CN113960208A - 一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，即采用高效液相进行测定，具体的液相条件为高效液相色谱仪：岛津SPD‑20A；色谱柱：HypersilBDS反向C18柱（5µm,4.6mm×250mm）；紫外检测波长230nm；柱温：室温；流动相:甲醇:水（pH=3.5磷酸溶液）=54:46；进样量：20ul；流速：0.8ml/min。本发明所述的HPLC检测方法的方法专属性强，辅料对阿普斯特的检测无干扰；采用本发明能够便捷、准确、可靠地测定出阿普斯特的含量，真实反映产品的质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法。
背景技术
阿普斯特，化学名为(S)-2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺酰基乙基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1,3-二酮，分子结构式为C22H24N2O7S，相对分子质量为460.50,易溶于乙腈，溶解于丙酮，在甲醇和乙醇中微溶，几乎不溶于水,目前临床上主要用于中重度斑块型银屑病及银屑病关节炎的治疗。
由于阿普斯特的水溶性很差，基本不溶于水。为了增大其溶解度，提高生物利用度，可以采用将其制成微乳或者微乳凝胶的方法。微乳作为一种新型的给药载体具有粒径小、渗透性强、能够显著增大难溶性药物的溶解度及易于制备等优点；凝胶剂作为一种新型的药物制剂，具有生物相容性好、无刺激、制备工艺简单、局部给药后易于吸收等优点，适用于皮肤局部给药。无论是微乳还是微乳凝胶，作为医药制剂，严格准确测定其中阿普斯特的含量尤为必要。
发明内容
本发明提出了一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，采用本发明可以对阿普斯特制剂中有效成分含量进行测定，该方法准确可靠，能够实现对阿普斯特制剂质量的有效控制。
本发明所述的一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，采用高效液相进行测定，具体的液相条件为高效液相色谱仪：岛津SPD-20A；色谱柱：HypersilBDS反向C18柱（5µm,4.6mm×250mm）；紫外检测波长230nm；柱温：室温；流动相:甲醇:水（pH=3.5磷酸溶液）=54:46；进样量：20ul；流速：0.8ml/min。
其具体步骤为：
（1）阿普斯特标准溶液的制备：精确称量150mg阿普斯特至50ml容量瓶中，加入色谱级甲醇振摇使之完全溶解，然后加甲醇至刻度定容，摇匀后得3mg/ml的阿普斯特母液。用移液管分别量取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml的阿普斯特母液，置于50ml容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，分别得到浓度为6.0、12.0、18.0、24.0、30.0、60.0、120.0、180.0、240.0、300.0µg/ml的标准溶液；
（2）阿普斯特样品溶液的制备：精确称量1.00g的阿普斯特制剂，置于250ml的容量瓶内，加入100ml的甲醇溶液，涡旋振荡5min，超声30min，加甲醇至刻度，摇匀，备用；
（3）高效液相色谱仪分析：对标准品溶液进行液相分析，得到标准曲线方程；然后对样品溶液进行分析，得出阿普斯特制剂中有效成分含量。
所述的阿普斯特制剂为阿普斯特微乳或阿普斯特微乳凝胶。
