CN104792920B - 一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法 - Google Patents
一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法,其包括如下步骤:a)将供试品溶液点样于反相薄层板上,挥去样品溶剂后使用适宜的展开剂与薄层板一起预饱和20分钟,再展开;b)取出挥干溶剂,喷显色剂溶液,然后加热显色;c)置于白光下进行检视:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。本发明方法不需要复杂的试剂、仪器或设备,可快速鉴别禽畜类胆粉中的胆汁酸类成分,不仅鉴别结果形象直观、易于辨识,而且灵敏度和专属性高于常规正相薄层色谱鉴别方法,为胆汁酸类成分定性鉴别提供了一种便捷实用的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽畜胆粉中胆汁酸类成分的鉴别方法,具体说,涉及一种采用反相薄层色谱技术鉴别禽畜胆粉中胆汁酸类成分的方法。
背景技术
禽畜类胆粉中的化学成分有胆汁酸类、胆固醇类、氨基酸类和胆红素等,其中胆汁酸类成分被认为是主要成分,约占20%~80%。熊胆是四大名贵动物药之一,在中医临床中广泛应用。作为熊胆的原动物,亚洲黑熊已被列入濒危物种之一。近年来国内外动物保护组织对活熊取胆的长期抵制给国内熊胆粉的生产和发展带来巨大的压力,而且我国每年熊胆粉的产量远远满足不了人类健康的需求,因此市场流通中常常出现用其他禽畜胆粉(鸡胆、鸭胆、猪胆)替代熊胆粉或混入其中,极大地限制了熊胆粉制剂的药效发挥。鉴于此,构建一种简单快速的区别熊胆粉和其他动物胆粉的方法显得极为重要。
熊胆粉中胆汁酸主要为胆酸(CA),鹅去氧胆酸(CDCA),熊去氧胆酸(UDCA),去氧胆酸(DCA),牛磺熊去氧胆酸(TUDCA),牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)等,其中牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸是熊胆的特有成分,优品可达70%以上。鸡胆和鸭胆中主要含牛磺鹅去氧胆酸,而猪胆粉主要含甘氨结合型鹅去氧胆酸(GCDCA)。因此,可以利用上述各种动物胆粉中所含的特征性胆汁酸作为指标性成分构建熊胆粉和其他禽畜胆粉的鉴定方法。
目前测定动物胆粉中胆汁酸的方法有很多,主要包括试剂盒法、紫外分光光度法、近红外漫反射光谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法等,其中试剂盒法、紫外分光光度法和近红外漫反射光谱法专属性不强,只能测定总胆汁酸浓度或是其中的1~2个胆汁酸浓度,而且其灵敏度极低,很难鉴别动物胆粉的差异。高效液相色谱法是较为常用的方法,专属性强,灵敏度也较高,但是相对应的仪器设备成本也较高。
薄层色谱法是一种快速、简便、高效、经济和应用广泛的色谱分析方法,在以往的胆汁酸定性鉴别中也较为常用,根据薄层板固定相硅胶的不同又可分为正相色谱分离和反相色谱分离。熊胆粉中胆汁酸的正相色谱分离常采用硅胶G为载体,展开剂为氯仿、甲苯、水等,可以分离某些结合型胆汁酸,但是差向异构体如TUDCA和TCDCA却无法区分,所以采用正相薄层色谱技术分离胆汁酸还存在一定的缺陷。而反相薄层色谱技术适合极性成分和组分复杂的混合体系分离,采用反相高效薄层板为载体,第一次展开用己烷-乙酸乙酯-醋酸(72:27:1,v/v/v),转90°角用醋酸-甲醇-水(60:20:20,v/v/v)再展开,8种游离型胆汁酸可在结合型胆汁酸存在下完全分离。牛磺酸结合型胆汁酸用展开剂己烷-乙酸乙酯-醋酸(63:27:10,v/v/v)和醋酸-甲醇-水(40:30:30,v/v/v)。甘氨酸结合型胆汁酸用己烷-乙酸乙酯-醋酸(72:18:10,v/v/v)和醋酸-甲醇-水(40:30:30,v/v/v)两种展开剂双向分离。(倪坤仪.自由型胆汁酸和结合型胆汁酸的反相高效薄层色谱.南药译丛,1986,03:23-25.)该方法尽管能分离18种胆汁酸,但是展开过程复杂,需要采用不同的展开剂进行双向分离,应用到动物胆粉的复杂体系极易受到其他化合物的干扰,不能很好的鉴别熊胆粉与其他禽畜胆粉的差异。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷,本发明的目的是提供一种采用反相薄层色谱方法,该方法能快速鉴别熊胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉和猪胆粉中胆汁酸类成分异同,以便更好的评价熊胆粉的质量,避免其他动物胆粉替代或掺伪。
