CN1249251C - 生物成分测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物成分活性的测定试剂及其测定方法，在测定生物成分的方法中，避免胆红素、溶血血红蛋白等非待测对象物质的存在对测定结果的影响。一种生物成分测定试剂，在生物成分测定试剂中含有亚硫基二乙酸、β-硫二甘醇、甲硫氨酸中的任意一种或两种以上药剂。为了避免溶血血红蛋白的影响，添加亚硫基二乙酸、β-硫二甘醇、甲硫氨酸中的至少一种，特别是为了避免胆红素的影响，向试剂中添加亚硫基二乙酸、甲硫氨酸、硫脲、亚硫酸钠中的至少一种，而且，除了上面选择的任意一项物质，进而与十二烷基硫酸钠(SDS)并用。

Description

生物成分测定方法

技术领域

在临床检查领域生物成分测定方面，由于测定样品的非待测对象物质的存在对测定结果的影响，本发明与可以避免该影响的生物成分测定试剂有关。

背景技术

现在，在临床化学领域，作为血清成分的测定方法，在目标成分为酶的情况下，普遍方法是应用含有其基质的化合物进行酶反应，通过测定反应生成物计算酶活性。另外，在目标成分不是酶的情况下，普遍应用的方法也是使用对目标成分具有特殊作用的酶进行酶反应，通过测定其生成物计算目标成分量，即所谓的被称为“酶法”的测定方法。

众所周知，由于体液中的种种成分，例如还原性物质的抗坏血酸、血红蛋白、胆红素等的还原作用会产生负误差；或血红蛋白、胆红素等的色素由于测定波长造成正、负误差产生，由于光以及测定药剂组成成份的影响，这些色素自身的吸收，在测定过程中发生经时性变化，对测定结果产生影响，这种影响被称为“干扰”。

我们对各种避免体液成分干扰的方法进行了研讨，例如，仅就避免血红蛋白、胆红素产生的干扰对策就发表了很多的报告。关于避免血红蛋白干扰的方法，对使用硫脲的方法、使用阳离子表面活性剂/两性表面活性剂的方法、使用阳离子表面活性剂/两性表面活性剂/阴离子表面活性剂的方法、使用烷基磺酸盐类的方法、进行双色光测定的方法等作了许多报告。另外，关于避免胆红素干扰的方法，对使用胆红素氧化酶的方法、胆红素氧化酶与表面活性剂等合用的方法、使用铁氰化物的方法、使用亚铁氰化物的方法、使用铁氰化物/白蛋白的方法等也作了许多报告。

上述方法主要是使氧化酶与过氧化物酶组合、诱导其显色的方法中的避免干扰的方法，但也包含一部分类似在“白氨酸氨基肽酶测定法”的基质分解显色法中的避免干扰的方法。但是，迄今为止，仍不能说源于胆红素以及溶血血红蛋白的各干扰问题得到了充分解决。

发明内容

在生物成分测定方面，避免非待测对象物质、例如胆红素、溶血血红蛋白的存在对测定结果的影响，提供避免这种影响的生物成分测定试剂及其测定方法，就是本发明的课题。

本发明的发明者们经过反复专心的研究，发现在进行生物成分测定时，在试剂中加入亚硫基二乙酸、β-硫二甘醇、甲硫氨酸中的任意一种或两种以上药剂，可以避免溶血血红蛋白的干扰；加入含硫化合物，可以避免胆红素的干扰。在此基础上，他们完成了本发明。

即本发明是由以下所构成的：

1.一种生物成分测定试剂，其特征在于，在测定待测样品的生物成分时，为了避免试剂中非待测对象物质存在对测定结果产生的影响，使试剂中含有亚硫基二乙酸、β-硫二甘醇、甲硫氨酸中的任意一种或两种以上物质、