所述的阿普斯特微乳，所述的阿普斯特微乳，包括阿普斯特和水包油型微乳液，以质量比计，阿普斯特：水包油型微乳液=1:100；以重量百分比计，水包油型微乳液原料组成为：混合乳化剂58.6%，去离子水24.7%，三乙酸甘油酯16.7%。
所述混合乳化剂为吐温-80、C20聚氧乙烯醚和二乙二醇单乙基醚的混合物，以质量比计，吐温-80：C20聚氧乙烯醚：二乙二醇单乙基醚=1:1:4。
综合考虑溶解度，本发明选择三乙酸甘油酯，吐温80，C20聚氧乙烯醚，二乙二醇单乙基醚作为微乳的优选组成成分。
所述的阿普斯特微乳凝胶，以重量百分比计，其原料组成为：阿普斯特1%，三乙酸甘油酯5.57%，乳化剂6.5%，二乙二醇单乙基醚13%，羟苯乙酯0.2%，卡波姆940 1%，三乙醇胺1.35%，去离子水余量；所述乳化剂为吐温-80和C20聚氧乙烯醚的混合物，质量比为1:1。
阿普斯特微乳凝胶中，羟苯乙酯为防腐剂，三乙醇胺为pH调节剂。理想的防腐剂应具有性质稳定、用量小、对人体刺激性小、无不良气味、抗菌谱广等特点。对于阿普斯特微乳凝胶制剂最容易被染菌的应该是水溶性的基质，所以选择在水中分配系数低的防腐剂有利于提高防腐效果。另外，由于卡波姆凝胶对电解质特别敏感，离子会使凝胶的黏度迅速降低，所以制剂中尽量不要引入能解离出离子的电解质，因此选用羟苯乙酯作为防腐剂。
所述卡波姆940为凝胶基质，卡波姆940分子结构中含有大量的羧基，其被碱性物质中和后，羧基产生离子化，由于负电荷间的排斥作用而使分子链伸展具有黏性，从而形成凝胶。形成的凝胶具有良好的黏附性，可以显著延长微乳在皮肤上的滞留时间。
本发明所述的HPLC检测方法的方法专属性强，辅料对阿普斯特的检测无干扰；日内及日间精密度良好，相对标准偏差均小于2%符合方法学要求；回收率均良好；在6.0-300.0µg/ml浓度范围内阿普斯特浓度与峰面积线性关系良好，相关系数R2达到0.9991。采用本发明能够便捷、准确、可靠地测定出阿普斯特的含量，真实反映产品的质量。
附图说明
图1为阿普斯特的标准曲线；
图2为流动相（A），阿普斯特标准品（B），空白制剂（C），含阿普斯特微乳（D）的 HPLC色谱图；
图3为阿普斯特微乳凝胶和阿普斯特凝胶体外经皮渗透曲线（n=3）；
图4为阿普斯特不同制剂的皮肤内药物含量图；
图5为阿普斯特微乳和阿普斯特微乳凝胶在体经皮渗透血浆中药时曲线；
图6为阿普斯特微乳和阿普斯特微乳凝胶在体经皮渗透皮肤中药时曲线；
图7为不同阿普斯特制剂在血浆与皮肤中药物浓度的对比。
具体实施方式
实施例1
一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，采用高效液相进行测定，具体的液相条件为高效液相色谱仪：岛津SPD-20A；色谱柱：HypersilBDS反向C18柱（5µm,4.6mm×250mm）；紫外检测波长230nm；柱温：室温；流动相:甲醇:水（pH=3.5磷酸溶液）=54:46；进样量：20ul；流速：0.8ml/min。
其具体步骤为：
（1）阿普斯特标准溶液的制备：精确称量150mg阿普斯特至50ml容量瓶中，加入色谱级甲醇振摇使之完全溶解，然后加甲醇至刻度定容，摇匀后得3mg/ml的阿普斯特母液。用移液管分别量取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml的阿普斯特母液，置于50ml容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，分别得到浓度为6.0、12.0、18.0、24.0、30.0、60.0、120.0、180.0、240.0、300.0µg/ml的标准溶液；