本发明采用新的反相薄层色谱技术鉴别禽畜胆粉中胆汁酸类成分的方法,打破了以水和甲醇混合溶液为展开剂的传统方法,而是充分考虑胆汁酸化学结构的特殊性,在以水和甲醇的混合溶液中加入合适量的缓冲盐和甲(冰醋)酸,更适合禽畜类胆粉中一些特征性指标成分的分离,进而能快速,简便的鉴别熊胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉和猪胆粉的化学差异。
本发明采用的技术方案如下:
一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法,包括如下步骤:
a)将供试品溶液点样于薄层板上,挥去样品溶剂后使用展开剂与薄层板一起预饱和5~25分钟,再展开;
b)将经步骤a)处理后的薄层板取出挥干溶剂,喷显色剂溶液,然后加热显色;
c)将步骤b)显色后的薄层板置于白光下进行检视,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;其中:步骤a)中所述的展开剂选用醋酸铵水溶液、甲酸和甲醇形成的混合溶液;或者醋酸铵水溶液、冰醋酸和甲醇形成的混合溶液;或者磷酸二氢钠水溶液和甲醇形成的混合溶液。
作为优选方案,所述的薄层板选用反相薄层板。
步骤a)所述的展开剂中,醋酸铵水溶液、甲酸和甲醇形成的混合溶液是通过先在3~7mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.05%~2%加入甲酸,再按照体积比0.5:9.5~5:5(2:8,v/v)加入甲醇配制获得;进一步优选的,其通过先在5mMol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.1%加入甲酸,再按照体积比1:4,加入甲醇配制获得。
步骤a)所述的展开剂中,醋酸铵水溶液、冰醋酸和甲醇形成的混合溶液是通过先在3~7mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比0.05%~2%加入冰醋酸,再按照体积比0.5:9.5~5:5加入甲醇进行配制获得;进一步优选的,通过先在5mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.1%加入冰醋酸,再按照体积比为1:4加入甲醇进行配制获得。
步骤a)所述的展开剂中,磷酸二氢钠水溶液和甲醇形成的混合溶液由0.5~7mmol/L磷酸二氢钠水溶液和甲醇以体积比0.5:9.5~5:5配制而成。进一步优选的,其由1mmol/L磷酸二氢钠水溶液和甲醇以体积比1:4配制而成。
作为优选方案,所述的显色剂溶液选用质量-体积浓度为1~30%的磷钼酸乙醇溶液。本发明中,步骤b)的加热显色温度设置为105℃,加热时间为2~20分钟。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1)本发明不需要高昂的仪器设备,成本较低,操作简便,材料和试剂易于得到,适用性广,而且专属性和灵敏度均较高。
2)鉴别结果可视性强,易于辨识。
3)本发明以定性鉴别为主,不受供试品溶液浓度的影响。
4)能够快速鉴别熊胆粉和鸡胆粉、鸭胆粉、猪胆粉的胆汁酸差异,防止以其他动物胆粉替代熊胆粉或掺伪。
附图说明
图1为游离型、甘氨酸和牛磺酸结合型胆汁酸的薄层色谱图;A,B:正相薄层色谱;1:GCDCA,2:GUDCA,3:UDCA,4:CDCA,5:TCA,6:TCDCA,7:TUDCA,17:鸡胆粉,18:鸭胆粉,19:猪胆粉,20:鸡胆汁,21:鸭胆汁,22:猪胆汁,23:熊胆粉。
图2为不同展开剂的反相薄层色谱检视结果;A:5mM醋酸铵含0.1%冰醋酸-甲醇(2:8,v/v);B:1mM磷酸二氢钠-甲醇(2:8,v/v);C:5mM醋酸铵含0.1%甲酸-甲醇(2:8,v/v);STD:混合标准品,17:鸡胆粉,18:鸭胆粉,19:猪胆粉,23:熊胆粉。
