WO2003083133A1

WO2003083133A1 - Methode de detection d'une intolerance legere au glucose ou d'une hyposecretion d'insuline

Info

Publication number: WO2003083133A1
Application number: PCT/JP2003/003771
Authority: WO
Inventors: Masaru Yamakoshi; Takuji Kouzuma
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corporation
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2003-10-09
Also published as: AU2003227237A1; HK1070923A1; ES2302919T3; JPWO2003083133A1; JP4466912B2; JP2010094135A; DE60330411D1; CN1650025A; EP1923469A1; US20050214885A1; ES2333181T3; JP5004367B2; US7452687B2; EP1491636A1; US20090042279A1; CN100526473C; EP1923469B1; EP1491636B1; DE60321151D1; HK1114532A1

Description

明細書軽症耐糖能異常またはィンスリン分泌不全の検出方法

[技術分野]

本発明は、尿などの試料を用いて、軽症耐糖能異常またはインスリン分泌不全を検査する方法に関するものである。また本発明は、これら軽症耐糖能異常、もしくはインスリン分泌不全を経て発症する疾患、例えば糖尿病、動脈硬化、高血圧などの疾患の予知、診断方法、さらにそれら疾患の予防、治療 ·指導の効果判定方法、もしくは治療するための薬剤評価方法に応用することができる。

[背景技術]

糖尿病治療の最終的な目標は、糖尿病合併症の発症予防ならびに進展抑制である。この目標を達成するためには、できるだけ初期の段階で異常を見つけだし治療することが重要であるということが、臨床試験によつて実 Sitされてレヽる [Diabetes Research and Clinical Practice, 28, 103 (1995)など] 。

さらに、糖尿病を発症する以前、つまり、糖尿病予備群、さらに現在は糖尿病予備群ではないが近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常ゃィンスリン分泌不全を見つけだし、治療または運動や食事の指導を行なうことも、さらに進んだ予防的治療法として効果があると考えられる。このことを科学的に実証するための臨床試験が進められている [Diabetes Care, 21, 1720 (1998)など] 。したがって、糖尿病予備群の検出は糖尿病、さらには糖尿病合併症の予防を行う上で重要である。さらに現在は糖尿病予備群ではないが近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常ゃィンスリン分泌不全を診断することが、より早期に糖尿病の予防を行う観点から最も重要であると考えられている。

糖尿病を診断する方法には、例えば経口糖負荷試験があり、 75g経口グルコース負荷試験を行った場合に、空腹時血糖 110mg/dl 未満かつ負荷後 2時間血糖 140mg/dl 未満である群を正常型と判定する。また空腹時血糖 110m_g/dl以上 126mg/dl未満かつ負荷後 2時間血糖 140mg/dl未満である群を空腹時血糖異常上昇（impaired fasting glycemia, IFG) 、空腹時血糖 126mg/cll未満かつ負荷後 2時間血糖 140mg/dl以上 200mgAn 未満である群を耐糖能異常（impaired glucose tolerance, IGT)とし、 I F G + I G T =境界型と判定する。空腹時血糖 126mg/dl 以上または負荷後 2時間血糖 200mg/dl以上である群を糖尿病型と判定する。

また日本糖尿病学会の指針には、空腹時血糖値、負荷後 2時間血糖値だけを用いた判定では正常型であっても、糖負荷後 1時間時の血糖値が 180mg/dl 以上である場合は糖尿病型に移行する率が高いので境界型に準じた扱いとするとある。

耐糖能不良もしくは耐糖能不全とは、食事などによって血中に糖が流入した際に、血中の糖を骨格筋、肝臓、脂肪細胞などの末梢組織に充分取り込むことができずに血糖値が上昇する状態をいい、上昇する程度が健常者と比較すると高いが軽度である場合を軽症耐糖能異常という。

インスリンは、膝臓の i3細胞から分泌されるホルモンであり、骨格筋、肝臓、脂肪組織に作用して、血糖を下げる作用を有する。インスリン分泌不全は食事などによって血中に糖が流入した際に、血中の糠を骨格筋、肝臓、脂肪細胞などの末梢組織に充分取り込むために充分なィンスリンが分泌されない状態をいう。インスリン分泌不全のうち、血中に糖が流入した直後に末梢組織に取り込むために充分なィンスリンが分泌されない状態をィンスリン初期分泌不良という。日本糖尿病学会の指針によれば、インスリン初期分泌不良とは、インスリノジエニック ·ィンデッタス I. I (血糖値の糖負荷後 3 0分値と糖負荷前値の差 ( 3 0 - 0 ) ] に対する血中インスリン値の糖負荷後 3 0分値と糖負荷前値の差 [△ I R I ( 3 0— 0 ) ] 、すなわち、 △ I R I ( 3 0 - 0 ) /Δ Ρ G ( 3 0 - 0 ) が 0 . 4未満の状態をいう。

しかしこれらの診断のための血糖値ゃィンスリンの測定法は、いずれも短時間に複数回の採血が必要な侵襲的な方法であり、被験者に多大な苦痛を与える。従ってこれらの欠点を解消する簡便なより侵襲性の少ない検査方法、好ましくは非侵襲的な検査方法が望まれている。

一方、生体試料中のミオイノシトールを定量することは、糖尿病の診断に有用であると考えられており、以下のような例が報告されている。

( a )尿中ミオイノシトール濃度は糖尿病で増加する〔Larner J. et al. , New Eng. J. Med. , 323， 373-378 (1990)〕。

( b ) 尿中ミオイノシトール量は正常型、境界型において差がない。

[Susumu Suzuki, Diabetes Care, Vol. 17, Nol2 (1994) 1465-1468] 。 ( c ) 糖負荷後の尿中ミオイノシトールが正常型に比べて境界型（ I F G、 I G T ) 、糖尿病型で増加している（特開 2001- 190299号）。

上記（a ) 、 ( b ) は尿中のミオイノシトールを GC/MS法によって測定した結果であるが、測定者により結果が異なっているためデータの再現性、信頼性に問題がある。また一方（c ) では酵素を用いた高感度なミオイノシトール測定試薬により尿中のミオイノシトールを測定した結果であり、 GC/MS 法と比べより正確で信頼のある結果が得られた。これにより糖尿病予備群の検出が可能となった。

しかしこの（ c )のミオイノシトール測定試薬は、①測定範囲が狭く、尿中の様々な濃度のミオイノシトールを測定するには試料を希釈しなければならず、よって最小検出感度が充分でなかったこと、 ②尿中の共存物質、特にグルコースの影響回避が充分でないなどの課題が残されており、正常型に含まれている軽症耐糖能異常ゃィンスリン分泌不全の検出は不可能であった。

さらに、 75g 経口糖負荷前おょぴ糖負荷後 2時間時の血糖値だけを用いて正常型と判定された場合には、 0〜 2時間までの血糖推移の状態は反映されておらず、例えば実は糖負荷直後から血糖推移が高く維持されている近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い群（軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全）でも正常型に分類されてしまう。ここで軽症耐糖能異常とは正常型に分類されるが、空腹時、負荷後 3 0分、 1時間、 2時間に採血を 4回実施する負荷試験を行うと、 ①負荷後 3 0 分、 1時間の血糖値が非常に高い（180mg/dL以上）急峻高血糖や、 ②負荷後 2時間時の血糖が 1 4 0 mg/dL未満ではあるが健常者より高い（例えば 120mg/dL以上）、 ③ 75g経口糖負荷直前、糖負荷後 30分、 60分、 120分の血糖値の総和である∑ P Gが高い（例えば 530mg/dL以上）などの特徴を有する、軽度に耐糖能が低下したものを指す。そのため上記 ( a ) 〜（c ) の公知の事実からは、ミオイノシトールを調べることにより近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い群、例えば、軽症耐糖能異常の判別が可能であるとは予測できない。

このように、従来技術では、糖負荷直後から血糖推移が高く維持されている近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐糖能異常ゃィンスリン分泌不全を検出する方法は見出されていなかった。

[発明の開示]

本発明の課題は、軽症耐糖能異常おょぴ Zまたはィンスリン分泌不全を簡便かつ再現性良く判定する検查方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を達成するために、軽症耐糖能異常および Z またはインスリン分泌不全を有効に判定する何らかのマーカーを探すことが有効であると考えた。そこで本発明者らは鋭意検討の結果、従来インスリン抵抗性や糖尿病予備群（境界型や糖尿病型）の検出に有用と考えられていたミオイノシトールが意外にも、軽症耐糖能異常、インスリン分泌不全を有効に判定するマーカーとしても有用であることを見出した。