（2）阿普斯特样品溶液的制备：精确称量1.00g的阿普斯特制剂，置于250ml的容量瓶内，加入100ml的甲醇溶液，涡旋振荡5min，超声30min，加甲醇至刻度，摇匀，备用；
（3）高效液相色谱仪分析：对标准品溶液进行液相分析，得到标准曲线方程；然后对样品溶液进行分析，得出阿普斯特制剂中有效成分含量。标准曲线方程为A=118635C+304535，R2=0.9991，A为峰面积，C为浓度，说明阿普斯特在 6.0-300.0 µg/ml 的范围内浓度与峰面积的线性关系良好。
所述的阿普斯特制剂为阿普斯特微乳或阿普斯特微乳凝胶。
所述的阿普斯特微乳，包括阿普斯特和水包油型微乳液，以质量比计，阿普斯特：水包油型微乳液=1:100；以重量百分比计，水包油型微乳液原料组成为：混合乳化剂50%-80%，水相15%-45%，油相5%-35%，油相、混合乳化剂及水相总和为100%。
所述混合乳化剂为吐温-80、C20聚氧乙烯醚和二乙二醇单乙基醚的混合物，以质量比计，吐温-80：C20聚氧乙烯醚：二乙二醇单乙基醚=1:1:4。
所述的阿普斯特微乳凝胶，以重量百分比计，其原料组成为：阿普斯特1%，三乙酸甘油酯5-6%，乳化剂6-7%，二乙二醇单乙基醚10-15%，羟苯乙酯0.1-0.3%，卡波姆9401-2%，三乙醇胺1-1.5%，去离子水余量；所述乳化剂为吐温-80和C20聚氧乙烯醚的混合物，质量比为1:1。
所述的阿普斯特微乳凝胶，以重量百分比计，其原料组成为：阿普斯特1%，油相5.57%，乳化剂6.5%，助乳化剂13%，防腐剂0.2%，凝胶基质1%，pH调节剂1.35%，去离子水余量。
实施例2
方法专属性
将适量的阿普斯特溶于甲醇中形成对照品溶液、将适量空白制剂用甲醇稀释至适当浓度、取适量含阿普斯特的制剂用甲醇稀释，经过滤后取20ul进行HPLC测定（空白微乳凝胶与含药微乳凝胶先4000rpm离心10min），得到各样品图谱如图2所示。由图谱可知，在该HPLC色谱条件下辅料对阿普斯特的检测无干扰。
精密度考察
配制阿普斯特浓度分别为6.0，120.0，300.0µg/ml的溶液，HPLC法测定阿普斯特的浓度。
日内精密度：于同一天内，在不同时间点且相同时间间隔每个样品分别测量5次，记录峰面积，数据见表1。
日间精密度：每天在相同时间点对样品进行测量，每个样品测量1次，连测5天，记录峰面积，数据见表2。
由数据可知：样品浓度为6.0，120.0，300.0µg/ml时，阿普斯特检测方法的日内精密度和日间精密度的相对标准偏差RSD均小于3%，说明精密度良好，能够满足方法学要求。
表1：阿普斯特日内精密度检测结果（n=5）
表2：阿普斯特日间精密度检测结果（n=5）
回收率考察
配制阿普斯特浓度分别为6.0，120.0，300.0µg/ml的溶液，HPLC测定阿普斯特的浓度平行测定5次，计算阿普斯特的回收率，结果见表3。
表3：阿普斯特回收率检测结果（n=5）
由上表可知：药物浓度为6.0，120.0，300.0µg/ml时，所建立的阿普斯特检测方法回收率介于95%-105%之间，符合方法学的要求。
试验例1 阿普斯特微乳的体外经皮渗透实验
1、大鼠离体皮肤的制备
取体重170-200g健康的SD大鼠， 实验前一天用电动剃毛器和脱毛膏去除大鼠背部的毛，用0.9%氯化钠溶液清洗皮肤并擦干。实验当天乙醚麻醉处死，用手术剪小心剪下皮肤，用手术刀清除皮下组织和血管，冲洗干净。灯光下查看皮肤状况，检查皮肤有无针眼、有无厚薄不均过厚或者过薄，若有损伤不能用于实验，完好的皮肤置于0.9%氯化钠溶液中反复漂洗至溶液无浑浊，用滤纸吸干皮肤上的水分，置于铝箔中包裹，放-20℃冰箱保存，临用前解冻至室温使用。
