CN108241032B - 一种奈达铂的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法，该分析方法包括三个具体技术方案，实现了奈达铂中主要杂质之间以及主要杂质与主峰之间的有效分离，解决了奈达铂杂质分离不理想以及部分杂质无法检测的难题，适用于奈达铂原料药及其制剂(如冻干粉针及其他剂型)的有关物质分析。

Description

一种奈达铂的分析方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体来说，本发明涉及奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法。
背景技术
奈达铂(Nedaplatin)属铂类抗肿瘤药物，其化学名称为(Z)－二氨(羟基乙酸-O1,-O2,)铂，结构式如式-I所示：
Figure BDA0001190473190000011
奈达铂于1995年6月首次获准上市，在临床上主要用于头颈部癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，食管癌，卵巢癌等实体瘤的治疗。奈达铂具有抗肿瘤谱广，联合化疗面宽，联合化疗增效，与顺铂无交叉耐药性以及不良反应低等特点。
有关物质的检测是控制药物质量的关键指标，申请人经研究发现奈达铂原料药及其制剂中主要含有5种已知杂质，分别为：
Figure BDA0001190473190000021
目前关于奈达铂及其制剂有关物质检测的方法按色谱柱种类主要可以分为三种：C18色谱柱、C8色谱柱和氨基色谱柱。C18和C8色谱柱方法主要存在奈达铂保留时间较短(4～6min左右)，杂质与奈达铂、杂质与杂质之间分离不理想等问题；氨基色谱柱方法的主要问题是色谱柱键合相容易脱落，色谱柱寿命非常短，奈达铂保留时间虽有延长，但是杂质的分离度仍不理想。除上述问题之外，申请人还发现利用现有分析方法无法检测杂质B、C和E，这给奈达铂的用药安全带来很大风险。本领域亟需奈达铂的新的分析检测方法，使其能够准确有效地分析奈达铂原料药或其制剂中的主要杂质，从而实现更好控制产品质量的目的。
发明内容
为解决现有技术问题，本发明提供了新的奈达铂的分析方法，所述分析方法包括如下所述的技术方案，实现了杂质之间以及杂质与主峰之间的有效分离，适用于奈达铂原料药及其制剂(如冻干粉针及其他剂型)的有关物质分析。
本发明的第一方面提供了一种奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法，所述分析方法采用XBridge Amide色谱柱；以流动相A和流动相B作为洗脱液进行梯度洗脱，所述流动相A为缓冲液或水，所述流动相B为乙腈；所述梯度洗脱的条件包括：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
10 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
30 M<sub>2</sub> 100-M<sub>2</sub>
60 M<sub>3</sub> 100-M<sub>3</sub>
其中5≤M1≤25，30≤M2≤40，45≤M3≤55。
在梯度洗脱的时间点0分钟至60分钟内，杂质A、奈达铂、杂质D依次被洗脱出峰；优选地，在梯度洗脱的时间点0分钟至40分钟内，杂质A、奈达铂、杂质D依次被洗脱出峰；更进一步优选地，在梯度洗脱的时间点0分钟至30分钟内，杂质A、奈达铂、杂质D依次被洗脱出峰。
优选地，所述梯度洗脱的条件包括：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
10 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
30 M<sub>2</sub> 100-M<sub>2</sub>
60 M<sub>3</sub> 100-M<sub>3</sub>
其中15≤M1≤20，30≤M2≤35，45≤M3≤50。
优选地，所述梯度洗脱的条件具体为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
10 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
30 M<sub>2</sub> 100-M<sub>2</sub>
60 M<sub>3</sub> 100-M<sub>3</sub>
60.01 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
80 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
其中15≤M1≤20，30≤M2≤35，45≤M3≤50。
色谱柱的选择对于提高高效液相色谱分析方法的准确性来说是一个关键因素。申请人在研究过程中尝试了不同种类(如，Polar-Imidazole Hilic色谱柱、Thermo HypersilGold Hilic色谱柱、Thermo Acclaim Trinity P1色谱柱、CAPCELL PAK ADME色谱柱、SeQuant ZIC-HILIC色谱柱等)以及相同种类不同厂家的诸多色谱柱(如，Inertsil Amide色谱柱、Thermo Amide Hilic色谱柱、Ultimate Hilic Amide色谱柱、XAmide色谱柱等)，皆未获得理想结果，申请人意外地发现本发明采用XBridge Amide色谱柱以及合适的色谱条件可以实现奈达铂、杂质A和D的有效分离，取得了意想不到的技术效果。具体地，本发明中所采用的XBridge Amide色谱柱为Waters XBridge Amide色谱柱；优选地，所述WatersXBridge Amide色谱柱的规格为内径4.6mm，长度250mm，填料粒径3.5μm或5μm。
本发明的有关物质分析方法采用梯度方式以流动相A和流动相B作为洗脱液进行洗脱，所述流动相A为缓冲液或水，所述流动相B为乙腈。优选地，所述流动相A为缓冲液。