試料としては、人体から分離された血清または血漿、尿、あるいは、ホモジネィトした生体組織抽出物等が用いられるが、非侵襲で得られる尿が好ましい。

本発明者らは、精度が高く、簡便かつ安価なミオイノシトールの定量方法を提供することを目的としてミオイノシトールの高感度定量法おょぴ定量用組成物（特公平 6-61278 号）の開発を行ってきた。この前処理不要な酵素法によって、初めてミオイノシトールについて信頼できるデータの取得が可能になった。本発明の軽症耐糖能異常および/またはインスリン分泌不全の検査方法は、このようなミオイノシトールの高感度定量法およぴ定量用組成物の開発があって、初めて成功したものである。

さらに、被験者に一定量の糖を投与した後、一定時間の間に被験者から非侵襲的に採取した尿中のミオイノシトール濃度を上記のミオイノシトール測定試薬にて定量したところ、糖尿病予備群（境界型、 I F G、 I G T ) 、糖尿病型のみならず、'正常型に分類されてはいるが実は軽症耐糖能異常であるものや、正常型に分類されてはいるが実はィンスリンの初期分泌の低下した者においても、あらかじめ健常者にて設定した特徴的な値よりも高いことが明らかとなり、本測定試薬により、正常型と耐糖能異常の進んだ非正常型（境界型、 I F G、 I G T、糖尿病）の判別のみならず、正常型に分類されてはいるが実は軽症耐糖能異常である者や、正常型に分類されてはいるが実はィンスリンの初期分泌の低下した者を健常者と簡便かつ再現性良く高率に判別できることを見出した。また試料中のミオイノシトールは微量であり、用いるミオイノシトールデヒドロゲナーゼによってはグルコースにも弱い作用を示すことから、予めグルコースを消去する必要がある場合がある。グルコースを消去する方法としては、ミオイノシトールの極端な化学的安定性を利用する方法や、酵素を触媒としてグルコースを修飾する方法がある。化学的安定性を利用する方法としては、 6N塩酸存在下に加熱し、ミオイノシトール以外の糖類を酸分解し分解生成物中に残存しているミオイノシトールを回収する方法や、水素化ホウ酸ナトリゥムの様な還元剤で処理し, ミオイノシトール以外のグルコースなどのカルボニル基またはホルミル基を有する糖類を還元し、ミオイノシトール定量用酵素であるミオイノシトールデヒドロゲナーゼと反応し得ない化合物に修飾する方法などがある。酵素を触媒としてグルコースを修飾する方法としては、試料中のグノレコースをグルコースォキシダーゼ（EC1, 1， 3， 4)にてダルコン酸に変換する方法や、試料中のグルコースをへキソキナーゼ（EC2, 7, 1， 1) にてグルコース一 6—リン酸に変換する方法などがある。

これらの変換方法において種々の改良が知られている。グルコースォキシダーゼによってグルコースをダルコン酸に変換する方法においては、グルコースォキシダーゼを作用させた後、カタラーゼを作用させ生成する過酸化水素を消去する方法（特開昭 6 3— 1 8 5 3 9 7号公報）などが知られている。

またへキソキナーゼによってグレコースをグ /レコース一 6—リン酸に変換する方法においては、ホスホへキソースィソメラーゼおよび⁶—ホスホフルクトキナーゼを作用させ、グルコースをフルクトース一 1， 6 —ニリン酸に変換させることにより、グルコース一 6—リン酸が平衡反応によりグルコースに再変換されるのを防ぐ方法（特開平 5— 7 6 3 9 7号）、酸化型補酵素存在下にグルコース一 6—リン酸デヒドロゲナーゼを作用させる方法（特開平 1一 3 2 0 9 9 8号公報、特開平 3— 2 7 2 9 9号）、アデノシン二リン酸存在下にピルビン酸キナーゼを作用させ、グルコース消去時に減少するアデノシン三リン酸の濃度変化を防止し、アデノシン三リン酸濃度を一定に保つ方法（特開平 2— 1 0 4 2 9 8号公報）などが知られている。

しかしながらへキソキナーゼを用いてグルコースを消去する場合には. 酵素反応によって A D Pが反応液中に大量に生成するため、酵素反応に及ぼす影響は無視できないものとなる。そのため生成した A D Pを反応に影響を及ぼさないものに変換することが好ましい。

そこで本発明者らは、酵素反応によって反応液中に生成する A D Pを反応に影響を及ぼさないものに変換する方法として A D P消去剤を用いる方法が有効であると考えた。

A D P消去剤としては A D Pを反応に影響を及ぼさないものに変換できればいかなるものでも構わないが、酵素が好ましく、 A D Pを AM P に変換する反応を触媒するキナーゼがより好ましい。キナーゼはホスホキナーゼ、ホスホトランスフェラーゼとも呼ばれ、 ADPを AMPに変換する反応を触媒するキナーゼとしては、ピロフォスフェート一グリセロー/レトランスフェラーゼ、 6—ホスホフノレクトキナーゼ、アセテートキナーゼ、 AD P—へキソキ^ "一ゼなどが知られている。

本発明者らは鋭意検討の結果、本発明の AD P消去剤として用いるキナーゼとしては、 6—ホスホフルクトキナーゼゃ AD P—へキソキナーゼが好ましいことを見いだした。

AD P消去剤として 6—ホスホフルクトキナーゼを用いた場合には、試料中のグルコース消去反応において、 AT P存在下に AT P—へキソキナーゼの作用でグルコースをグルコース一 6—リン酸に変換する際に生成する AD Pを、 6—ホスホフルクトキナーゼを同時に作用させることで、あらかじめ添加してあるフルクトース一 6—リン酸をフルクトースー 1、 6— 2リン酸に変換するとともに AD Pを AMPに変換することができる。

AD P消去剤として AD P—へキソキ ^ "一ゼを用いた場合には、試料中のグルコース消去反応において、 AT P存在下に AT P一へキソキナーゼの作用でグルコースをグルコース一 6—リン酸に変換する際に生成する AD Pを AMPに変換することができる。

また反応の際、塩類を共存させるのが好ましく、塩類としては塩化マグネシゥム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カリウム、硫酸力リゥム等の力リゥム塩等が挙げられる。これらの塩は 1〜100 mM程度用いるのが好ましいが、特に限定はされない。

これら酵素により修飾されて生じた化合物は、いずれもミオイノシトール定量用酵素であるミオイノシトールデヒドロゲナーゼが作用しない化合物である。本発明者らは、このような方法によって、予めダルコースを消去することが、より好ましいことを見出した。

さらに、本発明者らは、糖消去反応に関して、 ATP—へキソキナーゼおよび A D P—へキソキナーゼの 2種類のキナーゼを同時に用いた場合に試料中の糖の影響が小さくなり、より正確にミオイノシトールを測定できることを見出した。またチォ NAD濃度を終濃度で O. lmM以上、好ましくは 2〜： !OmMにすることによりミオイノシトールの測定範囲を既法の 1 0倍程度まで広げられることを見出し、より高感度な測定系を完成することができた。

特徴的な値とは、正常型からさらに選別した健常者の尿中ミオイノシ卜ールの平均値、標準偏差や R O C (Response operating characteri st i c)曲線をもとに設定した値であり、試料が尿である場合は糖負荷前および糖負荷一定時間後に尿中に排泄されるミオイノシトールの量の増カロ量として 0〜20 g/mg · クレアチュン、もしくは 5〜15 /1 g/mg · クレァチニン、好ましくは 8〜12 / g/mg · クレアチュンである。また今後大規模試験を行って、臨床的に確定した健常者を判断したときにはこの特徴的な値は変わることもあり得る。また特徴的な値については、例えば人種、性別、年齢など母集団の選択によって変わることもあり得る。

[図面の簡単な説明]

図 1は、参考例 1に基づくチォ NAD量の検討結果を示す。

図 2は、参考例 2に基づくミオイノシトール試薬の安定性試験の結果を示す。

図 3は、参考例 3に基づく ADP—へキソキナーゼの影響を示す。

図 4は、参考例 4に基づくミオイノシトール定量曲線を示す。

図 5は、実施例 1に基づくミオイノシトールと∑ P Gの関連図である _c 図 6は、実施例 2に基づくィノシトールとインスリノジエニック 'ィンデッタスの関連図である。

図 7は、実施例 3に基づく各群と∑ P Gの関連図である。

図 8は、実施例 4に基づく各群とインスリノジエニック ' インデックスの関連図である。

図 9は、実施例 5に基づく各群とミオイノシトールとの関連図である c 図 1 0は、実施例 6に基づく各群とミオイノシトールとの関連図である。

図 1 1は、実施例 7に基づく糖負荷試験における尿中ミオイノシトールと食事における尿中ミオイノシトールの相関図である。

図 1 2は、実施例 8に基づく各群の糖負荷試験における△ミオイノシトールと食事における△ミオイノシトールの関連図である。

図 1 3は、実施例 9に基づく尿糖陰性者での食事における尿中ミオイノシトールと軽症耐糖能異常との関連図である。

[発明を実施するための最良の形態]