图3为不同的显色方法检视的结果;A:10%磷钼酸乙醇溶液(w/v)显色;B:10%磷钼酸乙醇溶液(w/v)显色后氨水熏蒸;STD:混合标准品,23:熊胆粉。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述:
图1为游离型、甘氨酸和牛磺酸结合型胆汁酸的薄层色谱图;A,B:正相薄层色谱;C:反相薄层色谱;STD:混合标准品,1:GCDCA,2:GUDCA,3:UDCA,4:CDCA,5:TCA,6:TCDCA,7:TUDCA,17:鸡胆粉,18:鸭胆粉,19:猪胆粉,20:鸡胆汁,21:鸭胆汁,22:猪胆汁,23:熊胆粉。
实施例1
标准品溶液制备:取鹅去氧胆酸,熊去氧胆酸,牛磺鹅去氧胆酸,牛磺熊去氧胆酸,牛磺胆酸,甘氨鹅去氧胆酸,甘氨熊去氧胆酸标准品各1mg,精密称定,分别加1ml甲醇溶解,制成1mg/ml的单标溶液。
供试品溶液制备:取熊胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉、猪胆粉各0.1g,分别置10ml量瓶中,加甲醇适量,超声处理5min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。
取鸡胆汁、鸭胆汁、猪胆汁适量,加三倍量甲醇稀释,摇匀,离心。再取上清液适量,加十倍量甲醇稀释,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。
薄层色谱鉴别:吸取甘氨鹅去氧胆酸,甘氨熊去氧胆酸,熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸标准品溶液各4μl,供试品溶液各8μl,分别点于同一硅胶G薄层板上(HPTLCHSGF200×100,烟台江友硅胶开发有限公司),以正己烷-乙酸乙酯-醋酸-甲醇(20:25:2:4,v/v/v/v)为展开剂,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液(w/v),105℃加热至斑点显色清晰,至白光下检视。供试品色谱中,在与标准品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,结果见图1(A)。
吸取牛磺酸结合型标准品溶液各2μl,供试品溶液各3μl,分别点于同一硅胶G薄层板上(HPTLCHSGF200×100,烟台江友硅胶开发有限公司),以正丁醇-冰醋酸-水(18:6:3,v/v/v)为展开剂,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液(w/v),105℃加热至斑点显色清晰,至白光下检视。供试品色谱中,在与标准品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,结果见图1(B)。
以上正相方法结果显示7个胆汁酸以及禽畜胆粉的比较不可能在一个条件中完成。
实施例2
标准品溶液制备:取鹅去氧胆酸,熊去氧胆酸,牛磺鹅去氧胆酸,牛磺熊去氧胆酸,牛磺胆酸,甘氨鹅去氧胆酸,甘氨熊去氧胆酸标准品各1mg,精密称定,分别加1ml甲醇溶解,制成1mg/ml的单标溶液。取各单标溶液适量,混匀,制成0.1mg/ml的混标溶液。
供试品溶液制备:取熊胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉、猪胆粉各0.1g,分别置10ml量瓶中,加甲醇适量,超声处理5min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。
薄层色谱鉴别:吸取混标溶液4μl、熊胆1μl、鸡胆0.5μl、鸭胆0.5μl、猪胆1μl,分别点于同一反相薄层板(MERCK铝板,TLCSilicagel60RP-18F254S,20cm×20cm)上,分别以5mM醋酸铵含0.1%冰醋酸溶液-甲醇溶液(2:8,v/v),1mM磷酸二氢钠水溶液-甲醇(2:8,v/v)和5mM醋酸铵含0.1%甲酸溶液-甲醇溶液(2:8,v/v)为展开剂,预饱和20min,上行展开约9cm,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液(w/v),105℃加热至斑点显色清晰,至白光下检视,结果如图2所示。供试品色谱中,在与标准品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
