | 97 | 97 |
| B（%） | 3 | 3 | 15 | 3 | 3 |
优选的，所述A液为磷酸的钾盐水溶液，进一步优选为KH2PO4水溶液。
优选的，所述流动相A液的pH为4.7～6.0；更优选pH值为5.7。所述A液用KOH、NaOH或磷酸来调节pH值。
本发明所述磷酸的钠盐为NaH2PO4、Na2HPO4或Na3PO4；所述磷酸的钾盐为KH2PO4、K2HPO4或K3PO4。
优选的，所述方法的检测柱温为20～30℃；优选25℃。
作为一个优选的具体实施方式，本发明提供一种高效液相色谱法测定多尼培南和/或有关物质的方法，采用紫外检测器进行测定，具体包括：
色谱条件：
固定相：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：用KOH调节pH=5.7的0.02mol/L的K2HPO4水溶液：乙腈=94:6（v/v）,等度洗脱；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测器，检测波长230nm；
供试品溶液：
精密称取多尼培南原料药、粗品或多尼培南注射用冻干粉25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照品溶液：
精密量取所述述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质的含量。
作为另一个更优选的具体实施方式，本发明还提供一种高效液相色谱法测定多尼培南和/或有关物质的方法，采用紫外检测器进行测定，具体包括：
色谱条件：
固定相：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：A液为用KOH调节pH=5.7的0.02mol/LK2HPO4水溶液，B液为乙腈，按如下程序进行梯度洗脱，
0min时，A液与B液的体积比为97:3，
第15min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为85:15，持续到第40min，
第41min开始至第45min，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为97:3，并保持到洗脱终点；即按下表所示程序进行梯度洗脱：
| t（min） | 0 | 15 | 40 | 45 | 50 |
| A（%） | 97 | 97 | 85 | 97 | 97 |
| B（%） | 3 | 3 | 15 | 3 | 3 |
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测器，检测波长230nm；
供试品溶液：
精密称取多尼培南原料药、粗品或多尼培南注射用冻干粉25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照品溶液：
精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质的含量。
烷基硅烷键合硅胶，其键合相如式（II）所示。当R1、R2为非极性基团，如：R1为甲基，R2为C8、C18烷基，为通用型反相色谱柱的填料，即现有技术中公开的L-columnODS色谱柱、ZorbaxSB-C18色谱柱等。
在R2的烷基链上嵌入极性基团(polargroup,简称PG），即是本发明所述键合极性基团的烷基硅烷键合硅胶，填充成色谱柱也就是通常所说的水性柱，也叫AQ柱、亲水柱、极限柱、极限亲水柱。其键合相如式（III）所示，R1、R为非极性基团，如R1为甲基，R为烷基，
PG为极性基团，可选自酰胺、氨基酰氯基团、磺胺基、醚基的一种或多种；如嵌入酰胺基的十八烷基硅烷键合硅胶，其键合相如式（IV）所示，即是本发明所述键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶之一，填充成色谱柱也就是本发明所述的C18水性柱。
需要说明的是，式（III）、式（IV）只是其中一种极性基团及连接位置的示意图，极性基团的种类及连接位置，依色谱柱各生产厂家不同而不同，不限于式（III）、式（IV）所示。一般用AQ（Aqueous的缩写）、Hydro、Polar表示的C18色谱柱即为本发明优选的键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；包括但不限于：市场销售的ODS-AQ色谱柱、Polar-RP色谱柱、Hydro-RP色谱柱、AQ-C18极限柱，品牌不限。优选UltimateAQ-C18柱，WelchPolar-RP色谱柱，ZORBAXSB-AQ色谱柱，YMC-PackODS-AQ色谱柱，ProntoSILC18AQ色谱柱，CenturySILC18AQ色谱柱，SynergiHydro-RPC18色谱柱或VertexAQ-C18色谱柱，更优选WelchPolar-RP色谱柱。
水性柱具有疏水性的高碳含量和相对亲水的表面，由于亲水性表面，其可以被极性流动相“湿润”,可在高水相甚至100%水的流动相中，提供优良的色谱峰，这在通用型反相色谱柱上难以实现。一般水性柱常用于分析和纯化肽类和生物分子，如多肽、蛋白、核酸类。但现有技术中尚没有将水性柱应用于测定多尼培南和/或有关物质的先例。
