JP2023161500A - カルシウム濃度測定の直線性の改善方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定試薬において、カルシウム濃度に対する直線性を改善することにより、試料中のカルシウム濃度を正確に測定できる方法を提供する。【解決手段】クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアルカリ金属イオンを含有させる。【選択図】なし
Description
本発明は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いたカルシウム濃度測定試薬における、カルシウム濃度に対する直線性を改善する方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
カルシウムは、人体内に約１，２００ｇ存在しており、その約９９％が骨と歯に存在し、残りの約１％が血液などの体液や筋肉などに存在している。この１％のカルシウムが、出血を止めることや、神経の働き、筋肉運動など、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。また、血液中のカルシウム濃度は、カルシウムの吸収異常、骨疾患、内分泌疾患、高血圧、又は動脈硬化症などにより変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
カルシウム濃度の測定方法として使用されている方法としては、原子吸光法、電極法、キレート発色剤のο－クレゾールフタレイン・コンプレクソンを使用した方法（ｏ－ＣＰＣ法）があるが、これらの方法は、高価な機器を必要としたり、試料の前処理を必要とする場合がある。特に臨床検査の分野で広く使用されているｏ－ＣＰＣ法は、マグネシウムイオンの影響を受けたり、温度や測定時間によって吸光度が変化するなど測定値の精度に問題がある。
カルシウムイオンによる酵素の活性化を利用した測定方法として、α－アミラーゼやホスホリパーゼＤを用いた方法が開発されているが、これらの方法は、キレート発色剤を使用した方法に比べてその測定コストが高いという問題がある。
また、キレート発色剤としてアルセナゾ－ＩＩＩを使用した測定方法が開発されているが、アルセナゾ－ＩＩＩは構造内にヒ素成分を含むため、人体や環境への影響を考慮する必要があると指摘されている。
そこで、近年、アルセナゾ－ＩＩＩに類似しているが、ヒ素成分を含まないキレート発色剤であり、マグネシウムイオンの影響をほとんど受けない、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定方法が開発されている。
しかしながら、このクロロホスホナゾ－ＩＩＩは弱酸性の反応溶液中でタンパク質成分と非特異的な反応を起こすため、試料中のカルシウム濃度の測定に正誤差を生じることが知られていた。
このため、クロロホスホナゾ－ＩＩＩをキレート発色剤として使用したカルシウム濃度の測定試薬に、バナジン酸イオンを含有させる（特許文献１参照）ことや、アニオン型界面活性剤やポリアミン類等を含有させる（特許文献２参照）ことにより、クロロホスホナゾ－ＩＩＩとタンパク質との非特異的反応を抑制する測定試薬が提案されている。
しかしながら、本発明者は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩをキレート発色剤として使用したカルシウム濃度の測定試薬において、カルシウム濃度に対する直線性が十分でなく、試料中のカルシウム濃度を正確に測定できないという問題があることを確認した。
従って、本発明の課題は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定試薬において、カルシウム濃度に対する直線性を改善することにより、試料中のカルシウム濃度を正確に測定できる方法を提供することである。
本発明者は、上記課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアルカリ金属イオンを含有させることにより、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアルカリ金属イオンを含有させることを特徴とする、カルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（２） アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンである、前記（１）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（３） カルシウム濃度の測定試薬が、更にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、前記（１）又は（２）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（４） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（１）又は（２）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（５） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（３）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（６） クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むカルシウム濃度測定試薬。
（７） アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンである、前記（６）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（８） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（６）又は（７）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（１） クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアルカリ金属イオンを含有させることを特徴とする、カルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（２） アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンである、前記（１）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（３） カルシウム濃度の測定試薬が、更にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、前記（１）又は（２）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
