CN103760366A - 一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法 - Google Patents

一种1，5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及1,5-脱水山梨醇检测领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于，包括：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂；所述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体由1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到。本发明的有益之处在于：1,5-脱水山梨醇免疫原的免疫原性高，制备出的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体特异性强、效价高；含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的1,5-脱水山梨醇含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现1,5-脱水山梨醇的高通量快速化测定，准确度高，特异性强。

Description

一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法
技术领域
本发明涉及1,5-脱水山梨醇检测领域，具体涉及一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备和检测方法。
背景技术
1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydro glucitol，1,5-AG)，结构式如式（III）所示：
Figure BDA0000464987840000011
1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydro glucitol，1,5-AG)又称为1,5-脱水葡萄糖醇，是一种具有吡喃环结构的六碳单糖。1,5-AG的结构与葡萄糖十分相似，两者区别仅在于葡萄糖C-1位置上的羟基被氢所取代。1,5-AG主要存在于人体血液、脑脊液及各组织器官中，血清中1,5-AG浓度一般为12-40mg/L，其代谢较稳定。当患有糖尿病时血清1,5-AG浓度会显著降低，其机理是：糖尿病患者大量葡萄糖由尿中排出竞争性的抑制了1,5-AG经肾小管的重吸收，使1,5-AG大量经尿排出，导致血液中1,5-AG浓度下降，且下降程度与糖尿病的严重程度显著相关。研究表明：血液中1,5-AG与葡萄糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbAlc)、果糖胺(FMN)都呈显著的负相关，其水平可反映近一周内的血糖和尿糖情况，是糖尿病诊断与治疗的灵敏指标，日本于上世纪九十年代初就把1,5-AG作为糖尿病诊断和疗效检测的重要指标。此外，1,5-AG还有其它多种临床应用价值，例如，1,5-AG能反映餐后高血糖峰值，可作为非糖尿病人群监测餐后高血糖相关的心血管危险发生率的指标；血浆或尿中的1,5-AG浓度还能很好的反映慢性肾功能衰竭病人的肾小管重吸收功能，因为1,5-AG重吸收系统比葡萄糖重吸收系统更容易受损。
检测1,5-脱水山梨醇的方法有很多，如高效液相色谱法、微柱层析法、化学发光法等，各有其优缺点。其中高效液相色谱法操作比较复杂，且试剂需现用现配，不能长期保存，因此不适合大批量临床检测使用；微柱层析法、化学发光法均需昂贵的专用仪器，操作繁琐，也不适合用于临床常规检验。目前适用于自动化分析仪的1,5-AG测定方法主要是酶法，包括ADP-HK-NADPH方法和GK-PROD方法。但是，现有的酶法测定试剂盒成本较高、价格昂贵，且大多为干粉试剂，稳定性、灵敏度、特异性等方面均不能满足临床检验的要求。
直接用1,5-脱水山梨醇免疫动物无法获得抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的1,5-脱水山梨醇检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。
均相酶免疫检测法，以其检测速度快、操作简单、灵敏度高、特异性强且可以在全自动生化分析仪上实现对小分子物质的高通量快速化检测的优点，开始得到越来越多的关注。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既安全又可快速、高效、灵敏、准确检测出待测样本中1,5-脱水山梨醇含量的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂及其制备方法，以及可以与各种类型的自动生化分析仪联用、对检测人员要求较低的1,5-脱水山梨醇免疫检测方法。
为了实现上述目标，本发明采用的技术方案是：
一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂；所述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体由1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到，所述1,5-脱水山梨醇免疫原的结构式如式（I）所示：
Figure BDA0000464987840000031
式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
前述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，所述的R为-(CH2)4-COO-；所述的载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
前述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；所述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
前述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与1,5-脱水山梨醇衍生物偶联形成，所述1,5-脱水山梨醇衍生物的结构式如式（II）所示：
Figure BDA0000464987840000041
R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
前述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，R为-(CH2)4-COO-。
一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）1,5-脱水山梨醇衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；
（2）1,5-脱水山梨醇免疫原的合成：使1,5-脱水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；
（3）用1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物，制备并纯化抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体；
（4）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活1,5-脱水山梨醇衍生物，使G6PDH与1,5-脱水山梨醇衍生物连接，纯化连接产物；