本发明所述测定方法相对于现有技术的优点在于：
1）本发明采用的固定相（色谱柱填料）为键合极性基团的烷基硅烷键合硅胶，对多尼培南这种极性物质的保留和选择性更佳，可以使多尼培南的峰形更好，使主峰与杂质峰、杂质与杂质之间能够实现良好的分离；
2）本发明所述的固定相不会发生相塌陷现象，可以长时间保持柱效，延长柱寿命；
3）本发明所述方法具有优良的批与批之间和柱与柱之间的重现性；
4）本发明所述方法以230nm作为检测波长，能够检测到最多的杂质，从而可以更加全面的了解、检测多尼培南产品的质量；
5）本发明所述方法适用范围宽，流动相A液的浓度在0.01～0.2mol/L、pH4.7～6.0的范围内都可以用于测定；
6）本发明所述方法无需外加内标，操作、计算简便。
附图说明
图1是实施例1中，不同流动相-固定相的测定的多尼培南HPLC图谱；其中1A色谱条件是通用型C18柱，流动相：MOPS-乙腈，
1B色谱条件是通用型C8柱，流动相：乙酸铵-乙腈，
1C色谱条件是C18水性柱，流动相：KH2PO4-乙腈。
图2是实施例2中通用型C8柱检测多尼培南的HPLC图谱，其中2A-2E分别为第1次至第5次的检测图谱。
图3是实施例2中通用型C18柱检测多尼培南的HPLC图谱，其中3A-3E分别为第1次至第5次的检测图谱。
图4是实施例1中水性C18柱检测多尼培南的HPLC图谱，其中4A-4E分别为第1次至第5次的检测图谱。
图5是实施例3在不同波长下检测的HPLC谱图；其中5A检测波长为210nm，5B检测波长为220nm，5C检测波长为230nm，5D检测波长为240nm，5E检测波长为250nm，5F检测波长为298nm。
图6是实施例4中，以0.02mol/L不同磷酸盐配制的流动相为A液时，多尼培南的HPLC图谱，其中6A是KH2PO4，6B是K2HPO4，6CK3PO4，6D是NaH2PO4，6E是Na2HPO4,6F是Na3PO4。
图7是实施例4中，流动相磷酸盐溶液（A液）不同pH值时，多尼培南的HPLC图谱，其中7A是pH=3.0的图谱，7B是pH=3.7的图谱，图7C是pH=4.7的图谱，图7D是pH=5.7的图谱，图7E是pH=5.8的图谱，图7F是pH=6.0的图谱。
图8是实施例4中，等度洗脱时，流动相A液与B液不同体积比时，多尼培南的HPLC图谱，其中8A是A:B=94:6的图谱，图8B是A:B=95:5的图谱。
图9是实施例4中，梯度洗脱时，流动相A液浓度不同时，多尼培南的HPLC图谱，其中9A是A液浓度为0.01mol/L时的图谱，图9B是A液浓度为0.02mol/L时的图谱。
图10是实施例5中，不同柱温时，多尼培南的HPLC图谱，其中10A为柱温25℃的图谱，10B为柱温30℃的图谱。
图11是实施例6的HPLC图谱。
图12是实施例8的HPLC图谱。
图13是实施例11的HPLC图谱。
图14是实施例13的HPLC图谱。
图15显示的是实施例17的HPLC图谱，其中1号峰为多尼培南的吸收峰。
图16显示的是对比例1的HPLC图谱，其中1号峰为多尼培南的吸收峰。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例及对比例中所用多尼培南原料药、粗品或多尼培南注射用冻干粉如无特殊说明，均为深圳市海滨制药有限公司自制（参照申请号CN201210082240.1或CN1995193672的发明专利申请记载的方法制备）。仪器：安捷伦高效液相色谱仪Agilent1260；ThermoUltimate3000高效液相色谱仪和Waterse2695型高效液相色谱仪；
色谱柱：（1）键合极性基团的十八烷基硅烷键和硅胶色谱柱，即C18水性柱，可以选择但不限于UltimateAQ-C18（4.6×250mm，5μm），WelchPolar-RPC18（4.6×250mm，5μm），ZORBAXSB-AqC18（4.6×250mm，5μm），VertexAQ-C18水性柱（4.6×250mm，5μm），YMC-PackODS-AQ色谱柱（4.6×250mm，5μm），ProntoSILC18AQ色谱柱（4.6×250mm，5μm），CenturySILC18AQ色谱柱（4.6×250mm，5μm），SynergiHydro-RPC18色谱柱（4.6×250mm，5μm）；（2）通用型C18柱，选择MerckLPC18（4.6×250mm，5μm）；通用型C8柱，选择AgilentZORBAXEclipseplusC8（4.6×250mm，5μm）。
色谱柱、检测波长、流动相等因素，都影响多尼培南及有关物质的分离。因此，通过下述实施例对色谱条件进行优选。
实施例1流动相-固定相体系的选择
参考现有技术，分别考察了不同流动相-固定相体系对多尼培南及有关物质检测的影响
1.1MOPS（3-（N-吗啉基）丙磺酸）
色谱柱：通用型C18柱（4.6×250，5μm）；柱温：25℃；流动相：以10mmol/LMOPS（乙酸调节pH=5.7）为流动相A液，乙腈为流动相B液；流速：1.0ml/min，检测波长：230nm；采用表1梯度洗脱程序，检测结果见图1A和表4。
