CN105738489A - 一种采用液相色谱法测定利伐沙班及其杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定利伐沙班及制剂中杂质的方法，该方法采用液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以混合缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流动相采用梯度洗脱方法，测定利伐沙班及其制剂的杂质。该方法可以将利伐沙班与已知杂质和未知杂质进行有效分离和测定，专属性强，准确度高，操作简便，能有效控制利伐沙班及其制剂的质量。

Description

一种采用液相色谱法测定利伐沙班及其杂质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及用液相色谱法测定利伐沙班及其制剂中杂质的方法。

背景技术

利伐沙班是一个高选择性直接抑制因子Xa的口服抗凝药，其分子式为C₁₉H₁₈ClN₃O₅S，其结构式见下式（a）化合物。

利伐沙班的化学名为：5-​氯-​N-​({(5S)​-​2-​ 氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​-​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​ 基}​-​甲基)​-​2-​噻吩-甲酰胺。在合成利伐沙班的工艺中，一些已知结构的中间体和未知杂质因去除不完全而残留，影响利伐沙班的纯度和质量，这些已知结构的中间体和未知结构的杂质以及伐沙班的降解产物统称为药物质量控制中通常所说的有关物质（即杂质）。对于利伐沙班中需要控制的主要已知结构杂质有五个：起始原料SM1，其结构式见下式（b）化合物；杂质IP1（去氯利伐沙班，Dechlororivaroxaban），其结构式见下式（c）化合物(在Drug Metabolism and disposition,2009,Vol.37,No.5 P1046-1055中公开)； 杂质IP2，其结构式见下式（d）化合物(WO2012035057中披露)；杂质IP3，其结构式见下式（e）化合物（US2009/36504中披露）；杂质IP4，其结构式见下式（f）化合物(WO2012035057中披露)。这些杂质均要进行控制，以保证利伐沙班质量。

CN103217492A公开一种利伐沙班光学异构体的分离测定方法。即取待测利伐沙班光学异构体样品和已知组成含量的利伐沙班消旋体标准样品适量，分别用乙腈溶解，配成待测利伐沙班光学异构体样品和已知组成含量的利伐沙班消旋体标准样品乙腈溶液，用键合型手性柱CHIRALPAKIC柱、进样，检测波长为210-260nm，柱温15-35℃，进样量5-20μl，控制流动相流速为0.7-1.0ml/min，完成待测利伐沙班光学异构体的分离；采用面积归一法将所得的利伐沙班光学异构体样品的分离图谱与已知组成的利伐沙班消旋体标准样品的分离图谱进行比对从而计算出待测的利伐沙班光学异构体中S构型和R构型的利伐沙班的含量。

CN103558326B公开了一种高效液相色谱法测定利伐沙班片中利伐沙班含量的方法，它包括如下步骤：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、测定，高效液相色谱仪的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇和0.01%磷酸的混合溶液，柱温为40～50℃，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，读取数据。本发明应用高效液相色谱法测定利伐沙班片剂中利伐沙班含量，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，通过检测利伐沙班片中利伐沙班的含量，能够控制利伐沙班片剂的质量，更好的控制产品的稳定性。

CN103822997A公开了一种利伐沙班中间体的分析检测方法，用于利伐沙班中间体的质量控制，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（C18，4.6×150mm，5μm），以高氯酸水溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，以检测波长为240～250nm，柱温为30～40℃，流速0.7～1.1ml/min进行高效液相色谱法分析检测。本发明的分析检测方法可以有效的将利伐沙班中间体及其杂质分开，而且该方法具有分离度及灵敏度高，重复性及耐用性好，分析时间短，操作简单，结果稳定可靠的优点。

