ES2333181T3 - Metodo para la deteccion de una intolerancia ligera a la glucosa o hiposecrecion de insulina. - Google Patents
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Abstract
Método para la eliminación de glucosa en una muestra, caracterizado porque se utilizan simultáneamente ATPhexocinasa y ADP-hexocinasa para la reacción de eliminación de glucosa en la muestra.
Description
Método para la detección de una intolerancia
ligera a la glucosa o hiposecreción de insulina.
Un objetivo final del tratamiento diabético
consiste en prevenir la aparición de complicaciones diabéticas e
inhibir el desarrollo de las mismas. Según ponen de manifiesto los
ensayos clínicos para la consecución de este objetivo, es
importante descubrir cualquier anomalía y comenzar el tratamiento
de la misma en la fase más precoz posible [p.ej., Diabetes Research
and Clinical Practice, 28, 103 (1995)].
Además, se considera efectivo como procedimiento
preventivo más avanzado, encontrar personas con prediabetes o en
las fases previas de la diabetes, o personas con alteraciones
ligeras de la tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de
insulina que no se encuentran actualmente en el estadio
prediabético pero que presentan una alta probabilidad de
desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, y administrarles
tratamiento o recomendarles ejercicio y dietas adecuadas. Se han
llevado a cabo ensayos clínicos destinados a demostrar este hecho
científicamente [p.ej., Diabetes Care, 21, 1720 (1998)]. Por
consiguiente, la detección de las personas con prediabetes tendrá
importancia en la prevención de la diabetes mellitus, así como de
las complicaciones relacionadas con ésta. Asimismo, se considera
que poder diagnosticar a personas con alteraciones ligeras de la
tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de insulina, que no
se encuentran actualmente en el estadio prediabético pero que
presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o
prediabetes a corto plazo, resulta de vital importancia a fin de
prevenir la diabetes mellitus de forma precoz.
Un ejemplo del procedimiento diagnóstico de la
diabetes mellitus consiste en una prueba de tolerancia oral a la
glucosa. Tras una sobrecarga oral de glucosa de 75 gramos, se
define como tolerancia normal a la glucosa (NGT) a un grupo de
personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas
inferior a 110 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre 2 horas
después de la sobrecarga, inferior a 140 mg/dL. Además, se define
como glucemia anormal en ayunas (IFG) a un grupo de personas que
presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas no inferior a 110
mg/dL pero inferior a 126 mg/dL y con un nivel de glucosa en
sangre, 2 horas después de la sobrecarga, inferior a 140 mg/dL; y
se define como alteraciones de la tolerancia a la glucosa (IGT) a
un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en
ayunas inferior a 126 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre, 2
horas después de la sobrecarga, no inferior a 140 mg/dL pero
inferior a 200 mg/dL; y ambos grupos IFG e IGT se definen como de
tipo límite. Se define como diabetes mellitus a un grupo de
personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas no
inferior a 126 mg/dL o con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas
después de la sobrecarga, no inferior a 200 mg/dL.
Las directrices de la Sociedad Japonesa de la
Diabetes (Japan Diabetes Society) determinan que entre las personas
definidas como NGT sobre la base exclusivamente del nivel de
glucosa en sangre en ayunas y del nivel de glucosa en sangre 2
horas después de la sobrecarga, aquellas que presenten niveles de
glucosa en sangre, 1 hora después de la sobrecarga, de 180 mg/dL o
superiores, corren un mayor riesgo de desarrollar diabetes, de
forma que deberían tratarse como casos de tipo límite.
El término "alteraciones de la tolerancia a la
glucosa" o "intolerancia a la glucosa" se refiere a la
afección marcada por un aumento del nivel de glucosa en sangre
causado por una absorción insuficiente de la glucosa en sangre
hacia los tejidos periféricos, tales como los músculos
esqueléticos, el hígado y los adipocitos tras la entrada de la
glucosa en la sangre a través de las comidas. Además, el término
"alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa" se
refiere a que el incremento es ligeramente superior al que se
produce en las personas sanas.
La insulina es una hormona secretada por las
células beta del páncreas que actúa en los músculos esqueléticos,
en el hígado y en el tejido adiposo a fin de disminuir el nivel de
glucosa en sangre. El término "defecto secretor de insulina" se
refiere a la afección marcada por una secreción de insulina
insuficiente para absorber una cantidad suficiente de la glucosa en
sangre hacia los tejidos periféricos, tales como los músculos
esqueléticos, el hígado y los adipocitos tras la entrada de la
glucosa en la sangre a través de las comidas o de cualquier otro
modo. Dentro del defecto secretor de insulina, la afección marcada
por una secreción de insulina insuficiente para absorber una
cantidad suficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos
periféricos justo después de la entrada de la glucosa en la sangre
se denomina "secreción precoz alterada de insulina". Según las
directrices de la Sociedad Japonesa de la Diabetes, el término
"secreción precoz alterada de insulina" se refiere a la
afección en la que el índice insulinógeno I.I es inferior a 0,4. El
índice insulinógeno I.I se define como \DeltaIRI
(30-0)/\DeltaPG (30-0), fórmula en
la que \DeltaIRI (30-0) se refiere a la diferencia
entre los niveles de insulina en sangre 30 minutos después de la
sobrecarga de glucosa y antes de la sobrecarga de glucosa; y
\DeltaPG (30-0) se refiere a la diferencia entre
los niveles de glucosa en sangre 30 minutos después de la
sobrecarga de glucosa y antes de la sobrecarga de glucosa.
Las pruebas analíticas para evaluar los niveles
de glucosa y los niveles de insulina en sangre son procedimientos
invasivos que precisan la extracción de sangre más de una vez en un
corto período, infligiendo un dolor considerable a los pacientes.
Por consiguiente, se necesita una prueba analítica sencilla, menos
invasiva, que pueda resolver estas desventajas, preferentemente una
prueba analítica no invasiva.
Por otra parte, se ha considerado que la
determinación cuantitativa de mioinositol en una muestra biológica
resulta útil en el diagnóstico de la diabetes mellitus, habiéndose
documentado los siguientes informes.
(a) En la diabetes mellitus, se observó un
incremento en el nivel de mioinositol en orina [Larner J. et
al., New Eng. J. Med., 323, 373-378
(1990)].
(b) No se encontraron diferencias entre los
tipos NGT y límite con respecto al nivel de mioinositol en orina
[Susumu Suzuki, Diabetes Care, Vol. 17, No. 12 (1994)
1465-1468].
(c) El tipo límite (IFG; IGT) y la diabetes
mellitus mostraron un nivel de mioinositol en orina superior al
correspondiente al tipo NGT (JP 2001-190299 A).
Los informes (a) y (b) anteriores muestran los
resultados obtenidos determinando los niveles de mioinositol en
orina mediante CG/EM. Sin embargo, los datos plantean problemas de
reproducibilidad y fiabilidad, debido a su variación entre los
distintos examinadores. Por otra parte, en el informe (c), los
resultados resultan más precisos y fiables que los obtenidos
mediante CG/EM, puesto que se han obtenido determinando el nivel de
mioinositol en orina con un reactivo para el análisis de
mioinositol de alta sensibilidad que utiliza una enzima. De este
modo, ha sido posible realizar la detección del grupo con
prediabetes.
No obstante, el reactivo para el análisis de
mioinositol utilizado en el informe (c) plantea problemas, tales
como: (i) un insuficiente nivel inferior de detección, debido al
estrecho intervalo de medición y a la necesidad de diluir una
muestra para la determinación de diversos niveles de mioinositol en
orina; y (ii) una insuficiente capacidad para evitar los efectos de
las sustancias coexistentes en la orina, en particular de la
glucosa. Por consiguiente, no ha sido posible conseguir la
detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y
del defecto secretor de insulina, que caen dentro de la NGT.
Se ha indicado por Kouzuma y otros, Clinica
Chimica Acta 312 (2001) 143-151, un método de
ciclización enzimática para la determinación cuantitativa de
mioinositol en muestras biológicas.
El documento EP 1 008 657 A2 da a conocer un
método y un reactivo para la determinación cuantitativa de
1,5-anhidroglucitol.
Además, si se evalúa que un paciente tiene NGT
basándose exclusivamente en los niveles en sangre antes de una
sobrecarga oral de glucosa de 75 g y transcurridas 2 horas desde la
sobrecarga de glucosa, tal juicio no refleja el cambio en el nivel
en sangre de las 0 a las 2 horas. Por ejemplo, incluso las personas
(con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y defecto
secretor de insulina) que mantienen un nivel de glucosa en sangre
más alto justo desde la sobrecarga de glucosa y que, por tanto,
presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o
prediabetes a corto plazo, se clasifican prácticamente como NGT.