表1MOPS梯度洗脱程序
| t（min） | 0 | 15 | 30 | 35 | 45 | 50 | 51 | 56 |
| A（%） | 96 | 96 | 90 | 90 | 85 | 85 | 96 | 96 |
| B（%） | 4 | 4 | 10 | 10 | 15 | 15 | 4 | 4 |
1.2乙酸铵
色谱柱：通用型C8柱（4.6×250，5μm），柱温：25℃，流动相：以10mmol/L乙酸铵（乙酸调pH=5.7）为流动相A，乙腈为流动相B。流速：1.0ml/min，检测波长：230nm；采用表2梯度洗脱程序，检测结果见图1B及表4。
表2乙酸铵梯度洗脱程序
| t（min） | 0 | 10 | 30 | 32 | 40 |
| A（%） | 96 | 96 | 87 | 96 | 96 |
| B（%） | 4 | 4 | 13 | 4 | 4 |
1.3磷酸盐
色谱柱：C18水性柱（4.6×250，5μm），柱温：25℃，流动相：以10mmol/L的KH2PO4（KOH调pH=5.7）为流动相A，乙腈为流动相B。流速：1.0ml/min，检测波长：230nm；采用表3梯度洗脱程序，检测结果见图1C及表4。
表3磷酸盐梯度洗脱程序
| t（min） | 0 | 10 | 20 | 40 | 45 | 50 |
| A（%） | 96 | 96 | 90 | 90 | 96 | 96 |
| B（%） | 4 | 4 | 10 | 10 | 4 | 4 |
实验结果：参见图1及表4。
表4不同流动相-固定相体系对检测结果的影响
在流动相-固定相的选择过程中，尝试了多种体系，由实验可看出通用型C18柱与MOPS体系容易出现倒峰，通用型C8柱与乙酸铵体系部分杂质未检出，而C18水性柱与磷酸盐体系具有良好的峰形，且主峰与杂质峰、杂质与杂质之间能够实现良好的基线分离，所以初步考虑C18水性柱-磷酸盐溶液的流动相-固定相体系更适合多尼培南及有关物质的检测。
实施例2流动相-固定相体系的验证
为了排除流动相对分离效果的影响，统一以磷酸盐溶液-乙腈为流动相，考察不同固定相对多尼培南及有关物质的分离效果。
2.1测试对象
通用型C8柱：AgilentZORBAXEclipseplusC8（4.6×250mm，5μm）；
通用型C18柱：MerckLPC18（4.6×250mm，5μm）；
键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（水性C18柱）：WelchPolar-RP（4.6×250mm，5μm）。
2.2实验方法
用新鲜配制的KOH调节pH=5.7的0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液为流动相A，以乙腈为流动相B液；采用表5所示梯度洗脱程序。柱温：25℃，流速：1ml/min，检测波长：230nm。
表5梯度洗脱程序
| t（min） | 0 | 15 | 40 | 45 | 50 |
| A（%） | 97 | 97 | 85 | 97 | 97 |
| B（%） | 3 | 3 | 15 | 3 | 3 |
供试液的配制：
精密称取多尼培南原料药约25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
上述供试液10μl注射入液相色谱仪，进行洗脱和检测。三种色谱柱平行操作，不同时间共重复检测五次，实验安排如表6所示。
表6
2.3实验结果：同一多尼培南供试液在三种色谱柱上5次检测结果，见图2、图3、图4及表7。
表7不同色谱柱多尼培南保留时间（min）
从上述实验结果看出，以磷酸盐溶液-乙腈为流动相，通用型C8或C18柱对多尼培南的分离、检测效果，不及C18水性柱。表现为：通用型C8或C18柱批间重现性差。同一样品，不同操作人、同一操作人不同操作时间，多尼培南给在通用型C8、C18柱的保留时间都有较大差异。其中，C8柱上多尼培南的保留时间最大相差约5min，C18柱上多尼培南保留时间最大相差4min。但使用水性C18柱（键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱）时，多尼培南的出峰时间基本稳定，5次检测的保留时间相差仅为0.075min，不受操作人、时间等因素的影响。
上述实验证实了对多尼培南含量及有关物质的检测，键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，分离效果远优于通用型辛烷基或十八烷基硅烷键合硅胶。
实施例3检测波长的选择
色谱柱：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱WelchPolar-RP（5μm,φ4.6×250mm）；
样品：2.5mg/mL的多尼培南水溶液；
进样量：10μl；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
流动相A为KH2PO4水溶液（0.02mol/L，用KOH调节pH5.7），流动相B为乙腈，按表5进行梯度洗脱；