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（５） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（３）に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
（６） クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むカルシウム濃度測定試薬。
（７） アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンである、前記（６）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
（８） アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、前記（６）又は（７）に記載のカルシウム濃度測定試薬。
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度の測定試薬において、カルシウム濃度に対する直線性を改善することにより、試料中のカルシウム濃度を正確に測定することができるものである。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な測定結果（測定値）を提供することができるものである。
そして、これにより、疾患の診断等の場において、誤差を含まない、かつ正確な測定結果（測定値）を提供することができるものである。
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこの実施の形態に限定されるものではない。また、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することができる。
１． クロロホスホナゾ－ＩＩＩ
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、キレート発色剤として、２，７－ビス（４－クロロ－２－ホスホノフェニルアゾ）－１，８－ジヒドロキシ－３，６－ナフタレンジスルホン酸（クロロホスホナゾ－ＩＩＩ）〔ＣＡＳ番号１９１４－９９－４〕を使用する。
なお、クロロホスホナゾ－ＩＩＩは、広く市販されており、市販品をそのまま使用すればよい。
また、本発明において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩの濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１～１．０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１６～０．４０ｍＭの範囲が特に好ましい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、キレート発色剤として、２，７－ビス（４－クロロ－２－ホスホノフェニルアゾ）－１，８－ジヒドロキシ－３，６－ナフタレンジスルホン酸（クロロホスホナゾ－ＩＩＩ）〔ＣＡＳ番号１９１４－９９－４〕を使用する。
なお、クロロホスホナゾ－ＩＩＩは、広く市販されており、市販品をそのまま使用すればよい。
また、本発明において、クロロホスホナゾ－ＩＩＩの濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１～１．０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１６～０．４０ｍＭの範囲が特に好ましい。
２． アルカリ金属イオン
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、測定試薬にアルカリ金属イオンを含有させることにより、カルシウム濃度に対する直線性を改善することができる。
ここで、アルカリ金属イオンについては、カルシウム濃度に対する直線性を改善する作用を有するものであれば特に限定されないが、特に、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンを使用することが好ましい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬では、測定試薬にアルカリ金属イオンを含有させることにより、カルシウム濃度に対する直線性を改善することができる。
ここで、アルカリ金属イオンについては、カルシウム濃度に対する直線性を改善する作用を有するものであれば特に限定されないが、特に、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンを使用することが好ましい。
なお、このアルカリ金属イオンは、１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
また、測定試薬に含有させるアルカリ金属イオンの濃度については、カルシウム濃度に対する直線性を向上させる作用を発揮する濃度であれば特に限定されない。
例えば、アルカリ金属イオンとしてナトリウムイオンを使用する場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、３０～１８０ｍＭの範囲にあればよく、４５～１２０ｍＭの範囲であることが好ましく、６０～１００ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、測定試薬に含有させるアルカリ金属イオンとしてカリウムイオンを使用する場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、１５～１８０ｍＭの範囲にあればよく、３０～１００ｍＭの範囲であることが好ましく、４５～６０ｍＭの範囲が特に好ましい。
更に、測定試薬に含有させるアルカリ金属イオンとしてリチウムイオンを使用する場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、６０～１８０ｍＭの範囲であることが好ましく、１２０～１８０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、測定試薬に含有させるアルカリ金属イオンとしてカリウムイオンを使用する場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、１５～１８０ｍＭの範囲にあればよく、３０～１００ｍＭの範囲であることが好ましく、４５～６０ｍＭの範囲が特に好ましい。
