CN110579546A - 一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法。该方法的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸二氢钾溶液，所述流动相B为乙腈，通过采用特定的梯度洗脱方式，可在高效液相色谱图中将阿普唑仑片中有关物质(包含阿普唑仑和至少5种常见杂质)分离检测出来，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏性及其含量的准确性进一步得到提升。本方法专属性好、分析速度快、重现性高，便于对阿普唑仑片的质量检测与监控，有利于阿普唑仑的安全推广与应用。

Description

一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法。
背景技术
阿普唑仑(Alprazolam)是一种新的BDZ类药物，具有抗焦虑、抗抑郁、镇静、催眠、抗惊厥及肌肉松弛等作用，可用于治疗焦虑症、抑郁症、失眠等，其分子作用靶点为：GABA-Areceptor，具有同地西泮相似的药理作用，但不良反应如倦乏、头晕、口干、恶心等较地西泮轻。阿普唑仑片的原研商为PHARMACIA AND UPJOHN，1981年商品名为XANAX的1mg片剂在美国首先上市，其在国内有62个批准文号，但中国药典中，并未对有关物质进行规定。
然而，阿普唑仑片在作为药品时容易产生杂质，已知有5个，分别为杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E。目前，现有技术未公开阿普唑仑片5个已知杂质的检测方法，因此需提供一种测定阿普唑仑片有关物质的方法。
发明内容
目前，现有技术未公开对阿普唑仑片中5个已知杂质的检测方法，为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法，流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸二氢钾溶液，所述流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～10min，所述流动相A的体积由75％递减为70％，所述流动相B的体积由25％递增为30％；
在第10～30min，所述流动相A的体积为70％，所述流动相B的体积为30％；
在第30～60min，所述流动相A的体积由70％递减为50％，所述流动相B的体积由30％递增为50％。
本发明发现，采用高效液相色谱法对阿普唑仑片中容易出现的杂质进行检测时，流动相的选择和洗脱方式对杂质的分离都有较大的影响，当采用固定比例的流动相A和流动相B进行检测时，难以将上述杂质很好的分离，且分析时间长，经过大量尝试发现，当采用上述方法进行梯度洗脱时，可以很好地将阿普唑仑片中容易出现的杂质区分开来。
本发明所述的阿普唑仑片有关物质包括阿普唑仑及杂质，所述杂质对照品为选自杂质A(式1)、三唑仑(式2)、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮(式3)、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮(式4)、杂质E(式5)中的一种或一种以上混合物。
通过本发明中的方法可同时将上述5个已知杂质与阿普唑仑分离开来。
为了进一步提升检测的准确性和灵敏性，本发明对高效液相色谱法的其他条件进行了优化，得到如下优选方案(将各优选方案组合可得本发明较佳实施例)：
作为优选，所述磷酸二氢钾A溶液的浓度为1.1～1.7g/L，优选为1.4g/L。
作为优选，采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
作为优选，色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm，优选为WatersShieldRP18，4.6mm×250mm，5μm。
作为优选，所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min，优选为1.0mL/min。
作为本发明的一种优选方案，采用以下条件进行测定：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱的规格为WatersShield RP18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相A：浓度为1.4g/L的磷酸二氢钾溶液；
流动相B：乙腈；
柱温：35～45℃；
检测波长：226nm～236nm；
流速：0.9～1.1mL/min；
采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～10min，所述流动相A的体积由75％递减为70％，所述流动相B的体积由25％递增为30％；
在第10～30min，所述流动相A的体积为70％，所述流动相B的体积为30％；
在第30～60min，所述流动相A的体积由70％递减为50％，所述流动相B的体积由30％递增为50％。
作为优选，取阿普唑仑片，研细，用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中含阿普唑仑250μg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
作为优选，用稀释液稀释阿普唑仑和杂质对照品作为混合对照溶液，
其中，所述阿普唑仑的浓度为20μg/mL；
所述杂质对照品选自杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E中的一种或几种；
所述杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E的浓度均为20μg/mL。
作为优选，所述稀释液为体积比为0.8-1.2:1的乙腈和水的混合物，优选为1:1；
本发明有益效果如下：本发明提供的方法可在高效液相色谱图中将阿普唑仑片中有关物质(包含阿普唑仑和5种常见杂质)分离检测出来，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏性及其含量的准确性进一步得到提升。本方法专属性好、分析速度快、重现性高，便于对阿普唑仑片的质量检测与监控，有利于阿普唑仑的安全推广与应用。
附图说明
图1是本发明实验例1的混合对照溶液色谱图。
图2是本发明实验例1的稀释液色谱图。
图3是本发明实验例1的空白辅料色谱图。
图4是本发明实验例1的供试品溶液色谱图。
图5是本发明对比例1的混合溶液色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法，采用以下条件进行测定：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：浓度为1.4g/L的磷酸二氢钾溶液；
流动相B：乙腈；
柱温：40℃；
检测波长：231nm；
流速：1.0mL/min；