Según se emplea en el presente documento, el término "alteraciones
ligeras de la tolerancia a la glucosa" se clasifica dentro del
grupo NGT, pero se refiere a una ligera disminución en la
tolerancia a la glucosa caracterizada por, según los resultados
obtenidos tras una prueba de sobrecarga y la consiguiente toma de
cuatro muestras de sangre en ayunas, a los 30 minutos, transcurrida
1 hora y transcurridas 2 horas desde la sobrecarga, (i) una
oxihiperglucemia, es decir, niveles de glucosa en sangre muy
elevados (180 mg/dL o superiores) transcurridos 30 minutos y 1 hora
desde la sobrecarga, (ii) un nivel de glucosa en sangre superior al
de las personas sanas transcurridas 2 horas desde la sobrecarga,
aunque el nivel en sangre es inferior a 140 mg/dL (p.ej., no
inferior a 120 mg/dL), (iii) un alto \SigmaPG (p.ej., 530 mg/dL o
superior), es decir, el total de los niveles de glucosa en sangre
justo antes de la sobrecarga oral de glucosa de 75 g y
transcurridos 30, 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa.
Por consiguiente, no se puede esperar, a la vista de cuanto se da a
conocer en los documentos públicos (a)-(c), que resulte posible
identificar el grupo de personas que presenta una alta probabilidad
de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, por ejemplo,
las personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la
glucosa, mediante la determinación de los niveles de
mioinositol.
En este sentido, la tecnología convencional no
contempla ningún procedimiento para la detección de alteraciones
ligeras de la tolerancia a la glucosa y del defecto secretor de
insulina en personas que mantienen un nivel de glucosa en sangre
más alto justo después de la sobrecarga de glucosa y que, por
tanto, presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o
prediabetes a corto plazo.
La presente invención pretende dar a conocer un
procedimiento analítico para la determinación sencilla de las
alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o del defecto
secretor de insulina con buena reproducibilidad.
Para alcanzar este objetivo, los presentes
inventores consideraron que la búsqueda de cualquier marcador para
la determinación eficaz de las alteraciones ligeras de la
tolerancia a la glucosa y/o del defecto secretor de insulina
resultaba ventajosa. Como resultado de esfuerzos concentrados,
mientras que convencionalmente se considera que el mioinositol
resulta útil para la detección de resistencia a la insulina y
prediabetes (tipo límite y diabetes mellitus), los presentes
inventores descubrieron inesperadamente que el mioinositol también
representa un marcador útil para detectar de forma eficaz las
alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o el defecto
secretor de insulina.
Como muestra se utilizan suero sanguíneo, plasma
u orina procedentes del cuerpo humano, o un extracto homogeneizado
de tejido vivo. Preferentemente se utiliza orina, dado que se puede
obtener de forma no invasiva.
Los presentes inventores continuaron
desarrollando una prueba analítica para la determinación
cuantitativa con alta sensibilidad de mioinositol y una composición
para la prueba analítica, a fin de conseguir una prueba analítica
sencilla y económica para la determinación cuantitativa de
mioinositol con alto grado de exactitud (JP 06-61278
B). Esta prueba analítica enzimática, que no precisa de ningún
tratamiento preliminar, abrió por primera vez el camino hacia la
obtención de datos fiables del mioinositol. Tal desarrollo de la
prueba analítica para la determinación cuantitativa con alta
sensibilidad y la composición para la determinación cuantitativa
permitieron lograr el primer éxito al dar a conocer el
procedimiento de la presente invención para el examen de
alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o del defecto
secretor de insulina.
Además, tras la administración de una cantidad
determinada de glucosa a un paciente, se obtuvieron muestras de
orina del paciente de forma no invasiva en unos tiempos
determinados y, posteriormente, se determinaron los niveles de
mioinositol de las mismas mediante el reactivo para el análisis de
mioinositol, según lo descrito anteriormente. La determinación
reveló que no sólo las personas con prediabetes (de tipo límite,
IFG, IGT) y las personas con diabetes mellitus, sino también las
personas que prácticamente muestran alteraciones ligeras de la
tolerancia a la glucosa, a pesar de pertenecer al grupo NGT, así
como las personas que prácticamente muestran una disminución de la
secreción precoz de insulina, a pesar de pertenecer al grupo NGT,
presentan niveles superiores a los valores característicos
predeterminados de las personas sanas. Por consiguiente, se ha
descubierto que el reactivo analítico de la presente invención
permite no sólo la distinción entre NGT y no NGT con alteraciones
avanzadas de la tolerancia a la glucosa (tipo límite, IFG, IGT,
diabetes), sino también la distinción sencilla, con alta
reproducibilidad y eficiente entre las personas que en la práctica
muestran alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa, a
pesar de pertenecer al grupo NGT, así como las personas que en la
práctica muestran una disminución de la secreción precoz de
insulina, a pesar de pertenecer al grupo NGT, y las personas
sanas.
Además, la concentración de mioinositol presente
en una muestra puede ser muy baja y algunas de las mioinositol
deshidrogenasas utilizadas pueden reaccionar débilmente con la
glucosa. Así pues, puede ser necesario eliminar la glucosa antes de
la prueba. Entre los procedimientos para la eliminación de la
glucosa se incluye uno que aprovecha la extremada estabilidad
química del mioinositol y otro que modifica la glucosa con ayuda de
una enzima como catalizador. Los procedimientos que aprovechan la
estabilidad química incluyen, por ejemplo, uno consistente en
calentar una muestra en presencia de HCl 6N de forma que se consiga
la descomposición ácida de los azúcares, sin que se descomponga el
mioinositol, y recuperar el mioinositol que queda en el producto
descompuesto; y uno consistente en tratar una muestra con un agente
reductor, tal como el borohidruro de sodio, a fin de reducir los
azúcares con grupos carbonílicos o grupos formílicos, tales como la
glucosa, excepto el mioinositol, y modificándolos para conseguir
compuestos no reactivos con la mioinositol hidrogenasa, es decir,
una enzima para el análisis cuantitativo del mioinositol. El
procedimiento que modifica la glucosa con ayuda de una enzima como
catalizador incluye uno que convierte la glucosa presente en una
muestra en ácido glucónico por acción de la glucosa oxidasa
(EC1,1,3,4) y uno que convierte la glucosa presente en una muestra
en glucosa-6-fosfato por acción de
la hexocinasa (EC2,7,1,1).
Se conocen varias mejoras a estos procedimientos
de conversión. En relación con el procedimiento de conversión de la
glucosa en ácido glucónico por acción de la glucosa oxidasa, por
ejemplo, se conoce un procedimiento para eliminar el peróxido de
hidrógeno producido mediante una catalasa tras la reacción con la
glucosa oxidasa (JP 63-185397 A).
Además, en relación con el procedimiento de
conversión de la glucosa en
glucosa-6-fosfato por acción de la
hexocinasa, se conocen procedimientos para convertir la glucosa en
fructosa-1,6-bifosfato por acción
de la fosfohexosa isomerasa y la 6-fosfofructocinasa
a fin de evitar que la
glucosa-6-fosfato se convierta
nuevamente en glucosa mediante una reacción de equilibrio (JP
05-76397 A); para llevar a cabo la reacción con
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en
presencia de una coenzima oxidada (JP 01-320998 A,
JP 03-27299 A); y para llevar a cabo la reacción con
piruvato cinasa en presencia de difosfato de adenosina a fin de
evitar el descenso de nivel de trifosfato de adenosina a medida que
se elimina la glucosa, manteniendo de esta forma constante dicho
nivel de trifosfato de adenosina (JP 02-104298
A).
No obstante, cuando se elimina la glucosa
mediante hexocinasa, la reacción enzimática produce una gran
cantidad de ADP en la solución de reacción, de forma que no se
puede ignorar el efecto del mismo sobre la reacción enzimática. Así
pues, es preferible convertir el ADP resultante en un compuesto que
no afecte a la reacción.
Así pues, los presentes inventores han
considerado un procedimiento eficaz que utiliza un agente
eliminador de ADP cuya función consiste en convertir el ADP
generado en la solución de reacción, como consecuencia de la
reacción enzimática, en un compuesto que no afecte a la
reacción.
Como agente eliminador de ADP se pueden utilizar
cualesquiera enzimas capaces de convertir el ADP en un compuesto
que no afecte a la reacción. Entre estas, son preferibles las
enzimas que catalizan la conversión de ADP a AMP. Las cinasas
también se denominan fosfocinasas o fosfotransferasas. Entre los
ejemplos de las cinasas que catalizan la conversión de ADP a AMP se
encuentran la pirofosfato-glicerol transferasa, la
6-fosofofructocinasa, la acetato cinasa y la
ADP-hexocinasa.
Como resultado de profundas investigaciones, los
presentes inventores han descubierto que la
6-fosofofructocinasa y la
ADP-hexocinasa se utilizan preferentemente como
agentes eliminadores de ADP en la presente invención.
Cuando se utiliza
6-fosofofructocinasa como agente eliminador de ADP
en la reacción de eliminación de la glucosa presente en una
muestra, se produce ADP junto con la conversión de glucosa en
glucosa-6-fosfato utilizando
ATP-hexocinasa en presencia de ATP y se hace
reaccionar simultáneamente con 6-fosofofructocinasa
de modo que se realice la conversión de ADP a AMP junto con la
conversión de la fructosa-6-fosfato
añadida previamente en
fructosa-1,6-bifosfato.
Cuando se utiliza ADP-hexocinasa
como agente eliminador de ADP en la reacción de eliminación de la
glucosa presente en una muestra, se produce ADP junto con la
conversión de glucosa en
glucosa-6-fosfato utilizando
ATP-hexocinasa en presencia de ATP, que se puede
convertir en AMP.
Además, es preferible realizar dicha reacción en
presencia de sales. Entre los ejemplos de las sales se incluyen:
sales de magnesio, tales como cloruro de magnesio y acetato de
magnesio; y sales de potasio, tales como cloruro de potasio y
sulfato de potasio. La concentración de las sales utilizadas se
encuentra, sin limitación, preferentemente entre aproximadamente 1
y 100 mM.
Cualquiera de estos compuestos producidos
mediante la modificación enzimática no reaccionan con la
mioinositol deshidrogenasa, una enzima para la determinación
cuantitativa de mioinositol. Los presentes inventores han
descubierto que resulta más preferible eliminar la glucosa
previamente siguiendo estos procedimientos.
Además, los presentes inventores han descubierto
que el mioinositol se puede determinar de forma más precisa cuando
se utilizan simultáneamente dos tipos de cinasas,
ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa,
debido a que se reduce la influencia de los azúcares presentes en
una muestra. Además, los presentes inventores han descubierto que
el intervalo de determinación del mioinositol puede extenderse
aproximadamente 10 veces ajustando el nivel de
tio-NAD hasta una concentración final de 0,1 mM o,
más preferentemente, entre 2 y 10 mM. Así pues, los presentes
inventores han completado un sistema analítico altamente
sensible.
El término "valor característico" se
refiere a un valor determinado sobre la base de un promedio de los
niveles de mioinositol en las muestras de orina de personas sanas
seleccionadas entre el grupo de NGT; desviación típica; y curva de
eficacia diagnóstica ROC (Response Operating Characteristic).
Cuando se utilizan muestras de orina, el incremento en la excreción
de mioinositol urinario entre antes de la sobrecarga de glucosa y
en un momento predeterminado tras la sobrecarga de glucosa se
encuentra comprendido en 0 y 20 \mug/mg de creatinina; o entre 5 y
15 \mug/mg creatinina; o, más preferentemente, entre 8 y 12
\mug/mg creatinina. Además, el valor característico puede cambiar
si se realiza en el futuro un examen a gran escala y se lleva a
cabo la determinación en personas sanas seleccionadas clínicamente.
Asimismo, el valor característico puede cambiar dependiendo de la
raza, sexo y edad de las poblaciones seleccionadas.
En la figura 1 se muestran los resultados del
estudio de los niveles de tio-NAD según el Ejemplo
de referencia 1.
En la figura 2 se muestran los resultados de la
prueba de estabilidad de los reactivos para el análisis de
mioinositol según el Ejemplo de referencia 2.
En la figura 3 se muestran los efectos de la
ADP-hexocinasa según el Ejemplo de referencia
3.
En la figura 4 se muestra la curva de
calibración de los niveles de mioinositol según el Ejemplo de
referencia 4.
En la figura 5 se muestra la relación entre el
nivel de mioinositol y \SigmaPG según el Ejemplo de referencia
1.
En la figura 6 se muestra la relación entre el
nivel de inositol y el índice insulinógeno según el Ejemplo de
referencia 2.
En la figura 7 se muestra la relación entre cada
grupo y \SigmaPG según el Ejemplo de referencia 3.
En la figura 8 se muestra la relación entre cada
grupo y el índice insulinógeno según el Ejemplo de referencia
4.
En la figura 9 se muestra la relación entre cada
grupo y el nivel de mioinositol según el Ejemplo de referencia
5.
En la figura 10 se muestra la relación entre
cada grupo y el nivel de mioinositol según el Ejemplo de referencia
6.
En la figura 11 se muestra la correlación entre
los niveles de mioinositol en orina en la prueba de tolerancia a la
glucosa y en la prueba de tolerancia a los alimentos según el
Ejemplo 7.
En la figura 12 se muestra la relación en cada
grupo entre \Delta mioinositol en la prueba de tolerancia a la
glucosa y \Delta mioinositol en la prueba de tolerancia a los
alimentos según el Ejemplo 8.
En la figura 13 se muestra la relación en las
personas con glucosa en orina negativa entre el nivel de
mioinositol en orina en la prueba de tolerancia a los alimentos y
las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa según el
Ejemplo 9.
A continuación se describirá de forma más
detallada la presente invención y sus realizaciones
preferentes.
Según la presente invención, la detección de
alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y del defecto
secretor de insulina se lleva a cabo determinando las cantidades de
mioinositol excretadas en la orina de un paciente antes de la
sobrecarga de glucosa y en un momento predeterminado tras la
sobrecarga de glucosa mediante el reactivo de la presente
invención; y realizando una comparación de una cantidad creciente o
una tasa creciente de mioinositol entre antes y después de la
sobrecarga de glucosa, estando definido por adelantado el valor
característico de las personas sanas.
La cantidad creciente se calcula como una
diferencia entre el contenido de mioinositol en un momento
predeterminado tras la sobrecarga de glucosa y el contenido de
mioinositol antes de la sobrecarga de glucosa, y la tasa creciente
se calcula como una relación entre el contenido de mioinositol en
un momento predeterminado tras la sobrecarga de glucosa y el
contenido de mioinositol antes de la sobrecarga de glucosa.
Para la concentración de mioinositol se puede
utilizar un valor realmente determinado, o puede utilizarse un
valor relativo con respecto a un índice estándar apropiado para
compensar la dilución de la orina con agua potable.
Preferentemente, el índice es un nivel de creatinina en orina. Los
pacientes incluyen a todas las personas, además de todos aquellos
de quienes se sospeche que puedan padecer enfermedades relacionadas
con el estilo de vida, tales como la diabetes.
Puede utilizarse cualquier cantidad de
sobrecarga de glucosa y cualquier tipo de método de sobrecarga de
glucosa No obstante, es preferible la administración oral de una
solución acuosa de 75 g de glucosa, como la que se utiliza en una
prueba típica de sobrecarga de glucosa o durante una ingesta de
alimentos.
Se pueden recoger muestras de orina antes de la
sobrecarga de glucosa y en cualquier momento hasta transcurridas 6
horas desde la sobrecarga de glucosa, preferentemente entre 30
minutos y 3 horas después de la sobrecarga de glucosa. El período
de recogida de orina se selecciona adecuadamente entre 30 minutos y
3 horas.
En los casos en los que se utiliza la orina como
muestra, ésta se recoge mediante un procedimiento no invasivo, de
forma que no hay necesidad de seleccionar un procedimiento, momento
y lugar de muestreo. Por ejemplo, el paciente puede preparar
fácilmente una muestra de ese tipo en su propia casa, en la
oficina, en el colegio o en lugares similares, y la muestra de
orina recogida se puede transportar directamente o en forma de un
papel de filtro sumergido en orina o de cualquier otra forma
adecuada, eliminándose de este modo la necesidad de acudir a
instituciones médicas o similares. Así pues, la presente invención
da a conocer un destacado procedimiento en el que, cuando se
impregna un papel de filtro o similar con orina, la muestra
entregada se extrae mediante un procedimiento adecuado y se utiliza
en la sencilla y rápida prueba analítica de la presente invención,
tras lo cual se remiten los resultados inmediatamente al
paciente.