同一份样品分别在210nm、220nm、230nm、240nm、250nm和298nm波长下检测。
实验结果：参见图5。对图谱中的每个杂质峰进行峰面积积分，采用归一化法计算各杂质的百分含量，结果见表8。
表8不同波长下检测到的杂质状况
多尼培南的最大紫外吸收在298nm，但在该波长下仅检测到5个杂质；210nm、220nm、240nm、250nm下检测，也有些杂质未能检出。而在230nm波长下检测到的杂质最多，为了更好地检测有关物质，选择230nm为检测波长。
实施例4流动相的选择
4.1磷酸盐的选择
选取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以KOH或磷酸调节pH=5.7的0.02mol/L磷酸的钠盐或钾盐缓冲溶液为流动相A液，以乙腈为流动相B液，按表5进行梯度洗脱；柱温：25℃，流速：1.0ml/min，检测波长：230nm。
实验结果：参见图6和表9。
表9不同磷酸盐对色谱行为的影响
| 磷酸盐 | 色谱行为 | RT |
| KH2PO4 | 峰形良好、柱效高 | 13.66min |
| K2HPO4 | 峰形良好、柱效高 | 13.04min |
| K3PO4 | 峰形良好、柱效高 | 13.16min |
| NaH2PO4 | 峰形良好、柱效高 | 13.55min |
| Na2HPO4 | 峰形良好、柱效高 | 13.46min |
| Na3PO4 | 峰形良好、柱效高 | 13.29min |
由实验结果可看出，无论是哪种磷酸钾盐或钠盐，都可以实现多尼培南良好的分离，并且保留时间适中，都可以作为本发明所述方法的流动相A液。但是磷酸的钾盐水溶液，尤其是KH2PO4配制的流动相，分离、检测到的杂质最多。因此，优选磷酸盐为磷酸的钾盐，更优选的是KH2PO4。
4.2磷酸盐溶液pH值的选择
选取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（5μm,φ4.6×250mm）；检测波长：230nm；柱温：25℃，样品：2.5mg/mL的多尼培南水溶液；进样量：10μl；流速：1.0ml/min；流动相A液为KH2PO4水溶液（0.02mol/L，用KOH或H3PO4调节pH），流动相B液为乙腈，采用表5梯度洗脱程序。检测结果见表10，图7：
表10磷酸盐溶液pH值的影响
| pH | 3.0 | 3.7 | 4.7 | 5.7 | 5.8 | 6.0 | 6.7 |
| 保留时间 | 23.797 | 17.880 | 13.667 | 13.663 | 13.543 | 13.577 | 16.63 |
| 柱效 | 6319 | 7069 | 6808 | 7408 | 5819 | 5252 | 5882 |
实验结果显示流动相酸性较强时，主峰后杂质明显增多，并且随着流动相pH值的减小，杂峰的个数和面积增加。这与多尼培南在酸性介质中的降解有关，在酸性较强的条件下检测到的杂质与多尼培南的有关物质无关。在流动相接近中性时，主峰前的杂质明显增大。所以pH4.7～6.0为合适的pH测定范围；更优选pH=5.7，因为该pH条件下柱效最高，保留时间适宜。
本发明所述检测方法，流动相由A液和B液组成，可以采用等度洗脱，也可以采用梯度洗脱。在优选出磷酸盐种类和A液pH值后，下面分别对等度洗脱和梯度洗脱的相关条件效果进行考察。
4.3等度洗脱
4.3.1A液与B液的比例对色谱行为的影响
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，检测波长为230nm，柱温：25℃；流速：1.0ml/min;进样量：10μl；流动相A液为KH2PO4水溶液（0.02mol/L，用KOH调节pH5.7），流动相B液为乙腈，按表11所示比例等度洗脱。实验结果见表11，A液与B液的比例为94:6、95:5的谱图见图8。
表11A与B的比例对色谱行为的影响
| A：B（v:v） | 90:10 | 91:9 | 92:8 | 93:7 | 94:6 | 95:5 | 97:3 |
| R.T.（min） | 4.29 | 4.68 | 5.08 | 5.64 | 6.81 | 8.35 | 13.58 |
| 柱效 | 7482 | 7270 | 7448 | 4237 | 6932 | 7616 | 9005 |
结果显示，A液与B液的比例为90:10～97:3均能进行分析检测，从保留时间和分析效果考虑，优选94:6～97:3。又因为A与B的比例为94:6时，后面的3个杂质可以在50min以内出峰，而95:5需要在60min以内出峰,97:3需要更长的时间（>60min）才能出来。考虑到既不能让杂质残留在柱子上，又避免太长的分析时间，所以A与B的体积比更优选94:6～95:5，进一步优选94:6。
4.3.2A液浓度对色谱行为的影响
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A液为KH2PO4水溶液（用KOH调节pH5.7），B液为乙腈，A：B=94：6（v/v）,检测波长为230nm，柱温25℃；流速：1.0ml/min;进样量：10μl。不同A液浓度下，多尼培南的保留时间（RT）检测结果见表12。