2、体外经皮渗透实验
本发明采用改良的 Franz 扩散池进行实验，水浴温度控制在 32±1 ℃，搅拌转速 300 rmp。皮肤用不锈钢夹子固定在供给池和接收池之间，皮肤的角质层朝向供给池，向接收池内加入接收液，液面与皮肤紧密接触，中间无气泡（接收液预先超声处理，除去液体内的气泡），接收液为30%乙腈-0.9%氯化钠溶液（W/V）。接收池加入接收液后先在水浴内平衡 1 小时，然后再在供给池内加入微乳液 0.5 ml(含有阿普斯特 5 mg)。加入微乳液后于1、 2、 4、 6、 8、 10、 12、15、 18、 24h 从取样口取样 0.5 ml，同时向接收池内加入等量新鲜的接收液。向所取接收液内加入 2 倍体积的乙腈溶液，涡旋 2 min，沉淀蛋白，经0.22 µm 微孔滤膜过滤后 HPLC 法检测阿普斯特的浓度，以下公式为计算药物累计经皮渗透量（Q）：
其中，Cn 为第n个取样点中的药物浓度；V0 为扩散池的体积（本发明所用扩散池容积为 8.2 ml）；Ci 为为第 i 个取样点的浓度；Vi 为取样体积；A 为扩散面积（3.14cm2）。以阿普斯特的累计经皮渗透量 Q 对时间绘制药物累计渗透曲线（如图5所示）。给药24 h 后， 实施例1-3三种微乳中阿普斯特的累计经皮渗透量分别为8.81µg/cm2、3.58µg/cm2、2.97 µg/cm2。
试验例2 阿普斯特微乳在皮肤中的药物截留
体外经皮渗透试验结束后，用棉签将残留在皮肤上的药物轻轻的擦掉，避免伤到皮肤，用生理盐水清洗皮肤表面， 用滤纸吸干表面的水分，剪下经过体外经皮渗透试验的皮肤， 称重，将剪下的皮肤剪成小块，放入离心管中，加入 9 倍量的0.9%氯化钠溶液，用高速匀浆机将皮肤匀浆成匀浆液。精密量取 100 µl 的匀浆液，加入100 µl 的乙腈沉淀蛋白，涡旋 5 min，12000 rmp 高速离心 10 min，分离上层清液，取 10 µl 进行 HPLC 法检测阿普斯特的浓度。
经皮渗透24 h后，阿普斯特微乳的累计经皮渗透量 Q24 和药物皮肤截留量Qskin实验结果如表1所示,说明阿普斯特微乳既有良好的皮肤渗透能力，又有优良的药物截留能力。
表1
| 处方 | Q<sub>24</sub>（μg/cm<sup>2</sup>） | Q<sub>skin</sub>（μg/cm<sup>2</sup>） |
| 实施例1阿普斯特微乳 | 8.81 | 469.3 |
对本发明获得的阿普斯特微乳进行质量评价，具体如下：
1、载药量测定
用HPLC 法测定阿普斯特浓度微乳处方的载药量为38.98 mg/g±0.192（n=3），表明该处方有优良的载药能力。
2、外观形态
本发明获得的微乳外观为澄清透明状，紫外分光光度计620nm处测定透光率，结果显示透光率为98.22%。
3、离心测试
微乳在4000 rmp离心 10 min，观察微乳的外观，没有发现微乳破裂分层的现象，微乳仍维持澄明状态，说明微乳的稳定性较好。
4、微乳类型的鉴别
向微乳液中分别加入油溶性染料苏丹红和水溶性染料亚甲兰，观察红色和蓝色的扩散速度， 实验发现蓝色的扩散速度快于红色的，说明微乳的类型为O/W 型。
5、pH 值、旋转黏度的测量
参照2020 版《中国药典（四部）》 测定微乳液的 pH 值和旋转黏度。结果显示微乳液的 pH 值为6.9-7.0，在皮肤的 pH 值范围内（ pH 值为 4-7）。采用BROOKFIELD 旋转粘度计，在 25±1℃测定旋转黏度为 20.4 mPa•S（剪切速率为76.8S-1）。
6、粒径及粒度分布