更に、測定試薬に含有させるアルカリ金属イオンとしてリチウムイオンを使用する場合には、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、６０～１８０ｍＭの範囲であることが好ましく、１２０～１８０ｍＭの範囲が特に好ましい。
なお、測定試薬が複数試薬により構成される場合、アルカリ金属イオンは、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中の濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、第１試薬又は第２試薬のいずれに含有させてもよく、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。
３． アミノアルコール及びイミダゾール
本発明のカルシウム濃度測定試薬には、測定試薬にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有させることができる。
ここで、アミノアルコールについては、特に限定されないが、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンを使用することが好ましい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬には、測定試薬にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有させることができる。
ここで、アミノアルコールについては、特に限定されないが、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンを使用することが好ましい。
測定試薬に含有させるアミノアルコール及びイミダゾールの濃度については、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、５０～２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、１００～１５０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、測定試薬が複数試薬により構成される場合、アミノアルコール又はイミダゾールは、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含有する試薬に含有させれば良いが、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含有しない試薬にもアミノアルコール又はイミダゾールを含有させても良い。
４． ｐＨ
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用するため、測定反応液のｐＨは４．０～７．０の範囲にあることが好ましく、４．５～６．０がさらに好ましく、４．８～５．２の範囲が特に好ましい。
なお、測定試薬又は測定反応液を前記のｐＨ範囲に調整する場合は、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、コハク酸、クエン酸、又はグッド緩衝液等を挙げることができる。
また、本発明においては、測定試薬に含有させる、アミノアルコール又はイミダゾールをｐＨの調整に使用することが可能である。
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用するため、測定反応液のｐＨは４．０～７．０の範囲にあることが好ましく、４．５～６．０がさらに好ましく、４．８～５．２の範囲が特に好ましい。
なお、測定試薬又は測定反応液を前記のｐＨ範囲に調整する場合は、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝剤を適宜使用することができる。
このような緩衝剤として使用できるものとしては、例えば、リン酸、コハク酸、クエン酸、又はグッド緩衝液等を挙げることができる。
また、本発明においては、測定試薬に含有させる、アミノアルコール又はイミダゾールをｐＨの調整に使用することが可能である。
５． 試料
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
６． カルシウム濃度測定試薬
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むものである。
本発明のカルシウム濃度測定試薬においては、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール又はイミダゾールの存在下でカルシウムとクロロホスホナゾ－ＩＩＩとを反応させること以外は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いる従来より公知のカルシウム濃度を測定する試薬に従えばよい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むものである。
本発明のカルシウム濃度測定試薬においては、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール又はイミダゾールの存在下でカルシウムとクロロホスホナゾ－ＩＩＩとを反応させること以外は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを用いる従来より公知のカルシウム濃度を測定する試薬に従えばよい。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、一段階のステップにより測定を行う１ステップ法（１試薬法）のものであってもよく、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより測定を行う多ステップ法（多試薬法）のものであってもよく、適宜選択すればよい。
本発明のカルシウム濃度測定試薬において、測定試薬には前記の成分の他に、公知の防腐剤、安定化剤、又は界面活性剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のカルシウム濃度の測定に使用することができる。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、前記した測定試薬以外のその他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の測定対象物質の測定に使用することもできる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、検量（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
前記した測定試薬以外のその他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、検量（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
また、この本発明のカルシウム濃度測定試薬は、第１試薬及び第２試薬、又はその他の試薬等の複数の構成試薬からなる測定試薬キットであってもよい。
７．カルシウム濃度測定の直線性の改善方法
本発明における、カルシウム濃度測定の直線性の改善方法は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用した試料中のカルシウム濃度の測定方法において、アルカリ金属イオンの存在下で測定を行うことによるものである。
また、本発明におけるカルシウム濃度測定の直線性の改善方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
本発明における、カルシウム濃度測定の直線性の改善方法は、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用した試料中のカルシウム濃度の測定方法において、アルカリ金属イオンの存在下で測定を行うことによるものである。
また、本発明におけるカルシウム濃度測定の直線性の改善方法を実施する際の試薬の構成成分や試料や条件等は、前記した通りである。
そして、本発明のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法は、上記の構成により、カルシウム濃度に対する直線性を改善することができ、精度が高いカルシウム濃度の測定値を得ることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕（カルシウム濃度測定試薬におけるアルカリ金属イオンの効果の確認）
各種アルカリ金属イオンをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のカルシウム濃度に対する直線性について、その効果を確認した。
各種アルカリ金属イオンをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のカルシウム濃度に対する直線性について、その効果を確認した。
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、塩化ナトリウム濃度の異なる６種類の第１試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
非イオン性界面活性剤 ０．７６％
トリエタノールアミン １４２．１ｍＭ
塩化ナトリウム ０ｍＭ、２２．８ｍＭ、４５．７ｍＭ、９１．４ｍＭ、１８２．７ｍＭ及び２７４．１ｍＭ
（２） 第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ ０．４９ｍＭ
トリエタノールアミン ６９．０ｍＭ
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、塩化ナトリウム濃度の異なる６種類の第１試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
非イオン性界面活性剤 ０．７６％
トリエタノールアミン １４２．１ｍＭ
塩化ナトリウム ０ｍＭ、２２．８ｍＭ、４５．７ｍＭ、９１．４ｍＭ、１８２．７ｍＭ及び２７４．１ｍＭ
（２） 第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、カルシウム濃度測定試薬の第２試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
クロロホスホナゾ－ＩＩＩ ０．４９ｍＭ
トリエタノールアミン ６９．０ｍＭ
２． 試料
直線性試料として、市販標準液である「カルシウム標準液（Ｃａ：１，０００ｍｇ／ｌ）」（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）を精製水で２．５倍希釈し、カルシウム濃度が４０ｍｇ／ｄＬの試料を調製した。さらに２ｍｇ／ｄＬごとに濃度が低くなるよう計２０試料を調製した。
直線性試料として、市販標準液である「カルシウム標準液（Ｃａ：１，０００ｍｇ／ｌ）」（製造元：富士フィルム和光純薬株式会社）を精製水で２．５倍希釈し、カルシウム濃度が４０ｍｇ／ｄＬの試料を調製した。さらに２ｍｇ／ｄＬごとに濃度が低くなるよう計２０試料を調製した。
３． 試料中のカルシウム濃度の測定
前記２の試料中のカルシウム濃度を、前記１で調製した６種類の測定試薬にて測定した。
カルシウム濃度の測定は、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて行い、試料３．４μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。その後、前記１の（２）で調製した第２試薬７５μＬを添加し、３７℃で５分間反応させ、波長７００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。
なお、上記の試料と６種類の第１試薬と第２試薬とを混合した後の測定反応液（最終反応液）中の塩化ナトリウムの濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭ、又は１８０ｍＭ
前記２の試料中のカルシウム濃度を、前記１で調製した６種類の測定試薬にて測定した。
カルシウム濃度の測定は、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ）にて行い、試料３．４μＬに前記１の（１）で調製した第１試薬１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。その後、前記１の（２）で調製した第２試薬７５μＬを添加し、３７℃で５分間反応させ、波長７００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。
なお、上記の試料と６種類の第１試薬と第２試薬とを混合した後の測定反応液（最終反応液）中の塩化ナトリウムの濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭ、又は１８０ｍＭ