由于利伐沙班有关物质较多，本发明人发现上述公开的利伐沙班的测试方法可以测定利伐沙班的含量及其手性异构体，但难以将利伐沙班与杂质（手性异构体除外）和杂质与杂质之间进行分离测定，不能有效控制利伐沙班的质量。这主要是这些杂质的物质极性或结构类似，特别是杂质IP1和IP3、杂质IP2和起始原料SM1的极性相似，给分离带来难度，也就是说在满足利伐沙班与各个杂质分离的前提下，还要满足杂质与杂质之间的分离，现有技术方法和常规方法难以满足这些要求，有必要研究一种新的测试条件和方法，以实现利伐沙班与杂质以及杂质与杂质之间的有效分离，完成伐沙班及其制剂的质量的有效控制，为此完成本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用液相色谱法（HPLC）分离测定利伐沙班及其杂质的方法，该方法能有效达到利伐沙班与杂质、杂质与杂质之间的分离和测定，从而实现对利伐沙班及其制剂质量的有效控制。解决了现有技术无法实现利伐沙班及其制剂的有效质量控制的问题，该方法可简单、快速、准确地分离检测出利伐沙班及其制剂中的有关物质即杂质。

本文中所说的杂质是指从合成过程中引入的杂质或原料药或其制剂降解产生的杂质，包括起始原料等。利伐沙班及其制剂中的杂质较多，主要杂质包含： N-​({(5S)​-​2-​ 氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​-​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​ 基}​-​甲基)​-​2-​噻吩-甲酰胺(本文简称IP1)、N,N’-双[{(5S)​-​2-​氧代-​3-​[4-​(3-​氧代吗啉-​4-​基)​苯基]​-​1,3-​噁唑烷-5-基}​甲基] 脲(本文简称IP2)、2-​[2-​({4-​[(5S)​-​5-​({[(5-​氯-​2-​噻吩基)​甲酰基]​氨基}​甲基)​-​2-​氧代 - 1,​3-​噁唑烷- 3-基 ] 苯基}氨基)​乙氧基]​-乙酸或其单盐酸盐（简称IP3）、5-​氯-噻吩- 2-​羧酸（本文简称SM1）、或N ¹,​N ²-​双({(5S)​-​2-​氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​基}​甲基)​-1,​2-​苯二酰胺(本文简称IP4)。

为实现本发明的方法，提供了如下实施方案：

在一实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法测定利伐沙班及杂质的方法，包括：

a）采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；

b）以缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

c）流动相采用梯度洗脱法，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，用紫外检测器进行检测；

其中，所述缓冲溶液为三氟乙酸与磷酸盐的混合溶液,

所述梯度洗脱法为：0分钟，流动相A为95%～90%，流动相B为5%～10%；0分钟至9分钟，流动相A线性减少至70%～60%，流动相B线性增加至30%～40%；9分钟至28分钟，流动相A线性减少至60%～30%，流动相B线性增加至40%～70%；28分钟至50分钟，流动相A为40%～30%，流动相B为60%～70%；50.1分钟，流动相A为95%～90%，流动相B为5%～10%；50.1分钟至60分钟，流动相A为95%～90%，流动相B为5%～10%；即50分钟后为平衡色谱柱，流动相A和流动相B均为体积百分比。

在上述实施方案中，本发明的方法，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵和它们的混合物，优选为磷酸二氢钠。

在上述实施方案中，本发明的方法，所述缓冲溶液中磷酸盐的浓度为0.0001-1mol/L，优选为0.01mol/L，三氟乙酸的浓度为0.01-0.1%(V/V)，优选为0.05%(V/V)，所述缓冲溶液的pH为4.40-4.60。

在上述实施方案中，优选的，本发明的方法，所述梯度洗脱法为：0分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；0分钟至9分钟，流动相A线性减少至70%（V/V），流动相B线性增加至30%（V/V）；9分钟至28分钟，流动相A线性减少至60%（V/V），流动相B线性增加至40%（V/V）；28分钟至50分钟，流动相A线性减少至30%（V/V），流动相B线性增加至70%（V/V）；50.1分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；50.1分钟至60分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱。

在上述实施方案中，本发明的方法，还进一步包含以下步骤：

a) 供试品溶液的配制：取利伐沙班或含利伐沙班的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配制成每1ml含利伐沙班0.01至5mg的样品溶液作为供试品溶液；

b) 对照溶液的配制：精密量取利伐沙班供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度0.1%～2.0%的溶液，作为对照溶液；

c) 设置流动相的流速为0.8～1.2ml/min，设置检测波长为220nm至250nm，设置色谱柱的柱温为20℃至30℃，设置进样量为5ml至100ml，分别精密量取等体积的供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定；