表12A液浓度对多尼培南保留时间（RT）的影响
| 浓度(mol/L) | 0.01 | 0.02 | 0.1 | 0.2 |
| RT(min) | 6.86 | 6.81 | 6.73 | 6.48 |
| 柱效 | 6106 | 6932 | 5381 | 7104 |
由实验结果可看出，A液（KH2PO4水溶液）浓度在0.01mol/L-0.2mol/L之间时，柱效高、保留时间适中，均可以进行分析，考虑到浓度太高有可能损伤色谱柱，优选A液浓度为0.02mol/L。
4.4梯度洗脱中A液浓度对色谱行为的影响
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：25℃；流速：1.0ml/min;进样量：10μl；检测波长：230nm；流动相A液为KH2PO4水溶液，B液为乙腈，采用表5梯度洗脱程序。不同浓度的A液的检测结果见表13,A液浓度为0.01mol/L、0.02mol/L的谱图分别见图9A和9B。
表13A液浓度对多尼培南保留时间（RT）的影响
| 浓度(mol/L) | 0.01 | 0.02 | 0.05 | 0.1 | 0.2 |
| RT(min) | 13.43 | 13.66 | 13.45 | 13.12 | 13.11 |
| 柱效 | 4880 | 7408 | 4681 | 5259 | 7199 |
由实验结果可看出，KH2PO4水溶液浓度在0.01mol/L-0.2mol/L时保留时间稳定、适中，均可以进行分析；其中，KH2PO4水溶液浓度为0.02mol/L时，柱效最好。因此，优选KH2PO4水溶液（A液）浓度为0.02mol/L。
实施例5柱温的选择
选取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（5μm,φ4.6×250mm）；波长：230nm；样品：2.5mg/mL的多尼培南水溶液；进样量：10μl；流速：1.0ml/min；流动相A液为KH2PO4水溶液（0.02mol/L，用KOH调节pH5.7），流动相B液为乙腈，按表5进行梯度洗脱；
分别于柱温20℃、25℃、30℃、40℃考察柱温对含量、有关物质检测的影响，检测结果见表15，25℃、30℃的HPLC图谱见图10。
表15柱温对含量、有关物质检测的影响
| 柱温(℃) | 20 | 25 | 30 | 40 |
| 多尼培南(%) | 99.16 | 99.18 | 99.27 | 99.15 |
| 有关物质(%) | 0.89 | 0.85 | 0.83 | 0.86 |
由实验结果可看出柱温20℃、25℃、30℃、40℃时，检测出的含量及有关物质基本相同，由于多尼培南在温度较高时不稳定，所以选择检测柱温为20～30℃，优选25℃下进行检测。
因此，通过上述实施例的研究，建立了本发明优选的高效液相色谱法测定多尼培南（原料药或多尼培南注射用冻干粉末）和/或有关物质的方法：
色谱条件：
固定相：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：K2HPO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7）：乙腈=94:6（v/v）,等度洗脱；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测器，检测波长230nm。
供试品溶液：
精密称取多尼培南原料药约25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：
精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质的含量。
或者本发明更优选的方法是：色谱条件：
固定相：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：A液为KH2PO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7），B液为乙腈，按下表进行梯度洗脱：
| t（min） | 0 | 15 | 40 | 45 | 50 |
| A（%） | 97 | 97 | 85 | 97 | 97 |
| B（%） | 3 | 3 | 15 | 3 | 3 |
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测器，检测波长230nm。
供试品溶液：
精密称取多尼培南原料药约25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：
精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质的含量。
下面，以本发明所述检测方法，尤其是上述优选的方法，对不同批次的多尼培南原料药进行多尼培南和有关物质的含量测定。
实施例6
