CN114216976B - 高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括：配制对照品溶液、供试品溶液，对对照品溶液、供试品溶液进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A为8～12mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.08～0.12％V/V磷酸，流动相B为甲醇和乙腈的体积比为95:5～85:15的混合溶剂，梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为220～240nm；采用外标法测定利伐沙班中4‑(4‑吗啉基)‑苯胺的含量。本发明方法用于检测利伐沙班中的基因毒性杂质4‑(4‑吗啉基)‑苯胺，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，且检测量更低。
Description
技术领域
本发明属于物质检测技术领域，涉及一种高效液相色谱法(HPLC)测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，尤其是涉及一种高效液相色谱法测定利伐沙班中杂质4-(4-吗啉基)-苯胺的方法。
背景技术
伐沙班片为一种抗血栓药物，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Xa因子。利伐沙班为利伐沙班片中主要活性成分，通过测定利伐沙班潜在基因毒性杂质，可以较好的反映利伐沙班片的质量。因此，建立一种测定利伐沙班中的潜在基因毒性杂质方法，可以更好的控制利伐沙班的质量和产品的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于建立一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质4-(4-吗啉基)-苯胺的方法，以更好的控制利伐沙班的质量和产品的稳定性。
由于4-(4-吗啉基)-苯胺极性较大，采用0.1％磷酸溶液为流动相A时，4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间2～5min，容易被溶剂峰干扰而不能准确采集到数据，因此发明人考虑添加离子对试剂改变4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间。发明人筛选了戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠和葵烷磺酸钠等阳离子对试剂，在离子对试剂同等浓度条件下，离子对的链越长4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间相对越长，但并非保留时间越长越好，而是需要综合考虑检测成本、检测时间、空白溶剂干扰、回收率和分离度等方面，从而选用辛烷磺酸钠作为离子对添加剂，确认采用辛烷磺酸钠溶液(8～12mmol/L浓度，含0.08～0.12％V/V磷酸)作为流动相A。除去离子对试剂的影响，有机相对峰型、灵敏度和保留时间也有影响，发明人考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(V/V)混合溶剂的影响。采用甲醇作为有机相时，甲醇的比例在5％～15％时，4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间在20min之后，但是峰型较宽，灵敏度不符合要求；甲醇的比例在15％～35％时，4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间在20min之前，峰型较好，灵敏度符合要求，但是空白溶剂和供试品溶液干扰。采用乙腈做有机相时，由于乙腈的洗脱能力较甲醇强，乙腈的比例在5％～15％时，4-(4-吗啉基)-苯胺的保留时间在10～15min，峰型好，灵敏度符合要求，但是受空白溶剂和供试品溶液干扰。综合考虑甲醇和乙腈的洗脱能力，对峰型和灵敏度的影响，选用甲醇-乙腈(95:5～85:15V/V)混合溶剂作为流动相B。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括：
配制对照品溶液：取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，采用二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg～0.5μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；
配制供试品溶液：称取利伐沙班，采用二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg～10mg利伐沙班的供试品溶液；
分别对对照品溶液、供试品溶液进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，所述的流动相A为8～12mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.08～0.12％V/V磷酸，所述的流动相B为甲醇和乙腈的体积比为95:5～85:15的混合溶剂，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min。，检测波长为220～240nm；
所述的梯度洗脱的条件为：
采用外标法测定利伐沙班中4-(4-吗啉基)-苯胺的含量。
优选的，配制对照品溶液：称取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液。
优选的，配制供试品溶液：称取利伐沙班，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班的供试品溶液。
优选的，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自YMC Triart-C18色谱柱(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)、Agilent C18色谱柱(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.5μm)。
优选的，所述的流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.1％V/V磷酸；所述的流动相B为甲醇和乙腈的体积比为90:10的混合溶剂。
优选的，所述的梯度洗脱的条件为：
优选的，所述的流速为1.0mL/min。
优选的，所述的检测波长为225～235nm；更优选的，所述的检测波长为230nm。
所述的进样量为20μL～100μL。
本发明的有益效果：
本发明采用高数液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质4-(4-吗啉基)-苯胺，分离效率高、分析速度快(保留时间为42min～50min)、检测灵敏度高，通过检测利伐沙班中潜在基因毒性杂质，控制利伐沙班中潜在基因毒性杂质在50ppm以内，能够控制利伐沙班的质量，更好的控制产品的稳定。
附图说明
图1为实施例1空白溶剂的HPLC谱图。
图2为实施例1对照品溶液的HPLC谱图。
图3为实施例1供试品溶液HPLC谱图。
图4为实施例1加标供试品溶液HPLC谱图。
图5为实施例2对照品溶液HPLC谱图。
图6为实施例2检测限溶液HPLC谱图。
图7为实施例3定量限溶液HPLC谱图。
图8为实施例3定量限加标供试品溶液的HPLC图。
图9为实施例4空白溶剂的HPLC图。
图10为实施例4对照品溶液的HPLC图。
图11为实施例4供试品溶液的HPLC图。
图12为实施例4加标供试品溶液的HPLC图。
图13为实施例5空白溶剂的HPLC图。
图14为实施例5对照品溶液的HPLC图。
图15为实施例5供试品溶液的HPLC图。
图16为实施例5加标供试品溶液的HPLC图。
图17为实施例6空白溶剂的HPLC图(检测波长为225nm)。
图18为实施例6对照品溶液的HPLC图(检测波长为225nm)。
图19为实施例6供试品溶液的HPLC图(检测波长为225nm)。
图20为实施例6加标供试品溶液的HPLC图(检测波长为225nm)。
图21为实施例6空白溶剂的HPLC图(检测波长为235nm)。
图22为实施例6对照品溶液的HPLC图(检测波长为235nm)。