其中，所述稀释剂为甲醇、乙腈和水的混合溶液，甲醇：乙腈：水的体积比为1：1：1～2：2：1，优选为2：1：1。

上述本发明的方法，优选的，步骤c)中，流动相的流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，柱温为25℃，进样量为20ml。

在上述实施方案中，本发明的方法，所述杂质包含下列化合物中一种或多种： N-​({(5S)​-​2-​ 氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​-​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​ 基}​-​甲基)​-​2-​噻吩-甲酰胺、N,N’-双[{(5S)​-​2-​氧代-​3-​[4-​(3-​氧代吗啉-​4-​基)​苯基]​-​1,3-​噁唑烷-5-基}​甲基] 脲、2-​[2-​({4-​[(5S)​-​5-​({[(5-​氯-​2-​噻吩基)​甲酰基]​氨基}​甲基)​-​2-​氧代 - 1,​3-​噁唑烷- 3-基 ] 苯基}氨基)​乙氧基]​-乙酸或其单盐酸盐、5-​氯-噻吩- 2-​羧酸、N ¹,​N ²-​双({(5S)​-​2-​氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​基}​甲基)​-1,​2-​苯二酰胺。

在一具体实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法测定利伐沙班及杂质的方法，包括：

a） 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；

b） 以缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

c） 流动相采用梯度洗脱方法，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，用紫外检测器进行检测；

其中，所述缓冲溶液为三氟乙酸与磷酸二氢钠的混合溶液，所述缓冲溶液的pH为4.40至4.60，所述梯度洗脱法为：0分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；0分钟至9分钟，流动相A线性减少至70%（V/V），流动相B线性增加至30%（V/V）；9分钟至28分钟，流动相A线性减少至60%（V/V），流动相B线性增加至40%（V/V）；28分钟至50分钟，流动相A线性减少至30%（V/V），流动相B线性增加至70%（V/V）；50.1分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；50.1分钟至60分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱，该方法包括以下步骤：

a) 供试品溶液的配制：取利伐沙班或含利伐沙班的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配

制成每1ml含利伐沙班0.01至5mg的样品溶液作为供试品溶液；

b）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度

0.1%～2.0%的溶液，作为对照溶液；

c）设置流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min；设置检测波长为220nm至250nm，优选250nm；设置色谱柱的柱温为20℃至30℃，优选25℃；设置进样量为5ml至100ml，优选20ml；分别精密量取等体积供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定；

其中，所述稀释剂为甲醇、乙腈和水的混合溶液，甲醇、乙腈与水的体积比为1：1：1～2：2：1，优选2:1:1。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，所说的缓冲溶液的pH为4.45至4.55，最优为4.50；缓冲溶液中三氟乙酸的浓度为0.01%至0.1%(V/V)，优选为0.05%至0.1%(V/V)，最优选为0.05%(V/V)，磷酸二氢钠的浓度为0.0001mol/L至1mol/L，优选0.001mol/L至0.01mol/L，最优0.01mol/L；。

在上述实施方案中，本发明的方法，所说的色谱柱选自下列牌号的色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent Zorbax Extend-C18、Welch Xtimate C18、Welch AQ-C18和Kromasil 100-5C18色谱柱。

在上述具体实施方案中，本发明的方法，所述杂质包括已知结构的杂质和其它未知结构的杂质（包括降解产物），其中，已知结构的杂质包含选自以下化合物中的一种或多种： IP1、IP2、IP3、IP4、SM1。

有益效果：

本发明的方法，能够有效的分离检测利伐沙班及其制剂中的杂质，选用甲醇、水和乙腈混合液作为稀释剂溶解样品，排除了溶剂峰的干扰和溶剂效应；采用梯度洗脱，确保能够使利伐沙班与杂质、杂质与杂质之间得到有效分离；配合三氟乙酸和磷酸二氢钠，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效；流动相B选择乙腈，增大了分离度，使杂质与杂质之间得到有效分离。

