CN101191787B - 高效液相色谱法测定多利培南含量的方法 - Google Patents

高效液相色谱法测定多利培南含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法测定多利培南含量的方法，采用紫外检测器进行测定，其特征在于，该方法采用的色谱柱为辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为磷酸的钠盐水溶液和乙腈，且磷酸的钠盐水溶液的pH为5.0～6.0。本发明方法操作简单、灵敏度高，在pH5.0～6.0范围内都可以测定多利培南，且峰形良好。

Description

高效液相色谱法测定多利培南含量的方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及高效液相色谱法测定多利培南含量的方法。
背景技术
随着抗生素在临床上的大量应用，细菌的耐药现象日趋严重。在新抗生素的研发中，近年来国外从典型的β—内酰胺抗生素研究领域正向非典型的β—内酰胺抗生素研究领域转化。碳青酶烯类抗生素就是非典型的β—内酰胺抗生素的一种。
多利培南(doripenem)为日本Shionogi公司开发的碳青酶烯类新广谱抗生素，具有抗菌谱广、对绝大多数β-内酰胺酶稳定的特点。本品已于2005年9月在日本上市，具有良好的临床应用价值和市场前景。
EP1270575A1中公开的多利培南的含量测定方法是采用高效液相色谱仪、紫外检测器和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，色谱条件为以对乙酰氨基酚为内标物质，0.002mol/L的磷酸盐溶液(pH5.8)：乙腈＝191:9为流动相，检测波长为240nm。比较多利培南与内标物质的色谱峰面积，并用多利培南标准品以外标法定量。该方法存在以下不足之处：①对缓冲液pH要求苛刻，只能在pH5.8时正常测定，pH稍有变动，峰形就会分叉，不能正常测定。②使用240nm作为检测波长，非多利培南的最大吸收波长，方法灵敏度较低，最小检测限为3ng。③使用内标物质，配置样品、结果计算都比较麻烦。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中多利培南的含量测定方法对缓冲液pH要求苛刻、灵敏度较低及不够方便等缺点。
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱法测定多利培南含量的方法，采用紫外检测器进行测定，其特征在于，该方法采用的色谱柱为辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(反相色谱柱)，流动相为磷酸的钠盐水溶液和乙腈，且磷酸的钠盐水溶液的pH为5.0～6.0。
所述的磷酸的钠盐水溶液为NaH2PO4、Na2HPO4或Na3PO4的水溶液，优选NaH2PO4水溶液。
所述的磷酸的钠盐水溶液与乙腈的体积比为100:10～100:1，优选100：4。
所述的磷酸的钠盐水溶液浓度为0.01～0.2mol/L，优选0.02mol/L。
所述的磷酸的钠盐水溶液的pH优选为5.7。
所述的磷酸的钠盐水溶液的pH值优选用NaOH或磷酸来调节。
所述的紫外检测器的检测波长优选为292nm。
以下提供本发明含量测定方法的实验部分，以证明本发明方法的优越性：
1.流动相的选择
1.1选取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)
流动相 色谱行为
甲醇：水＝100:10 色谱峰拖尾
乙腈：水＝100:10 拖尾消除，但柱效差
乙腈：1％三乙胺水溶液＝100:10 色谱峰分叉
乙腈：0.02mol/L的NaH2PO4水溶液(pH5.7)＝100:10 峰形、柱效好，RT太短
乙腈：0.02mol/L的NaH2PO4水溶液(pH5.7)＝100:4 峰形、柱效好，RT适中
1.2选取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)，流动相为0.02mo1/L的NaH2PO4水溶液(pH5.7)：乙腈
磷酸的钠盐水溶液：乙腈 100:10 100:7 100:4 100:2 100:1
保留时间 2.0min 3.9min 5.1min 9.7min 15.2min
柱效 3213 3185 3192 3150 3100
100:7、100:4、100:2的HPLC谱图见附图1、附图2、附图3
综合分析：优选的流动相组合为0.02mol/L的NaH2PO4水溶液(pH5.7)和乙腈。100:10～100:1都可以作为合适的比例，考虑到保留时间的因素，100:4为最佳比例。
2.不同反相色谱柱和磷酸的钠盐水溶液浓度的选择
选取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)两种反相色谱柱。
流动相：磷酸的钠盐水溶液(NaH2PO4，用NaOH调节到pH5.7)：乙腈＝100:4
检测波长：292nm
柱温：40℃
样品：0.5mg/ml的多利培南水溶液
进样量：10μL
流速：1.0ml/min
不同反相色谱柱及磷酸的钠盐水溶液浓度下的保留时间(RT)
0.002mol/L 0.01mol/L 0.02mol/L 0.1mol/L 0.2mol/L
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 RT不稳定 约8min 约9min 约10min 约11min
辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱 色谱峰易裂分 约4min 约5min 约6min 约8min
综合分析：磷酸的钠盐水溶液浓度很低时，色谱峰不稳定；使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，分析时间较长。故选择辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，在磷酸的钠盐水溶液浓度为0.01～0.2mol/ml的条件下都可以进行分析。但考虑到磷酸的钠盐水溶液浓度过高时，容易使磷酸的钠盐水溶液从流动相中析出，有可能损伤色谱柱和仪器。故优选的磷酸的钠盐水溶液浓度定为0.02mol/L。
3.磷酸的钠盐水溶液pH值的选择
色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(5μm，Φ4.6×150mm)
流动相：磷酸的钠盐水溶液(0.02mol/L NaH2PO4，用NaOH调节pH，pH4.0用磷酸调节)：乙腈＝100:4
检测波长：292nm
柱温：40℃
样品：0.5mg/ml的多利培南水溶液
进样量：10μL
流速：1.0ml/min
pH 4.0 5.0 5.3 5.7 6.0 7.0
保留时间 3.2min 5.5min 5.2min 5.1min 5.5min 5.8min
柱效 3170 3275 3194 3192 3175 1603
pH5.3、pH6.0的HPLC谱图见附图4、附图5
综合分析：磷酸的钠盐水溶液pH值较低时(4.0)，保留时间过短，不利于分析。磷酸的钠盐水溶液pH值过较高时(7.0)，柱效很低。故选择pH5.0～6.0作为磷酸的钠盐水溶液的pH范围，在保证柱效的同时，使保留时间适中。
4.检测波长的选择
多利培南的紫外最大吸收波长在292nm，以292nm作为紫外检测器的分析波长时，峰面积响应值最大，最低检测限可达0.5ng，使本分析方法的灵敏度提高。对比以非最大吸收波长240nm作为分析波长时，灵敏度明显降低。故选择292nm为紫外检测波长。
检测波长 292nm 240nm
最小检测限 0.5ng 3ng