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱WelchPolar-RP（4.6×250mm，5μm），流动相为K2HPO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7）：乙腈=94：6等度洗脱，检测波长为230nm，柱温25℃。
精密称取多尼培南原料药32.74mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.31%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.74%。HPLC谱图见图11。
实施例7
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱UltimateAQ-C18柱（4.6×250mm，5μm），流动相为KH2PO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7）：乙腈=93：7等度洗脱，检测波长为230nm，柱温30℃。
精密称取多尼培南原料药32.54mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.32%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.68%。
实施例8
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱ZORBAXSB-Aq柱（4.6×250mm，5μm），流动相为KH2PO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7）：乙腈=95：5等度洗脱，检测波长为230nm，柱温25℃。
精密称取多尼培南原料药31.58mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.16%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.84%。HPLC图谱见图12。
实施例9
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱YMC-PackODS-AQ柱（4.6×250mm，5μm），流动相为KH2PO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH6.0）：乙腈=97：3等度洗脱，检测波长为230nm，柱温20℃。
精密称取多尼培南原料药32.36mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.54%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.46%。
实施例10
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱ProntoSILC18AQ柱（4.6×250mm，5μm），流动相为NaH2PO4水溶液（0.1mol/L,用KOH调节pH5.7）：乙腈=90：10等度洗脱，检测波长为230nm，柱温25℃。
精密称取多尼培南原料药32.17mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.37%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.63%。
实施例11
选取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱UltimateAQ-C18柱（4.6×250mm，5μm），流动相以KH2PO4水溶液（0.01mol/L,用KOH调节pH5.7）为A液，以乙腈为B液，按表5进行梯度洗脱，检测波长为230nm，柱温为20℃，流速：1.0ml/min。
精密称取多尼培南原料药（按照申请号CN201210082240.1的发明专利申请公开的方法制备）24.28mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.16%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.89%。HPLC谱图见图13。
实施例12
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱CenturySILC18AQ柱（4.6×250mm，5μm），流动相以K2HPO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7）为A液，以乙腈为B液，按表5进行梯度洗脱，检测波长为230nm，柱温30℃，流速：1.0ml/min。
精密称取多尼培南原料药25.00mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.32%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.72%。
实施例13
