JP2023106690A - カルシウム濃度測定試薬及び測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定試薬において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制することにより、試料中のカルシウム濃度を正確に測定できる方法を提供する。【解決手段】クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有させる。【選択図】なし
Description
本発明は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いたカルシウム濃度測定試薬及び測定方法に関するものである。更には、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
カルシウムは、人体内に約１，２００ｇ存在しており、その約９９％が骨と歯に存在し、残りの約１％が血液などの体液や筋肉などに存在している。この１％のカルシウムが、出血を止めることや、神経の働き、筋肉運動など、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。また、血液中のカルシウム濃度は、カルシウムの吸収異常、骨疾患、内分泌疾患、高血圧、又は動脈硬化症などにより変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
カルシウム濃度の測定方法として使用されている方法としては、原子吸光法、電極法、キレート発色剤のο－クレゾールフタレイン・コンプレクソンを使用した方法（ｏ－ＣＰＣ法）があるが、これらの方法は、高価な機器を必要としたり、試料の前処理を必要とする場合がある。特に臨床検査の分野で広く使用されているｏ－ＣＰＣ法は、マグネシウムイオンの影響を受けたり、温度や測定時間によって吸光度が変化するなど測定値の精度に問題がある。
カルシウムイオンによる酵素の活性化を利用した測定方法として、α－アミラーゼやホスホリパーゼＤを用いた方法が開発されているが、これらの方法は、キレート発色剤を使用した方法に比べてその測定コストが高いという問題がある。
また、キレート発色剤としてアルセナゾ－ＩＩＩを使用した測定方法が開発されているが、アルセナゾ－ＩＩＩは構造内にヒ素成分を含むため、人体や環境への影響を考慮する必要があると指摘されている。
そこで、近年、アルセナゾ－ＩＩＩに類似しているが、ヒ素成分を含まないキレート発色剤であり、マグネシウムイオンの影響をほとんど受けない、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定方法が開発されている。
しかしながら、このクロロホスホナゾ－ＩＩＩは弱酸性の反応溶液中でタンパク質成分と非特異的な反応を起こすため、試料中のカルシウム濃度の測定に正誤差を生じることが知られていた。
このため、クロロホスホナゾ－ＩＩＩをキレート発色剤として使用したカルシウム濃度の測定試薬に、バナジン酸イオンを含有させる（特許文献１参照）ことや、アニオン型界面活性剤やポリアミン類等を含有させる（特許文献２参照）ことにより、クロロホスホナゾ－ＩＩＩとタンパク質との非特異的反応を抑制する測定試薬が提案されている。
また、クロロホスホナゾ－ＩＩＩは、ブランクが高いため、測定値の精度に問題があることが知られており、前記した特許文献１では、測定試薬にバナジン酸イオンを含有させることでブランクを抑制できることが提案されている。
しかしながら、バナジウムは重金属であり、弱い変異原作用の兆候もあるとされ、人体への影響を考慮する必要があると指摘されている。
しかしながら、バナジウムは重金属であり、弱い変異原作用の兆候もあるとされ、人体への影響を考慮する必要があると指摘されている。
従って、本発明の課題は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定試薬において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制することにより、試料中のカルシウム濃度を正確に測定できる方法を提供することである。
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有させることにより、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） クロロホスホナゾ－ＩＩＩと、アミノアルコール及びイミダゾール からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むカルシウム濃度測定試薬。
（２） カルシウム濃度測定試薬が、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬、並びに、クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む第２試薬とから構成される、前記（１）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（３） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（１）又は（２）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（４） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度測定試薬と試料を混合し、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下でクロロホスホナゾ－ＩＩＩとカルシウムを反応させることを特徴とする、カルシウム濃度測定方法。
（５） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（４）に記載のカルシウム濃度測定方法。
（６） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いるカルシウム濃度測定方法に適用されるクロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤であって、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤。
（７） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（６）に記載のブランク抑制剤。
（８） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法。
（９） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（８）に記載のブランク抑制方法。
（１） クロロホスホナゾ－ＩＩＩと、アミノアルコール及びイミダゾール からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むカルシウム濃度測定試薬。
（２） カルシウム濃度測定試薬が、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬、並びに、クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む第２試薬とから構成される、前記（１）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（３） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（１）又は（２）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（４） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度測定試薬と試料を混合し、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下でクロロホスホナゾ－ＩＩＩとカルシウムを反応させることを特徴とする、カルシウム濃度測定方法。
（５） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（４）に記載のカルシウム濃度測定方法。
（６） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いるカルシウム濃度測定方法に適用されるクロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤であって、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤。
（７） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（６）に記載のブランク抑制剤。
（８） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法。
（９） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（８）に記載のブランク抑制方法。
本発明のカルシウム濃度測定試薬及び測定方法は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定試薬において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制することができるものである。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な測定結果（測定値）を提供することができるものである。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な測定結果（測定値）を提供することができるものである。