采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～10min，所述流动相A的体积由75％递减为70％，所述流动相B的体积由25％递增为30％；
在第10～30min，所述流动相A的体积为70％，所述流动相B的体积为30％；
在第30～60min，所述流动相A的体积由70％递减为50％，所述流动相B的体积由30％递增为50％；
在第60～61min，所述流动相A的体积由50％递增为75％，所述流动相B的体积由50％递减为25％。
取阿普唑仑片，研细，用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含阿普唑仑250μg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
用稀释液稀释阿普唑仑片细粉和杂质对照品作为混合对照溶液，其中，所述阿普唑仑的浓度为20μg/mL；所述杂质对照品为包含杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E的混合物；所述杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E的浓度均为20μg/mL。
所述稀释液为体积比1:1的水和乙腈。
实施例1中各溶液的具体配置过程及本发明方法的试验验证过程及结果见实验例1～4。
实验例1系统适用性试验
稀释液：体积比为1:1的水和乙腈。
空白辅料溶液：精密称取空白辅料(由质量比为31:39:9:1的淀粉、蔗糖、糊精和硬脂酸镁组成)500mg，置10ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
混合对照溶液的配制：取阿普唑仑及杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E适量，加稀释液溶解并稀释制成每1mL中含阿普唑仑、杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E各20μg的溶液，滤过，取续滤液作为混合对照溶液。
各杂质定位溶液的配制：分别取杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E适量，分别加稀释液溶解并稀释制成浓度为20μg/mL的溶液作为各杂质定位溶液。
供试品溶液的配制：取阿普唑仑片细粉500mg，置10ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为浓度为1.4g/L的磷酸二氢钾溶液，流动相B为乙腈，柱温为40℃，检测波长为231nm，流速1.0mL/min，采用梯度洗脱，其运行的比例变化过程见表1。
表1有关物质梯度洗脱程序
精密量取上述各溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。各杂质定位溶液的检测结果见表2，混合对照溶液色谱图见图1，稀释液色谱图见图2，空白辅料溶液色谱图见图3，供试品溶液色谱图见图4。
表2有关物质方法学-专属性-混合对照结果
结论：稀释液、空白辅料溶液均不干扰供试品溶液中有关物质的检测，混合对照溶液中各峰与其相邻色谱峰之间的分离度均符合规定，表明本发明提供的高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法的专属性良好。
实验例2线性与范围试验
线性储备液：分别精密量取阿普唑仑、杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、杂质E各适量，分别用稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)配制成浓度为10μg/mL的溶液。
线性1溶液：分别精密量取杂质A、杂质E线性储备液各0.4mL、0.6mL、0.75mL、0.9mL、1.125mL、1.5mL置不同的20mL量瓶中，分别用稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀，即分别得到线性1溶液①②③④⑤⑥。
线性2溶液：分别精密量取三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮线性储备液各0.2mL、阿普唑仑线性储备液0.1mL，置20mL量瓶中，用稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀，即得到线性2溶液①；分别精密量取三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、阿普唑仑线性储备液各0.25mL，置20mL量瓶中，用稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀，即得到线性2溶液②；分别精密量取阿普唑仑、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮线性储备液各0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.75mL、1.0mL置不同的20mL量瓶中，分别用稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀，即分别得到线性2溶液③④⑤⑥⑦。
精密量取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3。
表3有关物质方法学-线性结果
结论：阿普唑仑在0.0603μg/ml～0.6032μg/ml范围内，线性回归方程为y＝108642.5742x-3034.5858，相关系数r为0.9996，大于0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。
杂质A在0.1624μg/ml～0.6089μg/ml范围内，线性回归方程为y＝83340.0062x-4106.3604，相关系数r为0.9999，大于0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。
三唑仑在0.1250μg/ml～0.6250μg/ml范围内，线性回归方程为y＝91933.0596x-2314.6855，相关系数r为0.9998，大于0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。
7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮在0.1114μg/ml～0.5572μg/ml范围内，线性回归方程为y＝139082.7621x-2687.2265，相关系数r为0.9997，大于0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。
杂质E在0.1269μg/ml～0.9518μg/ml范围内，线性回归方程为y＝112266.5865x-3031.1749，相关系数r为0.9997，大于0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。