图23为实施例6供试品溶液的HPLC图(检测波长为235nm)。
图24为实施例6加标供试品溶液的HPLC图(检测波长为235nm)。
图25为实施例7空白溶剂的HPLC图。
图26为实施例7对照品溶液的HPLC图。
图27为实施例7供试品溶液的HPLC图。
图28为实施例7加标供试品溶液的HPLC图。
具体实施方式
通过下列实施例进一步说明本发明的技术方案，但实施例并非限制本发明的。
实施例中所用试剂均为市售或依据现有方法进行简单合成。
高效液相色谱仪型号：
实施例1～实施例6色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，实施例7色谱柱为Agilent C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.5μm)。
所用试剂：
实施例1
高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括如下步骤：
空白溶剂：二甲基亚砜。
对照品溶液的制备：称取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液。
供试品溶液的制备：称取利伐沙班，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班的供试品溶液。
加标供试品溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量、利伐沙班适量，加二甲基亚砜制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班和0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的加标供试品溶液。
测定：分别吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，高效液相色谱仪色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％V/V)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表1，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为230nm。
表1.梯度洗脱程序
空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液的HPLC图分别如图1、图2、图3、图4所示。说明：在此条件下，对照品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺峰分离度符合要求；供试品溶液不干扰对照品中4-(4-吗啉基)-苯胺的检测；加标供试品溶液中能有效检测出4-(4-吗啉基)-苯胺且回收率良好。
实施例2检测限的实施例
检测限溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.6ng4-(4-吗啉基)-苯胺的检测限溶液。
测定：分别吸取对照品溶液(同实施例1)、检测限溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，高效液相色谱仪色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％V/V)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表1，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为230nm。
对照品溶液的HPLC图如图5所示，检测限溶液的HPLC图如图6所示。
实施例3定量限的实施例
定量限溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量，加二甲基亚砜制成每1mL二甲基亚砜含2ng4-(4-吗啉基)-苯胺的定量限溶液。
定量限加标供试品溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量，取利伐沙班适量，加二甲基亚砜制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班和2ng4-(4-吗啉基)-苯胺的定量限加标供试品溶液。
测定：分别吸取对照品溶液(同实施例1)、定量限溶液、定量限加标供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，高效液相相色谱仪色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％V/V)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表1，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为230nm。
定量限溶液的HPLC图如图7所示，定量限加标供试品溶液的HPLC图如图8所示。
实施例4
高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括如下步骤：
空白溶剂：二甲基亚砜。
对照品溶液的制备：称取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；
供试品溶液的制备：称取利伐沙班，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班的供试品溶液。
加标供试品溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量、利伐沙班适量，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班和0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的加标供试品溶液。
测定：分别吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪。高效液相色谱仪色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表2，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为230nm。
表2.梯度洗脱程序
空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液的HPLC图分别如图9、图10、图11所示。
结论：有机相(流动相B)比例降低2％(即18％)时，对照品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间RSD为0.3％，小于2.0％，峰面积RSD为3.9％，小于5.0％；加标供试品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺回收率为71.38％，在70.0％～150.0％范围内，符合要求。
实施例5
高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括如下步骤
空白溶剂：二甲基亚砜。
对照品溶液的制备：称取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，加二甲基亚砜制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取利伐沙班，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班的供试品溶液。
加标供试品溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量、利伐沙班适量，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班和0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的加标供试品溶液。
测定：分别吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪。高效液相相色谱仪色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％V/V)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表3，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为230nm。