以下、本発明およびその好ましい形態について更に詳しく説明する。本発明における軽症耐糖能異常、インスリン分泌不全の検出は、被験者への糖負荷前および糖負荷一定時間後に尿中に排泄されるミオイノシトールの量を本試薬にて測定し、前後のミオイノシトールの増加量、または増加率をあらかじめ健常者にて設定した特徴的な値と比較して行う。

増加量は糖負荷一定時間後のミオイノシトール量と糖負荷前のミォイノシトール量の差として算出され、増加率は糖負荷一定時間後のミオイノシトール量と糖負荷前のミオイノシトール量の比として算出される。

ミオイノシトールの濃度は、実測値または飲水などによる尿の希釈の影響を補正するための適当な標準となる指標に対する相対値が使用されても構わない。指標としてはそれぞれの尿におけるクレアチニン値が好ましい。測定の対象は糖尿病などの生活習慣病の疑いがあるものだけではなく、全てのものが対象となりうる。 '

糖負荷の量および糖負荷の方法は、いかなる量、いかなる方法でも構わないが、通常の糖負荷試験に用いられている 75gグルコースの水溶液を経口投与する方法または食事が好ましい。

尿を採取する時間は、糖負荷前おょぴ糖負荷直後から 6時間後までのいずれの時期であっても構わず、 3 0分から 3時間までが好ましい。蓄尿期間は 3 0分から 3時間までの間で適宜選択される。

試料として尿を用いる場合には非侵襲の方法であるので、サンプル採取の方法、時間、場所を選ばずに済む。例えば自宅、職場、学校などにおいて自分で簡単にサンプルを作ることができ、採取した尿を直接、または濾紙などにしみ込ませて輸送することも可能であるため、医療機関などで拘束される必要もない。尿を濾紙などにしみ込ませた場合には、送付されたサンプルを適当な方法で抽出し、本発明を用いて簡便、短時間に測定し、結果を被験者に直ちに返すことができる画期的な方法を提供できる。

特に糖負荷を行わず普段通りに生活しながら随時尿中のミオイノシトールをモニタリングし、例えば 1 日のなかの最高ミオイノシトール量- または最高ミオイノシトール量と最低ミオィノシトール量の差で耐糖能異常の程度、インスリン分泌不全の程度を把握することも可能である _c また随時尿中のミオィノシトールをモニタリングすることで、食事内容の見直しや、運動量の調整を行い普段通りに生活しながら糖尿病の予防や進行防止をサポートすることも可能である。

尿中ミオイノシトールをモニタリングする方法としては、ミオイノシトールが検出できればいかなる方法でも構わないが、例えばミオイノシトールに作用する酵素を試験紙に固定する試験紙法や、ミオイノシトールに作用する酵素を電極に固定化してセンサーとし電気化学的に検出する方法が挙げられる。

試験紙法では、例えばォキシダーゼにより生じた過酸化水素にペルォキシダーゼを作用させ活性酸素を発生せしめ、これが色原体を酸化し呈色される度合いを観察すればよい。色原体としてはヨウ化カリウム、テトラメチルベンチジン、 N- (3-スルホプロピル）- 3, 3'， 5, 5' -テトラメチルベンチジンナトリウム、 4-アミノアンチピリン、 0-トリジンなどが挙げられるがこれに限定されるものではない。

またセンサーで検出する場合、例えばォキシダーゼを用いる場合には生じた過酸化水素を直接電極にて測定するか、もしくはフエ口セン誘導体やキノン誘導体などの電子伝達体を介在させ、得られる酸化還元電流あるいはその電気量を測定すれば良く、デヒドロゲナーゼを用いる場合にも同様に、還元型補酵素を直接電極測定するか、電子伝達体を介在させ、得られる酸化還元電流あるいはその電気量を測定すれば良い。例えば「バイオセンサおよびそれを用いた基質の定量法（特願平 9-263492) 」などの例が挙げられる。

また例えばトイレ便器などに直接、あるいは併設したデバイス内に上記センサーを組み込むことで、日常の尿中ミオイノシトールのモニタリングをより簡便にすることもできる。さらにデバイスに測定結果を記憶する機能、情報端末などへの接続機能を持たせることにより、例え被験者が遠隔地に住むような場合でも、電子媒体を用いて医師や医療機関との連携のもとに生活データを管理 '指導し、耐糖能異常の程度、インスリン分泌不全の程度を把握し、食事内容の見直しや、運動量の調整、生活習慣の改善、治療を行うことも可能である。

また試料中のミオイノシトールと併せて試料中のグルコースを定量し、軽症耐糖能異常および/またはィンスリン分泌不全を検出する場合、ミオイノシトールの定量は本発明で述べた方法が好ましいが、ダルコ一スの定量は公知のいかなる方法を用いても構わない。

また測定した結果に医師の診断を添付すればより精密な管理ができる。さらに従来のマーカーでは判別し得ない糖尿病を発症する以前、つまり、糖尿病予備群、さらに現在は糖尿病予備群ではないが近い将来糖尿病もしくは予備群に移行する確率の高い軽症耐耱能異常ゃィンスリン分泌不全を見つけだすことで糖尿病に移行するリスクがわかるので、例えば生命保険等の審查項目として使用することもできる。

試料中のミオイノシトールを定量するには、ミオイノシトール定量用組成物に試料 1〜500 L を加え、 37°Cの温度にて反応させ、反応開始後の一定時間後の 2点間の数分ないし数十分間、例えば 3分後と 4分後の 1分間、または 3分と 8分後の 5分間において変化した補酵素の量を直接または間接的に測定すれば良い。この場合既知濃度のミオイノシトールを用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば試料中のミォイノシトール量を求めることができる。

定量用組成物（試薬）は、少なくともミオイノシトールに作用する酵素を含むことが必要であるが、さらに、補酵素を含むものが好ましい。また本試薬にはポリオキシエチレンォクチルフエニルエーテル

(OP-10)などの界面活性剤を適宜添加しても構わない。

また本試薬は液状品、凍結乾燥品、凍結品の形で用いられる。

試料中のミオイノシトールを定量するには酵素を用いミオイノシトールを定量できる方法であればいずれの方法を用いても良い。本発明に使用しうるミオイノシトールを定量できる酵素としては、少なくともミオイノシトールに作用する酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼが好ましく、フラボパクテリウム . エスピー（Flavobacterium sp. ) 671 (FERM BP- 7323、以下 F. sp. 671 と略す）由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼが最も好ましい。また用いるミオイノシトールデヒドロゲナーゼは試薬中に含まれるチォ NADや NADHなどの補酵素に悪影響を与える、例えば NADH才キシダーゼのような補酵素分解活性を持つ物質などのコンタミネーシヨンをできる限り軽減、もしくはなくしたものが好ましい。

なお、 F. sp. 671株は日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に、受託番号 FERM BP- 7323 (寄託日平成 12年 10月 12 日）として国際寄託されている。

検出方法としてはミオイノシトールが検出できればいかなる方法でも構わないが、例えばチォ NAD を用いた黄色発色、 NBT (ニトロブルーテトラゾリゥム）を用いた青色発色、あるいは INT (2- (4- lodophenyl) - 3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium chloride)を用レヽた赤色発色に代表される可視光発色試薬を用いる方法、発光法や蛍光法を用いる方法、電気的変化を捉える方法、およびこれらを増幅する方法を組み合わせる方法が挙げられる。

また上記の方法を利用できるコンパクトなデバイスを用いることで時間や場所の制限を受けずに非侵襲的に尿中ミオイノシトールを測定することも可能である。

ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの活性測定法は以下のとおりでめ。

(1) 活性測定法

<反応液組成 >

lOOmM トリス緩衝液（pH8. 5)

20mM ミオイノシトール (シグマ社製)

2mM ニコチンァミドアデニンジヌクレオチド（NAD) (オリエンタル酵母社製）

5U/ml ジァフオラーゼ（旭化成社製）

0. 025 % ニトロブルーテトラゾリゥム（NBT ；和光純薬社製）

1. 5 % トリトン（Triton) - X100 (和光純薬社製）

上記反応液 1ml を小試験管に入れ、 37°Cで 5 分間インキュベート後に、 B倍に希釈した酵素液 20 μ 1 を添加して攪拌し、反応を開始する。正確に 5分間の反応後に 0. 1NHC1 2ml を添加して攪拌し反応を停止する _c