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
１． クロロホスホナゾ－ＩＩＩ
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、キレート発色剤として、２，７－ビス（４－クロロ－２－ホスホノフェニルアゾ）－１，８－ジヒドロキシ－３，６－ナフタレンジスルホン酸（クロロホスホナゾ－ＩＩＩ）〔ＣＡＳ番号１９１４－９９－４〕を使用する。
なお、クロロホスホナゾ－ＩＩＩは、広く市販されており、市販品をそのまま使用すればよい。
また、本発明において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩの濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１～１．０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１６～０．４０ｍＭの範囲が特に好ましい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、キレート発色剤として、２，７－ビス（４－クロロ－２－ホスホノフェニルアゾ）－１，８－ジヒドロキシ－３，６－ナフタレンジスルホン酸（クロロホスホナゾ－ＩＩＩ）〔ＣＡＳ番号１９１４－９９－４〕を使用する。
なお、クロロホスホナゾ－ＩＩＩは、広く市販されており、市販品をそのまま使用すればよい。
また、本発明において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩの濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１～１．０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１６～０．４０ｍＭの範囲が特に好ましい。
２． アミノアルコール及びイミダゾール
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、測定試薬にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有させることにより、試料中のカルシウム濃度を測定する際の、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制することができる。
ここで、アミノアルコールについては、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制する作用を有するものであれば特に限定されないが、特に、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンを使用することが好ましい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、測定試薬にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有させることにより、試料中のカルシウム濃度を測定する際の、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制することができる。
ここで、アミノアルコールについては、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制する作用を有するものであれば特に限定されないが、特に、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンを使用することが好ましい。
測定試薬に含有させるアミノアルコール及びイミダゾールの濃度については、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制する作用を発揮する濃度であれば特に限定されないが、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、５０～２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、１００～１５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、測定試薬が複数試薬により構成される場合、アミノアルコール又はイミダゾールは、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含有する試薬に含有させれば良いが、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含有しない試薬にもアミノアルコール又はイミダゾールを含有させても良い。
３． ｐＨ
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用するため、測定反応液のｐＨは４．０～７．０の範囲にあることが好ましく、４．５～６．０がさらに好ましく、４．８～５．２の範囲が特に好ましい。
なお、測定試薬又は測定反応液を前記のｐＨ範囲に調整する場合は、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、コハク酸、クエン酸、又はグッド緩衝液等を挙げることができる。
また、本発明においては、測定試薬に含有させる、アミノアルコール又はイミダゾールをｐＨの調整に使用することが可能である。
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用するため、測定反応液のｐＨは４．０～７．０の範囲にあることが好ましく、４．５～６．０がさらに好ましく、４．８～５．２の範囲が特に好ましい。
なお、測定試薬又は測定反応液を前記のｐＨ範囲に調整する場合は、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、コハク酸、クエン酸、又はグッド緩衝液等を挙げることができる。
また、本発明においては、測定試薬に含有させる、アミノアルコール又はイミダゾールをｐＨの調整に使用することが可能である。
４． 試料
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
５． カルシウム濃度測定試薬
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩと、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むものである。
本発明のカルシウム濃度測定試薬においては、アミノアルコール又はイミダゾールの存在下でカルシウムとクロロホスホナゾ－ＩＩＩとを反応させること以外は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いる従来より公知のカルシウム濃度を測定する試薬に従えばよい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩと、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むものである。
本発明のカルシウム濃度測定試薬においては、アミノアルコール又はイミダゾールの存在下でカルシウムとクロロホスホナゾ－ＩＩＩとを反応させること以外は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いる従来より公知のカルシウム濃度を測定する試薬に従えばよい。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、一段階のステップにより測定を行う１ステップ法（１試薬法）のものであってもよく、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより測定を行う多ステップ法（多試薬法）のものであってもよく、適宜選択すればよい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬において、測定試薬には前記の成分の他に、公知の防腐剤、安定化剤、又は界面活性剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のカルシウム濃度の測定に使用することができる。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、前記した測定試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の測定対象物質の測定に使用することもできる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、検量（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、検量（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又はその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
６．カルシウム濃度測定方法