采用马尔文激光粒度仪测量微乳的粒径及粒度分布，平均粒径20.30 nm，多分散指数（PDI）为 0.146，说明粒径分布较窄，呈正态分布。
7、Zeta 电位
微乳的 Zeta 电位为-0. 384 mV，本发明的微乳的乳化剂都是非离子型，助乳化剂为醇类也不产生离子，故微乳整体显电中性。
8、微观形态观察
取微乳1 g，用4 g去离子水稀释，稀释时搅拌要缓慢，防止破坏微乳的结构。用透射电镜专用铜网蘸取适量溶液，自然晾干后再用2%的磷钨酸进行负染，晾干后置于透射电镜内进行观察，微乳呈规则的球形，粒径在20-30nm之间，微乳内部可见包裹物，微乳无粘连现象，说明加水稀释对其影响不大。
试验例3阿普斯特微乳凝胶剂的质量评价
1阿普斯特微乳凝胶剂外观性状
阿普斯特微乳凝胶剂外观呈半透明、有光泽、半固体状，黏附性很好，倒置也不会流动，在皮肤上很容易涂布，有滑腻感，易清洗。
2 pH值的测定
用凝胶专用电极检测阿普斯特微乳凝胶pH值，阿普斯特微乳凝胶剂pH值接近中性，对皮肤基本无刺激。
3含量测定
精确称量1.00g的阿普斯特微乳凝胶（实施例1），置于250ml的容量瓶内，加入100ml的甲醇溶液，涡旋振荡5min，超声30min，加甲醇至刻度，摇匀。采用外标法进行HPLC的检测。实验结果见表2。
表2阿普斯特微乳凝胶剂的含量测定
4初步的稳定性考察
4.1离心稳定性
取5g阿普斯特微乳凝胶，置于10ml离心管中，4000rpm离心30min，观察凝胶的外观变化。样品经离心后没有发生分层，沉淀等现象，外观也没有发生变化。
4.2冻融实验
取5g阿普斯特微乳凝胶，置于10ml离心管中，置于-20℃条件下冷冻2天，然后在40℃条件下放置2天，反复冻融3次，观察凝胶的外观变化。实验后样品没有发生分层，沉淀等现象，外观也没有发生变化。
5流变学实验
为了考察阿普斯特微乳凝胶剂的流变学，采用TA-2000ex流变仪在不同的剪切速率下检测其黏度，微乳凝胶剂随着剪切速率的增大，黏度逐渐变小，属于典型的非牛顿流体中塑性流体的特征。其在静止时能不滴落，且易于涂布。
试验例4阿普斯特微乳凝胶的体外经皮渗透研究
实验动物
SD大鼠，SPF级，雄性，体重170-200g，斯贝福（北京）生物技术有限公司（合格证编号：110324210100892713）。动物房饲养条件：温度25℃±2℃，湿度50%-70%RH。
2.1阿普斯特微乳凝胶剂的制备
按照本发明实施例1配方制备含药的阿普斯特微乳凝胶剂。
2.2普通阿普斯特凝胶剂的制备
称取与微乳凝胶剂相同处方量的阿普斯特，加入适量的乙腈溶解，将此溶液逐滴加入已溶胀好的1.5%的卡波姆940凝胶基质中，搅拌均匀，最后用三乙醇胺调pH值6.5-7.0，真空去除气泡后静置备用。
2.3大鼠离体皮肤的制备
取体重170-200g健康的SD大鼠，实验前一天用电动剃毛器和脱毛膏去除大鼠背部的毛，用0.9%氯化钠溶液清洗皮肤并擦干。实验当天乙醚麻醉处死，用手术剪小心剪下皮肤，用手术刀清除皮下组织和血管，冲洗干净。灯光下查看皮肤状况，检查皮肤有无针眼、有无厚薄不均过厚或者过薄，若有损伤不能用于实验，完好的皮肤置于0.9%氯化钠溶液中反复漂洗至溶液无浑浊，用滤纸吸干皮肤上的水分，置于铝箔中包裹，放-20℃冰箱保存，临用前解冻至室温使用。
2.4体外经皮渗透实验