实施例3
标准品溶液制备:取鹅去氧胆酸,熊去氧胆酸,牛磺鹅去氧胆酸,牛磺熊去氧胆酸,牛磺胆酸,甘氨鹅去氧胆酸,甘氨熊去氧胆酸标准品各1mg,精密称定,分别加1ml甲醇溶解,制成1mg/ml的单标溶液。取各单标溶液适量,混匀,制成0.1mg/ml的混标溶液。
供试品溶液制备:取熊胆粉、鸡胆粉、鸭胆粉、猪胆粉各0.1g,分别置10ml量瓶中,加甲醇适量,超声处理5min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液作为供试品溶液。
薄层色谱鉴别:吸取混标溶液4μl、熊胆1μl、鸡胆0.5μl、鸭胆0.5μl、猪胆1μl,分别点于同一反相薄层板(MERCK铝板,TLCSilicagel60RP-18F254S,20cm×20cm)上,以5mM醋酸铵含0.1%甲酸溶液-甲醇溶液(2:8,v/v)为展开剂,预饱和20min,上行展开约9cm,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液(w/v)或10%磷钼酸乙醇溶液(w/v)显色后再用氨水熏蒸。至白光下检视,10%磷钼酸乙醇溶液显色后斑点清晰,而用氨水熏蒸后,斑点颜色变淡,清晰度降低,结果如图3所示。故本方法中选择磷钼酸乙醇溶液作为显色剂。
Claims (6)
1.一种禽畜类胆粉中胆汁酸类成分的反相薄层色谱鉴别方法,其特征在于,包括如下步骤:
a)将供试品溶液点样于反相薄层板上,挥去样品溶剂后使用展开剂与薄层板一起预饱和5~25分钟,再展开;
b)将经步骤a)处理后的反相薄层板取出挥干溶剂,喷显色剂溶液,然后加热显色;
c)对步骤b)显色后的反相薄层板进行检视:置于白光下进行检视:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;其中:
步骤a)中,所述的展开剂选用醋酸铵水溶液、甲酸和甲醇形成的混合溶液;或者醋酸铵水溶液、冰醋酸和甲醇形成的混合溶液;或者磷酸二氢钠水溶液和甲醇形成的混合溶液;
展开剂选用醋酸铵水溶液、甲酸和甲醇形成的混合溶液时,该混合溶液通过先在3~7mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.05%~2%加入甲酸,再按照体积比0.5:9.5~5:5加入甲醇进行配制获得;
展开剂选用醋酸铵水溶液、冰醋酸和甲醇形成的混合溶液时,该混合溶液通过先在3~7mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.05%~2%加入冰醋酸,再按照体积比0.5:9.5~5:5加入甲醇进行配制获得;
展开剂选用磷酸二氢钠水溶液和甲醇形成的混合溶液时,该混合溶液由0.5~7mmol/L磷酸二氢钠水溶液和甲醇以体积比0.5:9.5~5:5配制而成。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述醋酸铵水溶液、甲酸和甲醇形成的混合溶液通过先在5mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.1%加入甲酸,再按照体积比1:4加入甲醇进行配制获得。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述醋酸铵水溶液、冰醋酸和甲醇形成的混合溶液通过先在5mmol/L醋酸铵水溶液中按照体积比为0.1%加入冰醋酸,再按照体积比1:4加入甲醇进行配制获得。
4.如权利要求1或3所述的方法,其特征在于:所述磷酸二氢钠水溶液和甲醇形成的混合溶液由1mmol/L磷酸二氢钠水溶液和甲醇以体积比1:4配制而成。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤b)的显色剂溶液选用质量-体积浓度为1~30%的磷钼酸乙醇溶液。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤b)的加热显色温度设置为105℃,加热时间为2~20分钟。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |