CN116087377A - 一种头孢克肟中有关物质的检测方法 - Google Patents

一种头孢克肟中有关物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种头孢克肟中有关物质的检测方法，采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A为质量浓度为20mmol/L～100mmol/L，pH值为3.5～6.0的甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液，流动相B为乙腈和/或甲醇；梯度洗脱的程序为：0～60min，流动相A的体积占比为65％～97％；60～80min，流动相A的体积占比为45％～75％；总时长不少于80min。该方法简单方便，实用，灵敏度好，能够在一个色谱系统中同时检测头孢克肟的小分子杂质及高分子聚合物杂质，缩短检测时间，提高检测效率，节约检测成本，便于头孢克肟原料及其制剂的质量控制。

Description

一种头孢克肟中有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种头孢克肟中有关物质的检测方法。
背景技术
头孢克肟(商品名为Cefixime)为第三代头孢菌素类口服抗生素，其主要适用于治疗敏感菌所致的泌尿、呼吸和胆道等部位的感染，目前上市销售的头孢克肟包括片剂、胶囊、分散片、干混悬剂和颗粒剂等多种剂型。头孢克肟为β-内酰胺类化合物，稳定性差，易降解，杂质种类也相对复杂，USP PF 44提供了头孢克肟7个特定杂质的结构，分别为杂质A、B(7Z)、C、D、E、F、G。头孢克肟主要降解杂质杂质A有两个手性中心(以*标出)，因此有4个异构体。主要降解杂质B的C-7位侧链上的α位乙酸氧基肟基有两个顺反异构体，命名为杂质B(7Z)及杂质B(7E)，各含有一个手性中心(以*标出)，因此杂质B亦含有4个异构体杂质。头孢克肟含有易致敏的聚合物杂质，已知的有聚合物杂质B、聚合物杂质D。USP PF 44版中头孢克肟、头孢克肟干混悬剂、头孢克肟片及头孢克肟胶囊的有关物质检查均将杂质A1～A4、杂质B1～B2、杂质C、D、E、F、G定为特定杂质，并制定了各特定杂质的控制限度。
中国药典2020版、美国药典USP 43版，日本药典JP 18版、EP 10.0等现行药典中，头孢克肟及其制剂的有关物质检查项均以四丁基氢氧化铵(pH6.5)-乙腈(75：25)为流动相进行等度洗脱。采用药典方法进行有关物质检测时，杂质A、杂质B在四丁基氢氧化铵(pH6.5)-乙腈系统中表现为肩峰，杂质A、杂质B的4个异构体杂质难以有效分离，无法准确定量。CN201810509889.4公开了以四丁基氢氧化铵(pH6.5)-乙腈(50：50)为流动相A，四丁基氢氧化铵(pH6.5)-乙腈(85：15)为流动相B进行梯度洗脱，但该专利未对杂质进行杂质定位，且检出6个杂质，杂质个数较少。
USP PF 44中的有关物质分析方法采用流动相A醋酸铵(pH4.2)-甲醇(95：5)、流动相B醋酸铵(pH4.2)-甲醇(50：50)进行梯度洗脱，CN202010344563.8公开的头孢克肟有关物质方法的体系亦为流动相A醋酸铵-甲醇(1000：52.5)及流动相B醋酸铵-甲醇(1：1)，两相梯度洗脱，上述分析方法虽能分离杂质A的4个异构体杂质，但杂质B的2个反式异构体B3、B4表现为肩峰，无法基线分离。
对于头孢克肟聚合物杂质，常用凝胶色谱法，与有关物质分别控制，检验效率较低，且部分小分子杂质易与聚合物共出峰，方法专属性较差、定量准确性较差。CN202110712152.4公开了一种能同时检测头孢克肟有关物质及聚合物D的方法，该方法以流动相A醋酸铵-甲醇(95：5)及流动相B醋酸铵-甲醇(20：80)进行梯度洗脱，该方法流动相体系与USP PF44相似，均为醋酸铵-甲醇，两组流动相均为盐与甲醇的混合溶液，操作较为繁琐，两相混合时，若操作不当，较易出鬼峰，且该方法未对头孢克肟特定杂质G及聚合物杂质B进行控制。
CN202010378071.0公开了一种以甲酸作为流动相A相，乙腈作为B相，以检测头孢克肟聚合物杂质B及聚合物杂质D的方法，该方法结果显示在保留时间0～10分钟时，头孢克肟及小分子杂质均已被洗脱出峰，小分子杂质在该色谱条件下基本无保留，该方法无法分离各小分子杂质，该方法仅能用于检测聚合物杂质，无法对小分子杂质进行准确定量。
因此，需开发一种头孢克肟及制剂的有关物质检测方法，以同时检测头孢克肟的小分子杂质及高分子聚合物杂质B、聚合物杂质D。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种头孢克肟中有关物质的检测方法，该方法能够缩短检测时间，提高检测效率，能够准确测定头孢克肟杂质A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C、D、E、F、G、聚合物杂质B及聚合物杂质D的含量，同时能使主成分头孢克肟峰及相邻杂质峰，各杂质峰之间的分离度均符合要求。
本发明的第一方面，提供了一种头孢克肟中有关物质的检测方法，包括以下步骤：
采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以流动相进行梯度洗脱，检测头孢克肟中有关物质的含量；
所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为质量浓度为20mmol/L～100mmol/L，pH值为3.5～6.0的甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈和/或甲醇；
所述梯度洗脱的程序为：0～60min，流动相A的体积占比为65％～97％；60～80min，流动相A的体积占比为45％～75％；总时长不少于80min。
根据本发明的一些实施例，所述色谱柱可选自YMC-Triart C18或PhenomenexGemini C18。
根据本发明的一些实施例，所述色谱柱的规格为250mm×4.6mm，3μm或250mm×4.6mm，5μm。