本发明采用改良的Franz扩散池进行实验，水浴温度控制在32±1℃，搅拌转速300rmp。皮肤用不锈钢夹子固定在供给池和接收池之间，皮肤的角质层朝向供给池，向接收池内加入接收液，液面与皮肤紧密接触，中间无气泡（接收液预先超声处理，除去液体内的气泡），接收液为30%乙腈-0.9%氯化钠溶液（W/V）。接收池加入接收液后先在水浴内平衡1小时，然后再在供给池内加入阿普斯特微乳凝胶剂（ME-Gel）1g、阿普斯特普通凝胶剂1g(含有阿普斯特10mg)。加入制剂后于2、4、6、8、10、12h从取样口取样0.5ml，同时向接收池内加入等量新鲜的接收液。向所取接收液内加入2倍体积的乙腈溶液，涡旋2min，沉淀蛋白，经0.22µm微孔滤膜过滤后HPLC法检测阿普斯特的浓度，以下公式为计算药物累计经皮渗透量（Q）：
其中，Cn为第n个取样点中的药物浓度；V0为扩散池的体积（本发明所用扩散池容积为8.2ml）；Ci为为第i个取样点的浓度；Vi为取样体积；A为扩散面积（3.14cm2）。以阿普斯特的累计经皮渗透量Q（表3）对时间绘制药物累计渗透曲线（如图3所示）。
表3阿普斯特不同制剂的累计经皮渗透量（n=3）
由表3可知，体外经皮渗透12h后，阿普斯特微乳、阿普斯特微乳凝胶剂、阿普斯特凝胶剂累计经皮渗透量分别为4.79µg/cm2、3.12µg/cm2、0.94µg/cm2。由图3可知，微乳和微乳凝胶剂的累计经皮渗透量分别为普通的凝胶剂的5.1倍、3.3倍，表现出良好的经皮渗透能力，微乳的累计经皮渗透量要略高于微乳凝胶剂，说明凝胶对药物的经皮渗透有阻滞作用。
2.5阿普斯特微乳在皮肤中的药物截留
体外经皮渗透试验结束后，用棉签将残留在皮肤上的药物轻轻的擦掉，避免伤到皮肤，用生理盐水清洗皮肤表面，用滤纸吸干表面的水分，剪下经过体外经皮渗透试验的皮肤，称重，将剪下的皮肤剪成小块，放入离心管中，加入9倍量的0.9%氯化钠溶液，用高速匀浆机将皮肤匀浆成匀浆液。精密量取100µl的匀浆液，加入100µl的乙腈沉淀蛋白，涡旋5min，12000rmp高速离心10min，分离上层清液，取10µl进行HPLC法检测阿普斯特的浓度。
实验结果如表4，图4所示。经皮渗透12h后，ME的累计经皮渗透量Q12是最高的，但其皮肤截留量要远低于ME-Gel，ME-Gel的保留渗透比为5.30，ME的保留渗透比为1.63，说明ME-Gel滞留在皮肤内的药量要大于进入血液中的，其在皮肤内形成了药物贮库，说明ME-Gel既有良好的皮肤渗透能力，又有优良的药物截留能力。普通的阿普斯特凝胶制剂不仅经皮渗透作用小，而且皮肤内的滞留药量也不高，说明其进入皮肤内的药量小，将其制成微乳和微乳凝胶制剂大大提高了其经皮渗透及滞留皮肤内的能力。
表4 阿普斯特不同制剂中皮肤内药物含量
试验例5阿普斯特微乳凝胶剂在体经皮渗透研究
5.1血浆样品检测方法的建立
5.1.1血浆样品的处理
全血置于预先用肝素润湿过的离心管中，4000rmp离心10min，分离上层血浆，放置于-20℃冰箱内待测。测试前若血浆冷冻过，血浆需充分解冻，然后重新离心处理；若为新鲜的血浆，精密量取100µl的血浆，加入乙腈100µl沉淀蛋白，涡旋振荡5min，12000rmp高速离心10min，取上层清液10µl进行HPLC检测，测量血浆中阿普斯特的浓度。
5.2在体经皮渗透实验
3.2.1实验设计
5.2.1.1大鼠皮肤的处理
本实验将大鼠随机分成2个大组，一组为微乳组，一组为微乳凝胶组。实验前24h，将大鼠背部的毛用电动剃毛器和脱毛膏清除干净，用0.9%氯化钠溶液清理干净皮肤并擦干，观察皮肤有无破损，皮肤有破损的不能入组，大鼠禁食，正常饮水。
5.2.1.2给药方案
实验时，先称大鼠的体重并记录，将大鼠背部朝上固定在鼠板上，按照20mg/kg的剂量，将阿普斯特微乳和阿普斯特微乳凝胶涂抹在大鼠皮肤表面，涂抹面积2cm×2cm。一组涂抹微乳，另一组涂抹微乳凝胶。
5.2.1.3采样方法