４． 測定結果
前記３の測定結果について、カルシウム濃度１０ｍｇ／ｄＬ付近の試料の測定値をカルシウム濃度で割った計算値を理論値とした。また、塩化ナトリウム濃度ごとに、各試料の測定値を理論値で割った値を縦軸に、カルシウム濃度を横軸にプロットした（図１）。
前記３の測定結果について、カルシウム濃度１０ｍｇ／ｄＬ付近の試料の測定値をカルシウム濃度で割った計算値を理論値とした。また、塩化ナトリウム濃度ごとに、各試料の測定値を理論値で割った値を縦軸に、カルシウム濃度を横軸にプロットした（図１）。
図１から明らかなように、測定試薬に塩化ナトリウム（アルカリ金属イオン）を含有させていない場合は、理論値を大きく外れていることが分かる。
これに対して、測定試薬に塩化ナトリウム（アルカリ金属イオン）を含有させた場合は、測定試薬中の塩化ナトリウム濃度がいずれの場合も、塩化ナトリウムを含有させない場合に比べて、理論値との差が減少し改善されていることが分かる。
すなわち、測定試薬に塩化ナトリウムを存在させることによって、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが分かる。
これに対して、測定試薬に塩化ナトリウム（アルカリ金属イオン）を含有させた場合は、測定試薬中の塩化ナトリウム濃度がいずれの場合も、塩化ナトリウムを含有させない場合に比べて、理論値との差が減少し改善されていることが分かる。
すなわち、測定試薬に塩化ナトリウムを存在させることによって、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが分かる。
このように、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度測定試薬にアルカリ金属イオンを含有させることにより、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが確認された。
〔実施例２〕（カルシウム濃度測定試薬におけるアルカリ金属イオンの効果の確認）
各種アルカリ金属イオンをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のカルシウム濃度に対する直線性について、その効果を確認した。
各種アルカリ金属イオンをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のカルシウム濃度に対する直線性について、その効果を確認した。
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、塩化カリウム濃度の異なる６種類の第１試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
非イオン性界面活性剤 ０．７６％
トリエタノールアミン １４２．１ｍＭ
塩化カリウム ０ｍＭ、２２．８ｍＭ、４５．７ｍＭ、９１．４ｍＭ、１８２．７ｍＭ及び２７４．１ｍＭ
（２） 第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬を、第２試薬として用いた。
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、塩化カリウム濃度の異なる６種類の第１試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
非イオン性界面活性剤 ０．７６％
トリエタノールアミン １４２．１ｍＭ
塩化カリウム ０ｍＭ、２２．８ｍＭ、４５．７ｍＭ、９１．４ｍＭ、１８２．７ｍＭ及び２７４．１ｍＭ
（２） 第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬を、第２試薬として用いた。
２． 試料
前記実施例１の２で調製した２０種類の試料を、試料として用いた。
前記実施例１の２で調製した２０種類の試料を、試料として用いた。
３． 試料中のカルシウム濃度の測定
前記２の試料中のカルシウム濃度を、前記１及び２で調製した測定試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。
なお、試料と６種類の第１試薬と第２試薬とを混合した後の測定反応液中の塩化カリウムの濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭ、又は１８０ｍＭ
前記２の試料中のカルシウム濃度を、前記１及び２で調製した測定試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。
なお、試料と６種類の第１試薬と第２試薬とを混合した後の測定反応液中の塩化カリウムの濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭ、又は１８０ｍＭ
４． 測定結果
前記３の測定結果について、カルシウム濃度１０ｍｇ／ｄＬ付近の試料の測定値をカルシウム濃度で割った計算値を理論値とした。また、塩化カリウム濃度ごとに、各試料の測定値を理論値で割った値を縦軸に、カルシウム濃度を横軸にプロットした（図２）。
前記３の測定結果について、カルシウム濃度１０ｍｇ／ｄＬ付近の試料の測定値をカルシウム濃度で割った計算値を理論値とした。また、塩化カリウム濃度ごとに、各試料の測定値を理論値で割った値を縦軸に、カルシウム濃度を横軸にプロットした（図２）。
図２から明らかなように、測定試薬に塩化カリウム（アルカリ金属イオン）を含有させていない場合は、理論値を大きく外れていることが分かる。
これに対して、第１試薬に塩化カリウム（アルカリ金属イオン）を含有させた場合は、測定試薬中の塩化カリウム濃度がいずれの場合も、塩化カリウムを含有させない場合に比べて、理論値との差が減少し改善されていることが分かる。
すなわち、測定試薬に塩化カリウムを存在させることによって、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが分かる。
これに対して、第１試薬に塩化カリウム（アルカリ金属イオン）を含有させた場合は、測定試薬中の塩化カリウム濃度がいずれの場合も、塩化カリウムを含有させない場合に比べて、理論値との差が減少し改善されていることが分かる。
すなわち、測定試薬に塩化カリウムを存在させることによって、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが分かる。