优选地，所述缓冲液为1～5mmol/L的缓冲盐选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、乙酸铵、磷酸氢二铵或磷酸二氢铵的溶液，用氢氧化钠或磷酸调节所述缓冲液pH值至6.5～7.5；更优选地，所述缓冲液为1～4mmol/L的磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钠调节pH值至6.8～7.2；进一步优选地，所述缓冲液为1.5～2.5mmol/L的磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钠调节pH值至7.2。
优选地，在本发明奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法中，还具有如下任选的色谱条件：
色谱柱温度为15～35℃，优选为20～25℃，和/或
流动相流速为0.6～1.5ml/min，更优选为0.8～1.2ml/min，和/或
检测器采用紫外检测器，检测波长为200～230nm，优选为205～215nm。
在本发明的一个具体实施方案中，所述色谱柱温度为20℃；流动相流速为1.0ml/min；检测波长为210nm。
本领域技术人员应知晓的是，除上述紫外检测器外，本发明的分析方法还可以灵活选用常用的其他类型高效液相色谱检测器，如荧光检测器、电化学检测器、示差检测器、蒸发光散射检测器、电导检测器、质谱检测器、电雾式检测器等。
本发明奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法包括供试品溶液的制备、对照溶液的制备、系统适用性试验溶液的制备以及检测四个步骤。
所述供试品溶液的制备包括：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂适量，用稀释液配制成浓度为每1ml含0.5～2mg奈达铂的溶液，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括：取供试品溶液，用稀释液稀释至100倍体积，作为对照溶液；
所述系统适用性试验溶液的制备包括：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂、杂质A对照品、杂质D对照品适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml含奈达铂0.5～2mg、杂质各1～20μg的溶液，作为系统适用性试验溶液；
所述检测步骤包括：取系统适用性试验溶液10～20μl，注入液相色谱仪，奈达铂峰与相邻各杂质峰的分离度应符合要求；取对照溶液10～20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10～20％；精密量取供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中所述稀释液为0～50％甲醇溶液，各杂质的化学结构如下所示：
Figure BDA0001190473190000051
本发明中的甲醇溶液浓度用体积百分比浓度表示。例如，本发明中的“30％甲醇溶液”中甲醇与水的体积比为30：70，可通过将30ml甲醇溶于70ml水配成100ml甲醇溶液来获得。
优选地，本发明奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂适量，用25～30％甲醇溶液配制成浓度为每1ml含0.8～1.1mg奈达铂的溶液，作为供试品溶液；
(2)对照溶液的制备：精密量取上述(1)制备的供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用(1)中所述25～30％甲醇溶液稀释至刻度，作为对照溶液；
(3)系统适用性试验溶液的制备：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂、杂质A对照品、杂质D对照品适量，加(1)中所述25～30％甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml含奈达铂0.8～1.1mg、杂质各8～12μg的溶液，作为系统适用性试验溶液；
(4)检测：取系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，奈达铂峰与相邻各杂质峰的分离度应符合要求；取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10～20％；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
在一个本发明的优选实施方案中，本发明奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂适量，用30％甲醇溶液配制成浓度为每1ml约含1.0mg奈达铂的溶液，作为供试品溶液；
(2)对照溶液的制备：精密量取上述(1)制备的供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用(1)中所述30％甲醇溶液稀释至刻度，作为对照溶液；
(3)系统适用性试验溶液的制备：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂、杂质A对照品、杂质D对照品适量，加(1)中所述30％甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml含奈达铂约1mg、杂质各约10μg的溶液，作为系统适用性试验溶液；
(4)检测：取系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，奈达铂峰与相邻各杂质峰的分离度应符合要求；取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％；精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