血浆的采样方法：分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12h取血，EP管已用肝素处理过，4000rmp离心10分钟，分离血浆，-20℃冰箱内保存。皮肤的采样方法：大鼠取血后，麻醉处死，用棉签将残留在皮肤上的药物轻轻的擦掉，避免伤到皮肤。用手术剪刀将给药部位的皮肤剪下，去除皮下组织。用滤纸吸干表面的水分，剪下1cm×1cm的皮肤称重，将剪下的皮肤剪成小块，放入离心管中，加入9倍量的0.9%氯化钠溶液，用高速匀浆机将皮肤匀浆成匀浆液。-20℃冰箱内保存。
5.2.1.4样品分析
血浆样品分析：精密量取100µl的血浆，加入乙腈100µl沉淀蛋白，涡旋振荡5min，12000rmp高速离心10min，取上层清液10µl进行HPLC检测，测量血浆中阿普斯特的浓度。皮肤匀浆液样品分析：精密量取100µl的匀浆液，加入100µl的乙腈沉淀蛋白，涡旋5min，12000rmp高速离心10min，分离上层清液，取10µl进行HPLC法检测阿普斯特的浓度。
5.2.2实验结果
5.2.2.1不同阿普斯特制剂血浆中的药时曲线
在体经皮渗透时，不同阿普斯特制剂在血浆中的药物浓度见表5，药时曲线见图5。由表5可见，微乳和微乳凝胶进行在体经皮渗透时，血浆中的最大药物浓度分别为13.90µg/ml，5.09µg/ml，前者是后者的2.7倍；由图5可见，在整个过程实验中，血浆中的药物浓度微乳的一直比微乳凝胶剂的高，且微乳的波动很大，而微乳凝胶的波动较小。
表5 不同阿普斯特制剂在体经皮渗透时血浆中的药物浓度
5.2.2.2不同阿普斯特制剂在皮肤中的药时曲线
在体经皮渗透时，不同阿普斯特制剂在皮肤中的药物浓度见表6，药时曲线见图6。由表6可知，实验过程中，微乳和微乳凝胶在皮肤中的最大药物浓度分别为18.01µg/ml，22.58µg/ml，其达峰时分别为0.5h，2.0h；由图6可见，微乳在实验过程中皮肤内的药物浓度很快达峰，其后皮肤内药物浓度一直下降，最后12h时皮肤内的药物浓度为5.38µg/ml，而微乳凝胶皮肤中的药物浓度是缓慢升高到峰值，然后浓度趋于稳定，最后12h时皮肤内的药物浓度为13.34µg/ml。这一现象和体外的经皮渗透实验结果基本一致，由于凝胶的阻滞作用，药物的达峰时推迟了1.5h。
表6 不同阿普斯特制剂在体经皮渗透时皮肤中的药物浓度
5.2.2.3在体经皮渗透，不同的阿普斯特制剂在皮肤中的截留
通过比较不同的制剂在皮肤和血浆中的药时曲线，如图7（A）微乳在皮肤和血浆中的药时曲线，图7（B）微乳凝胶在皮肤和血浆中的药时曲线，可以清楚的看到经过12h的渗透作用，微乳的截留渗透比（皮肤中药物浓度/血浆中药物浓度）为1.79，而微乳凝胶的截留渗透比为9.84，这一结果与体外经皮渗透时的药物皮肤截留比基本一致。
试验例6 微乳制剂对皮肤表面作用的初步研究
6.1实验方法
6.1.1大鼠皮肤的处理
实验前24h大鼠背部皮肤用电动剃毛器和脱毛膏脱毛，用0.9%氯化钠溶液清理干净皮肤，观察皮肤应该完整无破损。实验时，麻醉处死，用手术剪剪下背部皮肤，将剪下的皮肤分为三部分，将皮肤固定，一部分涂抹微乳凝胶，一部分涂抹微乳，另一部分作为空白对照，用4%的多聚甲醛溶液进行组织固定。皮肤处理12h后，清除皮肤表面残留的药物，并用0.9%氯化钠溶液擦净，用4%的多聚甲醛溶液进行组织固定。
6.1.2组织病理学切片
本实验采用石蜡包埋，HE染色法制备组织病理切片。用空白皮肤作为对照，样本在4%的多聚甲醛溶液中固定24h后，取出冲洗干净，然后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理、石蜡浸蜡包埋、切片机切片、脱蜡HE染色、显微观察照相后进行观察。
6.2显微观察结果及分析