根据本发明的一些实施例，所述反相高效液相色谱法的色谱条件还包括以下i-v中的至少一项：
i.检测器：紫外检测器；
ii.柱温：30℃～55℃；
iii.流速：0.5～1.5mL/min；
iv.检测波长：254nm；
v.进样量：5～20μL。
根据本发明的一些实施例，所述甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液的pH值为4.3～6.0。
当甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液的pH值为4.3～6.0时，各已知峰之间的最小分离度≥1.15。
根据本发明的一些优选的实施例，所述甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液的pH值为4.3～4.7。
当甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液的pH值为4.3～4.7时，各已知峰之间的最小分离度≥1.45。
根据本发明的一些更优选的实施例，所述甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液的pH值为4.5～4.7。
当甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液的pH值为4.5～4.7时，各已知峰之间的最小分离度≥1.50。
根据本发明的一些实施例，所述甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液中还包括pH调节剂。
根据本发明的一些实施例，所述pH调节剂为甲酸、氨水、磷酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
根据本发明的一些优选的实施例，所述pH调节剂为甲酸、氨水、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
根据本发明的一些更优选的实施例，所述pH调节剂为甲酸、乙酸、氨水、氢氧化钾中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述甲酸盐水溶液为甲酸铵水溶液。
根据本发明的一些实施例，所述梯度洗脱的程序为：
Figure BDA0003967787030000031
根据本发明的一些优选的实施例，所述梯度洗脱的程序为：
Figure BDA0003967787030000032
Figure BDA0003967787030000041
根据本发明的一些实施例，所述检测方法还包括制备供试品溶液和对照品溶液。
根据本发明的一些实施例，所述供试品溶液和所述对照品溶液的溶剂为所述流动相或磷酸盐缓冲液。
根据本发明的一些实施例，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合溶液。
根据本发明的一些实施例，所述混合溶液中，磷酸二氢钾的质量浓度为1～5g/L，磷酸氢二钠溶液的质量浓度为10～15g/L。
根据本发明的一些优选的实施例，所述混合溶液中，磷酸二氢钾溶液的质量浓度为3.54g/L，磷酸氢二钠溶液的质量浓度为14.52g/L。
根据本发明的一些实施例，所述供试品溶液可采用常用方法进行制备，如，将供试品与所述溶剂混合，即得。
根据本发明的一些实施例，所述供试品溶液的质量浓度为0.1～10mg/mL。
根据本发明的一些实施例，所述对照品溶液可采用常用方法进行制备，如将所述对照品与所述溶剂混合，即得。
根据本发明的一些实施例，所述对照品溶液的质量浓度为1～1000μg/mL。
根据本发明的一些实施例，所述检测方法还包括制备系统适用性溶液。
根据本发明的一些实施例，所述系统适用性溶液的质量浓度为0.1～10mg/mL。
根据本发明的一些实施例，所述系统适用性溶液的制备方法包括以下步骤：
将头孢克肟对照品与水混合，水浴加热后冷却至室温，固液分离，取液相，即得。
根据本发明的一些实施例，所述水浴加热的温度为80℃～100℃。
根据本发明的一些实施例，所述水浴加热的时间为30～60min。
根据本发明的一些实施例，所述检测方法还包括根据检测结果，定性和/或定量分析头孢克肟中有关物质。
根据本发明的一些实施例，所述分析采用的方法选自面积归一化法、自身对照法、内标法或外标法中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述有关物质为：
Figure BDA0003967787030000051
本发明所述的有关物质包含合成工艺过程中引入的杂质、在储存、运输、使用过程中产生的杂质。
根据本发明的一些实施例，所述头孢克肟选自头孢克肟原料药和/或头孢克肟制剂。
根据本发明的一些优选的实施例，所述头孢克肟制剂为头孢克肟片、头孢克肟分散片、头孢克肟混悬剂、头孢克肟胶囊或头孢克肟颗粒中的至少一种。
本发明的第二方面，提供上述的检测方法在头孢克肟的质量控制中的应用。
有益效果：
(1)采用本发明的方法，头孢克肟与相邻杂质、各杂质之间均能分离，分离度符合要求，尤其能使降解杂质A1～A4、降解杂质B1～B4实现基线分离，解决了现有技术存在的问题；
(2)本发明采用甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液-有机溶剂梯度洗脱分离头孢克肟及其杂质，操作简单，基线噪音小，耐用性好，能够准确定性和定量各杂质；该流动相体系挥发性好，因此，该方法可应用于液质联用(LC-MS)以确定未知杂质的分子量，为推断未知杂质的结构提供可靠依据，便于头孢克肟原料及制剂的质量控制；
(3)本发明的方法灵敏度好，各特定杂质的定量限均小于报告限0.05％，因本方法可同时检测高分子聚合物杂质及小分子杂质，可将有关物质和聚合物两个检测项合并到一个检测项，节省了人力物力，节约了产品的检测时间及成本，提高了检测效率。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH4.7)的选择性溶液色谱图；
图2为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH4.3)的选择性溶液色谱图；
