CN103822997B - 一种利伐沙班中间体的分析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利伐沙班中间体的分析检测方法，用于利伐沙班中间体的质量控制，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（C18，4.6×150mm，5μm），以高氯酸水溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，以检测波长为240～250nm，柱温为30～40℃，流速0.7～1.1ml/min进行高效液相色谱法分析检测。本发明的分析检测方法可以有效的将利伐沙班中间体及其杂质分开，而且该方法具有分离度及灵敏度高，重复性及耐用性好，分析时间短，操作简单，结果稳定可靠的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，尤其是利伐沙班中间体的分析检测方法。
背景技术
利伐沙班，英文名为Rivaroxban，是由拜耳和强生公司联合开发的一种口服Xa因子直接抑制剂，2008年在加拿大首先上市，利伐沙班主要用于预防髋关节或者膝关节置换术后患者深静脉血栓和肺栓塞的形成，也可用于预防非瓣膜性心房纤颤患者脑卒中和非中枢神经系统性栓塞，降低冠状动脉综合症复发的风险等。
4-{4-[(5(s)-5-氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3酮盐酸盐是合成利伐沙班的重要中间体，其化学式为C14H18ClN3O4，结构式如下：
到目前为止，文献中尚未记载该中间体的分析检测方法，但该中间体的分析检测对反应控制和收率提高有着重要的作用，同时也直接影响着终产品利伐沙班的质量，所以建立一种稳定有效的分析检测方法对该中间体进行质量控制是非常必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利伐沙班中间体的高效液相色谱分析检测方法，用于利伐沙班中间体的质量控制。
为解决上述技术问题，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：
一种利伐沙班中间体的分析检测方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（C18，4.6×150mm，5μm），以高氯酸水溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，以检测波长为240～250nm，柱温为30～40℃，流速0.7～1.1ml/min进行高效液相色谱法分析检测。
所述流动相A是用三乙胺调节pH为2.5～3.5的0.4～0.6%高氯酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱设置如下：
所述的流动相A优选为用三乙胺调节pH=3的0.5%高氯酸水溶液，梯度洗脱设置优选为：
进一步的，所述的流动相流速优选为1.0ml/min，检测波长优选为245nm，柱温优选为35℃。
本发明所述的分析检测方法，可通过以下步骤实现：
A、取利伐沙班中间体样品适量，用40%（体积比）甲醇水溶液溶解，配制成每1ml含利伐沙班中间体1.0mg的样品溶液；
B、设置流动相流速为0.7～1.1ml/min，检测波长为240～250nm，柱温为30～40℃；
C、取A的样品溶液5μl注入液相色谱仪，完成利伐沙班中间体的分析检测；
通过各实施例中的数据说明，本发明涉及的分析检测方法，可以有效的将利伐沙班中间体及其杂质分开，而且该方法分离度及灵敏度高，重复性及耐用性好，分析时间短，操作简单，结果稳定可靠，从而可用于利伐沙班中间体的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。
附图说明
图1实施例1的利伐沙班中间体HPLC图谱。
图2实施例2的利伐沙班中间体HPLC图谱。
图3实施例3的利伐沙班中间体HPLC图谱。
图4实施例8的利伐沙班中间体线性与范围工作曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
仪器与条件：Agilent1200液相色谱系统，色谱柱：安捷伦SB-C18（4.6×150mm，5μm），检测波长245nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，流动相A为用三乙胺调节pH=3的0.5%高氯酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱设置如下：
实验步骤：将利伐沙班中间体用40%（体积比）甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含利伐沙班中间体1.0mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。
附图1表明，在该色谱条件下，利伐沙班中间体峰和杂质峰可以完全分离，利伐沙班中间体峰的分离度为2.05，保留时间在6.164min。
实施例2
仪器与条件：Agilent1200液相色谱系统，色谱柱：安捷伦SB-C18（4.6×150mm，5μm），检测波长245nm，柱温35℃，流速1.1ml/min，流动相A为用三乙胺调节pH=3.5的0.6%高氯酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱设置如下：
实验步骤：将利伐沙班中间体用40%（体积比）甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含利伐沙班中间体1.0mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。
附图2表明，在该色谱条件下，利伐沙班中间体峰和杂质峰可以完全分离，利伐沙班中间体峰的分离度为2.35，保留时间在5.929min。
实施例3
