CN105588886A

CN105588886A - 一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法

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Publication number: CN105588886A
Application number: CN201410653684.5A
Authority: CN
Inventors: 熊娟; 代广会; 万娟; 张道林
Original assignee: Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Chongqing Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-11-18
Also published as: CN105588886B

Abstract

本发明公开了一种采用液相色谱法分离测定阿普斯特及制剂中杂质的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以缓冲溶液为流动相A，甲醇与乙腈的混合溶剂为流动相B，流动相采用梯度洗脱方法，测定阿普斯特及其制剂的杂质。该方法可以将阿普斯特与已知杂质和未知杂质进行有效分离和测定，专属性强，准确度高，操作简便，能有效控制阿普斯特及其制剂的质量。

Description

一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法。

背景技术

阿普斯特（Methylnaltrexonebromide）是一种磷酸二酯酶-4（PDE-4）的抑制剂，其分子式为C₂₂H₂₄N₂O₇S，其结构式见下式（a）化合物。

阿普斯特的化学名为：(S)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基乙基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1,3-二酮。在合成该化合物的过程中，有几步重要的中间体和未知杂质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，这些已知中间体和未知杂质以及产生的降解产物即为药物质量控制中通常所说的有关物质（即杂质）。对于阿普斯特的合成主要控制的已知杂质有八个，分别是：起始原料SM2，其结构式见下式（b）；中间体II，其结构式见下式（c）；中间体IV，其结构式见下式（d）；IP1，其结构式见下式（e）；IP8，其结构式见下式（f）；IP9，其结构式见下式（g）；IP10，其结构式见下式（h）；IP14，其结构式见下式（i）。其中，中间体Ⅱ即式（c）可通过商业途径购买；IP1、IP9、IP10和IP14已在Disposition,metabolismandmassbalanceof[¹⁴C]apremilastfollowingoraladministration；Xenobiotica,2011;41(12):1063–1075中公开。

可见，阿普斯特的相关物质较多，且结构类似，给分离带来难度，另外，各个杂质的极性各不相同，有极性差异较大的中间体IV和IP1，有极性相近的IP9和IP10、以及IP1和IP14，在满足阿普斯特与各个杂质分离的前提下，还要满足杂质与杂质之间的分离，这使检测增大了难度。采用常规的检测手段方法难以实现阿普斯特与杂质以及杂质与杂质之间的有效分离，这会影响阿普斯特及其制剂的质量控制。

为了准确地控制阿普斯特及制剂产品的质量，有必要研究一种能简单、快速、准确地分离检测出阿普斯特及其制剂有关物质的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用液相色谱法（HPLC）分离测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法，该方法能有效实现阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间的分离和测定，从而实现对阿普斯特及其制剂质量的有效控制。

这里所说的杂质是指从合成过程中引入的杂质或原料药或其制剂降解产生的杂质，包括起始原料等，还包括已知结构杂质和未知结构杂质。所述测定阿普斯特及其制剂中的杂质是指测定阿普斯特原料药和含有阿普斯特的制剂中的杂质或称为相关物质，所述已知结构的杂质包含：4-氨基-2-[1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1H-异吲哚-1,3（2H）-二酮（简称IP1）、3-乙酰基邻苯二甲酸（简称IP8）、N-{2-[1-（3-乙氧基-4-羟基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基}乙酰胺（简称IP9）、N-{2-[1-（3-乙氧基-4-羟基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基}乙酰胺（简称IP10）、N-{2-[1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基}-2-羟基乙酰胺（简称IP14）、3-硝基邻苯二甲酸（简称SM2）、（S）-1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-(甲基磺酰基)乙胺，N-乙酰基-L-亮氨酸盐（简称中间体II）或3-氨基邻苯二甲酸（简称中间体IV）。

为实现本发明的方法，提供了如下实施方案：

在一实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法，包括：

a）采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；

b）以缓冲溶液为流动相A，甲醇与乙腈的混合溶剂为流动相B；

c）流动相采用梯度洗脱方法，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，用紫外检测器进行检测；

其中，所述缓冲溶液为磷酸、磷酸盐溶液或它们的混合物，甲醇和乙腈的体积比为60：40~40：60。

在上述实施方案中，本发明的方法，所说的缓冲溶液的pH为2.0至2.4，优选pH2.0至2.3，最优为pH2.3；缓冲溶液的浓度为0.0001mol/L至1mol/L，优选为0.001mol/L至0.1mol/L，最优选为0.01mol/L；所说的缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液，其浓度为0.0001mol/L至1mol/L，优选0.001mol/L至0.01mol/L，最优0.01mol/L；所说的磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二铵，优选磷酸二氢钾。

在上述实施方案中，本发明的方法，所说的色谱柱选自下列牌号的色谱柱：AgilentEclipsePlusC18、AgilentZorbaxSB-C18、AgilentZorbaxXDB-C18、AgilentZorbaxExtend-C18、WelchXB-C18和WelchAQ-C18色谱柱。