图3为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH3.5)的选择性溶液色谱图；
图4为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH5.5)的选择性溶液色谱图；
图5为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH6.0)的选择性溶液色谱图；
图6为流动相A为100mmol/L甲酸铵水溶液(pH4.5)的选择性溶液色谱图；
图7为流动相A为50mmol/L甲酸水溶液(用氢氧化钾水溶液调pH4.7)的选择性溶液色谱图；
图8为流动相A为50mmol/L甲酸水溶液(用氨水溶液调pH4.7)的选择性溶液色谱图；
图9为流动相A为50mmol/L甲酸水溶液(用氢氧化钠溶液调pH4.7)的选择性溶液色谱图；
图10为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(用乙酸调pH4.7)的选择性溶液色谱图；
图11为流动相A为50mmol/L甲酸铵溶液(用磷酸调pH4.7)的选择性溶液色谱图；
图12为流速0.5mL/min，柱温55℃的选择性溶液色谱图；
图13为流速0.8mL/min，柱温45℃的选择性溶液色谱图；
图14为流速1.5mL/min，柱温30℃的选择性溶液色谱图；
图15为头孢克肟原料药供试品溶液(30℃/60％RH-留样6个月)色谱图；
图16为头孢克肟颗粒供试品溶液(40℃/75％RH-留样6个月)色谱图；
图17为头孢克肟颗粒供试品溶液(30℃/60％RH-留样1个月)色谱图；
图18为头孢克肟胶囊供试品溶液(60℃/60％RH-留样1个月)色谱图；
图19为采用不同流动相梯度洗脱程序的选择性溶液色谱图；
图20为采用不同流动相梯度洗脱程序的选择性溶液色谱图；
图21为流动相A为50mmol/L甲酸水溶液(pH2.5)的选择性溶液色谱图；
图22为流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH6.5)的选择性溶液色谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的对照品信息如下所示：
头孢克肟(中国食品药品检定研究院，批号：130503-202007，88.9％)；
杂质A(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-A-EP-20190426-01，92.3％)；
杂质B(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-B-EP-20200427-01，93.5％)；
杂质B(7E)(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-B(7E)-EP-20190221-02，93.7％)；
杂质C(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-C-EP-20180604-06，96.1％)；
杂质D(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-D-EP-20180622-05，98.3％)；
杂质E(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-E-EP-20190420-01，93.4％)；
杂质F(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-F-EP-20190426-01，93.3％)；
杂质G(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PITBKW-TBE-A-20180529-01，86.1％)；
头孢克肟聚合物杂质B(sincopharmachem，批号：20-04-2827，95.5％)；
头孢克肟聚合物杂质D(sincopharmachem，批号：20-04-2829，95.9％)。
以下实施例中的溶剂、供试品溶液、对照品溶液、选择性溶液、系统适用性溶液的制备方式如下：
供试品溶液：取白云山化学制药厂的头孢克肟原料药或白云山制药总厂在产的头孢克肟制剂适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成含头孢克肟1.0mg/mL的溶液，摇匀，过滤，舍弃初滤液2mL后，取续滤液作为供试品溶液。
头孢克肟对照溶液：取头孢克肟对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成含头孢克肟10μg/mL的溶液，过滤，舍弃初滤液2mL后，取续滤液作为对照溶液。
杂质对照品贮备液：取杂质A～G的对照品、聚合物杂质B、D的对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成浓度约为50μg/mL的溶液，摇匀，作为各杂质的对照品贮备液。
选择性溶液：取白云山制药总厂在产头孢克肟颗粒适量，精密称定，量取各杂质的对照品贮备液适量至同一量瓶中，加溶剂溶解并稀释制成含头孢克肟1mg/mL的溶液，摇匀，过滤，舍弃初滤液2mL后，取续滤液作为选择性溶液。
溶剂：取9.08g/L磷酸二氢钾溶液和23.8g/L磷酸氢二钠溶液按体积比39：61混合均匀，即得。
系统适用性溶液：取头孢克肟对照品适量，精密称定，加纯化水溶解并稀释制成约含头孢克肟1mg/mL的溶液，于95℃水浴45min，冷却至室温，过滤，舍弃初滤液2mL后，取续滤液作为系统适用性溶液。取10μL系统适用性溶液注入液相色谱色谱仪，记录色谱图，头孢克肟和杂质D之间的分离度不应小于8.0。
实施例1
使用Thermo高效液相色谱仪，采用YMC-Triart C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μL，流动相A为50mmol/L的甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH为4.7)，流动相B为甲醇，按下表1进行梯度洗脱：