本发明的方法可以将利伐沙班与相邻的杂质峰、降解产物、起始原料以及各个已知结构的杂质达到有效分离，能准确测定杂质，而且峰形对称，柱效较高，解决了利伐沙班及其制剂有关物质（杂质：包括起始原料、中间体和降解产物）分离和测定较为困难的问题，从而保证了利伐沙班及其制剂的质量可控。

附图说明

图1 为稀释剂的空白液相色谱图

图2 为SM1（起始原料）对照溶液的液相色谱图

图3 为IP1对照溶液的液相色谱图

图4 为IP2对照溶液的液相色谱图

图5 为IP3对照溶液的液相色谱图

图6 为IP4对照溶液的液相色谱图

图7 为利伐沙班+SM1 +IP1+IP2+IP3 +IP4的液相色谱图

图8 为利伐沙班原料药有关物质供试品溶液的液相色谱图

图9 为利伐沙班原料药有关物质1.0%对照溶液的液相色谱图

图10为利伐沙班片杂质测定供试品溶液的液相色谱图

图11为利伐沙班片杂质测定空白辅料供试液的液相色谱图

具体实施方式

以下实施例用于进一步理解和说明本发明的实质，但不以此限制本发明的范围。

实施例 1

仪器与条件

Agilent 1260型液相色谱仪及化学工作站；自动进样；以Kromasil 100-5 C18柱（5mm，250×4.6mm）为分离色谱柱；紫外检测器波长：250nm；流动相：以0.05%三氟乙酸与0.01mol/L磷酸二氢钠混合溶液（用氢氧化钠溶液调节pH值至4.50）为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱；0分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；0分钟至9分钟，流动相A线性减少至70%（V/V），流动相B线性增加至30%（V/V）；9分钟至28分钟，流动相A线性减少至60%（V/V），流动相B线性增加至40%（V/V）；28分钟至50分钟，流动相A线性减少至30%（V/V），流动相B线性增加至70%（V/V）；50.1分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；50.1分钟至60分钟，流动相A为93%（V/V），流动相B为7%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱。柱温为25℃，流速：1.0ml/min，进样体积为20ml。

操作方法：

分别取IP1、IP2、IP3、IP4、SM1 12.5mg，精密称量，分别置25ml量瓶中，加（乙腈：水=1:1 V/V）或（甲醇：水=1:1 V/V）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密量取贮备液0.25ml，置25ml量瓶中，加稀释剂（甲醇：乙腈：水=2:1:1 V/V）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照溶液；取利伐沙班约12.5mg，精密称定，置25ml量瓶中，精密加入杂质贮备液各0.25ml，加稀释剂（甲醇：乙腈：水=2:1:1 V/V）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。

分别取稀释剂（甲醇：乙腈：水=2:1:1 V/V）、利伐沙班对照溶液、各杂质对照溶液以及混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7。

图7中依次出峰的顺序是SM1、IP2、IP4、IP1、IP3、利伐沙班。

图1表明，稀释剂及色谱系统不干扰测定；图7表明，本发明的方法可以有效分离利伐沙班中可能存在的未知结构的杂质和已知结构的杂质，即本方法可以用于利伐沙班及其制剂的杂质的测定和利伐沙班及其制剂的质量有效控制。

实施例 2

利伐沙班原料药中杂质的测定。

取利伐沙班约12.5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂（甲醇：乙腈：水=2:1:1 V/V）超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度1.0%的溶液，作为对照溶液；照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰（除溶剂峰外），已知杂质乘以校正因子后峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2（0.5%），单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1/2（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。结果见图8、图9。

实施例 3

用液相色谱法测定利伐沙班片的杂质。

取本品适量（约相当于利伐沙班12.5mg），置25ml量瓶中，加稀释剂（乙甲醇：乙腈：水=2:1:1 V/V）超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度1.0%的溶液，作为对照溶液；另按处方比例取空白辅料适量，照供试品溶液相同的方法制备空白辅料供试液；照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰（除溶剂峰和空白辅料峰外），已知杂质乘以校正因子后峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2（0.5%），单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1/2（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。结果见图10、图11。