在上述实施方案中，本发明的方法，所说的梯度洗脱方法为：0分钟，流动相A为95%～80%（V/V），流动相B为5%～20%（V/V）；0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%～60%（V/V），流动相B线性增加至20%～40%（V/V）；8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20%～0%（V/V），流动相B线性增加至80%～100%（V/V）；40分钟至50分钟，流动相A为20%～0%（V/V），流动相B为80%～100%（V/V）；50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95%～80%（V/V），流动相B线性减少至5%～20%（V/V）；53分钟至60分钟，流动相A为95%～80%（V/V），流动相B为5%～20%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱。

在上述实施方案中，本发明的方法，优选的梯度洗脱方法为：0分钟，流动相A为95%（V/V），流动相B为5%（V/V）；0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%（V/V），流动相B线性增加至20%（V/V）；8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20%（V/V），流动相B线性增加至80%（V/V）；40分钟至50分钟，流动相A为20%（V/V），流动相B为80%（V/V）；50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95%（V/V），流动相B线性减少至5%（V/V）；53分钟至60分钟，流动相A为95%（V/V），流动相B为5%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱。

在上述实施方案中，本发明的方法，还包括以下步骤：

a)供试品溶液的配制：取阿普斯特或含阿普斯特的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配

制成每1ml含阿普斯特0.5至10mg的样品溶液作为供试品溶液；

b）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度

0.1%～2.0%的溶液，作为对照溶液；

c）设置流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min；设置检测波长为200nm至250nm，优选230nm；设置色谱柱的柱温为15℃至40℃，优选25℃；设置进样量为5ml至100ml，优选20ml；分别精密量取等体积供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定；

其中，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈与水的体积比为5：95～30：70，优选20：80。

在一具体实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法，包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，其pH值为2.3，以体积比为45：55（V/V）的甲醇-乙腈为流动相B，进行梯度洗脱：0分钟，流动相A为95%（V/V），流动相B为5%（V/V）；0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%（V/V），流动相B线性增加至20%（V/V）；8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20%（V/V），流动相B线性增加至80%（V/V）；40分钟至50分钟，流动相A为20%（V/V），流动相B为80%（V/V）；50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95%（V/V），流动相B线性减少至5%（V/V）；53分钟至60分钟，流动相A为95%（V/V），流动相B为5%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱，包括以下步骤：

a）供试品溶液的配制：取阿普斯特或含阿普斯特的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配

制成每1ml含阿普斯特0.5至10mg的样品溶液作为供试品溶液；

0.1%～2.0%的溶液，作为对照溶液；

本发明所述的杂质包括已知结构的杂质和其它未知结构的杂质（包括降解产物）。所述的

已知结构的杂质包含选自以下化合物中的一种或多种：IP1、IP8、IP9、IP10、IP14、SM2、中间体II和中间体IV。

本发明采用AgilentEclipsePlusC18色谱柱，能够有效的分离检测阿普斯特及其制剂中的杂质。选用水与乙腈混合液作为稀释剂溶解样品，排除了溶剂峰的干扰和溶剂效应；采用梯度洗脱，确保能够使阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间得到有效分离；配合磷酸二氢钾，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效；流动相B选择甲醇和乙腈的混合溶液，增大了分离度，使杂质与杂质之间得到有效分离。

本发明的方法可以将阿普斯特与相邻的杂质峰、降解产物以及起始原料、中间体II、中间体IV以及各个已知结构的杂质达到有效分离，能准确测定杂质，而且峰形对称，柱效较高，从而解决了阿普斯特及其制剂有关物质（杂质：包括起始原料、中间体和降解产物）分离和测定较为困难的问题，从而保证了阿普斯特及其制剂的质量可控。

附图说明

图1稀释剂的液相色谱图

图2SM2（起始原料）对照溶液的液相色谱图

图3中间体II对照溶液的液相色谱图

图4中间体IV对照溶液的液相色谱图

图5IP1对照溶液的液相色谱图

图6IP8对照溶液的液相色谱图

图7IP9对照溶液的液相色谱图

图8IP10对照溶液的液相色谱图

图9IP14对照溶液的液相色谱图

图10阿普斯特+SM2+中间体II+中间体IV+IP1+IP8+IP9+IP10+IP14的液相色谱图

图11阿普斯特原料药有关物质供试品溶液的液相色谱图

图12阿普斯特原料药有关物质1.0%对照溶液的液相色谱图

图13阿普斯特片杂质测定供试品溶液的液相色谱图

图14阿普斯特片杂质测定空白辅料供试液的液相色谱图。

具体实施方式

实施例1

仪器与条件

Agilent1200型液相色谱仪及化学工作站；自动进样；以AgilentEclipsePlusC18柱（5mm，250×4.6mm）为分离色谱柱；紫外检测器波长：230nm；流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸溶液调节pH值至2.3）为流动相A，以甲醇-乙腈（45：55；V/V）为流动相B，梯度洗脱；0分钟，流动相A为95%（V/V），流动相B为5%（V/V）；0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%（V/V），流动相B线性增加至20%（V/V）；8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20%（V/V），流动相B线性增加至80%（V/V）；40分钟至50分钟，流动相A为20%（V/V），流动相B为80%（V/V）；50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95%（V/V），流动相B线性减少至5%（V/V）；53分钟至60分钟，流动相A为95%（V/V），流动相B为5%（V/V）；即50分钟后为平衡色谱柱。柱温为25℃，流速：1.0ml/min，进样体积为20ml。