このように、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度測定試薬にアルカリ金属イオンを含有させることにより、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが確認された。
〔実施例３〕（カルシウム濃度測定試薬におけるアルカリ金属イオンの効果の確認）
各種アルカリ金属イオンをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のカルシウム濃度に対する直線性について、その効果を確認した。
各種アルカリ金属イオンをカルシウム濃度測定試薬に含有させた場合のカルシウム濃度に対する直線性について、その効果を確認した。
１． 測定試薬の調製
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、塩化リチウム濃度の異なる６種類の第１試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
非イオン性界面活性剤 ０．７６％
トリエタノールアミン １４２．１ｍＭ
塩化リチウム ０ｍＭ、２２．８ｍＭ、４５．７ｍＭ、９１．４ｍＭ、１８２．７ｍＭ及び２７４．１ｍＭ
（２） 第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬を、第２試薬として用いた。
（１） 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．０（２０℃）に調整し、塩化リチウム濃度の異なる６種類の第１試薬を調製した。
コハク酸 ５０．８ｍＭ
有機酸 ３８．１ｍＭ
非イオン性界面活性剤 ０．７６％
トリエタノールアミン １４２．１ｍＭ
塩化リチウム ０ｍＭ、２２．８ｍＭ、４５．７ｍＭ、９１．４ｍＭ、１８２．７ｍＭ及び２７４．１ｍＭ
（２） 第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬を、第２試薬として用いた。
２． 試料
前記実施例１の２で調製した２０種類の試料を、試料として用いた。
前記実施例１の２で調製した２０種類の試料を、試料として用いた。
３． 試料中のカルシウム濃度の測定
前記２の試料中のカルシウム濃度を、前記１及び２で調製した測定試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。
なお、試料と６種類の第１試薬と第２試薬とを混合した後の測定反応液中の塩化リチウムの濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭ、又は１８０ｍＭ
前記２の試料中のカルシウム濃度を、前記１及び２で調製した測定試薬にて実施例１の３と同様にして測定を行った。
なお、試料と６種類の第１試薬と第２試薬とを混合した後の測定反応液中の塩化リチウムの濃度は、各々、下記の様になる。
０ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭ、６０ｍＭ、１２０ｍＭ、又は１８０ｍＭ
４． 測定結果
前記３の測定結果について、カルシウム濃度１０ｍｇ／ｄＬ付近の試料の測定値をカルシウム濃度で割った計算値を理論値とした。また、塩化リチウム濃度ごとに、各試料の測定値を理論値で割った値を縦軸に、カルシウム濃度を横軸にプロットした（図３）。
前記３の測定結果について、カルシウム濃度１０ｍｇ／ｄＬ付近の試料の測定値をカルシウム濃度で割った計算値を理論値とした。また、塩化リチウム濃度ごとに、各試料の測定値を理論値で割った値を縦軸に、カルシウム濃度を横軸にプロットした（図３）。
図３から明らかなように、測定試薬に塩化リチウム（アルカリ金属イオン）を含有させていない場合は、理論値を大きく外れていることが分かる。
これに対して、第１試薬に塩化リチウム（アルカリ金属イオン）を含有させた場合は、測定試薬中の塩化リチウム濃度がいずれの場合も、塩化リチウムを含有させない場合に比べて、理論値との差が減少し改善されていることが分かる。
すなわち、測定試薬に塩化リチウムを存在させることによって、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが分かる。
これに対して、第１試薬に塩化リチウム（アルカリ金属イオン）を含有させた場合は、測定試薬中の塩化リチウム濃度がいずれの場合も、塩化リチウムを含有させない場合に比べて、理論値との差が減少し改善されていることが分かる。
すなわち、測定試薬に塩化リチウムを存在させることによって、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが分かる。
このように、クロロホスホナゾ－ＩＩＩを使用したカルシウム濃度測定試薬にアルカリ金属イオンを含有させることにより、カルシウム濃度に対する直線性を改善できることが確認された。
これらのことより、本発明のカルシウム濃度測定試薬による測定では、カルシウム濃度に対する直線性を改善し、正確に試料中のカルシウム濃度の測定を行えることが確かめられた。
Claims (8)
- クロロホスホナゾ－ＩＩＩを含むカルシウム濃度の測定試薬において、測定試薬中にアルカリ金属イオンを含有させることを特徴とする、カルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
- アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンである、請求項１に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
- カルシウム濃度の測定試薬が、更にアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項１又は２に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項３に記載のカルシウム濃度測定の直線性の改善方法。
- クロロホスホナゾ－ＩＩＩ、アルカリ金属イオン、並びにアミノアルコール及びイミダゾールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むカルシウム濃度測定試薬。
- アルカリ金属イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はリチウムイオンである、請求項６に記載のカルシウム濃度測定試薬。
- アミノアルコールが、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、又はＮ－メチル－Ｄ－グルカミンである、請求項６又は７に記載のカルシウム濃度測定試薬。
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