En particular, se pueden controlar los niveles
de mioinositol en orina según resulte necesario, mientras que el
paciente continúa con su vida cotidiana como de costumbre, sin
sobrecarga de glucosa. Por ejemplo, es posible conocer el grado de
alteración de la tolerancia a la glucosa o el grado de defecto
secretor de insulina sirviéndose del nivel máximo de mioinositol o
de la diferencia entre el nivel máximo de mioinositol y el nivel
mínimo de mioinositol en un día. Además, el control de los niveles
de mioinositol en orina, según resulte necesario, permite que el
paciente reconsidere el contenido de su dieta y controle la
cantidad de ejercicio necesario para prevenir la diabetes o su
avance, al tiempo que disfruta de una vida normal.
Entre los procedimientos para el seguimiento de
los niveles de mioinositol en orina se incluyen cualesquiera tipos
de procedimientos capaces de detectar el mioinositol, por ejemplo,
un procedimiento que utiliza un papel reactivo en el que está
fijada una enzima que actúa sobre el mioinositol, y un
procedimiento para la detección electroquímica del mioinositol con
ayuda de un electrodo como detector, sobre el que está fijada una
enzima que actúa sobre el mioinositol.
En el procedimiento del papel reactivo, por
ejemplo, se genera peróxido de hidrógeno por acción de una oxidasa
y se hace reaccionar con peroxidasa para generar oxígeno activo, y
a continuación el oxígeno activo provoca la oxidación de un
cromógeno para conseguir coloración, cuya intensidad se puede
observar. Entre los cromógenos se pueden citar, sin limitación, el
yoduro de potasio, la tetrametilbenzidina, la
N-(3-sulfopropil)-3,3',5,5'-tetrametilbenzidina
de sodio, la 4-aminoantipirina, y la
O-tolidina.
Para la detección mediante un detector, por
ejemplo, cuando se utiliza oxidasa, se puede medir directamente el
peróxido de hidrógeno generado con ayuda de un electrodo; o se
puede medir la corriente de oxidorreducción obtenida mediante un
portador electrónico tal como un derivado de ferrocenos o un
derivado de quinonas, o se puede medir la magnitud de la corriente
eléctrica. De igual forma, cuando se utiliza deshidrogenasa, se
puede medir directamente la coenzima reducida con ayuda de un
electrodo; o se puede medir la corriente de oxidorreducción
obtenida mediante un portador electrónico o la magnitud de la
corriente eléctrica. En el documento "Biosensor and Quantitative
Assay of Substrate Using the Same (Application No. JP
09-263492)" (Biosensor y análisis cuantitativo
de sustratos utilizando el mismo (Solicitud nº JP
09-263492)) y similares se incluyen ejemplos.
Además, por ejemplo, se puede llevar a cabo el
seguimiento diario de los niveles de mioinositol en orina de forma
más sencilla incorporando el detector citado anteriormente
directamente en un retrete o similares, o en un dispositivo unido
al mismo. Un dispositivo de este tipo puede contar con funciones
adicionales de memorización de las mediciones y de conexión con una
terminal de un procesador de información. De este modo, aun cuando
el paciente se encuentre en una ubicación lejana, un médico o una
institución médica puede estar en contacto con el paciente a través
de un medio eléctrico con el propósito de gestionar los datos
vitales, prestar asesoramiento médico y examinar el grado de
alteración de la tolerancia a la glucosa y el grado de defecto
secretor de insulina, lo que se traducirá en una revisión del
contenido de la dieta, en el control de la cantidad de ejercicio
físico, en la mejora de la calidad de vida y en la prestación de
tratamiento médico.
En el caso de que se realice la determinación
cuantitativa de la glucosa y del mioinositol presentes en una
muestra a fin de detectar alteraciones ligeras de la tolerancia a
la glucosa y/o defecto secretor de insulina, esta determinación
cuantitativa del mioinositol se efectúa, preferentemente, mediante
el procedimiento de la presente invención, mientras que la glucosa
se puede determinar cuantitativamente con ayuda de cualesquiera
procedimientos convencionales.
Además, se puede realizar una gestión más
precisa combinando los resultados de la determinación con la
observación practicada por un médico. Además, dado que es posible
determinar el riesgo de desarrollar diabetes detectando el estado
previo a la diabetes, es decir, la prediabetes, y también
detectando a las personas con alteraciones ligeras de la tolerancia
a la glucosa o con defecto secretor de insulina que no se
encuentran actualmente en el estadio prediabético, pero que
presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o
prediabetes a corto plazo, aunque sea imposible conseguir dicho
descubrimiento mediante un marcador convencional, por ejemplo, este
riesgo puede servir como elemento de examen para seguros de vida, o
similares.
Para determinar cuantitativamente el mioinositol
presente en una muestra, se añaden entre 1 y 500 \muL de la
muestra a la composición para la determinación cuantitativa de
mioinositol de forma que se produzca una reacción a 37ºC y a
continuación se pueden determinar de forma directa o indirecta las
cantidades de una coenzima cambiadas durante varios minutos o varias
decenas de minutos entre dos puntos de tiempo desde que comienza la
reacción, por ejemplo 1 minuto entre 3 minutos y 4 minutos tras el
comienzo de la reacción, o durante 5 minutos entre 3 minutos y 8
minutos. En este caso, el contenido de mioinositol presente en la
muestra se puede determinar realizando una comparación con los
cambios en la absorbancia que se miden para concentraciones
conocidas de mioinositol.
La composición (reactivo) para la determinación
cuantitativa debe contener, como mínimo, una enzima que actúe sobre
el mioinositol y, preferentemente, contiene además una coenzima.
Además, se puede añadir al presente reactivo,
según resulte apropiado, un tensioactivo tal como el éter
octilfenílico de polioxietileno (OP-10).
Además, el presente reactivo se utiliza en forma
de un producto líquido, de un producto liofilizado o de un producto
congelado.
Para determinar cuantitativamente el mioinositol
presente en una muestra, se puede utilizar cualquier tipo de
procedimiento que se sirva de una enzima para determinar
cuantitativamente el mioinositol. La enzima que se puede utilizar en
la presente invención, que es capaz de determinar cuantitativamente
el mioinositol, incluye cualquier enzima que actúe, como mínimo,
sobre el mioinositol. No obstante, entre esas, es preferente la
mioinositol deshidrogenasa, siendo la más preferente la mioinositol
deshidrogenasa derivada de la especie Flavobacterium 671 (FERM
BP-7323, abreviada en lo sucesivo como F.sp.671).
Además, preferentemente, la mioinositol deshidrogenasa que se debe
utilizar tiene una contaminación lo más baja posible, o
inexistente, de sustancias que afecten negativamente a las
coenzimas, tales como el tio-NAD y NADH presente en
el reactivo, por ejemplo, sustancias cuya actividad descompone las
coenzimas, tales como la NADH oxidasa.
La cepa F.sp.671 se encuentra depositada a nivel
internacional con el número de depósito FERM
BP-7323 (fecha de depósito: 12 de octubre de 2000)
en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana,
Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio
e Industria Internacional, ubicado en
1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki,
Japón (actualmente: Depositario del Organismo Internacional de
Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial
Avanzada, Agencia Administrativa Independiente, ubicado en el
Centro 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba,
Ibaraki, Japón).
Para la detección del mioinositol, se puede
utilizar cualquier tipo de procedimiento capaz de detectar el
mioinositol. Entre estos procedimientos se incluyen: un
procedimiento que utiliza un reactivo de coloración bajo luz
visible, por ejemplo, normalmente una coloración amarilla con
tio-NAD, una coloración azul con azul de
nitrotetrazolio (NBT), o coloración roja con cloruro de
2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio
(INT); un procedimiento de luminiscencia; un procedimiento de
fluorescencia; un procedimiento que comprende la detección de un
cambio eléctrico; y una combinación de estos procedimientos con
técnicas de amplificación.
Además, utilizando un dispositivo compacto que
pueda incorporar cualquiera de los procedimientos anteriores, se
puede llevar a cabo la determinación del mioinositol en orina de
forma no invasiva sin restricción de tiempo ni de lugar.
La prueba analítica para la determinación de la
actividad de la mioinositol deshidrogenasa es la siguiente:
- Tampón Tris 100 mM (pH 8,5)
- Mioinositol 20 mM (Sigma Co., Ltd.)