表3.梯度洗脱程序
空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液的HPLC图分别如图14、图15、图16所示。
结论：有机相(流动相B)比例升高2％(即22％)时，对照品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间RSD为0.5％，小于2.0％，峰面积RSD为4.6％，小于5.0％；加标供试品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺回收率为45.69％，不在70.0％～150.0％范围内，不符合要求。
实施例6不同波长的测定
高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括如下步骤：
空白溶剂：二甲基亚砜；
对照品溶液的制备：称取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取利伐沙班，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班的供试品溶液；
加标供试品溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量、利伐沙班适量，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班和0.125μg加标供试品溶液；
测定：分别吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪。高效液相相色谱仪色谱柱为YMC Triart-C18(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.0μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％V/V)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表1，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长分别为225nm、235nm。
检测波长为225nm时，空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液的HPLC图如图17、图18、图19、图20所示。
检测波长为235nm时，空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液的HPLC图如图21、图22、图23、图24所示。
结论：检测波长为225nm时，对照品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间RSD为0.2％，小于2.0％，峰面积RSD为4.5％，小于5.0％；加标供试品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺回收率为84.32％，在70.0％～150.0％范围内，符合要求。检测波长为235nm时，对照品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间RSD为0.2％，小于2.0％，峰面积RSD为3.7％，小于5.0％；加标供试品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺回收率为81.86％，在70.0％～150.0％范围内，符合要求；空白溶剂无干扰。
实施例7不同色谱柱的选择
高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，包括如下步骤：
空白溶剂：二甲基亚砜。
对照品溶液的制备：称取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；
供试品溶液的制备：称取利伐沙班，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班的供试品溶液；
加标供试品溶液的制备：分别取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品适量、利伐沙班适量，加二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg利伐沙班和0.125μg4-(4-吗啉基)-苯胺的加标供试品溶液；
测定：分别吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪；高效液相色谱仪采用Agilent C18色谱柱(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.5μm)，流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液(含磷酸0.1％V/V)，流动相B为甲醇-乙腈(90:10V/V)，梯度洗脱程序见表1，流速为1.0mL/min；高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为230nm。
空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液在不同波长下的检测图谱如图25、图26、图27、图28所示。
结论：更换AgilentC18色谱柱(内径4.6mm，长度150mm，粒径3.5μm)，对照品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺保留时间RSD为0.5％，小于2.0％，峰面积RSD为2.5％，小于5.0％；加标供试品溶液中4-(4-吗啉基)-苯胺回收率为109.69％，在70.0％～150.0％范围内，符合要求；空白溶剂无干扰。
Claims (7)
1.一种高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：包括：
配制对照品溶液：取4-(4-吗啉基)-苯胺对照品，采用二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含0.125μg～0.5μg4-(4-吗啉基)-苯胺的对照品溶液；
配制供试品溶液：称取利伐沙班，采用二甲基亚砜配制成每1mL二甲基亚砜含2.5mg～10mg利伐沙班的供试品溶液；
分别对对照品溶液、供试品溶液进行HPLC检测，所述的HPLC检测的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，所述的流动相A为8～12mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.08～0.12％V/V磷酸，所述的流动相B为甲醇和乙腈的体积比为95:5～85:15的混合溶剂，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，检测波长为220～240nm；
所述的梯度洗脱的条件为：
采用外标法测定利伐沙班中4-(4-吗啉基)-苯胺的含量。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：所述的流动相A为10mmol/L辛烷磺酸钠溶液，含0.1％V/V磷酸；所述的流动相B为甲醇和乙腈的体积比为90:10的混合溶剂。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：所述的梯度洗脱的条件为：
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：所述的流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：所述的检测波长为225～235nm。
6.根据权利要求1或5所述的高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：所述的检测波长为230nm。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定利伐沙班中潜在基因毒性杂质的方法，其特征在于：进样量为20μL～100μL。
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