本発明のカルシウム濃度測定方法においては、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含有うするカルシウム濃度測定試薬と試料を混合し、アミノアルコール又はイミダゾールの存在下でカルシウムとクロロホスホナゾ－ＩＩＩとを反応させて測定を行うこと以外は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いる従来より公知のカルシウム濃度測定方法に従えばよい。
また、本発明の試料中のカルシウム濃度測定方法は、１ステップ法（１試薬系）からなるものでもよく、複数ステップ法（複数試薬系）からなるものであってもよく、用手法又は自動分析装置による方法によりカルシウム濃度を測定することができる。
本発明のカルシウム濃度測定方法においては、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含有うするカルシウム濃度測定試薬と試料を混合し、アミノアルコール又はイミダゾールの存在下でカルシウムとクロロホスホナゾ－ＩＩＩとを反応させて測定を行うこと以外は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いる従来より公知のカルシウム濃度測定方法に従えばよい。
また、本発明の試料中のカルシウム濃度測定方法は、１ステップ法（１試薬系）からなるものでもよく、複数ステップ法（複数試薬系）からなるものであってもよく、用手法又は自動分析装置による方法によりカルシウム濃度を測定することができる。
７．クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法
本発明における、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用した試料中のカルシウム濃度の測定方法において、アミノアルコール又はイミダゾールの存在下で測定を行うことによるものである。
また、本発明におけるクロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制する方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
本発明における、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用した試料中のカルシウム濃度の測定方法において、アミノアルコール又はイミダゾールの存在下で測定を行うことによるものである。
また、本発明におけるクロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制する方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
そして、本発明のクロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法は、上記の構成により、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制することができ、精度が高いカルシウム濃度の測定値を得ることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕（カルシウム濃度測定試薬におけるアミノアルコールの効果の確認）
各種アミノアルコールをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のブランクの低下に対する効果を確認した。
各種アミノアルコールをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のブランクの低下に対する効果を確認した。
１． 本発明・測定試薬Ａの調製
（１） 第１試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第１試薬Ａを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
アニオン性界面活性剤 ２６．３ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １１．９ｍＭ
モノエタノールアミン １４２．１ｍＭ
（２） 本発明・第２試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬Ａを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ １．２２ｍＭ
モノエタノールアミン ７０．０ｍＭ
（１） 第１試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第１試薬Ａを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
アニオン性界面活性剤 ２６．３ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １１．９ｍＭ
モノエタノールアミン １４２．１ｍＭ
（２） 本発明・第２試薬Ａの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬Ａを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ １．２２ｍＭ
モノエタノールアミン ７０．０ｍＭ
２． 本発明・測定試薬Ｂの調製
（１） 第１試薬Ｂの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのジエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｂを調製した。
（２） 第２試薬Ｂの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのジエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｂを調製した。
（１） 第１試薬Ｂの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのジエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｂを調製した。
（２） 第２試薬Ｂの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのジエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｂを調製した。
３． 本発明・測定試薬Ｃの調製
（１） 第１試薬Ｃの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのトリエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｃを調製した。
（２） 第２試薬Ｃの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのトリエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｃを調製した。
（１） 第１試薬Ｃの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのトリエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｃを調製した。
（２） 第２試薬Ｃの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのトリエタノールアミンを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｃを調製した。
４． 本発明・測定試薬Ｄの調製
（１） 第１試薬Ｄの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭの２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール〔以下、ＡＭＰと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｄを調製した。
（２） 第２試薬Ｄの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＡＭＰを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｄを調製した。
（１） 第１試薬Ｄの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭの２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール〔以下、ＡＭＰと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｄを調製した。
（２） 第２試薬Ｄの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＡＭＰを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｄを調製した。
５． 本発明・測定試薬Ｅの調製
（１） 第１試薬Ｅの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔以下、Ｔｒｉｓと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｅを調製した。
（２） 第２試薬Ｅの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＴｒｉｓを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｅを調製した。
