CN109283263B - 用于雷替曲塞合成质量控制的检测分析方法 - Google Patents

用于雷替曲塞合成质量控制的检测分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于雷替曲塞合成质量控制的检测分析方法，包括起始原料6‑溴甲基‑3,4‑二氢‑2‑甲基‑喹唑啉‑4‑酮的纯度检测、起始原料5‑硝基‑2‑噻吩甲酸的纯度检测、雷替曲塞含量测定、雷替曲塞中6‑溴甲基‑3,4‑二氢‑2‑甲基‑喹唑啉‑4‑酮、6‑羟甲基‑3,4‑二氢‑2‑甲基‑喹唑啉‑4‑酮及5‑硝基‑2‑噻吩甲酸含量检测以及雷替曲塞对映异构体检测。本发明的方法具备灵敏度高、专属性强的特点，可以快速、准确地对雷替曲塞的合成工艺进行质量控制，从而保证雷替曲塞原料药的质量。

Description

用于雷替曲塞合成质量控制的检测分析方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种用于雷替曲塞合成质量控制的检测分析方法。
背景技术
雷替曲塞是由英国的Royal Marsden医院的癌症研究署与Zeneca共同合作开发的药物。它是一种胸腺核苷酸合成酶抑制剂，属于叶酸的衍生物，用于治疗晚期直肠结肠癌患者。1996年在英国首次上市，商品名Tomudex，同年在法国等国家上市。其作为晚期结直肠癌的一线治疗药物，具有毒副作用小、给药方便、价格便宜等优点，在中国的需求量大。
雷替曲塞的合成方法有多种，常用的合成路线如下：
在该路线中，以5-硝基-2-噻吩甲酸为起始原料，经酰氯化、酰胺化、硝基还原、甲基化得到中间体IV，中间体IV再与6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮发生反应得到中间体V，中间体V水解即得雷替曲塞。
5-硝基-2-噻吩甲酸与6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮是该路线的两个起始原料，在合成过程中发明人发现在5-硝基-2-噻吩甲酸中易混入杂质5-硝基-2-噻吩甲醛和4-硝基-2-噻吩甲酸，而在6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮原料中易混入6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮(下称杂质E)和2,6-二甲基-3,4-二氢-喹唑啉-4-酮(下称杂质X)。因此，需要对这两个起始原料的纯度进行质量控制以保证后续反应的顺利进行以及终产品的质量。
雷替曲塞的结构中有一个手性碳中心，在化学合成中会产生R-对映异构体。R-对映异构体无药效作用，因此在雷替曲塞终产品中需要作为杂质进行控制。
针对起始原料6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮，现有的质量控制手段包括薄层色谱法和沉淀滴定法两种。薄层色谱法检测专属性较差，检测灵敏度不高，部分杂质存在被漏检的可能性。沉淀滴定法测含量主要是通过氧瓶燃烧，将6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮中的溴元素转变成溴离子，然后用硝酸银滴定液滴定来测定其含量。实验过程中本申请发明人发现，6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮中的溴比较活泼，容易转变成其它化合物，滴定法测定的为总溴含量，方法专属性差，且氧瓶燃烧操作比较繁琐，不利于该物料的质量控制。目前尚无文献报道通过高效液相色谱法测定6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度。
针对5-硝基-2-噻吩甲酸，目前也尚未检索到通过高效液相色谱法测定其纯度的。
对于手性药物而言，对光学异构体进行质量控制一直是药学研究工作的重点和难点。文献CN101221147A公开了一种毛细管电泳法检测雷替曲塞对映异构体的方法。但并无文献报道通过高效液相色谱法检测其对映异构体的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是建立一种用于雷替曲塞合成工艺质量控制的检测分析方法，能够对雷替曲塞合成过程中的原料、终产品进行质量控制，从而保证合成过程的质量可控性。
本发明的检测分析方法采用高效液相色谱法，包括起始原料6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度检测、起始原料5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度检测、雷替曲塞含量测定、雷替曲塞中6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮及5-硝基-2-噻吩甲酸的含量检测、雷替曲塞对映异构体检测；检测方法如下：
(a)6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度检测采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以水-乙腈为流动相，检测波长为230nm，流动相速度为0.5～2.0mL/min；6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度采用面积归一化法计算；
流动相水-乙腈的体积比为75：25～85：15，优选为80：20；流动相速度优选1.0mL/min；柱温为30～45℃；
(b)5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度检测采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以水相-甲醇为流动相，其中水相含0.05％～0.15％体积百分比浓度的三氟乙酸，检测波长226nm，流动相速度为0.8～1.2mL/min；5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度采用面积归一化法计算；
流动相水相-甲醇的体积比为50：50～60：40，优选55：45；流动相速度优选1.0mL/min；三氟乙酸体积百分比浓度优选0.1％；柱温优选25～35℃；
(c)雷替曲塞含量测定采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液-甲醇为流动相，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0～9.0，流动相速度为0.5～2.0mL/min，检测波长为210～310nm；雷替曲塞含量采用外标法计算；