实验例3回收率试验
杂质A储备液：称取杂质A对照品约7.5mg，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
三唑仑储备液：称取三唑仑对照品约5mg，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮储备液：称取7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮对照品约5mg，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
杂质E储备液：称取杂质E对照品约7.5mg，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
混合溶液：精密量取杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、杂质E对照品储备液各1ml，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取混合溶液1ml，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：称取阿普唑仑片细粉约250mg，置5ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并定容至刻度，摇匀，滤过。
回收率溶液：分别精密量取混合溶液0.4ml、0.5ml、0.6ml，置5ml量瓶中，同时加入阿普唑仑片细粉约250mg，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，分别作为80％、100％、120％回收率溶液。每个浓度平行配制3份。
精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，结果见表4。
表4有关物质方法学-回收率结果
结论：80％、100％、120％浓度下，各杂质的组内平均回收率及组间平均回收率均在92％～105％之间，表明本方法用于检测上述杂质，准确度良好。
实验例4耐用性试验
空白辅料溶液：称取空白辅料约250mg，置5ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
供试品溶液：称取阿普唑仑片细粉约250mg，置5ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加稀释液(稀释液为体积比为1:1的水和乙腈)稀释至刻度，摇匀。
混合对照溶液：取阿普唑仑对照品及杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、杂质E适量，配成每1ml中均含20μg的溶液，作为混合对照溶液。
精密量取上述溶液20μl，于各色谱条件下注入液相色谱仪，结果见表5～6。
表5有关物质方法学-耐用性-混合对照结果
表6有关物质方法学-耐用性-杂质检出情况
结论：当柱温变化±5℃、流速变化±0.1mL/分钟，检测波长变化±5nm以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱的条件下，与正常条件相比，混合对照及杂质检出量均无明显差异。上述结果表明，色谱条件有微小变动(柱温变化±5℃、流速变化±0.1mL/分钟，检测波长变化±5nm以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱)时，本色谱条件耐用性良好。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于：不采用梯度洗脱，全程采用体积比为50：50的乙腈和磷酸二氢钾溶液(浓度为1.4g/L)的混合溶液作为流动相进行洗脱。混合溶液图谱如图5所示，混合溶液中包括(浓度分别为20μg/ml的阿普唑仑、杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E)。从图5中可以看出，杂质A、阿普唑仑、三唑仑出峰时间在4-5分钟之内，相邻色谱峰的分离度小于1.5。
由结果可知，使用本发明的测定方法可以将阿普唑仑片中各杂质有效检出，分离度均大于1.5。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种高效液相色谱法测定阿普唑仑片有关物质的方法，其特征在于，流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸二氢钾溶液，所述流动相B为乙腈；采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，
在第0～10min，所述流动相A的体积由75％递减为70％，所述流动相B的体积由25％递增为30％；
在第10～30min，所述流动相A的体积为70％，所述流动相B的体积为30％；
在第30～60min，所述流动相A的体积由70％递减为50％，所述流动相B的体积由30％递增为50％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm，优选为Waters Shield RP18，4.6mm×250mm，5μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法的柱温为35～45℃，优选为40℃。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.9～1.1mL/min，优选为1.0mL/min。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法的检测波长为226nm～236nm，优选为231nm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，取阿普唑仑片，研细，用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中含阿普唑仑250μg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，用稀释液稀释阿普唑仑和杂质对照品作为混合对照溶液，
其中，所述阿普唑仑的浓度为20μg/mL；
所述杂质对照品选自杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂
-2-硫酮、杂质E中的一种或几种；
所述杂质A、三唑仑、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-酮、7-氯-1,3-二氢-5-苯基-2H-1,4-苯并二氮杂-2-硫酮、杂质E的浓度均为20μg/mL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述稀释液为体积比为0.8-1.2:1的乙腈和水，优选1:1。
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