2.如上述1所述的生物成分测定试剂，其特征在于，非待测对象物质的任意项为溶血血红蛋白、

3.一种生物成分测定试剂，其特征在于，在测定待测样品的生物成分时，如果非待测对象物质的任意项为胆红素的时候，使试剂中含有一种或两种以上含硫化合物、

4.如上述3所述的生物成分测定试剂，其特征在于，含硫化合物为亚硫基二乙酸、β-硫二甘醇、甲硫氨酸、硫脲、亚硫酸钠、

5.如上述3或者4所述的测定试剂，其特征在于，非待测对象物质的任意项为胆红素及血红蛋白、

6.一种通过吸光度测定生物成分时使用的生物成分测定试剂，含有亚硫基二乙酸、β-硫二甘醇、甲硫氨酸、硫脲、亚硫酸钠中的任意一种或两种以上物质、

7.如上述6所述的测定试剂，其特征在于，根据生物成分吸光度进行的测定是对生物成分中酶活性的测定、

8.如上述7所述的测定试剂，酶活性的测定是，使用通过碱性磷酸酶(ALP)的作用而解离的显色化合物测定ALP活性、

9.如上述7或者8所述的测定试剂，含有亚硫基二乙酸、

10.如上述9所述的测定试剂，其特征在于，亚硫基二乙酸最终浓度为0.5～100mM、

11.如上述9或者10所述的测定试剂，其特征在于，除了亚硫基二乙酸之外，还含有十二烷基硫酸钠(SDS)、

12.如上述11所述的测定试剂，其特征在于，SDS的最终浓度为0.005～1.0％、

13.一种整套生物成分测定试剂，包含上述1～12项中任意一项中所述的试剂、

14.一种ALP活性测定方法，其特征在于，使用上述1～12项中任意一项中所述的试剂。

附图说明

图1：在ALP测定系中，结合态胆红素的干扰作用因是否添加亚硫基二乙酸，表示出相对的效果(实施例1)。

图2：在ALP测定系中，溶血血红蛋白的干扰作用因是否添加亚硫基二乙酸，出相对的效果(实施例1)。

图3：在ALP测定系中，溶血血红蛋白的干扰作用因是否添加SDS，表示出相对的效果(实施例1)。

具体实施方式

在本发明中，待测生物成分只要是生物体中含有的成分即可，并没有特定限制，可以用于进行例如人或动物的血液、血清、血浆、尿、粪便、精液、髓液、唾液、汗、眼泪、腹水、羊水等体液、脏器、组织、细胞等的抽出液等所含成分的测定。作为这类成分的例子可举出，可利用吸光光度计以特定波长的光的吸收度及反射为指标进行测定的物质，例如成分自身具有酶活性的物质、或者用酶标识待测成分、测定该酶活性的物质等。更具体地说，可以应用在以生物的碱性磷酸酶(ALP)活性为指标的生物成分的测定，同样也可以应用在以ALP的同功酶活性为指标的测定中。

将历来使用的ALP测定试剂不做任何措施的分成2个试剂系，由胆红素和溶血血红蛋白存在所产生的干扰，会对ALP活性的测定结果产生影响。研讨在ALP测定系中避免这些干扰的对策时，发现可以通过添加亚硫基二乙酸、甲硫氨酸、β-硫二甘醇中至少一种物质，避免溶血性血红蛋白的干扰。而且发现，添加含硫物质可以避免胆红素的干扰。所谓的含硫物质，只要分子中含有硫原子，就没有特定的限制，例如含有硫原子的含氧酸、硫代酸以及它们的盐、亚硫酸铵、亚硫酸钙、亚硫酸钠、硫代硫酸铵、硫代硫酸钠、硫代硫酸钾、亚硫基二乙酸、甲硫氨酸、硫脲等。比较理想的是在试剂中添加亚硫基二乙酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠、硫脲中至少一种物质之后的避免干扰的效果。从这些物质中选出的任意项物质，使之与具有避免溶血血红蛋白的干扰作用的SDS并存后，仍然可以保持避免胆红素干扰的效果，因此发现了通过与SDS并用可以分别避免胆红素及溶血血红蛋白的干扰，从而完成了本发明。