仪器与条件：Agilent1200液相色谱系统，色谱柱：安捷伦SB-C18（4.6×150mm，5μm），检测波长245nm，柱温35℃，流速0.7ml/min，流动相A为用三乙胺调节pH=2.5的0.4%高氯酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱设置如下：
实验步骤：将利伐沙班中间体用40%（体积比）甲醇水溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含利伐沙班中间体1.0mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。
附图3表明，在该色谱条件下，利伐沙班中间体峰和杂质峰可以完全分离，利伐沙班中间体峰的分离度为4.29，保留时间在7.319min。
实施例4
系统适应性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，加40%（体积比）甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，分别计算利伐沙班中间体峰峰面积以及保留时间的相对标准偏差，实验结果见表1。
表1利伐沙班中间体系统适用性实验结果
由表1可知，利伐沙班中间体峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，理论板数均高于2500，峰面积的相对标准偏差为0.21%（限度2.0%），保留时间的相对标准偏差为0.06%（限度1.0%）。可见，该色谱条件下，利伐沙班中间体及其杂质可以完全分离，而且相对标准偏差均在中国药典规定的限度内，所得结果稳定可靠。
实施例5
重复性实验
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，加40%（体积比）甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液，作为供试品溶液，同法配制6份供试品溶液。取供试品溶液，连续进样六次，按面积归一化法计算利伐沙班中间体的含量，并计算其相对标准偏差，实验结果见表2。
表2利伐沙班中间体重复性实验结果
由表2可知，各供试品溶液中利伐沙班中间体的含量没有明显差异，相对标准偏差为0.05％，可见本分析检测方法的重复性良好。
实施例6
耐用性实验
仪器与条件：Agilent1200液相色谱系统，色谱柱：安捷伦SB-C18（4.6×150mm，5μm），流动相及梯度设置同实施例1。
实验步骤：取本品适量，精密称定，加40%（体积比）甲醇水溶液溶解并稀释制成每1ml中含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。分别通过改变柱温、流速和检测波长，记录利伐沙班中间体有关物质及含量的变化情况（按面积归一化法计算），实验结果见表3。
表3利伐沙班中间体耐用性实验结果
由表3可知，改变柱温、流速和检测波长后，利伐沙班中间体有关物质及含量的测定结果没有明显差异，可见本发明分析检测方法的耐用性良好。
实施例7
检测限
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：精密称取利伐沙班中间体25.0mg，置于25ml量瓶中，加40%（体积比）甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，作为检测限储备液。采用加溶剂逐步稀释法，以S/N≈3时的浓度作为检测限浓度，此时利伐沙班中间体的浓度为0.1ug/ml，检测限为0.5ng。可见本方法及仪器的灵敏度较高。
实施例8
线性与范围
仪器与条件：同实施例1。
实验步骤：取利伐沙班中间体100.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加40%（体积比）甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，即得线性储备液。精密量取线性储备液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml分别置10ml量瓶中，加40%（体积比）甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，依法测定。以供试品溶液的浓度为横坐标，以利伐沙班中间体峰峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为y=13085.4872x+61.8848，工作曲线见附图4。
由附图4可知，图中趋势线的相关系数r=0.9998，可见在该色谱条件下，利伐沙班中间体在0.2004～1.2024mg/ml的浓度范围内线性关系良好。
Claims (4)
1.一种利伐沙班中间体4-{4-[(5(s)-5-氨基甲基)-2-氧代-1,3-噁唑烷-3-基]苯基}吗啉-3酮盐酸盐的分析检测方法，采用高效液相色谱法进行分析检测，其特征在于包括以下步骤：
A、取利伐沙班中间体样品适量，用40%体积比的甲醇水溶液溶解，配制成每1ml含利伐沙班中间体1.0mg的样品溶液；
B、设置流动相流速为0.7～1.1ml/min，检测波长为245～250nm，柱温为30～35℃；
C、取A的样品溶液5μl注入液相色谱仪，完成利伐沙班中间体的分析检测；
其中，色谱柱：安捷伦SB-C18，4.6×150mm，5μm；
所述流动相A是用三乙胺调节pH为2.5～3.5的0.4～0.6%高氯酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱设置如下：
。
2.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述的流动相A 为用三乙胺调节pH=3 的0.5% 高氯酸水溶液。
3.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱设置如下：
。
4.如权利要求1所述的分析检测方法，其特征在于所述的流动相流速1.0ml/min，检测波长为245nm，柱温为35℃。
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