- Dinucleótido de nicotinamida y adenina 2 mM (NAD) (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Diaforasa 5 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
- Azul de nitrotetrazolio al 0,025% (NBT; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- Triton-X100 al 1,5% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Se añade un mL de la anterior solución de
reacción a un pequeño tubo de ensayo. Tras ello, se incuba la
solución de reacción a 37ºC durante 5 minutos, se añaden a la misma
20 \mul de una solución enzimática diluida B veces y se mezcla
para comenzar la reacción. Una vez que la reacción ha transcurrido
exactamente durante 5 minutos, se añaden 2 mL de HCl 0,1 N y se
mezcla para detener la reacción. Se mide la absorbancia a 550 nm a
fin de obtener A1. Además, se utiliza la misma solución de
reacción, sin el mioinositol, para llevar a cabo una medición
similar y obtener la absorbancia A0. Se puede calcular la actividad
enzimática a partir de la siguiente ecuación.
U/mL=[(A1-A0)/18,3]
x [1/5] x [3,02/0,02] x
B
Los números de la ecuación tienen los siguientes
significados.
- 18,3:
- Coeficiente de absorción molar del NTB
- 5:
- Tiempo de reacción
- 3,02:
- Volumen total de solución de reacción
- 0,02:
- Volumen de solución enzimática
- B:
- Factor de dilución de la solución enzimática
Las propiedades de la mioinositol deshidrogenasa
derivada de la cepa F.sp.671 son las siguientes:
Esta enzima produce inososa y una coenzima
reducida en presencia, como mínimo, de mioinositol y una coenzima.
La coenzima incluye dinucleótidos de nicotinamida y adenina
(abreviados en lo sucesivo como NADs) tales como dinucleótido de
nicotinamida y adenina (NAD), dinucleótidos de nicotinamida y
acetilpiridina (acetil-NAD), dinucleótidos de
nicotinamida e hipoxantina (deamino-NAD),
dinucleótido de adenina y piridina aldehído
(aldehído-NAD), fosfato de dinucleótido de
nicotinamida y adenina (NADP), dinucleótido de tionicotinamida y
adenina (tio-NAD) y fosfato de dinucleótido de
tionicotinamida y adenina (tio-NADP).
En la tabla 1 se muestra la relación entre las
actividades relativas al utilizar cada coenzima (correspondiendo el
100% cuando se utiliza NAD como coenzima). Las actividades
relativas se determinaron cambiando la coenzima según el siguiente
procedimiento.
- Tampón:
- Tampón de glicina 100 mM (pH 10,0)
- Sustrato:
- Mioinositol 20 mM (Sigma Co., Ltd.)
- Coenzima:
- 2 mM
- \quad
- (NAD, tio-NAD, NADP, tio-NADP; Oriental Yeast Co., Ltd.)
\newpage
Se añade un mL de la anterior solución de
reacción a una cubeta de cuarzo. A continuación, la cubeta de
cuarzo se introduce en un espectrofotómetro ajustado a una
temperatura de 37ºC. La cubeta se incuba durante 5 minutos o más y
a continuación se añade a la misma 20 \mul de una solución
enzimática de aproximadamente 1,0 U/mL y se mezcla. La velocidad
inicial se calcula en función de un cambio de absorbancia por
minuto a una longitud de onda peculiar para cada coenzima reducida.
La velocidad inicial obtenida con cada coenzima se compara con la
velocidad inicial (100%) obtenida utilizando NAD como coenzima a
fin de obtener la actividad relativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según la prueba analítica de actividad relativa
descrita anteriormente, la medición se llevó a cabo utilizando la
misma concentración de D-quiroinositol,
D-manosa, D-fructosa,
D-galactosa, manitol, epiinositol o esciloinositol
en lugar del sustrato en la solución de reacción. La tabla 2 recoge
la actividad enzimática de cada sustrato, tomando la velocidad
inicial de la reacción con el mioinositol como 100%. Se revela que
la enzima derivada de la cepa F.sp.671 es deshidrogenasa con una
alta especificidad para el mioinositol.
Entre los sustratos utilizados se incluyen
D-manosa, D-fructosa,
D-galactosa, manitol,
D-quiroinositol (como antes: Wako Pure Chemical
Industries, Ltd.), mioinositol, epiinositol y esciloinositol (como
antes: Sigma Co., Ltd.).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Tras la prueba analítica de actividad relativa
descrita anteriormente, la medición se llevó a cabo utilizando
tampón Tris 100 mM (pH 7,0-9,0) y tampón de glicina
100 mM (pH 9,0-11,0) en lugar de tampón de glicina
100 mM de pH 10,0 en la solución de reacción. La medición mostró
que el pH óptimo era de aproximadamente 11,0 (sustrato:
mioinositol).
Se utilizó el gel TSK G300SW (0,75 \Phi x 600
mm), eluyente: tampón de fosfato 50 mM (pH 7,5) + 0,2 M
Na_{2}SO_{4} + 0,05% NaN_{3}, un juego de marcadores
moleculares de Oriental Yeast Co., Ltd. (Japón) y un cromatógrafo
fabricado por Shimadzu Corporation (Japón). Para la detección, se
midieron la absorbancia con UV de 280 nm y se midió la actividad de
cada fracción. Se utilizó mioinositol como sustrato en la medición
de la actividad, revelando el peso molecular de 40.000 \pm
10.000.
La enzima conservó prácticamente un 100% de
actividad remanente tras un tratamiento a 40ºC durante 15 minutos.
La solución enzimática de aproximadamente 5 U/mL se sometió a
tratamiento térmico durante 15 minutos. La actividad remanente se
midió siguiendo la prueba analítica de actividad enzimática
descrita anteriormente. En la medición de la actividad, se utilizó
mioinositol como sustrato.
Siguiendo la prueba analítica de actividad
relativa descrita anteriormente, se cambiaron la concentración de
mioinositol y las concentraciones de NAD y de
tio-NAD a fin de determinar los valores de Km
respectivos. Siguiendo la prueba analítica de actividad descrita
anteriormente, se cambió la concentración de sustrato a fin de
calcular el valor de Km.
- Valor Km para el sustrato
- Mioinositol: 1,7 \pm 0,2 mM
- Valor Km para la coenzima
- NAD: 0,04 \pm 0,01 mM
- Tio-NAD: 4,5 \pm 1 mM
Para realizar la determinación cuantitativa de
mioinositol con mayor sensibilidad, se puede seguir el
procedimiento de ciclación enzimática. En la siguiente ecuación se
ilustra un ejemplo del procedimiento de ciclación enzimática.
En la ecuación, A1 representa NAD(P) o
tio-NAD(P); A2 representa una forma reducida
de A1; B1 representa NAD(P) reducido cuando A1 es
tio-NAD(P) o
tio-NAD(P) reducido cuando A1 es
NAD(P); y B2 representa un producto oxidado de B1. Según se
emplea en el presente documento, NAD(P) representa
dinucleótido de nicotinamida y adenina y fosfato de dinucleótido de
nicotinamida y adenina.
Para la composición de la solución de la
reacción cuantitativa de mioinositol utilizando la ciclación
enzimática, se seleccionan apropiadamente dos o más coenzimas, en
vista de los valores Km de las coenzimas respectivas de mioinositol
deshidrogenasa, y similares, y posteriormente se ajusta el pH entre
los valores de pH óptimos para la reacción directa/reacción inversa
para conseguir un avance eficaz de la ciclación enzimática. Las
cantidades de A1 y de B1 deben estar en exceso con respecto al
contenido de mioinositol presente en una muestra y también en
exceso con respecto a los valores de mioinositol deshidrogenasa
para A1 y B1.
Al utilizar, por ejemplo, mioinositol
deshidrogenasa derivada de F.sp.671, los valores de Km para NAD y
tio-NAD son 0,04 mM y 4,5 mM, respectivamente. Para
la reacción de ciclación, se pueden seleccionar
tio-NAD y NADH como coenzimas. Las concentraciones
de Al y B1 se encuentran, preferentemente, entre 0,02 mM y 2 M, de
forma particularmente preferente entre 0,05 y 100 mM. La cantidad
de mioinositol deshidrogenasa se encuentra, preferentemente, entre
1 y 1000 U/mL, de forma particularmente preferente entre 1 y 100
U/mL. Las cantidades se pueden seleccionar adecuadamente sobre la
base del tipo y cantidad de la muestra de prueba, el contenido de
mioinositol en la muestra que se va a analizar, y similares; pero
también se admiten otras cantidades.