表1梯度洗脱程序(％：体积百分数)
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 93 7
40 85 15
50 85 15
60 70 30
73 70 30
75 50 50
80 50 50
85 93 7
90 93 7
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图1所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均基线分离，头孢克肟与杂质D的分离度为17.3，各已知峰之间的最小分离度为1.51，所得杂质的相对保留时间如表2所示。
实施例2
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：甲酸铵水溶液用甲酸调节pH为4.3。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图2所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均基线分离，头孢克肟与杂质D的分离度为17.1，各已知峰之间的最小分离度为1.45，所得杂质的相对保留时间如表2所示。
实施例3
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：甲酸铵水溶液用甲酸调节pH为3.5。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图3所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为20.0，各已知峰之间的最小分离度为0.91，所得杂质的相对保留时间如表2所示。
实施例4
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：甲酸铵水溶液用甲酸调节pH为5.5。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图4所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为17.1，各已知峰之间的最小分离度为1.37，所得杂质的相对保留时间如表2所示。
实施例5
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：甲酸铵水溶液用甲酸调节pH为6.0。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图5所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为18.7，各已知峰之间的最小分离度为1.16，所得杂质的相对保留时间如表2所示。
表2不同流动相ApH值下的各已知成分的相对保留时间
流动相A的pH值 pH4.7 pH4.3 pH3.5 pH5.5 pH6.0
杂质A1 0.58 0.58 0.66 0.58 0.59
杂质A2 0.64 0.64 0.72 0.65 0.65
杂质E 0.68 0.68 0.81 0.68 0.68
杂质A3 0.86 0.86 0.82 0.85 0.88
杂质A4 0.90 0.90 0.85 0.89 0.93
头孢克肟 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
杂质C 1.27 1.27 1.20 1.27 1.25
杂质D 1.61 1.61 1.47 1.60 1.67
杂质B1 2.01 2.01 1.24 1.95 2.27
杂质B2 2.09 2.10 1.29 2.03 2.35
杂质B3 2.16 2.16 1.50 2.09 2.53
杂质B4 2.21 2.21 1.51 2.14 2.58
日落黄(头孢克肟颗粒辅料) 2.79 2.73 1.73 2.75 2.93
聚合物杂质B 2.93 2.88 2.02 2.51 3.08
杂质F 3.00 2.93 1.90 2.95 3.23
聚合物杂质D 3.14 3.11 2.09 2.89 3.29
杂质G 3.54 3.23 2.18 3.12 3.44
实施例6
使用Thermo高效液相色谱仪，采用Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm，3μm)色谱柱，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μL，流动相A为100mmol/L的甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH为4.5)，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序参照实施例1。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图6所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均基线分离，头孢克肟与杂质D的分离度为17.8，各已知峰之间的最小分离度为1.52，各杂质的相对保留时间与表2中“pH4.7”项下的结果一致。
实施例7
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸水溶液，用氢氧化钾水溶液调节pH为4.7。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图7所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为16.9，各已知峰之间的最小分离度为1.51，所得杂质的相对保留时间如表3所示。
实施例8