“约”在本发明中是指在所述数值的±10％以内。
本发明的第二方面提供了一种奈达铂中杂质的高效液相色谱分析方法，所述杂质为杂质C和杂质E，所述分析方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂，用5～50％甲醇溶液溶解，制成浓度为每1ml含0.5～4mg奈达铂的溶液，作为供试品溶液；
(2)杂质对照溶液的制备：取杂质C和杂质E，用5～50％甲醇溶液溶解，制成浓度为每1ml含杂质C 1～6μg和杂质E 1～6μg的溶液，作为杂质对照溶液，其中杂质C、杂质E的化学结构如下所示：
Figure BDA0001190473190000061
(3)采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和杂质对照溶液进行检测，记录色谱图，其中检测条件为：采用弱阳离子交换色谱柱，柱温设置在20～40℃；流动相为磷酸盐缓冲液或者为磷酸盐缓冲液和乙腈的混合液，所述混合液中乙腈体积百分含量不高于50％；检测波长为200～230nm；流速为0.6～1.5ml/min。
申请人在研究中尝试用多种不同溶剂(如乙腈等)来溶解奈达铂及其制剂、杂质C和杂质E，发现由于奈达铂结构的特殊性，这些溶剂在溶解过程中会导致新的未知杂质产生，均不适合用来溶解奈达铂及其制剂、杂质C和杂质E。申请人意外地发现甲醇作为稀释液，不但能使杂质C和E稳定，也能满足奈达铂及其制剂溶解的需求。优选地，步骤(1)、(2)中所述甲醇溶液浓度为20～30％；更优选地，步骤(1)、(2)中所述甲醇溶液浓度为22～28％。在本发明的一个具体实施方案中，步骤(1)、(2)中所述甲醇溶液浓度为25％。
优选地，步骤(1)中，所述供试品溶液为每1ml含1.8～2.2mg奈达铂的溶液。
优选地，步骤(2)中，所述杂质对照溶液为每1ml含杂质C 3.6～4.4μg和杂质E 3.6～4.4μg的溶液。
优选地，所述弱阳离子交换色谱柱为Acclaim Mixed-Mode WCX-1色谱柱。所述Acclaim Mixed-Mode WCX-1色谱柱具体为Thermo AcclaimTM Mixed-Mode WCX-1色谱柱，该色谱柱采用羧基(COOH)作为主要键合官能团。在本发明的一个具体实施方案中，所述Acclaim Mixed-Mode WCX-1色谱柱的规格为内径4.6mm，长度150mm，填料粒径5μm。
申请人在研究中发现柱温的改变，对色谱结果没有明显影响，主要会对峰形产生影响，因此在本发明杂质C和E的高效液相色谱分析方法中可将柱温设置在本领域通常的温度范围内，例如设置在20～40℃；优选地，柱温设置在27～33℃。
优选地，步骤(3)中，所述混合液中磷酸盐缓冲液与与乙腈的体积比为85:15～95:5；更优选为90:10。
优选地，所述磷酸盐缓冲液为20～90mmol/L的磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵或磷酸二氢铵的溶液，用氢氧化钠或磷酸调节所述缓冲液pH值至3.8～4.2。更优选地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液的浓度为50～70mmol/L，pH值为3.8～4.0；更优选地，磷酸二氢钾溶液的浓度为70mmol/L，pH值为4.0。
优选地，步骤(3)中，检测波长为205～215nm，流速为0.8～1.2ml/min；优选地，检测波长为210nm，流速为0.9～1.1ml/min。
本发明的第三方面进一步提供了一种奈达铂中杂质的高效液相色谱分析方法，所述杂质为乙醇酸，所述分析方法包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂，用水溶解，制成浓度为每1ml含0.5～4mg奈达铂的溶液，作为供试品溶液；
(2)杂质对照溶液的制备：取乙醇酸，用水溶解，制成浓度为每1ml含乙醇酸1～6μg的溶液，作为杂质对照溶液；
(3)采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和杂质对照溶液进行检测，记录色谱图，其中检测条件为：色谱柱采用Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱或Acclaim TrinityP1色谱柱，柱温设置在20～40℃；流动相为磷酸盐缓冲液或者为磷酸盐缓冲液和乙腈的混合液，所述混合液中乙腈体积百分含量不高于50％；检测波长为200～230nm；流速为0.6～1.5ml/min。
优选地，步骤(1)中，所述供试品溶液为每1ml含1.8～2.2mg奈达铂的溶液。
优选地，步骤(2)中，所述杂质对照溶液为每1ml含乙醇酸3.6～4.4μg的溶液。
本发明中所述的Acclaim Trinity P1色谱柱具体为Thermo AcclaimTM TrinityP1色谱柱。在本发明的一个具体实施方案中，所述Thermo AcclaimTM Trinity P1色谱柱的规格为内径3.0mm，长度150mm，填料粒径3μm。
本发明中所述的Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱具体为Thermo AcclaimTMMixed-Mode WAX-1色谱柱。在本发明的一个具体实施方案中，所述Thermo AcclaimTMMixed-Mode WAX-1色谱柱的规格为内径4.6mm，长度150mm，填料粒径5μm。
优选地，步骤(3)中，所述色谱柱为Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱，柱温设置在20～30℃。