Cuando se utiliza hexocinasa como enzima para
eliminar los azúcares presentes en una muestra, se puede optar por
cualquier hexocinasa capaz de catalizar la reacción de glucosa a
glucosa-6-fosfato, como, por
ejemplo, la hexocinasa derivada de la especie Bacillus. La
hexocinasa preferente es aquella que presente una excelente
estabilidad térmica. La hexocinasa que presente una excelente
estabilidad térmica se puede obtener con el procedimiento descrito
en el documento "Stable Hexokinase and Production Method
Thereof" (Hexocinasa estable y método de fabricación de la misma)
(JP 2000-078982 A).
Dado que el ADP generado junto con la
glucosa-6-fosfato presenta cierto
efecto inhibidor sobre la reacción en el procedimiento de ciclación
enzimática, los presentes inventores han utilizado de manera
satisfactoria una hexocinasa dependiente de ADP simultáneamente con
hexocinasa a fin de mejorar sustancialmente la eliminación de
glucosa sin ninguna influencia sobre la reacción de la mioinositol
deshidrogenasa.
- Glc+ATP+Mg^{2+} ->G-6-P+ADP
- Glc+ADP+Mg^{2+} ->G-6-P+AMP
- ATP: 5'-trifosfato de adenosina
- ADP: 5'-difosfato de adenosina
- AMP: 5'-monofosfato de adenosina
La prueba analítica de la actividad de la
hexocinasa se lleva a cabo del siguiente modo.
- Tampón Tris 50 mM (pH 8,5) (Sigma Co., Ltd.)
- Glucosa 20 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- ATP 4 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 5 U/mL (Toyobo Co., Ltd.)
- NADP 1 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Cloruro de magnesio 10 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- Solución para disolver y diluir la enzima: Tampón Tris 50 mM (pH 8, 5)
Se añade un mL de la solución de reacción
anterior a una cubeta de cuarzo con una longitud de paso óptico de
1 cm, y se incuba a 37ºC durante 5 minutos. A continuación, se
añaden a la cubeta 20 \muL de la solución enzimática, que está
diluida B veces, y se mezcla para comenzar la reacción. La
absorbancia a 340 nm se mide desde el inicio de la reacción a fin
de obtener el cambio de absorbancia A1 por minuto, que muestra una
reacción lineal. De igual forma, se realiza una prueba ciega en una
reacción similar a fin de obtener el cambio de absorbancia A0 por
minuto, con la excepción de que se añaden 50 \muL de la solución
para disolver y diluir la enzima, en lugar de la solución
enzimática. Se calcula la actividad enzimática a partir de la
siguiente ecuación.
U/mL
=[(A1-A0)/6,22] x [1,02/0,02] x
B
Los números de la ecuación tienen los siguientes
significados.
- 6,22:
- Coeficiente de extinción milimolar del NADPH a 340 nm
- 1,02:
- Volumen total de solución de reacción (mL)
- 0,02:
- Volumen de solución enzimática utilizado en la reacción (mL)
- B:
- Factor de dilución de la solución enzimática
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
La prueba analítica de la actividad de la
hexocinasa dependiente de ADP se lleva a cabo del siguiente
modo.
- Tampón Tris 50 mM (pH 7,5)
- Solución de glucosa 20 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- Solución de ADP 2 mM (pH 7,0) (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 5 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
- Solución de NADP 1 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Solución de cloruro de magnesio 2 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- Solución para disolver y diluir la enzima: Tampón Tris 10 mM (pH 7, 5)
Se añaden tres mL de la anterior solución de
reacción a un pequeño tubo de ensayo, y se incuba a 37ºC durante 5
minutos. A continuación, se añaden a la cubeta 50 \muL de la
solución enzimática, que está diluida B veces, y se mezcla para
comenzar la reacción. La absorbancia a 340 nm se mide desde el
inicio de la reacción a fin de obtener el cambio de absorbancia A1
por minuto, que muestra una reacción lineal. De igual forma, se
realiza una prueba ciega en una reacción similar a fin de obtener
el cambio de absorbancia A0 por minuto, con la excepción de que se
añaden 50 \muL de la solución para disolver y diluir la enzima,
en lugar de la solución enzimática. Se calcula la actividad
enzimática a partir de la siguiente ecuación.
U/mL
=[(A1-A0)/6,22] x [3,05/0,05] x
B
Los números de la ecuación tienen los siguientes
significados.
- 6,22:
- Coeficiente de extinción milimolar del NADPH a 340 nm
- 3,05:
- Volumen total de solución de reacción (mL)
- 0,05:
- Volumen de solución enzimática utilizado en la reacción (mL)
- B:
- Factor de dilución de la solución enzimática
La cantidad de hexocinasa se encuentra,
preferentemente, entre 1 y 1.000 U/mL, de forma particularmente
preferente entre 1 y 100 U/mL. La cantidad de hexocinasa
dependiente de ADP se encuentra, preferentemente, entre 1 y 1.000
U/mL, de forma particularmente preferente entre 1 y 100 U/mL. Las
cantidades se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo
y cantidad de la muestra de prueba, y también se pueden utilizar
otras cantidades.
Además, para la determinación del mioinositol en
orina en un amplio rango de su concentración con buena
reproducibilidad, se debe realizar una reacción de ciclación
enzimática de forma eficaz. Como resultado de un examen intensivo
de las concentraciones y relación entre tio-NAD y
NADH, dos coenzimas que se utilizan en la reacción de ciclación
enzimática, Los presentes inventores han descubierto que el nivel
de tio-NAD es preferentemente de 0,01 mM o más, de
forma particularmente preferente entre 2 y 10 mM en una
concentración final y la relación entre
NADH/tio-NAD se encuentra, preferentemente, entre
0,01 y 0,5, de forma particularmente preferente entre 0,01 y 0,1. No
obstante, las cantidades se pueden seleccionar adecuadamente
dependiendo del tipo y cantidad de la muestra de prueba, y también
se pueden aplicar otras cantidades.
Los ejemplos de la presente invención y los
ejemplos de referencia se describirán con detalle, pero la presente
invención no se limita a ellos.
Ejemplo de referencia
1
- MES 5 mM (ácido 2-morfolinoetanosulfónico) (pH 6,0)
- Tio-NAD entre 0 y 40 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
\global\parskip1.000000\baselineskip
- Bicina 200 mM (pH 9,0)
- NADH 0,3 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Mioinositol deshidrogenasa 25 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
\vskip1.000000\baselineskip
El dispositivo de medición utilizado fue un
Autoanalyzer 71705 (Hitachi Chemical Co., Ltd.). A 3 \muL de
solución de mioinositol en concentraciones comprendidas entre 0 y
3.000 \muM, se añadieron 180 \muL del reactivo
R-1 y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos, seguido
de la adición de 180 \muL de reactivo R-2 para
comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm
transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a
continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una
tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltarABS/min) y
seguidamente se investigó la sensibilidad con respecto a la
solución estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se recogen en la figura 1. Según
se muestra en la figura 1, utilizando tio-NAD a
concentraciones finales de entre 0,1 y 10 mM, se observó la
linealidad de la curva de calibración en el intervalo de
concentraciones de mioinositol de entre 0 y 3.000 \mum. Además, se
ha descubierto que la concentración final de
tio-NAD se encuentra preferentemente entre 2 y 10 mM
a fin de potenciar la sensibilidad de la detección de
mioinositol.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
- MES 5 mM (pH 6,0)
- Tio-NAD 5 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Tampón 100 mM (pH 8,8)
- NADH 0,5 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Mioinositol deshidrogenasa 10 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos R-2 para la
determinación cuantitativa del mioinositol se prepararon siguiendo
la composición mostrada anteriormente, seleccionándose un tampón
entre:
- Tris (Tris(hidroximetil)aminometano),
- Tricina (N-Tris(hidroximetil)metilglicina),
- Bicina (N,N-bis(hidroxietil)glicina),
- TAPS (ácido N-Tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico),
- TEA (trietanolamina),
- CHES (ácido 2-ciclohexilamino)etanosulfónico), y
- AMPSO (ácido 3-((1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino)-2-hidroxipropanosulfónico).