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱WelchPolar-RP（4.6×250mm，5μm），流动相以KH2PO4水溶液（0.02mol/L,用KOH调节pH5.7）为A液，以乙腈为B液，按表5进行梯度洗脱，检测波长为230nm，柱温25℃，流速：1.0ml/min。
精密称取多尼培南原料药30.12mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.18%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.85%。检测谱图见附图14。
实施例14
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱SynergiHydro-RP（4.6×250mm，5μm），流动相以K3PO4水溶液（0.1mol/L,用KOH调节pH5.7）为A液，以乙腈为B液，按表5进行梯度洗脱，检测波长为230nm，柱温25℃，流速：1.0ml/min。
精密称取多尼培南原料药25.76mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.23%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.80%。
实施例15
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱VertexAQ-C18柱（4.6×250mm，5μm），流动相以Na2HPO4水溶液（0.05mol/L,用KOH调节pH5.7）为A液，以乙腈为B液，按表5进行梯度洗脱，检测波长为230nm，柱温30℃，流速：1.0ml/min；
精密称取多尼培南原料药34.53mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.24%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.79%。
实施例16
取键合极性基团的十八烷基硅烷键和硅胶色谱柱ZORBAXSB-Aq柱（4.6×250mm，5μm），流动相为NaH2PO4水溶液（0.02mol/L,用NaOH调节pH5.7）和乙腈，按表5进行梯度洗脱，检测波长为230nm，柱温20℃，流速：1.0ml/min。
精密称取多尼培南原料药33.17.mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别进样10μl，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量为99.21%，将杂质峰的峰面积与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质含量为0.83%。
实施例17
取键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱：WelchPolar-RP（4.6mm×250mm，5μm）；柱温30℃；流速：1.0ml/min;
检测波长：230nm；流动相：以20mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液，用KOH调节pH=5.7为流动相A液，以乙腈为流动相B液，采用表5梯度洗脱程序；
精密称取多尼培南粗品（按照申请号CN201210082240.1的发明专利申请记载的方法制备）24.60mg，置10ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，进样20μl，记录色谱图，HPLC图谱见图15。
其中，1号峰为多尼培南峰（RT=13.252min），其余均为杂质峰。
对比例1：
色谱柱：AgilentTechnologiesZORBAXEclipseplusC84.6×250mm,5μm；检测波长：292nm；流动相A液：20mmol/L磷酸二氢钠缓冲液用NaOH调至PH=5.70；流动相B液：乙腈；等度洗脱：A：B=100：4；流速：1.0ml/min；
取实施例17配制的供试品溶液，进样20μl，常温下进行检测，记录色谱图，HPLC图谱见图16。
其中，1号峰为多尼培南峰（RT=4.454min），其余均为杂质峰。
由实施例17与对比实施例1谱图可以看出，即使是针对杂质较多的多尼培南粗品，在相同的测定时间内，采用对比例1方法检测出多尼培南的杂质数量较少，且主峰与杂质峰、杂质与杂质之间不能实现良好的分离；而采用本发明方法，可以更好的体现其中的杂质信息，并能达到一定的分离效果。
总之，本发明所述的检测方法，可以实现多尼培南与杂质、杂质与杂质的良好分离，能够更好地控制多尼培南原料药、粗品、制剂的质量。
Claims (12)