优选地，步骤(3)中，所述磷酸盐缓冲液为1～50mmol/L的磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵或磷酸二氢铵的溶液，用氢氧化钠或磷酸调节所述缓冲液pH值至4.5～6.5。更优选地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液的浓度为2～30mmol/L，pH值为5～6.5。
优选地，步骤(3)中，所述流动相为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液的浓度为1～50mmol/L，pH值为4.5～6.5，其中磷酸二氢钾溶液的浓度更优选为2～30mmol/L，pH值为5～6.5。
优选地，步骤(3)中，检测波长为205～210nm，流速为0.8～1.2ml/min；优选地，检测波长为205nm，流速为0.9～1.1ml/min。
与现有技术相比，本发明的分析方法不但使得奈达铂及其主要杂质能够得到更好地保留与分离，可以检测出更多数量的杂质，杂质及主峰理论板数均能满足药典要求，而且方法学验证结果显示本发明方法重复性、灵敏度、耐用性、准确度均良好，为控制奈达铂原料药及其制剂的质量提供了有效准确的检测方法。
附图说明
图1为对照例1条件下的待测溶液色谱图；
图2为对照例2条件下的待测溶液色谱图；
图3为对照例3条件下的待测溶液色谱图；
图4为对照例4条件下的待测溶液色谱图，横坐标为时间(单位为min)；
图5为对照例5条件下的待测溶液色谱图，横坐标为时间(单位为min)；
图6为实施例1条件下的系统适用性试验色谱图；
图7为实施例1条件下的供试品溶液色谱图；
图8为实施例12条件下的对照品溶液色谱图；
图9为实施例12条件下的供试品溶液色谱图；
图10为实施例14条件下的对照品溶液色谱图；
图11为实施例14条件下的供试品溶液色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的描述。应理解的是，以下实施例仅用于进一步说明本发明，而不是对本发明范围的限制。本发明具体实施方式中使用的奈达铂(原料药)及其冻干制剂、杂质A对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、杂质E对照品均来源于江苏奥赛康药业股份有限公司，杂质B对照品来源于南京化学试剂有限公司；所使用的仪器为安捷伦1290高效液相色谱仪，包括G4220B 1290Bin Pump VL泵，G4212B 1260DAD紫外检测器及Thermo Chromeleon 7.2色谱工作站。
对照例1
1、色谱条件
色谱柱：Dikma Spursil ODS(250*4.6mm，5μm)
流动相：甲醇-0.01mol/L枸橼酸溶液(体积比30:70)(用三乙胺调节pH值至6.0)
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂1支，加流动相稀释制成每1ml中约含奈达铂1mg的溶液，作为待测溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部附录0512)并按上述条件进行测定。取待测溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图1。
检测结果显示，空白溶剂峰与主峰部分重叠，主峰对称度不符合规定，并且检测不到杂质。
对照例2
1、色谱条件
色谱柱：Waters Atlantis T3(250*4.6mm，5μm)
流动相：甲醇-0.01mol/L枸橼酸溶液(体积比30:70)(用三乙胺调节pH值至6.0)
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂1支，加流动相稀释制成每1ml中约含奈达铂1mg的溶液，作为待测溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部附录0512)并按上述条件进行测定。取待测溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图2。
由检测结果可以看出，空白溶剂峰与主峰部分重叠，主峰分叉，并且检测不到杂质。该方法不能满足检测要求。
对照例3
1、色谱条件
色谱柱：Dikma Spursil ODS(250*4.6mm，5μm)
流动相：甲醇-水-乙腈-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠12.52g与磷酸氢二钠1.01g加水稀释成250ml)＝25:75:2:7
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂1支，加流动相稀释制成每1ml中约含奈达铂1mg的溶液，作为待测溶液。取杂质A、杂质D，加流动相稀释制成每1ml中约含各杂质100μg的溶液，作为杂质定位溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部附录0512)并按上述条件进行测定。取待测溶液、杂质定位溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，其中待测溶液的色谱图见附图3。
检测结果显示，杂质A、杂质D保留时间均与主峰保留时间重合，该方法不能满足检测要求。
对照例4
1、色谱条件
色谱柱：Shim-pack CLC-ODS(150*4.6mm，5μm)
流动相：甲醇-0.01mol/L枸橼酸溶液(体积比30:70)(用三乙胺调节pH值至6.0)
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂1支，加流动相稀释制成每1ml中约含奈达铂1mg的溶液，作为待测溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部附录0512)并按上述条件进行测定。取待测溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图4。
检测结果显示，空白溶剂峰与主峰严重重叠，并且检测不到杂质。该方法不能满足检测要求。
