CN1456679A - 一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于采用氨偶联酶法，应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制测定试剂，用于测定体液样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的酶法测定试剂。本发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶－底物－NAD或酶－底物－NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，本发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。
Description
技术领域
本发明涉及测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法。
背景技术
腺苷脱氨酶是嘌呤核苷代谢中重要的酶类，是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。广泛分布于人体种类组织中，以胸腺、脾和其他淋巴组织中含量最高。腺苷脱氨酶有三种同工酶，分别为腺苷脱氨酶1、腺苷脱氨酶1+cp和腺苷脱氨酶2。近年来，测定血液、体液等样本中腺苷脱氨酶及其同工酶的活力水平对某些疾病的诊断、鉴别诊断、治疗及免疫功能的研究日趋受到临床重视。腺苷脱氨酶的活性缺乏与重症联合免疫缺陷病有关，其缺乏可导致核酸代谢障碍，影响胸腺发育。在艾滋病患者中红细胞腺苷脱氨酶活性特别高，血清腺苷脱氨酶的活性也较高，可作为艾滋病的协同诊断标志，血清或血浆中腺苷脱氨酶2活性升高可作为HIV感染的指标之一。在血液病方面，慢性溶血患者红细胞腺苷脱氨酶活性显著升高，为正常人的45-70倍；白血病患者腺苷脱氨酶活性随病情缓解降低，随复发而升高，血清腺苷脱氨酶活性测定有助于白血病和淋巴瘤的诊断和疗效观察。此外，肿瘤患者血清及组织中腺苷脱氨酶活性升高。腺苷脱氨酶活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一，与丙氨酸氨基转移酶或γ-谷氨酰转移酶等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学变化。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要包括放射核素法、电泳法和生化法。放射核素法灵敏度高，但需使用放射性核素，操作复杂，费用高，限制了该方法的临床应用，电泳法多用于腺苷脱氨酶同工酶的活性测定，由于电泳法测定时间较长，操作繁琐，不宜自动化，难以对大量样本进行测定，因此，临床上大多采用生化法。在生化法中，主要包括氨偶联酶测定法和次黄苷生成率测定法。次黄苷生成率测定法是于250nm波长处直接测定腺苷脱氨酶分解腺苷产生的次黄嘌呤核苷，由于其吸收峰与腺苷吸收峰部分重合，故灵敏度低，准确度差。氨偶联酶测定法是通过偶联的谷氨酸脱氢酶测定腺苷脱氨酶分解腺苷产生的氨。在传统的试剂配制过程中，需要加入氢氧化钠并煮沸去氨，以提高测定的准确度。在保存过程中，试剂容易发生生环境中氨污染，降低试剂的测定性能。本发明采用内源性慢反应酶循环机制不断排除试剂中污染的氨，从而无需煮沸去氨，并在试剂保存过程中，该机制能不间断地排除氨污染，稳定和提高了试剂的测定性能。
在腺苷脱氨酶及其同工酶活力的氨偶联酶测定法中，采用还原型烟酰胺辅酶或其类似物(如：NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH)测定体液样本中的腺苷脱氨酶及其同工酶是一个较为常用的方法，试剂中还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化程度，与样本中被测物的浓度成正比。根据样本中腺苷脱氨酶及其同工酶的活力，采用相应的酶反应机制，经过酶与底物反应，试剂中还原型烟酰胺辅酶或其类似物被氧化，反应系统的吸光度发生变化，通过测定反应系统的吸光度变化值，就可计算出样本中腺苷脱氨酶及其同工酶的浓度。
血清、血浆或体液样本中总腺苷脱氨酶活力的测定：样本中总腺苷脱氨酶分解腺苷产生的次黄嘌呤核苷和氨，氨在谷氨酸脱氨酶作用下与a-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中总腺苷氨酶的活力。
血清、血浆或体液样本中腺苷脱氨酶同工酶活力的测定原理与测定总腺苷脱氨酶活力的方法相同，在测定腺苷脱氨酶同工酶活力时，通过在试剂中加入腺苷脱氨酶同工酶1和腺苷脱氨酶同工酶1+cp的强抑制剂，如红-9-(2-羟基-3-壬烷)烷腺嘌呤(EHNA)，再测定腺苷脱氨酶同工酶2的活力。总腺苷脱氨酶的活性减去腺苷脱氨酶同工酶2的活性即为腺苷脱氨酶同工酶1和腺苷脱氨酶同工酶同工酶1+cp的活性。
但是由于试剂制造过程和环境中大量的氨污染，以及还原型烟酰胺辅酶或其类似物，特别是NADH和NADPH在这类酶试剂中不稳定，实际应用中只能采用干粉或冻干试剂。干粉或冻干试剂通过保持试剂的干燥状态，试剂的水分含量一般低于20％，以保持NADH或NADPH的稳定，试剂在复溶时采用煮沸去氨的复溶水，复溶后需立刻测定。
还原型烟酰胺辅酶在液体试剂的应用中，Joseph De Giorgio等(参见美国专利：5804402和5705356)发明了在测定试剂中加入NADH或NADPH的稳定酶系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其非专一性底物葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而达到排除氨污染，保持测定试剂中有效还原型烟酰胺辅酶浓度的目的。在他们的发明中，测定试剂生产或配制时不加入反应产物NAD或NADP，仍然按照传统的试剂生产或配制方法，加入NADH或NADPH，嵌入的再生酶系统仅仅用于NADH或NADPH氧化后的单向再生，并不生成新的NADH或NADPH。此外，这一发明中，Joseph De Giorgio等也未提出利用反应产物生产测定试剂的方法；也未提出测定腺苷脱氨酶的试剂。