1.一种高效液相色谱法测定多尼培南的方法，采用紫外检测器进行测定，其特征在于，所述方法的固定相为键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶；所述方法采用的色谱柱选自UltimateAQ-C18柱，WelchPolar-RPC18色谱柱，ZORBAXSB-AqC18色谱柱，YMC-PackODS-AQC18色谱柱，ProntoSILC18AQ色谱柱，CenturySILC18AQ色谱柱，SynergiHydro-RPC18色谱柱或VertexAQ-C18色谱柱；所述方法的流动相由A液和B液组成，A液为浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸的钠盐或钾盐水溶液，B液为乙腈；所述方法的检测波长为230nm；
其中，所述方法采用等度洗脱，A液与B液的体积比为90:10～97:3；
或，所述方法采用梯度洗脱：
0min时，A液与B液的体积比为97:3；
第15min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为85:15，持续到第40min；
第41min开始至第45min，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为97:3，并保持到洗脱终点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的流动相由A液和B液组成，A液为浓度为0.02mol/L的磷酸的钠盐或钾盐水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱为WelchPolar-RPC18色谱柱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用等度洗脱，A液与B液的体积比为94:6～97:3。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用等度洗脱，A液与B液的体积比为94:6。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相A液为磷酸的钾盐水溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述流动相A液为KH2PO4水溶液。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相A液的pH为4.7～6.0；用KOH、NaOH或磷酸来调节pH值。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述流动相A液的pH为5.7。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法的检测柱温为20～30℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法的检测柱温为25℃。
12.一种高效液相色谱法测定多尼培南的方法，采用紫外检测器进行测定，具体步骤包括：
色谱条件：
固定相：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：用KOH调节pH＝5.7的0.02mol/L的K2HPO4水溶液:乙腈＝94:6(v/v),等度洗脱；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测器，检测波长230nm；
供试品溶液：
精密称取多尼培南原料药、粗品或多尼培南注射用冻干粉25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照品溶液：
精密量取所述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量；或
色谱条件：
固定相：键合极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；
流动相：A液为用KOH调节pH＝5.7的0.02mol/LK2HPO4水溶液，B液为乙腈，按如下程序进行梯度洗脱：
0min时，A液与B液的体积比为97:3；
第15min开始，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为85:15，持续到第40min；
第41min开始至第45min，A液与B液的体积比缓慢、匀速地调整为97:3，并保持到洗脱终点；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
紫外检测器，检测波长230nm；
供试品溶液：
精密称取多尼培南原料药、粗品或多尼培南注射用冻干粉25mg,置10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照品溶液：
精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；
测定：
分别吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液色谱图上各吸收峰的峰面积，计算多尼培南归一含量。
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