对照例5
1、色谱条件
色谱柱：ReDual AX-C18(150*4.6mm，5μm)
流动相：甲醇-0.01mol/L枸橼酸溶液(体积比30:70)(用三乙胺调节pH值至6.0)
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂1支，加流动相稀释制成每1ml中约含奈达铂1mg的溶液，作为待测溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部附录0512)并按上述条件进行测定。取待测溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图5。
由检测结果可以看出，空白溶剂峰与主峰严重重叠，并且检测不到杂质。
实施例1有关物质方法
1、色谱条件
色谱柱：Waters XBridge Amide色谱柱(250*4.6mm,3.5μm)
流动相A：2mmol/L磷酸二氢钾溶液(NaOH调节pH至7.2)
B：乙腈
检测波长：210nm
流速：1.0ml/min
柱温：20℃
梯度洗脱条件：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 20 80
10 20 80
30 35 65
60 50 50
60.01 20 80
80 20 80
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂，加30％甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含奈达铂1mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用30％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取奈达铂冻干制剂、杂质A、杂质D对照品适量，加30％甲醇溶液溶解并稀释制成每1ml中含奈达铂约1mg、杂质各约10μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。
照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部附录0512)并按上述条件进行测定。取系统适用性试验溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图6及表1。
表1实施例1条件下的系统适用性试验结果
Figure BDA0001190473190000121
由检测结果可以看出，杂质A、奈达铂、杂质D依次出峰，保留时间分别为10.9min、19.1min、29.4min，杂质之间以及杂质与主峰之间分离度均大于5，可以满足中国药典的要求。与对照例相比，本发明方法的杂质及主峰理论板数更高，可以检测到样品中杂质数量更多，一般在10～30个。
取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％。精密量取供试品溶液、对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中供试品溶液的色谱图如附图7所示。检测结果显示，杂质A与D之间以及杂质与主峰之间均分离较好，可以满足中国药典的要求。
实施例2～11
1、色谱条件
实施例2～11的色谱条件中所采用的色谱柱、检测波长、流速与实施例1相同，其他色谱条件如下所示：
Figure BDA0001190473190000131
其中，梯度洗脱条件①为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 15 85
10 15 85
30 30 70
60 45 55
60.01 15 85
80 15 85
梯度洗脱条件②为：
Figure BDA0001190473190000132
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂，按照上述实施例2～11色谱条件，并根据实施例1所述的实验步骤进行液相色谱分析，供试品溶液检测结果如表2所示：
表2实施例2～11条件下的供试品溶液检测结果
Figure BDA0001190473190000141
实施例2～11的检测结果显示，在上述检测条件下，杂质A与D之间以及杂质与主峰之间均分离较好，可以满足中国药典的要求。
实施例12杂质C、E检查方法
1、色谱条件
色谱柱：Thermo AcclaimTM Mixed-Mode WCX-1色谱柱(150*4.6mm，5μm)
流动相：70mmol/L磷酸二氢钾溶液(pH4.0)：乙腈＝90：10
检测波长：210nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂，加25％甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含奈达铂2mg的溶液，作为供试品溶液。取杂质C、杂质E，精密称定，加25％甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含杂质各约4μg的溶液，作为对照品溶液。
取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中对照品溶液的色谱图如附图8所示，供试品溶液的色谱图如附图9所示。
检测结果显示，杂质E、杂质C的保留时间分别为14.3min、20.8min，主峰峰形好，杂质之间以及杂质与主峰之间分离良好，可以满足中国药典的要求。
实施例13
1、色谱条件
实施例13除改变流动相为50mmol/L磷酸二氢钾(pH3.8)-乙腈＝90:10，其余色谱条件均与实施例12相同。
2、实验步骤
取奈达铂冻干制剂，按照上述色谱条件，并根据实施例12所述的实验步骤进行液相色谱分析。检测结果显示，杂质E、杂质C的保留时间分别为16.3min、23.1min，杂质之间以及杂质与主峰之间分离良好，可以满足中国药典的要求。