（１） 第１試薬Ｅの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔以下、Ｔｒｉｓと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｅを調製した。
（２） 第２試薬Ｅの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＴｒｉｓを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｅを調製した。
６． 対照・測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬を調製した。
（２） 第２試薬の調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬を調製した。
（１） 第１試薬の調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第１試薬を調製した。
（２） 第２試薬の調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ａと成分及び濃度が同じである、第２試薬を調製した。
７． 試料
試料として、市販標準液である「ＣａＩＩ用標準液」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
試料として、市販標準液である「ＣａＩＩ用標準液」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
８． 試料中のカルシウム濃度の測定
前記７の試料中のカルシウム濃度を、前記１で調製した測定試薬Ａにて測定した。
カルシウム濃度の測定は、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて行い、試料３．４μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬Ａ１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。その後、前記１の（２）で調製した第２試薬Ａ７５μＬを添加し、３７℃で５分間反応させ、波長７００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。
さらに、測定試薬を前記２～６で調製した測定試薬Ｂ～Ｅ及び対照・測定試薬に変えて同様に測定を行った。
また、精製水を試料として同様に測定を行った際の吸光度をブランク吸光度とした。
前記７の試料中のカルシウム濃度を、前記１で調製した測定試薬Ａにて測定した。
カルシウム濃度の測定は、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて行い、試料３．４μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬Ａ１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。その後、前記１の（２）で調製した第２試薬Ａ７５μＬを添加し、３７℃で５分間反応させ、波長７００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。
さらに、測定試薬を前記２～６で調製した測定試薬Ｂ～Ｅ及び対照・測定試薬に変えて同様に測定を行った。
また、精製水を試料として同様に測定を行った際の吸光度をブランク吸光度とした。
９． 測定結果
前記８の測定結果を表１に示した。
なお、表１のΔ感度は、標準液吸光度からブランク吸光度を差し引いたものである。
前記８の測定結果を表１に示した。
なお、表１のΔ感度は、標準液吸光度からブランク吸光度を差し引いたものである。
表１から明らかなように、対照・測定試薬を使用した場合に比べて、本発明の測定試薬を使用した場合には、ブランク吸光度が低くなっていることが分かる。
また、本発明で使用するアミノエタノールについては、エタノール部位が増加する程、ブランクが低下していることが分かる。
また、本発明で使用するアミノエタノールについては、エタノール部位が増加する程、ブランクが低下していることが分かる。
このように、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度測定試薬にアミノエタノールを含有させることにより、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制できることが確認された。
〔実施例２〕（カルシウム濃度測定試薬におけるアミノアルコールの効果の確認）
各種アミノアルコールをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のブランクの低下に対する効果を確認した。
各種アミノアルコールをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のブランクの低下に対する効果を確認した。
１． 本発明・測定試薬Ｆの調製
（１） 第１試薬Ｆの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第１試薬Ｆを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
アニオン性界面活性剤 ２６．３ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １１．９ｍＭ
モノエタノールアミン １４２．１ｍＭ
（２） 本発明・第２試薬Ｆの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬Ｆを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ １．２２ｍＭ
モノエタノールアミン ７０．０ｍＭ
（１） 第１試薬Ｆの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第１試薬Ｆを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
アニオン性界面活性剤 ２６．３ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １１．９ｍＭ
モノエタノールアミン １４２．１ｍＭ
（２） 本発明・第２試薬Ｆの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬Ｆを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ １．２２ｍＭ
モノエタノールアミン ７０．０ｍＭ
２． 本発明・測定試薬Ｇの調製
（１） 第１試薬Ｇの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのＡＭＰを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｇを調製した。
（２） 第２試薬Ｇの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＡＭＰを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｇを調製した。
（１） 第１試薬Ｇの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのＡＭＰを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｇを調製した。
（２） 第２試薬Ｇの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＡＭＰを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｇを調製した。
３． 本発明・測定試薬Ｈの調製
（１） 第１試薬Ｈの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭの２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール〔以下、ＡＭＰＤと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｈを調製した。
（２） 第２試薬Ｈの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＡＭＰＤを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｈを調製した。
（１） 第１試薬Ｈの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭの２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール〔以下、ＡＭＰＤと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｈを調製した。
（２） 第２試薬Ｈの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＡＭＰＤを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｈを調製した。
４． 本発明・測定試薬Ｉの調製