（5）1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂A的制备：由抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体和均相酶底物混合而成；
试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
前述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，所述的步骤（2）中，蛋白质载体为BSA，n=4，具体合成步骤如下：
1）将20mg BSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液PBS中，上述溶液置于烧杯A中；
2）将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg1,5-脱水山梨醇衍生物，0.35ml二甲基酰胺，0.35ml乙醇，0.7ml10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液，40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原，储存于-20℃。
前述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）具体过程为：
1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg（0.05M）Tris、8mg MgCl2（3.3mM）和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH=9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
2)1,5-脱水山梨醇衍生物的激活
a）在无水状态下称取10mg1,5-脱水山梨醇衍生物，溶解于600μLDMF中；
b）使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c）加入3μL三丁胺；
d）加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e)-2～-8℃搅拌30分钟；
3）G6PDH与1,5-脱水山梨醇衍生物的连接
a）将上述激活的1,5-脱水山梨醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b)2-8℃搅拌过夜；
4）纯化产物
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
前述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，步骤（5）的具体过程如下：
试剂A的制备：将4.036g（11.25mM）氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g（11.25mM）葡萄糖-6-磷酸G6P用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
利用1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将待测样本与抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体接触；
2）根据待测样本中1,5-脱水山梨醇与抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中甘胆酸的含量；
所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
本发明的有益之处在于：本发明的1,5-脱水山梨醇免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的45种药物无任何交叉反应；含有上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的1,5-脱水山梨醇含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现1,5-脱水山梨醇的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是1,5-脱水山梨醇均相酶免疫反应标准曲线图；
图2是1,5-脱水山梨醇均相酶免疫相关性分析图。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案是：
1,5-脱水山梨醇免疫原，其结构式如式（I）所示：
Figure BDA0000464987840000081
式中，R为连接基团，可以是-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数，特别的，R为-(CH2)4-COO-；载体具有免疫原性，优选的，载体为具有免疫原性的蛋白质。虽然其它足够大的具备免疫原性的物质也可以作为载体，但通常情况下选用蛋白质作为载体。最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。本发明中的载体优选为血清蛋白。
一种抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，由式（I）所示的1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到。
本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
获得多克隆抗体的方法是使用式（I）所示的1,5-脱水山梨醇免疫原，在加或者不加佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。持续免疫一直进行，直至抗体效价达到最高。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。
单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，包括：上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，其可通过化学合成方法得到。
上述1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：
1）将待测样本与上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体接触；
2）根据待测样本中1,5-脱水山梨醇与上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中1,5-脱水山梨醇的含量。
待测样本为各种生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等。优选的，待测样本为血清或血浆。
下面结合具体的实施例，进一步说明本发明。
实施例一：1,5-脱水山梨醇衍生物的合成及其结构确认
以下实施例中使用的1,5-脱水山梨醇衍生物化学结构如式（IV）所示：
Figure BDA0000464987840000101
该1,5-脱水山梨醇衍生物的合成路线如下：
Figure BDA0000464987840000111
具体的合成步骤如下：
化合物2的合成
Figure BDA0000464987840000112