Richard A.Kaufman等(参见美国专利：5589348)利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖-6-磷酸，在试剂测定过程中原位同时或先于测定样本快速生成还原型辅酶，用于被测物的测定。在他们的发明中，还原型烟酰胺辅酶的生成速率必需大于被测物酶系统再氧化的速率。被测物测定是在生成还原型辅酶的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖-6-磷酸的摩尔浓度必须低于用于生成还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此这类测定试剂配制成反应试剂后，生成的NADH或NADPH与普通测定试剂中一样不稳定，试剂保存过程中同样不能排除氨污染。在他们的发明中，相对于被测物酶系统将还原后的辅酶再氧化的速率，生成还原型辅酶的速率不可能以绝对快的速率完成，因此，测定样本中被测物含量时需要测定已知浓度的标准样本进行对照计算，从而求出样本中被测物的含量。采用这一方法在实际应用中很难对体液样本中的酶含量进行测定。
本发明是在测定试剂生产或配制时加入辅酶或其类似物的反应产物，如NAD、NADP、thioNAD或thioNADP，及其慢反应酶和底物，形成慢反应酶-底物-NAD、酶-底物-thioNAD、酶-底物-NADP或酶-底物-thioNADP等系统。测定试剂中有效的NADH、thio-NADH、NADPH或thio-NADPH含量是由该系统生成的同时该系统由于不断生成测定所需的还原型辅酶或其类似物，从而大大提高了试剂的稳定性，测定试剂配制完成后及保存过程中，内部嵌入的慢反应酶系统能不断排除试剂内和环境中的氨污染，提高试剂测定的准确度。
发明内容
本发明是关于采用氨偶联酶法，应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶(NAD)、NADP或其类似物，如thio-NAD、thio-NADP等)配制测定试剂，用于测定血液或其他体液样本中腺苷脱氨酶及其同工酶的酶法测定试剂。其特点是在生产或配制过程中，本发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而是加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物(如：NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP等)及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，本发明所指的酶法试剂就可达到测定被测物的目的。由于内嵌的酶和底物系统还原氧化型烟酰胺辅酶或其类似物的速率显著低于被测物及其测定酶或底物系统对还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化速率，因此该内嵌的酶和底物系统不但不影响被测物的测定反应，而且能不断地排除试剂内和环境中的氨污染，便于本测定试剂的规模生产和自动化使用。
本发明同时首次提出了一种利用反应产物逆向生成原反应物的测定腺苷脱氨酶及其同工酶的试剂生产方法。
本发明同时公开了一种节约和改良的测定腺苷脱氨酶及其同工酶试剂的配制和生产方法，由于试剂生产配制时不使用NADH、NADPH、thio-NADPH或其类似物，从而大降低了试剂的原料成本。
本发明同时公开了一种改良的测定腺苷脱氨酶及其同工酶的试剂，该试剂能不断地排除试剂内和环境中发生的氨污染。
根据本发明的原理，试剂测定中可以采用的还原型辅酶或其类似物的生成系统很多，包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等。为了有效地降低还原型烟酰胺辅酶或其类似物的生成速率，不影响试剂的测定性能，可以对上述生成系统中的酶和底物及其浓度进行高速使其生成还原型烟酰胺辅酶或其类仿物的速率在测定被测物时不影响还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化速率。例如，葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等。考虑到测定样本时样本中可能含有的底物物质影响到还原型烟酰胺辅酶或其类似物的生成速率，进而影响被测物的测定反应，上述各系统中优先选用的系统为甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统和(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统，最为优先选用的系统为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统。以下以(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统为例，进一步阐述本发明试剂的原理和制法。
本发明中的还原型辅酶或其类似物生成系统生成的还原型辅酶在达到一定的浓度后，即可与试剂其它测定成分一起进行被测物的浓度测定，此时还原型辅酶或其类似物生成系统可以已经完全完成了还原型辅酶或其类似物的生成反应，也可以仍在继续生成还原型辅酶或其类似物。这一特点保证了采用本发明可以配制或生产出单一稳定的液体试剂。本发明中的还原型辅酶或其类似物生成系统生成还原型辅酶或其类似物的速率可以是任何不干扰测定反应的速率，可以采用的生成有效还原型烟酰胺辅酶或其类似物的浓度的速率在0.001-365天内之间，生成的还原型辅酶或其类似物的吸光度在0.5-5.0范围之内(340nm或405nm波长，光径10mm)；生成速率小于0.001天，生成系统会影响测定系统的测定性能，生成速率大于365天，测定试剂的配制非常困难。更为合适的生成速率是在1-30天之内，生成的还原型辅酶或其类似物的吸光度为0.8-3.0(波长340nm或405nm，光径10nm)；优先采用的生成速率是在1-7天内，生成的还原型辅酶的吸光度为1.1-2.8，波长340nm或405nm，光径10mm。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度范围在100-100000U/L之间，更为合适的范围在1000-10000U/L之间，优先选用的范围在2000-8000U/L范围之间。葡萄糖浓度的选择范围较大，较为合适的范围在1-500nM之间，优先选用的范围在10-200mM之间。氧化型辅酶或其类似物较为合适的浓度范围在0.05-0.85mM之间，优先选用的范围在0.20-0.50mM之间。