（１） 第１試薬Ｉの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのＮ－メチル－Ｄ－グルカミン〔以下、ＮＭＧと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｉを調製した。
（２） 第２試薬Ｉの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＮＭＧを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｉを調製した。
（１） 第１試薬Ｉの調製
モノエタノールアミンに変えて１４２．１ｍＭのＮ－メチル－Ｄ－グルカミン〔以下、ＮＭＧと略すこともある〕を含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第１試薬Ｉを調製した。
（２） 第２試薬Ｉの調製
モノエタノールアミンに変えて７０．０ｍＭのＮＭＧを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｆと成分及び濃度が同じである、第２試薬Ｉを調製した。
５． 試料
試料として、市販標準液である「ＣａＩＩ用標準液」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
試料として、市販標準液である「ＣａＩＩ用標準液」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
６． 試料中のカルシウム濃度の測定
前記５の試料中のカルシウム濃度を、前記１～４で調製した測定試薬Ｆ～Ｉにて実施例１の８と同様にして測定を行った。
前記５の試料中のカルシウム濃度を、前記１～４で調製した測定試薬Ｆ～Ｉにて実施例１の８と同様にして測定を行った。
７． 測定結果
前記６の測定結果を表２に示した。
なお、表２のΔ感度は、標準液吸光度からブランク吸光度を差し引いたものである。
前記６の測定結果を表２に示した。
なお、表２のΔ感度は、標準液吸光度からブランク吸光度を差し引いたものである。
表２から明らかなように、本発明の測定試薬を使用した場合には、ブランク吸光度が低く抑えられていることが分かる。
このように、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度測定試薬にアミノエタノールを含有させることにより、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制できることが確認された。
〔実施例３〕（カルシウム濃度測定試薬におけるイミダゾールの効果の確認）
イミダゾールをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のブランクの低下に対する効果を確認した。
イミダゾールをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のブランクの低下に対する効果を確認した。
１． 本発明・測定試薬Ｊの調製
（１） 第１試薬Ｊの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第１試薬Ｊを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
アニオン性界面活性剤 ２６．３ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １１．９ｍＭ
イミダゾール １４２．１ｍＭ
（２） 本発明・第２試薬Ｊの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬Ｊを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ １．２２ｍＭ
イミダゾール ７０．０ｍＭ
（１） 第１試薬Ｊの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第１試薬Ｊを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
アニオン性界面活性剤 ２６．３ｍＭ
非イオン性界面活性剤 １１．９ｍＭ
イミダゾール １４２．１ｍＭ
（２） 本発明・第２試薬Ｊの調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬Ｊを調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ １．２２ｍＭ
イミダゾール ７０．０ｍＭ
２． 対照・測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
イミダゾールに変えて１４２．１ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｊと成分及び濃度が同じである、第１試薬を調製した。
（２） 第２試薬の調製
イミダゾールに変えて７０．０ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｊと成分及び濃度が同じである、第２試薬を調製した。
（１） 第１試薬の調製
イミダゾールに変えて１４２．１ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（１）の第１試薬Ｊと成分及び濃度が同じである、第１試薬を調製した。
（２） 第２試薬の調製
イミダゾールに変えて７０．０ｍＭの水酸化ナトリウムを含有すること以外は前記１の（２）の第２試薬Ｊと成分及び濃度が同じである、第２試薬を調製した。
３． 試料
試料として、市販標準液である「ＣａＩＩ用標準液」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
試料として、市販標準液である「ＣａＩＩ用標準液」（販売元：株式会社シノテスト）を使用した。
４． 試料中のカルシウム濃度の測定
前記３の試料中のカルシウム濃度を、前記１及び２で調製した測定試薬Ｊ及び対照・測定試薬にて実施例１の８と同様にして測定を行った。
前記３の試料中のカルシウム濃度を、前記１及び２で調製した測定試薬Ｊ及び対照・測定試薬にて実施例１の８と同様にして測定を行った。
５． 測定結果
前記４の測定結果を表３に示した。
なお、表３のΔ感度は、標準液吸光度からブランク吸光度を差し引いたものである。
前記４の測定結果を表３に示した。
なお、表３のΔ感度は、標準液吸光度からブランク吸光度を差し引いたものである。
表３から明らかなように、対照の測定試薬を使用した場合に比べて、本発明の測定試薬を使用した場合には、ブランク吸光度が低くなっていることが分かる。
このように、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度測定試薬にイミダゾールを含有させることにより、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制できることが確認された。
これらのことより、本発明のカルシウム濃度測定試薬による測定では、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランクを抑制し、正確に試料中のカルシウム濃度の測定を行えることが確かめられた。
Claims (9)
- クロロホスホナゾ－ＩＩＩと、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むカルシウム濃度測定試薬。
- カルシウム濃度測定試薬が、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬、並びに、クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む第２試薬とから構成される、請求項１に記載のカルシウム濃度測定試薬。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項１又は２に記載のカルシウム濃度測定試薬。
- クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度測定試薬と試料を混合し、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下でクロロホスホナゾ－ＩＩＩとカルシウムを反応させることを特徴とする、カルシウム濃度測定方法。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項４に記載のカルシウム濃度測定方法。
- クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いるカルシウム濃度測定方法に適用されるクロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤であって、アミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制剤。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項６に記載のブランク抑制剤。
- クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、クロロホスホナゾ－ＩＩＩのブランク抑制方法。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項８に記載のブランク抑制方法。
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2022
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