实施例 4

参照实施例1的试验操作和条件参数，分别改变色谱条件中的流速、柱温、流动相的起始比例、缓冲液的pH值和色谱柱，其它条件及参数不变，考察利伐沙班与杂质、杂质与杂质之间的分离情况。结果见下表：

根据上表的结果表明，本发明的方法均能使利伐沙班与杂质、杂质与杂质之间达到基线分离，从而实现利伐沙班与杂质以及各杂质间有效的分离测定。本发明的方法专属性强，准确度高，操作简便。

Claims (10)

1.一种采用液相色谱法测定利伐沙班及其杂质的方法，包括：

a）采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；

b）以缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

c）流动相采用梯度洗脱方法，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，用紫外检测器进行检测；

其中，所述缓冲溶液为三氟乙酸与磷酸盐的混合溶液,

所述梯度洗脱方法为：0分钟，流动相A为95%～90%，流动相B为5%～10%；0分钟至9分钟，流动相A线性减少至70%～60%，流动相B线性增加至30%～40%；9分钟至28分钟，流动相A线性减少至60%～30%，流动相B线性增加至40%～70%；28分钟至50分钟，流动相A为40%～30%，流动相B为60%～70%；50.1分钟，流动相A为95%～90%，流动相B为5%～10%；50.1分钟至60分钟，流动相A为95%～90%，流动相B为5%～10%；即50分钟后为平衡色谱柱，流动相A和流动相B均为体积百分比。

2.根据权利要求1所述的方法，所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵和它们的混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，所述磷酸盐为磷酸二氢钠。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，所述缓冲溶液中磷酸二氢钠的浓度为0.0001-1mol/L，三氟乙酸的浓度为0.01-0.1%V/V。

5.根据权利要求4所述的方法，所述磷酸二氢钠的浓度为0.01mol/L，所述三氟乙酸的浓度为0.05%V/V。

6.根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的缓冲溶液的pH为4.40-4.60。

7.根据权利要求1所述的方法，还包含以下步骤：

d) 供试品溶液的配制：取利伐沙班或含利伐沙班的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配制成每1ml含利伐沙班0.01至5mg的样品溶液作为供试品溶液；

e) 对照溶液的配制：精密量取利伐沙班供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度0.1%～2.0%的溶液，作为对照溶液；

f) 设置流动相的流速为0.8～1.2ml/min，设置检测波长为220nm至250nm，设置色谱柱的柱温为20℃至30℃，设置进样量为5ml至100ml，分别精密量取等体积的供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定；

其中，所述稀释剂为甲醇、乙腈和水的混合溶液，甲醇：乙腈：水的体积比为1：1：1～2：2：1。

8.根据权利要求7所述的方法，步骤c)中，流动相的流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，柱温为25℃，进样量为20ml。

9.根据权利要求7所述的方法，所述甲醇：乙腈：水的体积比为2：1：1。

10.根据权利要求1所述的方法，所述杂质包含下列化合物中一种或多种： N-​({(5S)​-​2-​ 氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​-​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​ 基}​-​甲基)​-​2-​噻吩-甲酰胺、N,N’-双[{(5S)​-​2-​氧代-​3-​[4-​(3-​氧代吗啉-​4-​基)​苯基]​-​1,3-​噁唑烷-5-基}​甲基] 脲、2-​[2-​({4-​[(5S)​-​5-​({[(5-​氯-​2-​噻吩基)​甲酰基]​氨基}​甲基)​-​2-​氧代 - 1,​3-​噁唑烷- 3-基 ] 苯基}氨基)​乙氧基]​-乙酸或其单盐酸盐、5-​氯-噻吩- 2-​羧酸、N ¹,​N ²-​双({(5S)​-​2-​氧代-​3-​[4-​(3-​氧代-​4-​吗啉基)​苯基]​-​1,​3-​噁唑烷-​5-​基}​甲基)​-1,​2-​苯二酰胺。