1）称取3.2g（19.5mmol）化合物1（1,5-脱水山梨醇），溶解于100mL二甲基甲酰胺（DMF）中，在氮气（N2）保护下加入12g（300mmol）NaH（纯度60%w/t，溶于矿物油中），将此混合物冷却到0oC，逐滴加入20mL(170mmol)溴化苄（BnBr），室温下搅拌16小时后，缓慢加入100mL甲醇（MeOH），然后加入110mL纯化水，再用HCl(4M)将此溶液的pH值调节至中性；
2）将上述溶液用二氯甲烷（CH2Cl2）萃取，使用水冲洗有机相，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，所得产物通过硅胶柱层析法（流动相：PE/EtOAc=10:1）进行纯化，最后得到8g绿色油状的化合物2，产率78%。
化合物3的合成
Figure BDA0000464987840000121
1）称取7.0g（13.4mmol）化合物2溶解于185mL干燥的甲苯中，在氮气（N2）保护下逐滴加入140mL二异丁基氢化铝（DIBAL，1M溶于甲苯中），将此混合物温度增加到50oC并搅拌2小时，将溶液放置于冰上，加入185mL HCl（1M），并快速搅拌此混合物30分钟；
2）将上述混合物用乙酸乙酯（EtOAc）稀释后，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取水相，使用卤水冲洗结合的有机相，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，所得产物与甲基叔丁基醚/己烷（MTBE/hexane）一起搅拌，最后得到4.2g白色非晶形固体化合物3，产率75%。
化合物4的合成
Figure BDA0000464987840000131
1）称取3.8g（8.9mmol）化合物3，溶解于20mL二甲基甲酰胺（DMF）中，在氮气（N2）保护下加入1.78g（43.8mmol）NaH（纯度60%w/t，溶于矿物油中），将此混合物在室温下搅拌1小时，在0℃下逐滴加入7.42g（35.5mmol）1-溴戊酸乙酯，然后再将此混合物在室温下搅拌1小时；
2）将上述混合物用水稀释后再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机相，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，所得产物通过硅胶柱层析法（流动相：PE/EtOAc=10:1）进行纯化，最后得到3.6g无色油状的化合物4，产率75%。
化合物5的合成
Figure BDA0000464987840000141
1）称取2.6g（4.7mmol）化合物4加入40mL2N的NaOH水溶液中，再加入5mL乙醇，制成混合物，将此混合物回流搅拌2小时；
2）将上述反应混合物冷却至室温后用稀盐酸酸化，再用乙酸乙酯（EtOAc）萃取，使用卤水冲洗有机层，加入MgSO4干燥，过滤、浓缩，最后得到2.3g化合物5，产率93%。
1,5-脱水山梨醇衍生物的合成
Figure BDA0000464987840000151
1）称取2.3g（4.3mmol）化合物5、1g钯/碳（Pd/C,10%）溶解于50mL甲醇中制成混合物，将此混合物于50oC下搅拌过夜；
2）将上述混合物过滤，再将滤液浓缩得到1g1,5-脱水山梨醇衍生物，产率88%，纯度>98%。
对上述所得纯化产物进行结构鉴定
1、利用Varian III plus300MHz对上述化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(300MHz,CD3OD):δ3.84-3.89(m,1H),3.57-3.72(m,1H),3.40-3.57(m,4H),3.22-3.34(m,4H),3.13(t,J=4.5Hz,1H),2.28(t,J=7.2Hz,2H),1.57-1.69(m,4H)。表征为式（IV）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物。
2、利用色谱/质谱技术（LCMS）对得到的衍生物进行分析鉴定，采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Welchrom XB-C18(50×4.6mm,5μm)，柱温为30℃，流速为1.5mL/min，检测波长为214nm，流动相为95%水(TFA)-5%乙腈（CH3CN）～40%水(TFA)-60%乙腈（CH3CN），6min，最后在此条件下持续0.5min。LCMS结果显示：纯度>98%，保留时间：2.063min，分子量：264，分子离子：265([M+H]+)。
综合上述结果，可以确定该最终所得化合物为式（IV）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物。
实施例二：BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原的合成
BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原由牛血清白蛋白BSA与式（II）所示的1,5-脱水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n=4为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
1)将20mg BSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）中，上述溶液置于烧杯A中；
2)将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg1,5-脱水山梨醇衍生物，0.35ml二甲基酰胺（dimethylformamide，DMF），0.35ml乙醇，0.7ml10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液。40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（N-hydroxysulfosuccinimide,Sulfo-NHS），于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析（4×4L）纯化，得到BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原，储存于-20℃。
类似的，n取1～20范围内的其他整数时，用同样的方法可以制备出如式（I）所示的1,5-脱水山梨醇免疫原。当然，载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白（KLH）和甲状腺球蛋白。优选的，载体为牛血清白蛋白。
本发明中仅提供连接基团R为-(CH2)n-COO-，且n=4的1,5-脱水山梨醇衍生物的合成实施例并进行了相关后续实验，由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的1,5-脱水山梨醇衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数时，实验结果并无显著差异，使用不同n值的1,5-脱水山梨醇衍生物制备的1,5-脱水山梨醇免疫原均具备强免疫原性，相应制备的特异性抗体均具有优异性能。
实施例三：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的制备
将上述制得的BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
用PBS将上述合成的BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
对上述实验动物兔取血，分离纯化得到抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，经测定，该抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的效价为1:30000。