实施例14乙醇酸检查方法
1、色谱条件
色谱柱：Thermo AcclaimTM Mixed-Mode WAX-1色谱柱(150*4.6mm，5μm)
流动相：2mmol/L磷酸二氢钾溶液(pH6.5)
检测波长：205nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
2、实验步骤
取奈达铂，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含奈达铂2mg的溶液，作为供试品溶液。取乙醇酸，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中乙醇酸约4μg的溶液，作为对照品溶液。
取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中对照品溶液的色谱图如附图10所示，供试品溶液的色谱图如附图11所示。
检测结果显示，乙醇酸与奈达铂可以实现很好的分离，且基线良好，主峰峰形良好，不干扰杂质测定，可以满足中国药典的要求。
实施例15～25
1、色谱条件
实施例15～25的色谱条件中所采用的流速与实施例14相同，其他色谱条件如下所示：
Figure BDA0001190473190000161
2、实验步骤
取奈达铂，按照上述实施例15～25色谱条件，并根据实施例14所述的实验步骤进行液相色谱分析。检测结果显示，乙醇酸与奈达铂可以实现较好的分离，可以满足中国药典的要求。

Claims (5)

1.一种奈达铂有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，采用XBridge Amide色谱柱；以流动相A和流动相B作为洗脱液进行梯度洗脱，所述流动相A为缓冲液，所述流动相B为乙腈；所述梯度洗脱的条件包括：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％ 0 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub> 10 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub> 30 M<sub>2</sub> 100-M<sub>2</sub> 60 M<sub>3</sub> 100-M<sub>3</sub>
其中5≤M1≤25，30≤M2≤40，45≤M3≤55；
所述缓冲液为1～5mmol/L的缓冲盐溶液，所述缓冲盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、乙酸铵、磷酸氢二铵或磷酸二氢铵，调节所述缓冲液pH值至6.5～7.5；
其中，有关物质选自化学结构如下所示的物质：
Figure FDA0002547886030000011
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述缓冲液为1.5～2.5mmol/L的磷酸二氢钾溶液，调节缓冲液pH值至7.2。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件具体为：
时间/分钟 流动相A/％ 流动相B/％ 0 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub> 10 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub> 30 M<sub>2</sub> 100-M<sub>2</sub> 60 M<sub>3</sub> 100-M<sub>3</sub> 60.01 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub> 80 M<sub>1</sub> 100-M<sub>1</sub>
其中15≤M1≤20，30≤M2≤35，45≤M3≤50。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法有如下任选的色谱条件：
所述色谱柱的柱温为15～35℃，和/或
流动相流速为0.6～1.5ml/min，和/或
检测器采用紫外检测器，检测波长为200～230nm。
5.如权利要求1至4中任一项所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括供试品溶液的制备、对照溶液的制备、系统适用性试验溶液的制备以及检测四个步骤，
所述供试品溶液的制备包括：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂适量，用稀释液配制成浓度为每1ml含0.5～2mg奈达铂的溶液，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括：取供试品溶液，用稀释液稀释至100倍体积，作为对照溶液；
所述系统适用性试验溶液的制备包括：取奈达铂或含奈达铂的相关制剂、杂质A对照品、杂质D对照品适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml含奈达铂0.5～2mg、杂质A1～20μg、杂质D1～20μg的溶液，作为系统适用性试验溶液；
所述检测步骤包括：取系统适用性试验溶液10～20μl，注入液相色谱仪，奈达铂峰与相邻各杂质峰的分离度应符合要求；取对照溶液10～20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10～20％；精密量取供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中所述稀释液为不超过50％的甲醇溶液，杂质A、杂质D的化学结构如下所示：
Figure FDA0002547886030000021
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