流动相四丁基溴化铵水溶液-甲醇的体积比为65：35～75：25，优选70：30；优选四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.5；流动相速度优选1.0mL/min；检测波长优选226nm，柱温25～40℃；
(d)雷替曲塞中6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮及5-硝基-2-噻吩甲酸含量检测采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液-甲醇为流动相，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0～9.0，流动相速度为0.5～2.0mL/min，检测波长为210～310nm；6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮及5-硝基-2-噻吩甲酸含量采用自身对照法计算；
流动相四丁基溴化铵水溶液-甲醇的体积比为65：35～75：25，优选70：30；优选四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.5；流动相速度优选1.0mL/min；检测波长优选226nm，柱温25～40℃；
(e)雷替曲塞对映异构体检测采用以下方式进行：
以三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为高效液相手性色谱柱的填料，以正己烷：低级醇溶液为流动相，其中低级醇溶液包含体积百分比浓度为0.05～0.5％的三氟乙酸，检测波长为226nm，流动相流速为0.5～2.0mL/min；对映异构体的含量采用外标法计算；
流动相正己烷：低级醇溶液的体积比为40：60～60：40，优选55：45；三氟乙酸的体积百分比浓度优选为0.1％，流动相流速优选为1.0mL/min，低级醇选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇，优选为乙醇。
本发明的有益效果：采用本发明的方法对雷替曲塞合成工艺进行质量控制，具有操作方便、专属性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确、全面地对雷替曲塞合成工艺进行质量控制。在步骤(a)、(b)中可以测定起始原料6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、5-硝基-2-噻吩的纯度，保证起始原料的质量符合要求；在步骤(c)、(d)中可以测定雷替曲塞的含量、测定雷替曲塞中可能存在的杂质5-硝基-2-噻吩甲酸、6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的含量，保证雷替曲塞含量、杂质含量符合要求；在步骤(e)中可以测定对映异构体的含量，从而保证雷替曲塞的光学纯度符合要求。
附图说明
图1实施例1系统适用性溶液色谱图
图2实施例1供试品溶液色谱图
图3实施例2系统适用性溶液色谱图
图4实施例2供试品溶液色谱图
图5实施例3供试品溶液色谱图
图6实施例4供试品溶液色谱图
图7实施例5系统适用性溶液色谱图
图8实施例5供试品溶液色谱图
图9参考例方法1系统适用性溶液色谱图
图10参考例方法2系统适用性溶液色谱图
图11参考例方法3系统适用性溶液色谱图
图12参考例方法4系统适用性溶液色谱图
具体实施方式
下面结合实施例及附图详细阐述本发明内容，以下实施例仅对本发明内容做进一步说明，并不限定本发明。
实施例1高效液相色谱法测定起始原料6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度
1.1色谱条件
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；
检测器：VWD；
色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：水：乙腈＝80：20；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
检测波长：230nm；
进样量：10μL
1.2样品制备
空白溶液：50％乙腈水溶液
定位溶液的配制：精密称取杂质E、杂质X约10mg，分别加50％乙腈水溶液适量溶解，并稀释制成每1mL含0.1mg的溶液，分别作为杂质定位溶液。
系统适用性溶液的配制：精密称取6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮约10.0mg，置20ml量瓶中，加50％乙腈水溶液约10ml，超声溶解后，冷却，再向其中加入上述各杂质定位溶液各1.0ml，用50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的配制：精密称取6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮约10.0mg，置20ml量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
1.3测定
取空白溶液、定位溶液各10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果空白溶液对测定无干扰，杂质X和杂质E的保留时间分别为2.467min、6.033min。
取系统适用性溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、杂质E和杂质X与相邻色谱峰的分离度如下表所示，均满足要求。
取供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，按面积归一化法计算，6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度为93.52％，符合纯度大于90％的要求。杂质E的含量为2.28％,杂质X含量是0.41％。
1.4耐用性试验
在以上测定方法以及测定条件的试验过程中，进行了以下条件范围内的试验，考察了本方法的耐用性。
耐用性试验色谱条件
耐用性试验的结果如下表所示：
耐用性试验结果
结论：在不同色谱条件下，6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮与相邻色谱峰均能达到基线分离，方法耐用性良好。
1.5检测限试验