550nm における吸光度を測定し、 A1を求め、また上記反応液よりミオイノシトールを除いた反応液を用いて同様の測定を行いその吸光度 AO を求める。酵素活性は下記の式より算出する。

( A A O ) 3 . 0 2

m I = X X B

8 . 3 5 0 . 0 2— 式中の数値は、次の意味である。

18. 3 ； NTB の分子吸光係数

5 ；反応時間

3. 02；総反応液量 0. 02 ; 酵素液量

B ；酵素液の希釈倍率

F. sp. 671 株由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼの性状は以下の通りである。

(2) 酵素作用

少なくともミオイノシトールおょぴ補酵素の存在下、ィノソース及び還元型補酵素を生成する。上記の補酵素に関しては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下 NAD 類と略する）、例えば、ニコチンァミドアデニンジヌクレオチド（NAD) 、ァセチルビリジンアデニンジヌクレオチド (ァセチル NAD) 、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレォチド（デァミノ NAD) 、ピリジンアルデヒドアデニンジヌクレオチド (アルデヒド NAD) 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（N ADP)、チォニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チォ NAD)、チォニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チォ NADP)が挙げられる。各補酵素を用いた場合の相対活性比（NAD を捕酵素として用いた場合を 100%とする）は表 1に示すとおりである。また相対活性は下記の方法に基づき捕酵素を変えて測定を行った。

相対活性測定法

<反応液組成 >

緩衝液 lOOmM グリシン緩衝液（ρΗΙΟ. 0)

基質 20mM ミオイノシトール（シグマ社製）

補酵素 2mM

(NAD, チォ MD、 NADP, チォ NADP；以上オリエンタル酵母社製）。上記の反応液 1ml を石英セ^にとり、 37°C に温度コントロールされている分光光度計にセットする。 5分以上インキュベートし、約 1. 0U/ ml の酵素溶液を 20 /x l を添加、攪拌する。それぞれの還元型捕酵素に特有な波長の 1分間当たりの吸光度変化より初速度を求める。各補酵素で求めた初速度を、 NAD を補酵素として用いた場合の初速度（100% ) と対比して、相対活性とした。表 1

各補酵素を用いた場合の相対活性比

(3) 基質特異性

前記の相対活性測定法に従い、反応液中の基質に変えて同一濃度の D - カイロイノシトール、 D-マンノース、 D-フルクトース、 D-ガラクトース、マン-トール、ェピイノシトール、サイロイノシトールを測定した。ミオイノシトールに対する反応初速度を 100 とした場合の各基質における酵素活性を表 2 に示す。 F. sp. 671 株由来の酵素はミオイノシトールに特異性が高いデヒドロゲナーゼであることが明らかである。

基質としては、 D -マンノース、 D-フルクトース、 D-ガラクトース、マンニトール、 D-カイロイノシトール (以上、和光純薬社製) 、ミオイノシトール、ェピィノシトール、サイロイノシトール（以上、シグマ社製）を用いた。表 2

基質特異性

菌株名

補酵素 NAD

ミオイノシ! ^一ル 1 00 %

カイロイノシ 1■«—ル 1 8 %

サイロイノシ! ^一ル 1 %未満

ェピイノシトール 2 %

ガラクトース 1 %未満

フルクト一ス 1 %未満

マンノース 1 %未満

マンニトール 0 % (4) 至適 pH

前記の相対活性測定法を用い、反応液中の lOOmM の ρΗΙΟ. Οグリシン緩衝液にかえて lOOmM トリス緩衝液（pH7. 0〜9. 0)及ぴ lOOmM グリシン緩衝液（PH9. 0〜： L1. 0)の各緩衝液を用いて測定した。測定の結果、至適 p Hは、 11. 0付近（基質；ミオイノシトール）であることが分かった。

(5) 分子量

TSK ゲル G300SW (0. 75 φ X 600mm) 、溶離液； 50mMリン酸緩衝液（pH 7. 5) + 0. 2MNa2S04 + 0. 05%NaN3 分子量マーカーはオリエンタル酵母社製（日本）を使用した。クロマトグラフィー装置は島津社製装置（日本）を使用し、 UV280nm 及びフラクションの活性測定にて検出した。活性測定はミオイノシトールを基質として用いた。 40000± 10000であることが分かった。

(6) 熱安定性

40°C、 15分の処理でほぼ 100%の残存活性を有する。

酵素液、約 5U/ml に 15分間の加熱処理を行った。残存活性は前記の酵素活性測定法にて測定した。活性測定はミオイノシトールを基質として用いた。

(7) Km値

前記の相対活性測定法を用い、ミオイノシトールの濃度及び、 NAD及ぴチォ NAD の濃度を変化させそれぞれの Km値を測定した。なお、前記活性測定法を用いて基質濃度を変化させ Km値を算出した。

基質に対する Km値

ミオイノシトール： 1. 7 ± 0. 2mM

補酵素に対する Km値

NAD ： 0. 04 ± 0. OlmM

チォ NAD ： 4. 5 ± lmM

またミオイノシトールを定量するにあたり、さらに高感度が必要な場合には酵素サイクリング法を用いることができる。下式にその 1例を示す。 A A 2 イノシトール生成物

B 2 B 1

式中、 A1は NAD (P)類、またはチォ NAD (P)類を示し、 A2は A1の還元型を示し、 B1 は A1 がチォ NAD (P)類の場合には還元型 NAD (P)類を、 A1 が NAD (P)類の場合には還元型チォ NAD (P)類を示し、 B2は B1の酸化型生成物を示す。なお、ここで、 NAD (P)は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよぴニコチンァミドアデニンジヌクレオチドリン酸のことを表す。

酵素サイクリングを用いたミオイノシトール定量反応の液組成については、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの各種捕酵素間の Km値等を考慮して補酵素を 2種類またはそれ以上適宜選択し、その後正反応/ 逆反応の至適 pHの間で pH条件を酵素的サイクリングが効率よく進行するように設定すればよレ、。 Al、 B1 の量は試料中のミオイノシトール量に比較して過剰量であり、またミオイノシトールデヒドロゲナーゼの A 1、 B1に対する Km値に比較しても過剰量であることが必要である。例えば F. sp. 671 由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼについてみれば、 Km値は NAD、チォ NADについてそれぞれ 0. 04mM、 4. 5mMであり、サイタリング反応を行う場合にはチォ NAD、NADHを捕酵素として選択し、サイクリング反応を行うと良い。 A1および B1の濃度は 0. 02mM〜2M、特に 0. 05〜； LOOmMが好ましく、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの量は l〜1000U/mL、特に 1〜： !OOU/mLが好ましいが、その量は被検体の種類や量おょぴ測定したい試料中のミオイノシトール量などにより適宜選択することができ、これ以外の量を用いることもできる。

試料中に存在する糖を消去する酵素としてへキソキナーゼを用いる場合、グルコースからグルコース一 6—リン酸への反応を触媒すればいかなるへキソキナーゼを用いても良いが、例えば Baci llus sp.由来のへキソキナーゼが挙げられる。好ましいへキソキナーゼとしては熱安定性に優れたへキソキナーゼが良い。熱安定性に優れたへキソキナーゼは「安定なへキソキナーゼおよびその製造法（特開 2000-078982) 」に記載の方法により取得することができる。

さらに本発明者らはグルコース一 6—リン酸と同時に生成される ADP により、本酵素サイクリング法は若干の反応阻害を受けるため、次式のように ADP依存性へキソキナーゼをへキソキナーゼと同時に作用させることでミオイノシトールデヒドロゲナーゼの反応に影響を及ぼさずに、グルコース消去能を大幅に向上させることに成功した。

Glc + ATP + Mg2+ → G-6-P + ADP

Glc + ADP + Mg2+ → G-6-P + AMP

ATP：アデノシン 5' -三リン酸、 ADP：アデノシン 5，-ニリン酸、 AMP：ァデノシン 5' -一リン酸

へキソキナーゼの活性測定法は以下の通りである。

<反応液組成〉

50mM トリス緩衝液（ρΗδ. ⁵) (シグマ社製）

20mM グルコース（和光純薬社製）

4mM ATP (オリエンタル酵母社製）

5U/mL グルコース— 6—リン酸デヒドロゲナーゼ（東洋紡社製） ImM NADP (オリエンタル酵母社製）

10mM 塩化マグネシウム（和光純薬社製）

酵素溶解希釈用液 50mM トリス緩衝液（pH8. 5)