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸水溶液，用氨水溶液调节pH为4.7。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图8所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为17.8，各已知峰之间的最小分离度为1.53，所得杂质的相对保留时间如表3所示。
实施例9
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸水溶液，用氢氧化钠水溶液调节pH为4.7。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图9所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为16.8，各已知峰之间的最小分离度为1.46，所得杂质的相对保留时间如表3所示。
实施例10
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液，用乙酸溶液调节pH为4.7。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图10所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为17.8，各已知峰之间的最小分离度为1.52，所得杂质的相对保留时间如表3所示。
实施例11
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液，用磷酸溶液调节pH为4.7。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图11所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间的分离度均分离，头孢克肟与杂质D的分离度为16.7，各已知峰之间的最小分离度为1.25，所得杂质的相对保留时间如表3所示。
表3不同流动相A下的各已知成分的相对保留时间
实施例 7 8 9 10 11
杂质A1 0.59 0.59 0.59 0.58 0.59
杂质A2 0.65 0.65 0.65 0.64 0.65
杂质E 0.69 0.68 0.68 0.68 0.68
杂质A3 0.85 0.85 0.86 0.85 0.86
杂质A4 0.90 0.90 0.90 0.89 0.90
头孢克肟 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
杂质C 1.27 1.26 1.27 1.26 1.27
杂质D 1.60 1.58 1.58 1.58 1.58
杂质B1 1.96 1.98 1.93 1.95 1.96
杂质B2 2.04 2.06 2.01 2.03 2.04
杂质B3 2.09 2.11 2.06 2.09 2.07
杂质B4 2.13 2.15 2.11 2.14 2.12
日落黄(头孢克肟颗粒辅料) 2.81 2.90 2.62 2.77 2.78
聚合物杂质B 2.96 3.06 2.68 2.92 2.93
杂质F 3.03 3.13 2.89 2.98 3.00
聚合物杂质D 3.19 3.25 3.05 3.11 3.15
杂质G 3.37 3.33 3.32 3.41 3.48
实施例7～实施例11使用不同流动相A相，所得各杂质的相对保留时间与表2中“pH4.3、pH4.7”项下的结果基本一致。
实施例12
使用Thermo高效液相色谱仪，采用YMC-Triart C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为254nm，进样量为10μL，流动相A为20mmol/L的甲酸铵水溶液(用甲酸调节pH为4.5)，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序参照实施例1。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，在不同柱温和流速条件下，所得选择性溶液图谱如图12～14所示。其中，流速0.5mL/min，柱温55℃时，图谱见图12；流速0.8mL/min，柱温45℃时，图谱见图13；流速1.5mL/min，柱温30℃时，图谱见图14。由图中可以看出，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均分离。不同柱温、流速条件下对应的头孢克肟与杂质D的分离度为如表4所示。
表4不同柱温、流速对应的检测结果
Figure BDA0003967787030000121
实施例13
使用Thermo高效液相色谱仪，采用YMC-Triart C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μL，流动相A为50mmol/L的甲酸铵溶液(用甲酸调节pH为4.7)，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序参照实施例1。
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液、对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，所得供试品检测结果如下表5，头孢克肟原料药、头孢克肟颗粒、头孢克肟胶囊典型色谱图如图15～图18所示。
结果显示，聚合物杂质B、聚合物杂质D不稳定，在制剂生产过程中或留样过程中发生降解，杂质A1、杂质B1～杂质B4在留样过程中发生增长，杂质F、G均未检出，本方法可准确定量各杂质。
表5供试品检验结果
Figure BDA0003967787030000122
Figure BDA0003967787030000131
实施例14
使用Thermo高效液相色谱仪，采用Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μL，流动相A为50mmol/L的甲酸铵溶液(用甲酸调节pH为4.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序如下表6所示。