最小检测限的HPLC谱图见附图6。
因此，最优选地，本发明的多利培南(原料药或多利培南注射用冻干粉末)的含量测定方法的具体步骤为，在带有紫外检测器的高效液相色谱仪上，取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为NaH2PO4水溶液(0.02mol/L，用NaOH调节到pH5.7)：乙腈＝100:4；检测波长为292nm。精密称取多利培南约25mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品约25mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。用以下公式计算得多利培南的含量。
本发明测定方法相对于现有技术的优点在于：
1.使用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱和0.01～0.2mol/L的磷酸的钠盐水溶液浓度之后，在pH5.0～6.0范围内都可以测定多利培南，且峰形良好；
2.使用292nm作为检测波长，是多利培南的最大吸收波长，方法灵敏度高，最小检测限可达0.5ng；
3.使用外标法，配置样品、结果计算都比较简单。
附图说明
图1为磷酸的钠盐水溶液(0.02mol/L NaH2PO4，pH5.7)：乙腈＝100:7的HPLC谱图；
图2为磷酸的钠盐水溶液(0.02mol/L NaH2PO4，pH5.7)：乙腈＝100:4的HPLC谱图；
图3为磷酸的钠盐水溶液(0.02mol/L NaH2PO4，pH5.7)：乙腈＝100:2的HPLC谱图；
图4为磷酸的钠盐水溶液(0.02mol/L，NaH2PO4)pH为5.3时的HPLC谱图；
图5为磷酸的钠盐水溶液(0.02mol/L，NaH2PO4)pH为6.0时的HPLC谱图；
图6为最小检测限的HPLC谱图；
图7为实施例4的HPLC谱图；
图8为实施例5的HPLC谱图。
具体实施方式
实施例1
取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为0.2mol/L的NaH2PO4水溶液(用NaOH调节到pH5.0)：乙腈＝100:4；检测波长为292nm。
精密称取多利培南原料药(购自日本Shionogi公司)25.7mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品25.4mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。计算得多利培南的含量为99.13％。
实施例2
取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为0.01mol/L的Na2HPO4水溶液(用NaOH调节到pH5.3)：乙腈＝100:7；检测波长为292nm。
精密称取多利培南原料药(购自日本Shionogi公司)24.3mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品25.6mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。计算得多利培南的含量为99.31％。
实施例3
取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为0.1mol/L的Na3PO4水溶液(用磷酸调节到pH6.0)：乙腈＝100:2；检测波长为292nm。
精密称取多利培南原料药(购自日本Shionogi公司)25.5mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品25.0mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。计算得多利培南的含量为98.91％。
实施例4
取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为0.02mol/L的NaH2PO4水溶液(用磷酸调节到pH5.7)：乙腈＝100:4；检测波长为292nm。
精密称取多利培南原料药(购自日本Shionogi公司)24.9mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品25.2mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。计算得多利培南的含量为99.54％。
实施例5
取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为0.02mol/L的Na2HPO4水溶液(用NaOH调节到pH5.7)：乙腈＝100:4；检测波长为292nm。
精密称取多利培南注射用冻干粉末(购自日本Shionogi公司)24.8mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品24.9mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。计算得多利培南的含量为98.65％。
实施例6
取辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相为0.1mol/L的NaH2PO4水溶液(用NaOH调节到pH5.3)：乙腈＝100:1；检测波长为292nm。
精密称取多利培南注射用冻干粉末(购自日本Shionogi公司)24.5mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试溶液；精密称取多利培南标准品24.9mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。分别进样10μL，记录色谱图，量取多利培南峰面积。计算得多利培南的含量为98.71％。

Claims (7)

1.高效液相色谱法测定多利培南含量的方法，采用紫外检测器进行测定，其特征在于，该方法采用的色谱柱为辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为磷酸的钠盐水溶液和乙腈，且所述的磷酸的钠盐水溶液与乙腈的体积比为100∶10～100∶1，磷酸的钠盐水溶液的pH为5.0～6.0，磷酸的钠盐水溶液浓度为0.01～0.2mol/L，检测波长为292nm。
2.如权利要求1所述的测定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的钠盐水溶液为NaH2PO4、Na2HPO4或Na3PO4的水溶液。
3.如权利要求2所述的测定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的钠盐水溶液为NaH2PO4水溶液。
4.如权利要求1所述的测定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的钠盐水溶液与乙腈的体积比为100∶4。
5.如权利要求1所述的测定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的钠盐水溶液的浓度为0.02mol/L。
6.如权利要求1所述的测定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的钠盐水溶液的pH为5.7。
7.如权利要求1或6所述的测定多利培南含量的方法，其特征在于，所述的磷酸的钠盐水溶液的pH值用NaOH或磷酸来调节。
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