上記反応液 lmLを光路長 1cmのセルに入れ、 37°Cで 5分間ィンキュベート後に、 B倍に希釈した酵素液 20 Lを添加して攪拌し、反応を開始する。反応開始後、 340nm における吸光度を測定して直線的に反応している 1分間当たりの吸光度変化 A1 を求める。盲検は酵素液の代わりに酵素溶解希釈用液 50 を加え同様の反応を行い 1分間当たりの吸光度変化 AOを求める。酵素活性は下記の式より算出する。 (A A 0 ) 1. 02

UZm I = X X B

6. 22 0. 02 式中の数値は、次の意味である。

6.22 ； NADPHの 340nmにおけるミリモル分子吸光係数

1.02 ；反応総液量（mL)

0.02 ；反応に供した酵素試料液量（mL)

B ；酵素液の希釈倍率

ADP依存性へキソキナーゼの活性測定法は以下のとおりである。

<反応液組成 >

50mM トリス緩衝液（pH7.5)

20mM グルコース溶液（和光純薬工業社製）

2mM ADP溶液（pH7.0) (オリエンタル酵母社製）

5U/mL グルコース一 6—リン酸デヒドロゲナーゼ（旭化成社製） ImM NADP溶液（オリエンタル酵母社製）

2mM 塩化マグネシウム溶液（和光純薬工業社製）

酵素溶解希釈用液 lOmM トリス緩衝液（_PH7.5)

上記反応液 3mLを小試験管に入れ、 37°Cで 5分間ィンキュベート後に、 B倍に希釈した酵素液 50/xLを添加して攪拌し、反応を開始する。反応開始後、 340nmにおける吸光度を測定して直線的に反応している 1分間当たりの吸光度変化 A1 を求める。盲検は酵素液の代わりに酵素溶解希釈用液 50 Lを加え同様の反応を行い 1分間当たりの吸光度変化 AOを求める。酵素活性は下記の式より算出する。 , (A 1 - A O) 3.05 ―

U/m I = ~― X — - ~—Γ- X B

6. 22 0. 05 式中の数値は、次の意味である。

6.22 ； NADPHの 340nmにおけるミリモル分子吸光係数 3. 05 ；反応総液量（mL)

0. 05 ；反応に供した酵素試料液量（mL)

B ；酵素液の希釈倍率

へキソキナーゼの量は l〜1000u/mL、特に l〜100u/mLが好ましく、 A DP依存性へキソキナーゼの量は l〜1000u/mL、特に l〜100u/mLが好ましいが、その量は被検体の種類や量などにより適宜選択することができ、これ以外の量を用いることもできる。

また幅広い濃度範囲の尿中ミオイノシトールを再現性良く測定するためには効率良く酵素サイクリング反応を行わせる必要がある。本発明者らは、酵素サイクリング反応に用いる 2種類の補酵素であるチォ NAD、 NADHの濃度、比率を鋭意検討した結果、チォ NAD濃度は終濃度で 0. 01m M以上に、特に 2〜10mMに、 NADH/チォ NAD比は 0. 01〜0. 5、特に 0. 01 〜0. 1 にすることが好ましいことが分かった。しかし、その量は被検体の種類や量などにより適宜選択することができ、これ以外の量を用いることもできる。

[実施例]

本発明の実施例およぴ参考例を詳細に述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。

参考例 1 (チォ NAD量の検討)

1 ) B ,¾;

< R - 1 >

5mM MES (2-Morpholinoethanesulf onic acid) (pH 6. 0) 0〜40mM チォ NAD (オリエンタル酵母社製）

< R— 2 ；ミオイノシトール定量試薬 >

200mM Bicine (pH 9. 0)

0. 3mM NADH (オリエンタル酵母社製）

25u/mLミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）

2 ) 方法測定装置は自動分析装置 7 1 7 0 S (日立化成）を用いた。あらかじめ調製した 0〜3000μΜミオイノシトール溶液 3 X Lに R— 1試薬 180/zL を添加し 37°C4.8分間の反応後、 R— 2試薬 180//Lを加え反応を開始した。反応開始後 5.4分と 7.8分の 405nmにおける吸光度を読みとりその差をとり、 1分間当たりの吸光度増加速度（AmABS/min) を求め、標準液に対する感度を調べた。

3) 結果

結果を図 1に示す。図 1に示すように終濃度 0.1〜： !OmMのいずれのチォ NAD濃度においてもミオイノシトール 0〜3000_μΜで検量線の直線性が認められた。またミオィノシトールの検出感度を上げるためには終濃度 2〜： !OmMのチォ NAD濃度が好ましいことが分かった。

参考例 2 (ミオイノシトール定量試薬のバッファ一種の検討）

1 ) 試薬

< R- 1 >

5mM MES (pH 6.0)

5mM チォ NAD (オリエンタル酵母社製）

<R— 2 ；ミオイノシトール定量試薬 >

lOOmM Buffer (pH 8.8)

0.5mM NADH (オリエンタル酵母社製）

lOu/mLミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）

2) 方法

R- 2 ；ミオイノシトール定量試薬の Bufferの種類として、 Tris((T ris (hydroxymethyi; aminomethane)、 Tricine (N-Tris (hydroxymethyl) - m ethylglycine)、 Bicine (N, N- Bis (hydroxyethyl) glycine)、 TAPS (N-Tris

(hydroxymethyl) methyl-3-aminopropanesulf onic acid)、 TEA (Triethan olamine)、 CHES (2- (Cyclohexylamino) ethanesulf onic acid) AMPS0(3 -

( (1, 1 - Dimethyl - 2 - hydroxy - ethyl) amino) -2-hydroxypropane sulfonic acid)を選択し、上記の組成で各 R— 2試薬を調製した。測定装置は自動分析装置 7 1 7 0 S (日立化成）を用いた。あらかじめ調製した標準液 100 μΜミオイノシトール溶液 15;xLに R_ 1試薬 180 /xLを添加し 3 7°C4.8分間の反応後、 R— 2試薬 60 / Lを加え反応を開始した。反応開始後 5.4分と 7.8分の 405nmにおける吸光度を読みとりその差をとり、

1分間当たりの吸光度増加速度（AmABS/min) を求め、標準液に対する感度を調べた。加速試験として R— 2試薬のみを 30°Cのィンキュベータ一中にて 20日間保存し、 7、 12、 20 日目に同様の試験を行い、各 R— 2 試薬の安定性を調べた。

3) 結果

結果を図 2に示す。標準液に対する感度が安定であった緩衝液は Tri s、 Tricine、 Bicine、 TEAであり、最も感度が安定であった緩衝液は Bi cineであつた

参考例 3 (ADP-へキソキナーゼの検討）

1) 試薬

< R - 1 >

5mM MES (pH 6.0)

5mM MgC12 (和光純薬工業社製）

8mM ATP (オリエンタル酵母社製）

10mM チォ NAD (オリエンタル酵母社製）

10u/mL ATP-へキソキナーゼ（旭化成社製）

0〜4u/mL ADP-へキソキナーゼ（旭化成社製）

< R- 2 ；ミオイノシトール定量試薬 >

200mM Bicine (pH 9.0)

0.3mM NADH (オリエンタル酵母社製）

25u/mLミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）

2) 方法

測定装置は自動分析装置 7 1 70 S (日立化成）を用いた。 2000μΜ ミオイノシトール溶液 100 / L と 0〜10g/dLグルコース溶液 lmLを混和したものを試料とした。各試料 3 しに R— 1試薬 180 zLを添加し 37°C 4.8分間の反応後、 R— 2試薬 180^Lを加え反応を開始した。反応開始後 5. 4分と 7. 8分の 405nmにおける吸光度を読みとりその差をとり、 1 分間当たりの吸光度増加速度（AmABS/min) を求め、各試料に対する感度を調べた。

3 ) 結果

結果を図 3に示す。図 3から分かるように、 ATP-へキソキナーゼ単独ではグルコース濃度が 10g/dL のように高くなると、感度に影響が現れるのに対して、 ADP -へキソキナーゼを併用するときにはグルコース濃度が高くなつても影響がない。このことは、 ATP -へキソキナーゼと ADP - へキソキナーゼを同時に反応させることで、試料中の糖が消去され、より正確にミオイノシトールを測定できることを示している。

参考例 4 (酵素を用いた高感度なミオイノシトールの定量)

1 ) 試薬

ミオイノシトール測定試薬

< R - 1 ；グルコース消去試薬 >

5mM MES (pH 6. 0)

0. 05% NaN3 (和光純薬工業社製）

0. 05% 0P-10 (日本ケミカルズ社製）

5mM MgC12 (和光純薬工業社製）

8mM ATP (オリエンタル酵母社製）

10mM チォ NAD (オリエンタル酵母社製）

10u/mL ATP-へキソキナーゼ（旭化成社製）

4u/mL ADP -へキソキナーゼ（旭化成社製）

< R - 2 ；ミオイノシトール定量試薬 >

200mM Bicine (pH 9. 0)