具体实施例实施例1：配制测定腺苷脱氨酶的试剂、由下述组份按每升的含量组成，
试剂1：
Tris缓冲液100mM，(50-200mM)，PH8.2，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)
牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，
二磷酸腺甘钾盐2mM(0.2-20mM)
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)3500U/L(500-10000U/L)
NAD0.6mM(0.15-1.2mM)
D-葡萄糖40mM(10-200mM)
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L(500-10000U/L)
磷酸二氢钾5mM(2-100mM)
EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.2-20mM)
叠氮钠7.0mM(1-10mM)
根据上述配制试剂溶液的方法，以上试剂配制完成后，置2-8℃1-7天，试剂空白吸光度≥1.20，340m，10mm光径。
试剂2：
Tris缓冲液100mM，(50-200mM)，最终反应试剂PH7.4，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)
牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，
腺苷2mM(0.2-20mM)
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)3500U/L(500-10000U/L)
EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.2-20mM)
甘露糖醇55mM(10-100mM)
叠氮钠7.0mM(1-10mM)
根据上述配制试剂溶液的方法，配置试剂2，置2-8℃保存。测定样本时，采有两点法，试剂1：样本：试剂2的比例为200∶20∶100，温度37℃，试剂1加样本或校准品后在测定温度孵育300秒，除去样本中的氨，加入试剂2开始测定，延迟时间0秒，测定时间300秒，读数在测定时间内选择2个有效点。实施例2：总腺苷脱氨酶液体单试剂
Tris缓冲液100mM，(50-200mM)，PH7.4，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，(1-20mM)
牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，
二磷酸腺苷钾盐2.5mM(0.5-20mM)
腺苷2mM(0.2-20mM)
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)4500U/L(500-10000U/L)
NADP0.45mM(0.15-1.2mM)
D-葡萄糖40mM(010-200mM)
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L(500-10000U/L)
磷酸二氢钾5mM(2-100mM)
EDTA.Na2.2H2O1.5mM(0.2-20mM)
叠氮钠7.0mM(1-10mM)
根据上述配制试剂溶液的方法，配置试剂2，置2-8℃1-7天。试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本时，采有两点法，试剂1∶15，温度37℃，延迟时间0秒，除去样本中的氨，测定时间300秒，读数在测定时间内选择2个有效点。实施例3：腺苷脱氨酶同工酶同工酶2液体双试剂
试剂1：
Tris缓冲液100mM，(50-200mM)，PH8.2，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)
牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，
二磷酸腺苷钾盐2mM(0.2-20mM)
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)3500U/L(500-10000U/L)
NADP0.45mM(0.15-1.2mM)
EHNA0.15mM(0.05-0.5mM)
D-葡萄糖40mM(10-200mM)
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L(500-10000U/L)
磷酸二氢钾5mM(2-100mM)
EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.2-20mM)
叠氮钠7.0mM(1-10mM)
根据上述配制试剂溶液的方法，以上试剂配制完成后，置2-8℃ 1-7天。试剂空白吸光度≥1.20，340m，10mm光径。
试剂2：
Tris缓冲液100mM，(50-200mM)，最终反应试剂PH7.4，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，(2-20mM)
牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，
腺苷2mM(0.2-25mM)
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)3500U/L(500-10000U/L)
EDTA.Na2.2H2O1.5mM(0.2-20mM)
甘露糖醇55mM(10-100mM)
叠氮钠7.0mM(1-10mM)