操作方法：

分别取IP1、IP8、IP9、IP10、IP14、SM2、中间体II、中间体IV10mg，精密称量，分别置50ml量瓶中，加乙腈或水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密量取贮备液1.0ml，置10ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照溶液；取阿普斯特约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液各0.5ml，加稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。

分别取稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）、阿普斯特对照溶液、各杂质对照溶液以及混合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10。

图10中依次出峰的顺序是中间体IV、IP8、中间体II、SM2、IP9、IP10、IP14、IP1、阿普斯特。

图1表明，稀释剂及色谱系统不干扰测定；图10证明，本法可以有效分离阿普斯特中可能存在的未知结构的杂质和已知结构的杂质，即本方法可以用于阿普斯特及其制剂的杂质的测定。

实施例2

阿普斯特原料药中杂质的测定。

取阿普斯特约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取阿普斯特对照品10mg，置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰（除溶剂峰外），已知杂质乘以校正因子后峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2（0.5%），单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1/2（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。结果见图11、图12。

实施例3

用液相色谱法测定阿普斯特片的杂质。

取本品适量（约相当于阿普斯特10mg），置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取阿普斯特对照品10mg，置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20：80V/V）超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另按处方比例取空白辅料适量，照供试品溶液相同的方法制备空白辅料供试液；照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰（除溶剂峰和空白辅料峰外），已知杂质乘以校正因子后峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2（0.5%），单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1/2（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。结果见图13、图14。

实施例4

参照实施例1的试验操作和条件参数，分别改变色谱条件中的流速、柱温、流动相B的混合比例、缓冲液的pH值和色谱柱，其它条件及参数不变，考察阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间的分离情况。结果见下表：

根据上表的结果表明，本发明的方法均能使阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间达到基线分离，从而实现阿普斯特与杂质以及各杂质间有效的分离测定。本发明的方法专属性强，准确度高，操作简便。

Claims

1.一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法，包括：

a）采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；

其中，所述缓冲溶液为磷酸、磷酸盐溶液或它们的混合物，甲醇与乙腈的体积比为60：40至40：60。

2.根据权利要求1所述的方法，所述缓冲溶液为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵或它们的混合磷酸盐溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，所述磷酸盐为磷酸二氢钾。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，所述缓冲溶液的浓度为0.0001mol/L至1mol/L。

5.根据权利要求4所述的方法，所述缓冲溶液的浓度为0.001mol/L至0.1mol/L。

6.根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的缓冲溶液用磷酸溶液调节pH为2.0至2.4。

7.根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱方法为：0分钟，流动相A为95%～80%，流动相B为5%～20%；0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%～60%，流动相B线性增加至20%～40%；8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20%～0%，流动相B线性增加至80%～100%；40分钟至50分钟，流动相A为20%～0%，流动相B为80%～100%；50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95%～80%，流动相B线性减少至5%～20%；53分钟至60分钟，流动相A为95%～80%，流动相B为5%～20%；即50分钟后为平衡色谱柱，流动相A和流动相B均为体积百分比。

8.根据权利要求1所述的方法，还包含以下步骤：

a)供试品溶液的配制：取阿普斯特或含阿普斯特的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配制成每1ml含阿普斯特0.5至10mg的样品溶液作为供试品溶液；

b)对照溶液的配制：精密量取阿普斯特对照品适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度0.1%～2.0%的溶液，作为对照溶液；

设置流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min；设置检测波长为200nm至250nm，优选230nm；设置色谱柱的柱温为15℃至40℃，优选25℃；设置进样量为5ml至100ml，优选20ml；分别精密量取等体积的供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定；

9.根据权利要求1所述的方法，所述杂质包含已知结构的杂质和未知结构的杂质。

10.根据权利要求9所述的方法，所述已知结构的杂质选自下列化合物中一种或多种：4-氨基-2-[1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1H-异吲哚-1,3（2H）-二酮、3-乙酰基邻苯二甲酸、N-{2-[1-（3-乙氧基-4-羟基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基}乙酰胺、N-{2-[1-（3-乙氧基-4-羟基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基}乙酰胺、N-{2-[1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-（甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基}-2-羟基乙酰胺、3-硝基邻苯二甲酸、（S）-1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-(甲基磺酰基)乙胺，N-乙酰基-L-亮氨酸盐和3-氨基邻苯二甲酸。