以下以ALP为例详细说明本发明，但本发明的测定对象并不限定于ALP。

人体血清中的ALP广泛的分布在人体各器官中，是分解大多数磷酸化合物、部分存在于生物膜外侧、与膜结合的酶，呈亚单位2分子的二聚物状构造，是其上连接有糖链的糖蛋白。可以发现在例如佝偻病、纤维性骨炎、副甲状腺功能亢进、白赛氏病、转移性骨癌、软骨病等疾病和闭塞性黄疸、急性肝炎、肝硬化、转移性肝癌等中，ALP活性都有所上升。

本发明的生物成分测定，可以用于包含在人或动物的血液、血清、血浆、尿、粪便、精液、髓液、唾液、汗、眼泪、腹水、羊水等体液、脏器、组织、细胞等抽出液中的ALP的测定。另外，本测定法也可用于ALP同功酶的活性测定。

在本发明中，所谓在ALP的作用下解离的显色化合物，是指在ALP的作用下，从ALP测定用基质中解离出来的物质。ALP测定用基质并没有特殊的限制，例如甘油磷酸、p-硝基苯磷酸、苯磷酸等，一般使用p-硝基苯磷酸。在各ALP测定用基质中，由于ALP的作用解离出来的显色化合物是p-硝基苯酚。

在本发明中，使用上述基质进行ALP活性的测定，可以分时间测定基质的分解速度，根据吸光度的增加，算出ALP活性，也可以通过终点法测定。另外，在以p-硝基苯磷酸为基质的ALP活性测定中，使用二乙醇胺(diethanolamin；DEA)缓冲液、2-(乙基氨基)乙醇(2-(ethylamino)ethanol；EAE)缓冲液、N-甲基-D-葡糖胺(N-methyl-D-glucamine；MEG)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-amino-2-methyl-1-propanol；AMP)缓冲液作为缓冲液的方法也有所报告(检查与技术、Vol.29，No.3，p.225-230(2001))，本发明的测定试剂以及测定方法，在使用AMP的情况下特别有效。

在本发明中，为了避免胆红素以及溶血血红蛋白的干扰，使ALP测定试剂中含有的亚硫基二乙酸最终浓度为0.5～100mM，比较理想的是1.0～50mM，更理想的是2.0～30mM。这里所说的最终浓度，是指相对于测定系中、用于测定的样品和用于测定的试剂反应后的最终溶液量的浓度。

并且，本发明中，为了避免溶血血红蛋白的干扰作用，也可以在ALP测定试剂中除了加入亚硫基二乙酸以外，还含有SDS。该SDS的最终浓度为0.001～1.0％，比较理想的是0.005～0.5％，更理想的是0.01～0.1％。

本发明涉及：加入亚硫基二乙酸或者进而加入SDS的ALP测定试剂以及含有该试剂的整套测定试剂以及ALP测定方法。

实施例

以下，通过实施例来说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

对在结合态胆红素的浓度或者溶血血红蛋白的浓度不同的样品的测定系中，在测定试剂中添加亚硫基二乙酸或者SDS时的效果进行了研究。

测定用试剂按照以下方法调制：

(第一试剂)

2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)  350mM

硫酸锌                     1.36mM

醋酸镁                     2.71mM

N-羟基乙基乙二胺三乙酸     2.71mM

(HEDTA)

pH10.4(30℃)

(第二试剂)

2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP) 350mM

4-硝基苯磷酸              65.1mM

pH10.4(30℃)

调制在第一试剂中添加亚硫基二乙酸30mM的药剂和添加SDS0.5％的药剂。

测定用样品按照以下方式调制。

(a)结合态胆红素浓度不同的血清样品

质控血清QAP-trawl(トロ一ル)·1X(国际试剂制造)的血清9容量单位和不含结合态胆红素的水溶液或者含有调制好了的结合态胆红素(干扰审核：国际试剂制造)的水溶液1容量单位混合，调制结合态胆红素的最大浓度为22mg/dL的血清的稀释系列，作为各测定样品。

(b)血红蛋白浓度不同的血清样品

质控血清QAP-trawl·1X(国际试剂制造)的血清9容量单位和不含血红蛋白的水溶液或者含有调制好了的溶血血红蛋白(干扰校正：国际试剂制造)的水溶液1容量单位混合，调制溶血血红蛋白的最大浓度为480mg/dL的稀释系列血清，作为各测定样品。