实施例四：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）溶液的制备：
1）称取15mg规格为100KU的G6PDH，准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg（0.05M）Tris、8mg MgCl2（3.3mM）和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH=9.0。
2）在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。
3）在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethysulfoxide，DMSO)。
2.1,5-脱水山梨醇衍生物的激活
1）在无水状态下称取10mg上述1,5-脱水山梨醇衍生物，溶解于600μL DMF中。
2）使上述溶液温度降到-2～-8℃。
3）加入3μL三丁胺（tributylamine）。
4）加入1.5μL氯甲酸异丁酯（isobutylchloroformate）。
5）-2～-8℃搅拌30分钟。
3.G6PDH与1,5-脱水山梨醇衍生物的连接
1）将上述激活的1,5-脱水山梨醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
2）2-8℃搅拌过夜。
4.纯化产物
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
实施例五：1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂的制备
1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂，包括：上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂。指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物。其中，酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，其通过上述化学合成方法得到。
1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是分开放置的，不混合，所以将酶的底物与上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体混合在一起。也就是说，1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂，具体如下：
1.试剂A的制备：将4.036g（11.25mM）氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中，用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:500。
2.试剂B的制备：将上述制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中具体的比例为1:1000。
上述1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂的检测方法，包括以下步骤：
1）将待测样本与上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体接触；
2）根据待测样本中1,5-脱水山梨醇与上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断待测样本中1,5-脱水山梨醇的含量。
具体的，检测时，将待测样本加到试剂A中，待测样本中的1,5-脱水山梨醇与试剂A中的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体发生特异性结合，生成抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物；再加入试剂B，此时试剂B中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与试剂A中的酶的底物混合、接触，发生酶促反应，构成检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂，指示试剂根据待测样本中1,5-脱水山梨醇与上述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的结合情况判断待测样本中1,5-脱水山梨醇的含量。
由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与待测样本中的1,5-脱水山梨醇竞争性结合抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体，所以，待测样本中1,5-脱水山梨醇的量越多，均相酶溶液中游离的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的量越多，酶促反应越快，导致OD340上升。
上述待测样本为生理样本，例如血清、血浆、尿液、唾液等。
作为一种优选的方案，上述待测样本为血清或血浆。
实施例六：1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检验
1、获得标准曲线：设置迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数（见表1），操作过程为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图1所示。
表1迈瑞BS200全自动生化分析仪反应参数
Figure BDA0000464987840000211
通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将1,5-脱水山梨醇标准品溶解于人血清中，至浓度分别为3.00，15.00，40.00μg/ml。检测数据及数据分析见表2。
表2样品测定及精密度和回收率评估
Figure BDA0000464987840000221
检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95%-105%，精密度高，CV均低于5%。
实施例七：药物干扰试验
选取45种常见药物，调整浓度至10.0μg/ml，进行干扰试验测定。常见的45种药物以及测定结果具体参见表3。
表3常见干扰药物测定结果
Figure BDA0000464987840000231
Figure BDA0000464987840000241
测定结果：上述45种常见药物等价于1,5-脱水山梨醇的浓度均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗1,5-脱水山梨醇的特异性抗体。
实施例八：相关性分析
对包括50例阳性标本和25例阴性标本在内的75例临床标本分别使用日本协和医药株式会社的酶法1,5-脱水山梨醇测定试剂和本发明的均相酶免疫法测定试剂进行相关性分析，测定的数据参见表4。
表4真实样本测定值
Figure BDA0000464987840000242
Figure BDA0000464987840000251
Figure BDA0000464987840000261
对上述数据作图，参见图2，得到的线性方程为：y=1.0117x﹣0.0125，相关系数R2=0.9977，表明本发明的检测试剂测定的1,5-脱水山梨醇临床标本准确度高。