\newpage
El dispositivo de medición utilizado fue un
Autoanalyzer 71705 (Hitachi Chemical Co., Ltd.). A 15 \muL de
solución patrón 100-\muM de mioinositol preparada
de antemano, se añadieron 180 \muL del reactivo
R-1 y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos, seguido
de la adición de 60 \muL de reactivo R-2 para
comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm
transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a
continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una
tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltamABS/min) y
seguidamente se investigó la sensibilidad con respecto a la
solución estándar. Se evaluó la estabilidad de cada reactivo
R-2 mediante una prueba de aceleración en la que se
almacenó sólo el reactivo R-2 en una incubadora a
30ºC durante 20 días, tras lo cual se llevó a cabo la misma prueba
descrita anteriormente en el 7º, 12º y 20º días.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se recogen en la figura 2. Los
tampones que muestran una sensibilidad estable en comparación con
la solución patrón fueron Tris, Tricina, Bicina y TEA; y el tampón
con la sensibilidad más estable fue Bicina
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
3
- MES 5 mM (pH 6,0)
- MgCl_{2} 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- ATP 8 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Tio-NAD 10 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- ATP-hexocinasa 10 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
- ADP-hexocinasa entre 0 y 4 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
- Bicina 200 mM (pH 9,0)
- NADH 0,3 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Mioinositol deshidrogenara 25 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
\vskip1.000000\baselineskip
El dispositivo de medición utilizado fue un
Autoanalyzer 71705 (Hitachi Chemical Co., Ltd.). Se prepararon
muestras mezclando 100 \muL de solución de mioinositol 2.000
\muM y 1 mL de solución de glucosa de entre 0 y 10 g/dL. A 3
\muL de cada muestra, se añadieron 180 \muL del reactivo
R-1 y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos, seguido
de la adición de 180 \muL de reactivo R-2 para
comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm
transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a
continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una
tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltamABS/min) y
seguidamente se investigó la sensibilidad de las muestras
respectivas.,
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se recogen en la figura 3. Tal y
como resulta evidente en la figura 3, cuando se utiliza la
ATP-hexocinasa sola, el aumento del nivel de
glucosa, por ejemplo, hasta 10 g/dL, tiene influencia sobre la
sensibilidad. Por el contrario, cuando se utiliza la
ATP-hexocinasa junto con la
ADP-hexocinasa, el aumento del nivel de glucosa no
influye en la sensibilidad. Esto indica que la glucosa presente en
una muestra se puede eliminar mediante la reacción simultánea con
ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa y,
por tanto, se puede determinar de forma más precisa el nivel de
mioinositol.
\newpage
Ejemplo de referencia
4
Reactivo para el análisis del mioinositol
- MES 5 mM (pH 6,0)
- NaN_{3} al 0,05% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- OP-10 al 0,05% (Nippon Chemicals)
- MgCl_{2} 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- ATP 8 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Tio-NAD 10 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- ATP-hexocinasa 10 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
- ADP-hexocinasa 4 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
- Bicina 200 mM (pH 9,0)
- NaN_{3} al 0,05 ó (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- KHCO_{3} 40 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
- NADH 0,3 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
- Mioinositol deshidrogenasa 25 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
El dispositivo de medición utilizado fue un
Autoanalyzer 7170S (Hitachi Chemical Co., Ltd.). A 3 \muL de la
solución de mioinositol preparada de antemano, se añadieron 180
\muL del reactivo de eliminación de la glucosa y se incubó a 37ºC
durante 4,8 minutos para la reacción de eliminación de la glucosa,
y seguidamente se añadieron a la misma 180 \muL del reactivo para
la determinación cuantitativa del mioinositol a fin de comenzar la
reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm transcurridos 5,4 y
7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a continuación se
calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una tasa creciente de
absorbancia por minuto (\DeltamABS/min).
Los resultados se recogen en la figura 4. Según
se muestra en la figura 4, el presente reactivo analítico permitió
realizar la determinación cuantitativa del mioinositol de una forma
sencilla. El intervalo de medición del mioinositol fue de 0 a 2,000
\muM y el límite inferior de detección fue de 10 \muM cuando el
límite inferior de detección se definió como la concentración
mínima, que no se superpone con "la media de \DeltamABS/min + 2
x desviación típica" obtenida mediante múltiples mediciones de
mioinositol 0 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ciento doce pacientes participaron en la prueba
estándar de sobrecarga oral de 75 g de glucosa. Se extrajeron
muestras de sangre justo antes de la sobrecarga de glucosa y
transcurridos 30, 60, 120 y 180 minutos después de la sobrecarga de
glucosa a fin de determinar los niveles de glucosa y de insulina en
sangre. Simultáneamente, se recogieron muestras de orina justo
antes de la sobrecarga de glucosa y transcurridos 60, 120 y 180
minutos desde la sobrecarga de glucosa a fin de determinar los
niveles de mioinositol, glucosa en orina y creatinina.
Glucosa en sangre: Procedimiento con electrodos
(Kyoto Daiichi Kagaku Corporation: GA-1160)
Insulina: Procedimiento con anticuerpo RIA2
Reactivo para el análisis del mioinositol: el
mismo del ejemplo 4
Glucosa en orina: Procedimiento con electrodos
(Kyoto Daiichi Kagaku Corporation: GA-1160)
Creatinina: Prueba Creatinina-AH
de Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Como índice de tolerancia a la glucosa se
utilizó \SigmaPG, el total de los niveles de glucosa en sangre
justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa, y
transcurridos 30, 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa.
Se determinó el nivel de mioinositol y el nivel de creatinina en
las muestras de orina respectivas justo antes de la sobrecarga oral
de 75 g de glucosa y transcurridos 30, 60 y 120 minutos desde la
sobrecarga de glucosa a fin de calcular la relación entre la
cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la
orina (mioinositol/creatinina). Además, se utilizó la \Delta del
contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min -
contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido
de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la
sobrecarga)/2] como índice del nivel de mioinositol entre antes y
después de la sobrecarga de glucosa. Se investigó la relación entre
\SigmaPG y la \Delta del contenido de mioinositol.
Los resultados se recogen en la tabla 3 y en la
figura 5. Según se muestra en la figura 5, \SigmaPG y \Delta
del contenido de mioinositol mostraron una muy buena correlación. Un
mayor \SigmaPG indica que los niveles de glucosa en sangre se
mantienen altos tras la sobrecarga de glucosa y, por tanto, la
presencia de alteraciones de la tolerancia a la glucosa. Además,
por ejemplo, si el valor característico de la \Deltamioinositol
está fijado en 10 \mug/mg Cre (creatinina), es posible realizar
una detección eficaz en los casos que presenten alteraciones
ligeras de la tolerancia a la glucosa con un nivel \SigmaPG de
aproximadamente 530 mg/dL.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los mismos del ejemplo 1.
Los mismos del ejemplo 1.
Se determinaron los niveles de mioinositol y los
niveles de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la
sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos
desde la sobrecarga de glucosa, y a continuación se obtuvo la
relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de
creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina). Además,
se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de
mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la
sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min -
contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del
nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de
glucosa. Se investigó la relación entre el índice insulinógeno
(I.I) y la \Delta del contenido de mioinositol.
Los resultados se recogen en la figura 6. Según
se muestra en la figura 6, se calculó la relación entre el índice
insulinógeno y la \Delta del contenido de mioinositol. En un gran
porcentaje de los casos en los que la \Delta del contenido de
mioinositol fue de 15 \mum/mg Cre o superior, el índice
insulinógeno resultó ser inferior a 0,4. Según las directrices de
la Sociedad Japonesa de la Diabetes, un índice insulinógeno
inferior a 0,4 puede indicar la presencia de secreción precoz
alterada de insulina. Según resulta evidente en vistas de la figura
6, si el valor característico de la \Deltamioinositol es de 15
\mug/mg Cre, se puede realizar una detección eficaz en los casos
en los que el índice insulinógeno sea inferior a 0,4, o que
presenten una secreción precoz alterada de insulina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mismos del ejemplo 1.
Los mismos del ejemplo 1.
Se determinaron los niveles de mioinositol y los
niveles de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la
sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos
desde la sobrecarga de glucosa. A continuación, se obtuvo la
relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de
creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina). Al mismo
tiempo, también se obtuvieron los niveles de glucosa en orina. Se
utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de
mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la
sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min -
contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del
nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de
glucosa.
El caso que presentó un \Delta del contenido
de mioinositol de 10 \mug/mg Cre o superior se marcó con un signo
más (+), mientras que el resto de casos se marcaron con un signo
menos (-). Del mismo modo, en el caso de la glucosa en orina, el
caso que presentó un nivel de glucosa en orina de 50 mg/dL o
superior transcurridas 2 horas desde la sobrecarga de glucosa se
marcó con un "+", mientras que el resto de casos se marcaron
con un "-". Se utilizaron los valores de \SigmaPG calculados
en el ejemplo 5.