测定在以下条件下进行。

在5μL测定用样品中加入第一试剂210μL，在37℃条件下预热5分钟后，添加第二试剂70μL，搅拌后，比较其在405nm(主波长)及505nm(副波长)中单位时间内吸光度的增加速度。以已知ALP活性值的酶溶液吸光度的增加速度为基础，计算出各测定样品的酶活性。

测定装置使用日立7170型自动分析装置。

结果如第1图～第3图所示。第1图说明源于各浓度的结合态胆红素的干扰，通过添加亚硫基二乙酸而得以避免。

从第2图可以看出：源于各浓度的溶血血红蛋白的干扰，通过添加亚硫基二乙酸而得以减轻。

从第3图可以确认：源于各浓度的溶血血红蛋白的干扰，通过添加SDS而得以避免。

实施例2

在含有结合态胆红素以及溶血血红蛋白(Hb)的测定用样品中，在测定试剂中添加亚硫基二乙酸和SDS，对其效果进行研讨。测定用样品以及试剂的调制方法如下，测定以与实施例1同样的方式进行。

(测定用样品的调制)

测定用样品，以与实施例1同样的方式，分别调制成结合态胆红素浓度为21.6mg/dL和溶血Hb浓度为480mg/dL的。

(试剂的调制)

第一试剂以及第二试剂以与实施例1所示同样的方式调制。并且，调制出在第一试剂中同时添加亚硫基二乙酸30mM和SDS0.5％的药剂。

关于亚硫基二乙酸30mM和SDS0.5％添加效果的评价，把以不含结合态胆红素以及溶血Hb的测定系的测定值定为100％的相对值进行评析。

其结果如表1所示。表1明显地表示出：由于添加亚硫基二乙酸和SDS，避免了源于结合态胆红素以及溶血血红蛋白的干扰。

表1                                     (％)

测定用样品	无添加	添加
			添加结合态胆红素(21.6mg/dL)	97	100
添加溶血Hb(480mg/dL)	84	100

(无添加：没有添加亚硫基二乙酸和SDS的试剂测定系)

(添加：添加亚硫基二乙酸和SDS的试剂测定系)

产业上的利用可能性

如以上说明所示：使用本发明的生物成分测定试剂，可以避免溶血血红蛋白产生的干扰以及由胆红素产生的干扰，得到正确的生物成分测定值。

Claims (9)

1.一种碱性磷酸酶活性的测定试剂，其特征在于，在测定待测样品中的碱性磷酸酶的活性时，为了避免样品中溶血血红蛋白的存在对测定结果产生的影响，含有亚硫基二乙酸及十二烷基硫酸钠(SDS)中的任意一种或两种的物质。

2.一种碱性磷酸酶活性的测定试剂，其特征在于，在测定待测样品中的碱性磷酸酶的活性时，为了避免样品中胆红素的存在对测定结果产生的影响，在试剂中含有作为含硫化合物的亚硫基二乙酸。

3.权利要求1或2中所述的碱性磷酸酶活性的测定试剂，其中的试剂是通过吸光度来测定酶活性的试剂。

4.权利要求1～3中任一项所述的碱性磷酸酶活性的测定试剂，其中的试剂是使用通过ALP的作用而解离的显色化合物来测定ALP的活性的试剂。

5.权利要求1或2中所述的碱性磷酸酶活性的测定试剂，其特征在于，含有亚硫基二乙酸，亚硫基二乙酸的最终浓度为0.5～100mM。

6.权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定试剂，其特征在于，含有SDS，SDS的最终浓度为0.005～1.0％。

7.权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的测定试剂，其中含有亚硫基二乙酸及SDS，来避免样品中溶血血红蛋白及胆红素的影响。

8.一种整套碱性磷酸酶活性的测定试剂，其特征在于，含有权利要求1～7中任一项所述的试剂。

9.一种碱性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，使用权利要求1～7中任一项所述的试剂。

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