由于本发明的检测过程是由仪器全自动化完成，所以对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所做的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体、用于检测抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体-1,5-脱水山梨醇复合物的指示试剂；所述抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体由1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物得到，所述1,5-脱水山梨醇免疫原的结构式如式（I）所示：
Figure FDA0000464987830000011
式中，R为连接基团-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数，载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
2.根据权利要求1所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述的R为-(CH2)4-COO-；所述的载体为血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白。
3.根据权利要求1所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；所述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
4.根据权利要求3所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与1,5-脱水山梨醇衍生物偶联形成，所述1,5-脱水山梨醇衍生物的结构式如式（II）所示：
Figure FDA0000464987830000021
R为-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数。
5.根据权利要求4所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂，其特征在于，R为-(CH2)4-COO-。
6.一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）权利要求4所述的1,5-脱水山梨醇衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定；
（2）1,5-脱水山梨醇免疫原的合成：使1,5-脱水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基团与具有免疫原性的蛋白质载体连接，n为1至20之间的整数；
（3）用1,5-脱水山梨醇免疫原免疫动物，制备并纯化抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体；
（4）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液，激活1,5-脱水山梨醇衍生物，使G6PDH与1,5-脱水山梨醇衍生物连接，纯化连接产物；
（5）1,5-脱水山梨醇均相酶免疫检测试剂的制备：
试剂A的制备：由抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体和均相酶底物混合而成；
试剂B的制备：由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
7.根据权利要求6所述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，蛋白质载体为BSA，n=4，具体合成步骤如下：
1）将20mg BSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸缓冲液PBS中，上述溶液置于烧杯A中；
2）将如下化学品加入到烧杯B中搅拌溶解：20mg1,5-脱水山梨醇衍生物，0.35ml二甲基酰胺，0.35ml乙醇，0.7ml10mM pH5.0的磷酸钾缓冲液，40mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺，5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，于室温下搅拌溶解，反应30分钟；
3)将烧杯B中的溶液滴加至烧杯A中，得到混合溶液，在2～8℃下搅拌过夜；将上述搅拌后的混合溶液经过中性磷酸盐缓冲液透析纯化，得到BSA-1,5-脱水山梨醇免疫原，储存于-20℃。
8.根据权利要求6所述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）具体过程为：
1）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg（0.05M）Tris、8mg MgCl2（3.3mM）和100mgNaCl的溶液中,该溶液pH=9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
2)1,5-脱水山梨醇衍生物的激活
a）在无水状态下称取10mg1,5-脱水山梨醇衍生物，溶解于600μLDMF中；
b）使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c）加入3μL三丁胺；
d）加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e)-2～-8℃搅拌30分钟；
3）G6PDH与1,5-脱水山梨醇衍生物的连接
a）将上述激活的1,5-脱水山梨醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b)2-8℃搅拌过夜；
4）纯化产物
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
9.根据权利要求6所述的一种1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）的具体过程如下：
试剂A的制备：将4.036g（11.25mM）氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g（11.25mM）葡萄糖-6-磷酸G6P用1L55mM、pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将制备的抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH=8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
10.利用权利要求1至5任意一项所述的1,5-脱水山梨醇免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将待测样本与抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体接触；
2）根据待测样本中1,5-脱水山梨醇与抗1,5-脱水山梨醇特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中甘胆酸的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。
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