取各定位溶液分别用50％乙腈水溶液稀释制成一系列低浓度的溶液，分别进样，直至S/N≥3，即为检测限。结果：杂质E、杂质X的检测限依次为1.29ng/mL、1.35ng/mL。
实施例2高效液相色谱法测定起始原料5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度
2.1色谱条件
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪
检测器：VWD
工作站：Agilent OpenLAB CDS(EZChrom Edition)
色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
进样量：10μL
流动相：0.1％三氟乙酸水溶液：甲醇(55:45)
2.2样品制备
空白：45％甲醇水溶液
5-硝基-2-噻吩甲醛贮备液：精密称取5-硝基-2-噻吩甲醛约10.0mg，置20mL量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(约0.5mg/mL)
4-硝基-2-噻吩甲酸贮备液：精密称取4-硝基-2-噻吩甲酸约10.0mg，置20mL量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(约0.5mg/mL)
5-硝基-2-噻吩甲醛定位溶液：精密量取5-硝基-2-噻吩甲醛贮备液200μL置20mL量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(约5.0μg/mL)
4-硝基-2-噻吩甲酸定位溶液：精密量取4-硝基-2-噻吩甲酸贮备液200μL置20mL量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(约5.0μg/mL)
供试品溶液：精密称取5-硝基-2-噻吩甲酸约10.0mg，置20mL量瓶中，加空白溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(约0.5mg/mL)
系统适用性溶液：精密称取5-硝基-2-噻吩甲酸约10.0mg，置20mL量瓶中，加空白溶剂溶解后，再向其中加入5-硝基-2-噻吩甲醛贮备液和4-硝基-2-噻吩甲酸贮备液各200μ，用空白溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3测定
精密量取空白、5-硝基-2-噻吩甲醛定位溶液、4-硝基-2-噻吩甲酸定位溶液、系统适用性溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明空白对测定无干扰，4-硝基-2-噻吩甲酸的保留时间为7.320min，5-硝基-2-噻吩甲醛的保留时间为8.620min；系统适用性溶液的图谱见图3，5-硝基-2-噻吩甲酸与杂质的分离度如下表所示，分离度均满足分析要求：
供试品溶液的色谱图见图4所示，按面积归一化法计算，5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度是99.37％，杂质4-硝基-2-噻吩甲酸的含量为0.32％，其它杂质含量为0.31％。
2.4耐用性试验
在以上测定方法以及测定条件的试验过程中，进行了以下条件范围内的试验，考察了本方法的耐用性。
耐用性试验色谱条件
结果如下表所示：
结论：在不同色谱条件下，5-硝基-2-噻吩甲酸与相邻色谱峰均能达到基线分离，方法耐用性良好。
2.5检测限试验
取各杂质贮备溶液分别用45％甲醇水溶液稀释制成一系列低浓度的溶液，分别进样，直至S/N≥3，即为检测限。结果：4-硝基-2-噻吩甲酸的检测限为52.3ng/mL，5-硝基-2-噻吩甲醛的检测限为75.1ng/mL。
实施例3高效液相色谱法测定雷替曲塞含量
3.1色谱条件
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪
检测器：DAD
工作站：Agilent OpenLAB CDS(EZChrom Edition)
色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
进样量：10μL
流动相：缓冲液-甲醇(70：30)，其中缓冲液为0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液(用磷酸调节pH为8.5)
3.2溶液配制
对照品溶液：取一定量的雷替曲塞对照品，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液配制成浓度约为1.0mg/mL的溶液。
供试品溶液：取一定量的雷替曲塞供试品，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液配制成浓度约为1.0mg/mL的溶液。
3.3测定
分别精密量取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用外标法计算含量。供试品溶液的色谱图见图5，保留时间为10.127的峰为雷替曲塞的峰，雷替曲塞的含量为99.95％。
实施例4高效液相色谱法检测雷替曲塞中杂质的方法(杂质包括5-硝基-2-噻吩甲酸(以下简称杂质G)、6-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮(以下简称杂质H)、6-羟甲基-3，4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮(以下简称杂质E))
4.1色谱条件
与实施例3的3.1色谱条件相同
4.2溶液配制
空白溶液配制：精密量取0.1mol/L的氢氧化钠水溶液0.4mL，置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。
定位溶液配制：分别精密称取各杂质约10.0mg，置20mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠水溶液0.4mL并超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含0.5mg的各杂质定位溶液。
系统适用性溶液配制：精密称取雷替曲塞10.0mg，置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠水溶液0.4mL并超声使溶解，冷却，再向其中加入上述各杂质定位溶液100μL，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
自身对照溶液配制：精密量取雷替曲塞供试品溶液100μL，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液配制，精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠水溶液0.4mL并超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得1.0mg/mL的溶液。
4.3测定
取空白溶液、定位溶液、系统适用性溶液、供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明空白溶液对测定无干扰，杂质E、H、G的保留时间分别为2.160min、3.593min、8.173min。系统适用性溶液色谱图中，雷替曲塞峰的保留时间为10.360min，与杂质E、H、G能够实现有效分离。供试品溶液的图谱见图6，按自身对照法计算，杂质E含量为0.02％，杂质H、G均未检出。
在以上测定方法以及测定条件的基础上，考察了以下条件范围内的试验：流动相缓冲液-甲醇(65：35～75：25)，其中缓冲液为0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液(用磷酸调节pH为8.0～9.0)，柱温25～40℃，流动相速度为0.5～2.0mL/min。以上试验条件均能达到雷替曲塞与各杂质分离的目的，各杂质间的分离度均大于1.5，满足分析要求。
4.4检测限试验
取各定位溶液分别用0.1mol/L氢氧化钠水溶液稀释制成一系列低浓度的溶液，分别进样，直至S/N≥3，即为检测限。杂质E、H、G的检测限分别为1.3、5.2、6.3ng/mL。
实施例5高效液相色谱法检测雷替曲塞异构体
5.1色谱条件
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
检测器：VWD
工作站：Empower 3software
色谱柱：Daicel CHIRALPAK AD-H(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0ml/min
柱温：35℃
进样量：10μL
流动相：正己烷：0.1％三氟乙酸乙醇溶液(55:45)
5.2溶液配制
空白：甲醇
雷替曲塞对映异构体对照品贮备液：取雷替曲塞对映异构体对照品约12.5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇约50ml，超声使溶解后，放冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(约125μg/mL)
雷替曲塞对映异构体定位溶液：精密量取雷替曲塞对映异构体贮备液1.0mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(约1.25μg/mL)
供试品溶液：精密称取雷替曲塞约25.0mg，置100mL量瓶中，加甲醇约50mL，超声使溶解后，冷却，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(约250μg/mL)
系统适用性溶液：精密称取雷替曲塞约25.0mg，置100mL量瓶中，加甲醇约50mL，超声使溶解后，冷却，再向其中加入雷替曲塞对映异构体贮备液1.0mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
5.3测定
精密量取空白、雷替曲塞对映异构体定位溶液、系统适用性溶液、雷替曲塞供试品溶液分别注入高效液相色谱仪。结果表明空白对测定无干扰，雷替曲塞对映异构体的保留时间为4.531min。图7为系统适用性溶液图谱，表明雷替曲塞峰与雷替曲塞对映异构体峰可以完全分开，分离度达3.7，满足分析要求。图8为供试品溶液色谱图，表明在雷替曲塞原料药供试品中未检出对映异构体，其光学纯度符合原料药要求。
在以上测定方法以及测定条件的基础上，进行了以下条件范围内的试验：流动相正己烷-0.1％三氟乙酸低级醇溶液＝60：40～40：60，低级醇选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇，柱温20～35℃，流动相速度为0.5～2.0mL/min。以上试验条件都可以达到分离雷替曲塞与其对映异构体的目的，并且分离度均大于2.0，符合分析要求。
5.4检测限试验
取雷替曲塞异构体定位溶液用0.1mol/L氢氧化钠水溶液稀释制成一系列低浓度的溶液，分别进样，直至S/N≥3，即为检测限。结果对映异构体的检测限为5.87ng/mL
参考例采用其它方法测定对映异构体含量
1.方法1
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
检测器：VWD
工作站：Empower 3software
色谱柱：Daicel CHIRALPAK AD-H(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0ml/min
柱温：35℃
进样量：10μL
流动相：正己烷：0.1％甲酸乙醇溶液(55:45)
溶液配制方法及测定方法参照实施例5，系统适用性溶液的色谱图见图9，空白溶剂干扰检测，并且对映异构体峰和雷替曲塞峰分离不完全，不符合分析要求。说明甲酸不能替代本方法所使用的三氟乙酸。
2.方法2
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
检测器：VWD
工作站：Empower 3software
色谱柱：Daicel CHIRALPAK AD-H(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0ml/min
柱温：35℃
进样量：10μL
流动相：正己烷：0.1％乙酸乙醇溶液(55:45)
溶液配制方法及测定方法参照实施例5，系统适用性溶液的图谱见图10，空白溶剂干扰检测，该色谱条件不能用于雷替曲塞与其对映异构体的分离。
3.方法3
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
检测器：VWD
工作站：Empower 3software
色谱柱：Daicel CHIRALPAK AD-H(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0ml/min
柱温：35℃
进样量：10μL
流动相：正己烷：0.1％三氟乙酸乙醇溶液(30:70)
溶液配制方法及测定方法参照实施例5，系统适用性溶液的图谱见图11，由图可知，空白溶剂对检测有干扰，雷替曲塞峰与对映异构体峰分离度不满足要求，该流动相比例不能用于雷替曲塞与其对映异构体的分离。