没有处理过的空白鼠皮肤表皮的角质层细胞排列紧密，细胞间间隙很小，真皮靠近表皮处细胞排列紧密；经过微乳和微乳凝胶处理的皮肤，角质层明显变薄，特别是微乳处理过的皮肤角质层比凝胶处理的更薄，角质层细胞间隙变大，而且微乳处理过的皮肤真皮细胞间的间隙明显变大，这也说明了为什么微乳的透皮速率要比凝胶快。微乳和微乳凝胶剂对皮肤的角质层均有破坏作用，可使角质层变薄，使细胞间间隙变大，但皮肤的完整性并没有被破坏，有利于药物的经皮渗透。
Claims (6)
1.一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，其特征在于，采用高效液相进行测定，具体的液相条件为高效液相色谱仪：岛津SPD-20A；色谱柱：HypersilBDS反向C18柱（5µm,4.6mm×250mm）；紫外检测波长230nm；柱温：室温；流动相:甲醇:水（pH=3.5磷酸溶液）=54:46；进样量：20ul；流速：0.8ml/min。
2.根据权利要求1所述的一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，其特征在于，其具体步骤为：
（1）阿普斯特标准溶液的制备：精确称量150mg阿普斯特至50ml容量瓶中，加入色谱级甲醇振摇使之完全溶解，然后加甲醇至刻度定容，摇匀后得3mg/ml的阿普斯特母液；用移液管分别量取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml的阿普斯特母液，置于50ml容量瓶中，加入甲醇至刻度定容，摇匀，分别得到浓度为6.0、12.0、18.0、24.0、30.0、60.0、120.0、180.0、240.0、300.0µg/ml的标准溶液；
（2）阿普斯特样品溶液的制备：精确称量1.00g的阿普斯特制剂，置于250ml的容量瓶内，加入100ml的甲醇溶液，涡旋振荡5min，超声30min，加甲醇至刻度，摇匀，备用；
（3）高效液相色谱仪分析：对标准品溶液进行液相分析，得到标准曲线方程；然后对样品溶液进行分析，得出阿普斯特制剂中有效成分含量。
3.根据权利要求1所述的一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，其特征在于，所述的阿普斯特制剂为阿普斯特微乳或阿普斯特微乳凝胶。
4.根据权利要求1所述的一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，其特征在于，所述的阿普斯特微乳，包括阿普斯特和水包油型微乳液，以质量比计，阿普斯特：水包油型微乳液=1:100；以重量百分比计，水包油型微乳液原料组成为：混合乳化剂58.6%，去离子水24.7%，三乙酸甘油酯16.7%。
5.根据权利要求4所述的一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，其特征在于，所述混合乳化剂为吐温-80、C20聚氧乙烯醚和二乙二醇单乙基醚的混合物，以质量比计，吐温-80：C20聚氧乙烯醚：二乙二醇单乙基醚=1:1:4。
6.根据权利要求1所述的一种含阿普斯特制剂中有效成分含量测定的方法，其特征在于，所述的阿普斯特微乳凝胶，以重量百分比计，其原料组成为：阿普斯特1%，三乙酸甘油酯5.57%，乳化剂6.5%，二乙二醇单乙基醚13%，羟苯乙酯0.2%，卡波姆940 1%，三乙醇胺1.35%，去离子水余量；所述乳化剂为吐温-80和C20聚氧乙烯醚的混合物，质量比为1:1。
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