0. 05% NaN3 (和光純薬工業社製）

40mM KHC03 (和光純薬工業社製）

0. 3mM NADH (オリエンタル酵母社製）

25u/mLミオイノシト一ルデヒドロゲナーゼ（旭化成社製）

2 ) 方法測定装置は自動分析装置 7 1 7 0 S (日立化成）を用いた。あらかじめ調製したミオイノシトール溶液 3 /x Lにグルコース消去試薬 180 を添加し 37°C4. 8分間のグルコース消去反応後、ミオイノシトール定量試薬 180 μ ίを加え反応を開始した。反応開始後 5. 4分と 7. 8分の 405nm における吸光度を読みとりその差をとり、 1分間当たりの吸光度増加速度（AmABS/min) を求めた。

3 ) 結果

結果を図 4に示す。図 4に示すように本測定試薬によりミオイノシトールを簡便に定量することができた。ミオイノシトールの測定範囲は 0 〜2000 μ Μであり、 OroMミオイノシトールの多重測定により得られた Δηι ABS/min の平均 + 2 X標準偏差と重ならない最低濃度を最小検出感度とすると、最小検出感度は ΙΟ μ Μであった。

実施例 1 (尿中ミオイノシトール測定による軽症耐糖能異常の判定）

1 ) 対象

被験者 1 1 2名に通常の 75g 経口糖負荷試験を施行し、糖負荷直前、糖負荷後 30分、 60分、 120分、 180分に採血し、血糖、インスリンを測定した。また同時に糖負荷直前、糖負荷後 60分、 120分、 180分に採尿しミオイノシトール、尿糖、クレアチュンを測定した。

2 ) 試薬と測定法

血糖：電極法（京都第一化学： GA- 1160)

インスリン： R I A 2抗体法

ミオイノシトール測定試薬：実施例 4に同じ。

尿糖：電極法（京都第一化学： GA- 1160)

クレアチュン：クレアチニン一 H Aテストヮコ一（和光純薬工業社製）

3 ) 方法

耐糖能の指標として、 75g経口糖負荷直前、糖負荷後 30分、 60分、 120 分の血糖値の総和である∑ P Gを用いた。 75g経口糖負荷直前、糖負荷後 60分、 120分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチュン濃度を測定し、尿中クレアチュン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール zクレアチュン）を求めた。また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、厶ミオイノシトール量： [ (60分ミオイノシトール量 -負荷前ミオイノシトール量） /2] + [ ( 120分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2] を用いた。

∑ 0と/ ミオイノシトール量の関係を調べた。

4 ) 結果

結果を表 3およぴ図 5に示す。図 5に示したように、 ∑ 1^ &とミオイノシトール量は非常に良く相関した。 ∑ P Gが高いことは、糖負荷後の血糖推移が高く維持されていることを示し、すなわち耐糖能異常があることを意味する。また例えば△ミオイノシトールの特徴的な値を 10 μ g/mg Cre (クレアチュン）とすれば∑ PGが 530mg/dL程度の軽症耐糖能異常から効率よく検出することができる。

箫 3 40 正常型 89 114 87 91 63 381 7 9 10 15 3 0.08 27 35 44 44 12 0.01 0.02 0.01 0 12 381 0.08

41 正常型 95 169 175 109 59 548 11 35 46 29 7 0.32 9 10 9 9 0 0 0.02 0.01 0.01 0 548 0.32

42 正紫型 76 78 66 90 84 310 2 7 4 10 5 2.50 8 8 8 8 -1 0.01 0.01 0.02 0.01 -1 310 2.50

43 正常型 100 124 92 87 65 403 8 51 29 18 5 1.79 δ 7 9 12 1 o.ot 0.03 0.01 0 1 403 U9

44 正常型 95 138 117 91 67 441 7 26 44 27 6 0.44 10 17 23 26 10 0.02 0 0 0 10 441 0.44

45 正紫型 89 106 85 82 79 362 6 79 32 16 4 4.29 7 8 9 12 2 0.02 0.01 o.ot 0 2 362 4.29

46 正常型 103 192 153 96 80 544 9 33 44 20 5 0.27 18 56 38 2β 28 0.02 0.77 0.06 0 28 544 0.27

47 正常型 87 131 123 109 69 450 6 42 36 24 4 0.82 7 10 10 9 3 0.01 0.01 0.01 0.01 3 450 0.82

48 正 ft型 99 126 104 83 .66 412 10 47 9 15 5 1.37 27 18 21 18 -7 0 0.02 0 0.01 - 7 412 1.37

49 正紫型 B6 106 86 85 89 363 3 22 18 17 8 0.95 14 20 19 14 5 0 0 0 0 δ 363 0.95

50 正常型 84 131 89 89 80 393 6 40 24 12 10 0.72 10 15 17 16 5 0.03 0 0 0 5 393 0.72

51 正常型 85 116 99 110 83 410 6 17 17 18 Θ 0.35 13 13 12 11 一 1 0.03 0.02 0.02 0 - 1 410 0.35

52 正紫型 87 22 89 96 88 394 6 27 30 35 13 0.60 11 16 20 24 7 0.02 0.02 0.01 0 7 394 0.60

53 正紫型 90 147 112 116 52 465 6 72 53 50 8 1.16 17 16 22 26 2 0 0 0 0 2 465 1.16

54 正常型 Θ2 187 186 133 49 598 3 17 25 27 4 CM 5 368 487 623 395 186 0 0.23 0.15 0.03 186 598 0.15

55 正常型 99 146 181 133 137 559 5 19 16 15 13 0.30 4 4 4 3 1 0 0 0.01 0 1 559 0.30

56 正型 99 160 206 138 68 603 11 30 49 72 18 0.31 7 7 14 10 4 0.03 0.04 0 0 4 603 0.31

57 正常型 107 151 189 115 44 562 6 16 44 3Β 7 0.23 13 20 42 30 18 0,02 0.03 0.05 0.02 18 562 0.23

58 正常型 105 1Θ4 234 110 81 643 5 17 40 23 11 0.13 24 32 72 29 28 0 0.04 0.13 0 28 643 0.13

59 正常型 89 167 187 130 108 573 22 133 142 104 79 1.42 26 34 41 27 12 0.02 0.02 0.01 0 12 573 1.42