4.方法4
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪检测器：VWD
工作站：Empower 3software
色谱柱：Daicel CHIRALPAK AGP(3.0mm×150mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
进样量：10μL
流动相：0.05mol/L磷酸氢二钠溶液(用稀磷酸调节pH值为6.5)-异丙醇(98：2)
溶液配制方法及测定方法参照实施例5，系统适用性溶液的图谱见图12，对映异构体峰与雷替曲塞峰虽能实现基线完全分离，但是雷替曲塞峰存在拖尾现象，并且雷替曲塞峰的理论塔板数仅有464，柱效不能满足药品注册标准。说明该方法不能用于雷替曲塞与其对映异构体的分离测定。

Claims (14)

1.一种用于雷替曲塞合成质量控制的检测分析方法，包括起始原料6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度检测、起始原料5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度检测、雷替曲塞含量测定、雷替曲塞中6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮及5-硝基-2-噻吩甲酸含量检测、雷替曲塞对映异构体检测，其特征在于：
(a)6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度检测采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以水-乙腈为流动相，检测波长为230nm，流动相速度为0.5～2.0mL/min；6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮的纯度采用面积归一化法计算；
(b)5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度检测采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以水相-甲醇为流动相，其中水相含0.05％～0.15％体积百分比浓度的三氟乙酸，检测波长226nm，流动相速度为0.8～1.2mL/min；5-硝基-2-噻吩甲酸的纯度采用面积归一化法计算；
(c)雷替曲塞含量测定采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液-甲醇为流动相，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0～9.0，流动相速度为0.5～2.0mL/min，检测波长为210～310nm；雷替曲塞含量采用外标法计算；
(d)雷替曲塞中6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮及5-硝基-2-噻吩甲酸含量检测采用以下方式进行：
选用十八烷基硅烷键合硅胶为高效液相色谱柱的填充剂，以0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液-甲醇为流动相，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0～9.0，流动相速度为0.5～2.0mL/min，检测波长为210～310nm；6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮、6-羟甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮及5-硝基-2-噻吩甲酸含量采用自身对照法计算；
(e)雷替曲塞对映异构体检测采用以下方式进行：
以三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直链淀粉为高效液相手性色谱柱的填料，以正己烷：低级醇溶液为流动相，其中低级醇溶液包含体积百分比浓度为0.05～0.5％的三氟乙酸，检测波长为226nm，流动相流速为0.5～2.0mL/min；对映异构体的含量采用外标法计算。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(a)中流动相水和乙腈的体积比为75：25～85：15。
3.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于水和乙腈的体积比为80：20。
4.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(b)中流动相水相和甲醇的体积比为50：50～60：40。
5.根据权利要求4所述的检测分析方法，其特征在于水相和甲醇的体积比为55：45。
6.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(b)中三氟乙酸的体积百分比浓度为0.1％。
7.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(c)中流动相四丁基溴化铵水溶液-甲醇的体积比为65：35～75：25。
8.根据权利要求7所述的检测分析方法，其特征在于四丁基溴化铵水溶液-甲醇的体积比为70：30。
9.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(d)中流动相四丁基溴化铵水溶液-甲醇的体积比为65：35～75：25。
10.根据权利要求9所述的检测分析方法，其特征在于四丁基溴化铵水溶液-甲醇的体积比为70：30。
11.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(e)中流动相正己烷：低级醇溶液的体积比为40：60～60：40。
12.根据权利要求11所述的检测分析方法，其特征在于正己烷：低级醇溶液的体积比为55：45。
13.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于(e)中低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
14.根据权利要求13所述的检测分析方法，其特征在于(e)中低级醇为乙醇，三氟乙酸的体积百分比浓度为0.1％。
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