表6梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 88 12
40 80 20
50 80 20
60 65 35
73 65 35
75 60 40
80 60 40
85 88 12
90 88 12
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图19所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均分离。头孢克肟与杂质D的分离度为13.2，符合要求。流动相比例变化，各成分分离度仍符合要求，本专利方法的耐用性较好。
实施例15
使用Thermo高效液相色谱仪，采用Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样量为10μL，流动相A为50mmol/L的甲酸铵溶液(用甲酸调节pH为5.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序如下表7所示。
表7梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 97 3
40 88 12
50 88 12
60 75 25
73 75 25
75 45 55
80 45 55
85 97 3
90 97 3
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图20所示，头孢克肟与相邻杂质峰、各杂质峰之间均分离。头孢克肟与杂质D的分离度为14.8，符合要求。流动相比例变化，各成分分离度仍符合要求，本专利方法的耐用性较好。
实施例16
参照实施例1的操作步骤和色谱条件对本专利的方法进行了定量限及检测限的验证，结果如下表8所示。各杂质的定量限均小于报告限0.05％，检测灵敏度较好。
表8各特定杂质的定量限及检测限
Figure BDA0003967787030000141
Figure BDA0003967787030000151
对比例1
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸水溶液(pH2.5)。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图21所示，头孢克肟与相邻杂质峰无法分离，分离度＜1.0，且只检出11个特定杂质，部分特定杂质无法检出。
对比例2
参照实施例1的操作步骤和色谱条件，区别在于：流动相A为50mmol/L甲酸铵水溶液(pH6.5)。
精密量取选择性溶液10μL，注入高效液相色谱仪，所得选择性溶液图谱如图22所示，杂质B2与杂质B3无法分离，分离度为0.6。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种头孢克肟中有关物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填料，以流动相进行梯度洗脱；
所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为质量浓度为20mmol/L～100mmol/L，pH值为3.5～6.0的甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈和/或甲醇；
所述梯度洗脱的程序为：0～60min，流动相A的体积占比为65％～97％；60～80min，流动相A的体积占比为45％～75％；总时长不少于80min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱法的色谱条件还包括以下i-v中的至少一项：
i.检测器：紫外检测器；
ii.柱温：30℃～55℃；
iii.流速：0.5～1.5mL/min；
iv.检测波长：254nm；
v.进样量：5～20μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲酸盐水溶液和/或甲酸水溶液中还包括pH调节剂；
优选地，所述pH调节剂为甲酸、氨水、乙酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲酸盐水溶液为甲酸铵水溶液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
Figure FDA0003967787020000011
优选地，所述梯度洗脱的程序为：
Figure FDA0003967787020000012
Figure FDA0003967787020000021
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括制备供试品溶液和对照品溶液，所述供试品溶液和对照品溶液的溶剂为所述流动相或磷酸盐缓冲液；
优选的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合溶液；
更优选的，所述混合溶液中，磷酸二氢钾的质量浓度为1～5g/L，磷酸氢二钠溶液的质量浓度为10～15g/L。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括根据检测结果，定性和/或定量分析头孢克肟中的有关物质。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有关物质为：
Figure FDA0003967787020000022
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述头孢克肟选自头孢克肟原料药和/或头孢克肟制剂。
10.如权利要求1～9中任一项所述的检测方法在头孢克肟的质量控制中的应用。
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