60 IF 3 117 165 154 90 80 526 8 37 108 27 11 0.60 24 46 72 45 35 0.01 0.06 0.06 0 35 526 0.60

61 IFG 115 74 206 136 65 631 4 8 19 20 4 0.07 12 33 84 25 46 0,01 0.23 0.55 0 46 631 0.07

62 IFG 117 204 220 103 152 644 7 31 37 33 16 0.28 37 113 140 56 90 0.01 0.61 1.04 0.12 90 644 0.28

63 1FG 110 185 240 127 120 662 6 15 26 15 14 0.12 17 26 59 2Θ 26 0.02 0.05 0.12 0.03 26 662 0.12

64 IFG Π 1 183 200 83 75 577 4 16 22 12 4 0.17 16 26 48 2Θ 22 0 0.1 0.17 0 22 577 0.17

65 IFG 110 153 60 88 82 411 5 44 22 18 . 15 0.91 13 15 19 19 4 0.01 0.01 0.02 0.01 4 411 0.91

66 1FG 117 236 192 101 71 646 24 196 100 48 17 1.45 12 19 19 13 7 0.02 0.03 0.02 0.01 7 646 1.45

67 IFG 111 166 167 124 70 568 12 53 55 40 8 0.75 9 11 21 14 13 0.01 0.02 0.03 0 13 568 0.75

68 IFG 113 204 229 115 58 661 5 20 47 44 12 0.16 49 111 96 42 54 0.01 0.89 0.53 0.03 54 661 0.16

69 IGT 111 192 237 161 63 701 10 18 26 48 9 0.10 22 67 146 94 85 0.01 0.37 1.31 0.41 85 701 0.10

70 IGT 104 153 130 141 141 528 7 28 24 17 16 0.43 15 22 29 28 10 0.02 0.02 0 0.01 10 528 0.43

71 IGT 113 195 224 170 147 702 7 19 44 48 31 0.15 63 114 185 176 86 0.01 0.67 0.38 0.14 86 702 0.15

72 IGT 9 & 158 213 143 48 612 5 14 22 33 5 0.15 59 72 149 75 52 0.03 0.19 1.16 0.17 52 612 0.15

73 IGT 95 119 147 142 73 503 5 20 21 29 6 0.63 40 31 36 40 -6 0.01 0.01 0.03 0.01 -6 503 0.63

74 IGT 103 187 217 164 1 Π 671 6 18 30 35 11 0.14 21 55 74 27 44 0.01 0.02 0.01 0.01 44 671 0.14

75 IGT 123 196 232 150 158 701 3 30 60 67 56 0.37 31 88 119 88 72 0.01 0.95 0.53 0.66 72 701 0.37

76 1GT 108 150 192 168 124 618 3 17 22 32 26 0.33 15 14 15 13 0 0.02 0.02 0.02 0.02 0 618 0.33

77 IGT 114 178 204 172 136 668 4 10 13 17 12 0.09 29 47 89 49 39 0.02 0.04 0.13 0.03 39 668 0.09

78 IGT 108 211 2 ί67 69 700 6 36 50 41 10 0,29 t5 66 116 2S 76 0.01 0.22 0.43 0.03 76 700 0.29

79 IGT 97 211 256 196 117 760 6 20 28 34 16 0.12 15 29 29 26 15 0.03 0.06 0.05 0.01 15 760 0.12

80 IGT 123 218 244 160 83 745 2 11 13 21 7 0.09 17 73 150 27 95 0.02 1.41 1.54 0.02 95 745 0.09

§ 3 θύ

実施例 2 (尿中ミオイノシトール測定によるィンスリン初期分泌不良の判定）

1 ) 対象

実施例 1に同じ。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3 ) 方法

75g経口糖負荷直前、糖負荷後 60分、 120分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトールクレアチュン）を求めた。また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、 △ミオイノシトール量： [ (60分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2] + [ ( 120分ミオイノシトール量 -負荷前ミオイノシトール量） /2] を用いた。

インスリノジエニック .インデックス（ I . I . ) と△ミオイノシトール量の関係を調べた。

4 ) 結果

結果を図 6に示す。図 6に示したように、インスリノジェニック ·ィンデッタスと△ミオイノシトール量には関連が認められ、 △ミオイノシトール量が 15 μ g/mg Cre 以上であればかなり高率にィンスリノジェニック · インデックスは 0 . 4未満であった。日本糖尿病学会の指針によれば、ィンスリノジエニック ·ィンデッタスく 0 . 4であればィンスリン初期分泌不良と判断できる。図 6から明らかなように、 △ミオイノシトールの特徴的な値を 15 i g/mg Cre とすればインスリノジヱニック . インデックスが 0 . 4未満、つまりインスリン初期分泌不良であるものを効率よく検出することができる。

実施例 3 (尿中ミオイノシトール測定と尿糖測定による軽症耐糖能異常の判定）

1 ) 対象実施例 1に同じ。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3 ) 方法

75g経口糖負荷直前、糖負荷後 60分、 120分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチュン濃度を測定し、尿中クレアチュン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール/クレアチニン）を求めた。また同時に尿糖濃度を求めた。糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、 △ミオイノシトール量： [ (60 分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2] + [ ( 120分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2) ] を用いた。

4 ) 結果

△ミオイノシトール量が 10 g/mg Cre以上である場合をプラス（十）、そうでない場合をマイナス（一）とした。同様に尿糖に関しては糖負荷 2時間後の尿糖が 50mg/dL以上である場合を十、そうでない場合を一とした。 ∑ P Gは実施例 5で算出したものを用いた。

検討した 1 1 2名中、 △ミオイノシトール一尿糖一群は 5 2名、 △ミオイノシトール +尿糖一群は 1 2名、 △ミオイノシトール +尿糖 +群は 4 8名であった。 △ミオイノシトール一尿糖 +群に該当するものは無かつた。 △ミオイノシトール一尿糖一群、△ミオイノシトール +尿糖—群、 △ミオイノシトール +尿糖 +群それぞれの∑ P Gを比較した。

結果を図 7に示す。図 7に示すように△ミオイノシトール—尿糖—群における ∑ P Gの平均値、および標準偏差はそれぞれ 453mg/dL、 76. 6mg/dL であった。 △ミオイノシトール +尿糖一群における∑ P Gの平均値、および標準偏差はそれぞれ 556mg/dL、 81. Img/dLであった。 △ ミオイノシトール +尿糖 +群における∑ P Gの平均値、および標準偏差はそれぞれ 791mg/dL、 164. 8mg/dL であった。また△ミオイノシトール —尿糖一群の∑ P Gと比べ、 △ミオイノシトール +尿糖一群の∑ P Gは有意に高く、厶ミオイノシトール +尿糖 +群の∑ P Gは更に有意に高かつた。 ,

このことから尿中ミオイノシトール、尿糖を併せて測定することにより非侵襲的に耐糖能異常の程度を判定することができた。

実施例 4 (尿中ミオイノシトール測定と尿糖測定によるインスリン初期分泌不良の判定）

1) 対象

実施例 1に同じ。

2) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3) 方法

実施例 3に同じ。

4) 結果

△ミオイノシトール量が 10μ g/mg Cre以上である場合をプラス（十）、そうでない場合をマイナス（―）とした。同様に尿糖に関しては糖負荷 2時間後の尿糖が 50mg/dL以上である場合を十、そうでない場合を一とした。インスリノジエニック 'ィンデックスは実施例 2で算出したものを用いた。

△ミオイノシトール一尿糖—群、 △ミオイノシトール +尿糖一群、 △ ミオイノシトール +尿糖 +群それぞれのィンスリノジェ；ック ·ィンデックス（△ I R I 30-0/ΔΡ G 30-0) を比較した。

結果を図 8に示す。図 8に示すようにミオイノシトール—尿糖一群における A I R I 30- 0ΖΔ P G 30- 0の平均値、および標準偏差はそれぞれ 1.32、 0.79 であった。 △ミオイノシトール +尿糖—群における△ I R I 30-0/Δ P G 30-0 の平均値、および標準偏差はそれぞれ 0.45、 0.42 であった。 △ミオイノシトール +尿糖 +群における△ I R I 30-0 /△ P G 30-0の平均値、および標準偏差はそれぞれ 0.16、 0.19であつた。また△ミオイノシトール一尿糖一群の△ I R I 30-0/APG 30-0 と比べ、 △ミオイノシトール +尿糖—群の△ I R I 30-0/ ΔΡ G 30-0 は有意に低く、△ミオイノシトール +尿糖 +群の△ I R I 30-0/ Δ P G 30-0は更に有意に低かった。

このことから尿中ミオイノシトール、尿糖を併せて測定することにより非侵襲的にィンスリン初期分泌不良の程度を判定することができた。実施例 5 (尿中ミオイノシトール測定による軽症耐糖能異常の判定）

1 ) 対象

実施例 1のうち、空腹時血糖 l lOmg/dl 未満かつ負荷後 2時間血糖 140mg/dl未満である正常型に分類された 5 9名。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3 ) 方法

正常型と判定された中で、負荷後 1時間血糖 180mg/dL 以上、または負荷後 2時間血糖 120mg/dL以上のものをやや耐糖能の低下した症例（軽症耐糖能異常）として B群、それ以外のものを A群とした。正常型と判定された 59名中、 A群は 45名、 B群は 14名であった。 75g経口糖負荷直前、糖負荷後 60分、 120分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、 A 群、 B 群の尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール/クレアチニン）を求めた。

また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、 △ミオイノシトール量： [ (60分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2] + [ ( 120分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2] を用いた。

4 ) 結果

結果を図 9に示す。図 9に示したように、 A群の△ミオイノシトール平均値は 3. 9 μ g/mg Cre、 B群の△ミオイノシトール平均値は 25. 8 μ g/ mg Creであり、 A群に比べやや耐糖能の低下した B群（軽症耐糖能異常）では△ミオイノシトールが高い結果であった。

実施例 6 (尿中ミオイノシトール測定によるィンスリン分泌不全の判定）

1 ) 対象実施例 1に同じ。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3 ) 方法

正常型と判定された中で、ィンスリノジエニック *ィンデッタスが 0. 4 未満のものを B群、それ以外のものを A群とした。正常型と判定された 59名中、 A群は 37名、 B群は 22名であった。 75g経口糖負荷直前、糖負荷後 60分、 120分の各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチュン濃度を測定し、 A 群、 B 群の尿中クレアチュン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトールクレアチュン）を求めた。

また、糖負荷前後のミオイノシトール量の指標としては、 △ミオイノシトール量： [ (60分ミオイノシトール量-負荷前ミオイノシトール量） /2] + [ ( 120分ミオイノシトール量 -負荷前ミオイノシトール量） /2] を用いた。