根据上述配制试剂溶液的方法，配置试剂2，置2-8℃保存。测定样本时，采有两点法，试剂1：样本：试剂2的比例为200∶20∶100，温度37℃，试剂1加样本或校准品后在测定温度孵育300秒，除去样本中的氨，加入试剂2开始测定，延迟时间0秒，测定时间300秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
实施例4：腺苷脱氨酶同工酶2液体单试剂
Tris缓冲液100mM，(50-200mM)，PH7.4，37℃，
a-酮戊二酸7.5mM，(1-20mM)
牛血清白蛋白5g/L(1-10g/L)，
二磷酸腺苷钾盐2.5mM(0.5-20mM)
腺苷12.5mM(1-25mM)
谷氨酸脱氢酶(牛肝来源)4500U/L(500-10000U/L)
NADP0.45mM(0.15-1.2mM)
EHNA0.1mM(0.05-0.5mM)
D-葡萄糖4 0mM(0.05-200mM)
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(明串珠菌属)3700U/L(500-10000U/L)
磷酸二氢钾5mM(2-100mM)
EDTA.Na2.2H2O1.5Mm(0.5-20mM)
叠氮钠7.0mM(1-10mM)
根据上述配制试剂溶液的方法，配置试剂2，置2-8℃1-7天。试剂空白吸光度≥1.20，340nm，10mm光径。测定样本或校准品时，采有两点法，样本试剂比为1∶15，温度37℃，延迟时间300秒，除去样本中的氨并抑制腺苷脱氨酶1和腺苷脱氨酶1+cp，测定时间300秒，读数在测定时间内选择2个有效点。
上述举例1-举例4试剂配制完成后，其应用方法与相关领域中的普通试剂应用方法相同，在此不再赘述。
上述举例1-举例4试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理及其应用，本发明绝不局限于上述举例的应用范围；此外，在发明相关领域中的专业技术人员，可以根据本发明的原理和方法配制出与之类似的各种测定试剂，但并不脱离出本发明的原理和应用范围。
Claims (9)
1、一种测定腺苷脱氨酶的试剂，其特征在于：采用氨偶联酶法，应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制测定试剂，包含其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶-底物-NAD、酶-底物-(thio-NAD)、酶-底物-NADP或酶-底物-(thio-NADP)慢反应系统。如：葡萄糖脱氢酶-木糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶-a-酮戊二酸-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶。如：NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH等，对体液样本中腺甘脱氨酶及其同工酶活力进行测定的酶法测定试剂。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物酶反应系统生成有效的NADH或其类似物浓度的速率在0.001-365天之内，最好在1-7天之内。
2，一种测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：嵌入慢反应酶-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物，缓慢生成还原性烟酰胺辅酶或其类似物的酶反应系统，和利用生成的还原性烟酰胺辅酶或其类似物，如：NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH等，对体液样本中腺甘脱氨酶及其同工酶活力进行测定的酶法测定试剂。
3，如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物酶反应系统生成有效的NADH或其类似物浓度的速率在0.001-365天之内，最好在1-7天之内。
4、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的有效NADH浓度的吸光度在0.5-5.0之间，波长340nm，光径10mm。最好在1.0-2.5之间，波长340nm，光径10mm。11、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物酶反应系统生成有效NADPH浓度的速率在0.001-365天之内，最好在1-7天之内。
5、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的有效NADPH浓度的吸光度在0.5-5.0之间，波长340nm，光径10mm。最好在1.0-2.5之间，滤长340nm，光径10mm。
6、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物酶反应系统生成有效thio-NADH浓度的速率在0.001-365天之内，最好在1-7天之内。
7、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的有效thio-NADH的浓度吸光度在0.5-5.0之间，波长405nm，光径10mm。最好在1.0-2.5之间，波长405nm，光径10mm。
8、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物酶反应系统生成有效thio-NADPH浓度的速率在0.001-365天之内，最好在1-7天之内。
9、如权利要求2所述测定腺苷脱氨酶的试剂的制法，其特征在于：所指的有效thio-NADPH浓度的吸光度在0.5-5.0之间，波长405nm，光径10mm。最好在1.0-2.5之间，波长405nm，光径10mm。
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2003
- 2003-05-29 CN CN 03128092 patent/CN1456679A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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