4 ) 結果

結果を図 10 に示す。図 10 に示したように、 A群の△ミオイノシトール平均値は 4. 4 // g/mg Cre、 B群の△ミオイノシトール平均値は 16. 9 g /mg Cre であり、 A群に比べィンスリン初期分泌の低下した B群では△ ミオイノシトールが高い結果であった。

実施例 7 (糖負荷試験における尿中ミオイノシトールと食事における尿中ミオイノシトールの関係）

1 ) 対象

実施例 1のうち、食事負荷試験に同意した 5 2名。正常型（C群） 2 2名、境界型（B群） 1 4名、糖尿病型（D群） 1 6名であった。食事前および食後 120分後に採血し、血糖、インスリンを測定した。また食事前および食後 120分後に採尿し、ミオイノシトール、尿糖、クレアチニンを測定した。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。 3 ) 方法

空腹時に採血、採尿を行い食事を摂取した。食事内容はレトルトの調理済食品（ニチレイ製ウェルネス · メニューおよび佐藤食品工業製包装米飯）で、糖質 91. 6g、タンパク質 31. 0g、脂質 13. 9g、ナトリウム 1. lg を含み、エネルギーは 622kcalである。食事後 120分に採血、採尿を行つた。各尿中のミオイノシトール濃度、クレアチニン濃度を測定し、尿中クレアチニン排泄量に対するミオイノシトール量（ミオイノシトール /ゥレアチュン）を求めた。

また、食事前後のミオイノシトール量の指標としては、 △ミオイノシトール量： [ ( 120分ミオイノシトール量 -負荷前ミオイノシト一ル量） ] を用いた。

4 ) 結果

糖負荷試験における△ミオイノシトール（X 軸）と食事におけるミオイノシトール（Y軸）の関係を図 11に示す。図 11 に示したように、糖負荷試験における△ミオイノシトールと食事における△ミオイノシトールは非常に良く相関し（Y = 1. 044X - 2. 0, r = 0. 83, P く 0. 000 1 ) 、ほぼ同じ値を示した。これにより糖負荷試験を実施しなくとも、食事前後の尿中ミオイノシトールを測定することで、軽症耐糖能異常またはィンスリン分泌不全を検出できることが明らかとなった。

実施例 8 (糖負荷試験における尿中ミオイノシトールと食事における尿中ミオイノシトールの関係）

1 ) 対象

実施例 7に同じ。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3 ) 方法

実施例 7に同じ。

4 ) 結果

各群での糖負荷試験における△ミオイノシトールと、食事における△ ミオイノシトールの関係を図 12に示す。図 12に示したように、各群での糖負荷試験における△ミオイノシトールと食事における△ミオイノシトールは非常に良く一致していた。これにより糖負荷試験を実施しなくとも、食事前後の尿中ミオイノシトールを測定することで、軽症耐糖能異常'またはィンスリン分泌不全を検出できることが明らかとなった。実施例 9 (尿糖陰性者での食事における尿中ミオイノシトールと軽症耐糖能異常との関係）

1 ) 対象

実施例 7のうち、食後 2時間後尿糖が陰性（50mg/dL未満）である 3 2名。

2 ) 試薬と測定法

実施例 1に同じ。

3 ) 方法

実施例 7に同じ。ただし、食事における△ミオイノシトールが 7 μ g/mg Cre以上のものを（+ ) 群、それ以外を（一）群とした。

4 ) 結果

結果を図 13に示す。図 13に示したように、食後 2時間後尿糖陰性者でも△ミオイノシトール（+ )群は△ミオイノシトール（一）群と比べ、糖負荷試験での∑ P Gが高値を示す例が多かった。

このことから食後 2時間後尿糖陰性者でも、食事前後における尿中ミオイノシトールを測定することにより非侵襲的に耐糖能異常の程度を判定することができた。

[産業上の利用の可能性]

以上のとおり、本発明によれば、軽症耐糖能異常およびまたはインスリン初期分泌不良を非侵襲的に、簡便かつ再現性良く判定する検査方法を提供することができる。 [寄託された生物材料への言及]

( 1 ) ィ. 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称およびあて名

名称：独立行政法人産業技術総合研究所

特許生物寄託センター

あて名：日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 π ィの機関に寄託した日付

平成 12年 10月 12 日（原寄託日）

ハ . ィの機関が寄託について付した寄託番号

FERM BP— 7323

Claims

請求の範囲

1. 試料中に含有されるミオイノシトールを定量し、特徴的な値以上を軽症耐糖能異常またはィンスリン分泌不全であると判定することを特徴とする軽症耐糖能異常の検査方法。

2. 試料中のミオイノシトールを定量する方法が酵素を用いる方法である請求項 1に記載の方法。

3. 酵素がミオイノシトールデヒドロゲナーゼである請求項 2記載の方法。

4. 酵素を用いてミオイノシトールを定量する方法が酵素サイクリング法である請求項 2または 3に記載の方法。

5. 試料中のミオイノシトール以外の糖を消去した後に、ミオイノシトールを定量することを特徴とする請求項 1〜 4のいずれかに記載の方法。

6. 2種類のキナーゼを同時に反応させて、ミオイノシトール以外の糖を消去することを特徴とする請求項 5に記載の方法。

7. 2種類のキナーゼが AT P一へキソキナーゼと AD P—へキソキナーゼであることを特徴とする請求項 6に記載の定量方法。

8. ミオイノシトール定量反応に用いる補酵素であるチォ NADの濃度が終濃度で 0. 1 mM以上であることを特徴とする請求項 4〜 7のいずれかに記載の定量方法。

9. ミオイノシトール定量反応に用いる補酵素であるチォ NADの濃度が終濃度で 2〜 1 0 mMであることを特徴とする請求項 4〜 7のいずれかに記載の定量方法。

1 0. 試料が糖負荷前と糖負荷後、もしくは食事前と食事後に得られた試料である請求項 1〜 9のいずれかに記載の方法。

1 1. 試料が尿である請求項 1 0に記載の方法。

1 2. 試料が尿であり、かつ特徴的な値が、 75g グルコース負荷後に尿中に排泄されるミオイノシトールの増加量として 0〜 2 0 g /m g . クレアチュンであることを特徴とする請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の方法。

1 3. 試料が尿であり、かつ特徴的な値が、 75g グルコース負荷後に尿中に排泄されるミオイノシトールの増加量として 8〜 1 2 μ g /m g · クレアチュンであることを特徴とする請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の方法。

1 4. 試料中のミオイノシトールと併せて試料中のグルコースを定量することを特徴とする請求項 1〜 1 3のいずれかに記載の方法。

1 5. 2種類のキナーゼを同時に反応させて、試料中のグルコースを消去することを特徴とするグルコースの消去方法。

1 6. 2種類のキナーゼが AT P—へキソキナーゼと AD P消去剤であることを特徴とする請求項 1 5に記載のグルコースの消去方法。

1 7. AD P消去剤が AD P—へキソキナーゼである請求項 1 6に記載のグルコースの消去方法。

1 8. 試料中のミオイノシトールをチォ NAD、 NADH存在下でミオイノシトールデヒドロゲナーゼを用いて酵素的に定量する方法であつて、 2種類のキナーゼを併用することを特徴とする方法。

1 9. 2種類のキナーゼが AT P—へキソキナーゼと AD P消去剤であることを特徴とする請求項 1 8に記載の方法。

2 0. AD P消去剤が AD P—へキソキナーゼである請求項 1 9に記載のグルコースの消去方法。

2 1. ミオイノシトール定量用組成物であって、少なくとも以下の成分を含むことを特徴とする組成物。

1 ) チォ NAD

2 ) NADH

3 ) ミオイノシト一ルデヒドロゲナーゼ

4 ) 2種類のキナーゼ

2 2. 2種類のキナーゼが A T P—へキソキナーゼと AD P消去剤であることを特徴とする請求項 2 1に記載のミオイノシトール定量用組成物 _Q

2 3. AD P消去剤が AD P—へキソキナーゼである請求項 2 2に記載のミオイノシトール定量用組成物。

24. 緩衝液を含み、緩衝液として Bicine (N, N-Bis (hydroxyethyl) glycine) 、 Tris ^ (Tris (hydroxymethyl) aminometnane) _x TEA (Triethano 1 amine) _Λ Tricine (N - Tris (hydroxymethyl) - methylglycine)を用レヽることを特徴とする請求項 2 1〜2 3のいずれかに記載の定量用組成物。

2 5. チォ NADの濃度が終濃度で 0. 1 mM以上であることを特徴とする請求項 2 1〜24のいずれかに記載の定量用組成物。

2 6. チォ NADの濃度が終濃度で 2〜 1 0 mMであることを特徴とする請求項 2 1〜 24のいずれかに記載の定量用組成物。