De los 112 pacientes analizados, 52 pacientes se
encontraron en el grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina
(-), 12 pacientes se encontraron en el grupo \Deltamioinositol (+)
y glucosa en orina (-), y 48 pacientes se encontraron en el grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+). Ningún paciente se
incluyó en el grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (+).
Se compararon entre sí los valores \SigmaPG respectivos del grupo
\Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), del grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-), y del grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los resultados se recogen en la figura 7. Según
se muestra en la figura 7, la media y la desviación típica de los
valores de \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en
orina (-) fueron 453 mg/dL y 76.6 mg/dL, respectivamente. La media
y la desviación típica de los valores de \SigmaPG del grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) fueron 556 mg/dL y
81,1 mg/dL, respectivamente. La media y la desviación típica de los
valores de \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa
en orina (+) fueron 791 mg/dL y 164,8 mg/dL, respectivamente.
Además, comparado con el valor \SigmaPG del grupo
\Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), el valor \SigmaPG
del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) resultó
significativamente más alto, y también el valor \SigmaPG del grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) resultó
significativamente mucho más alto. Todo esto muestra que el grado
de alteración de la tolerancia a la glucosa se podría determinar de
forma no invasiva obteniendo conjuntamente el mioinositol en orina
y la glucosa en orina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mismos del ejemplo 1.
Los mismos del ejemplo 1.
El mismo del ejemplo 3
El caso que presentó un \Delta del contenido
de mioinositol de 10 \mug/mg Cre o superior se marcó con un signo
más (+), mientras que el resto de casos se marcaron con un signo
menos (-). Del mismo modo, en el caso de la glucosa en orina, el
caso que presentó un nivel de glucosa en orina de 50 mg/dL o
superior transcurridas 2 horas desde la sobrecarga de glucosa se
marcó con un "+", mientras que el resto de casos se marcaron
con un "-". Se utilizaron los valores del índice insulinógeno
calculados en el ejemplo 2.
Se compararon entre sí los valores del índice
insulinógeno respectivos (\DeltaIRI
30-0/\DeltaPG 30-0) del
grupo
\Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-), y del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+).
\Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-), y del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+).
Los resultados se recogen en la figura 8. Según
se muestra en la figura 8, la media y la desviación típica de
\DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0
del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-) fueron
1,32 y 0,79, respectivamente. La media y la desviación típica de
\DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del
grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) fueron 0,45 y
0,42, respectivamente. La media y la desviación típica de
\DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del
grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) fueron 0,16 y
0,19, respectivamente. Además, comparado con el valor 4IRI
30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo
\Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), el valor \DeltaIRI
30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) resultó
significativamente más bajo, y también el valor \DeltaIRI
30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo
\Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) resultó
significativamente mucho más bajo. Todo esto muestra que el grado
de secreción precoz alterada de insulina se podría determinar de
forma no invasiva obteniendo conjuntamente el mioinositol en orina
y la glucosa en orina.
\vskip1.000000\baselineskip
De los mostrados en el ejemplo 1, 59 pacientes
evaluados como NGT que presentaron un nivel de glucosa en sangre en
ayunas inferior a 110 mg/dL y el nivel de glucosa dos horas después
de la sobrecarga inferior a 140 mg/dL.
Los mismos del ejemplo 1.
De los pacientes evaluados como NGT, se
denominan grupo B a aquéllos que presentaron el nivel de glucosa
una hora después de la sobrecarga de 180 mg/dL o superior o el
nivel de glucosa dos horas después de la sobrecarga de 120 mg/dL o
superior, mientras que los casos que mostraron una tolerancia a la
glucosa ligeramente reducida (alteraciones ligeras de la tolerancia
a la glucosa) junto con todos los demás se denominaron grupo A. De
los cincuenta y nueve pacientes del grupo NGT, 45 pacientes
pertenecieron al grupo A y 14 pacientes pertenecieron al grupo B.
Se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad
de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina) en los
grupos A o B determinando los niveles de mioinositol y los niveles
de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la sobrecarga
oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos desde la
sobrecarga de glucosa.
Además, se utilizó la \Delta del contenido de
mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de
mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol
a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2]
como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la
sobrecarga de glucosa.
Los resultados se recogen en la figura 9. Según
se muestra en la figura 9, la media de la \Delta del contenido de
mioinositol del grupo A fue de 3,9 \mug/mg Cre, mientras que la
media de la \Delta del contenido de mioinositol del grupo B fue de
25,8 \mug/mg Cre. En comparación con el grupo A, el grupo B
(alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa) con una
tolerancia a la glucosa ligeramente reducida presentó una mayor
\Delta del contenido de mioinositol.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mismos del ejemplo 1.
Los mismos del ejemplo 1.
De los pacientes evaluados como NGT, se incluyen
en el grupo B aquéllos con un índice insulinógeno inferior a 0,4,
mientras que el resto de los pacientes se incluyen en el grupo A.
De los cincuenta y nueve pacientes del grupo NGT, 37 pacientes
pertenecieron al grupo A y 22 pacientes pertenecieron al grupo B.
Se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la
cantidad de creatinina excretada en la orina
(mioinositol/creatinina) en los grupos A o B determinando los
niveles de mioinositol y los niveles de creatinina en cada muestra
de orina justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa y
transcurridos 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa.
Además, se utilizó la \Delta del contenido de
mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de
mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol
a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2]
como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la
sobrecarga de glucosa.
Los resultados se recogen en la figura 10. Según
se muestra en la figura 10, la media de la \Delta del contenido
de mioinositol del grupo A fue de 4,4 \mug/mg Cre, mientras que la
media de la \Delta del contenido de mioinositol del grupo B fue de
16, 9 \mug/mg Cre. En comparación con el grupo A, el grupo B con
secreción precoz alterada de insulina presentó una mayor \Delta
del contenido de mioinositol.
\vskip1.000000\baselineskip
De los mostrados en el Ejemplo 1, 52 pacientes
que accedieron a someterse a la prueba de sobrecarga de alimentos,
que incluyeron 22 pacientes NGT (grupo C), 14 pacientes de tipo
límite (grupo B) y 16 pacientes de diabetes mellitus (grupo D). Se
extrajeron muestras de sangre antes de la ingesta de alimentos y
transcurridos 120 minutos desde la ingesta, y se determinó el nivel
de glucosa en sangre y el nivel de insulina. Además, se recogieron
muestras de orina antes de la ingesta de alimentos y transcurridos
120 minutos desde la ingesta, y a continuación se determinó el
nivel de mioinositol, el nivel de glucosa en orina y el nivel de
creatinina.
Los mismos del ejemplo 1.
Tras la recogida de las muestras de sangre y de
orina en ayunas, los pacientes ingirieron una comida. La comida
estaba formada por alimentos cocinados en envases flexibles
esterilizables (Wellness Menus (Nichirei Corporation) y arroz
hervido envasado (Sato Foods Industries, Co., Ltd.)) con un
contenido de 91,6 g de hidratos de carbono, 31,0 g de proteínas,
13,9 g de grasas y 1,1 g de sodio con un aporte energético de 662
kcal. Transcurridos 120 minutos desde la comida, se recogieron
muestras de sangre y muestras de orina. Se obtuvo la relación entre
la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en
la orina (mioinositol/creatinina) determinando el nivel de
mioinositol y el nivel de creatinina en cada muestra de orina.
Además, se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol
[(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol
antes de la sobrecarga)] como índice del contenido de mioinositol
entre antes y después de la comida.
La figura 11 muestra la relación entre la
\Deltamioinositol (eje X) en la prueba de sobrecarga de glucosa y
la \Delta mioinositol (eje Y) en la prueba de sobrecarga de
alimentos. Según se muestra en la figura 11, la \Deltamioinositol
en la prueba de sobrecarga de glucosa y la \Deltamioinositol en la
prueba de sobrecarga de alimentos presentaron una muy buena
correlación (Y=1,044X-2,0, r=0,83, P<0,0001) y
tomaron prácticamente los mismos valores. Estos resultados revelan
que las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o el
defecto secretor de insulina se pueden detectar determinando los
niveles de mioinositol en orina antes de una ingesta de alimentos,
aun cuando no se realice una prueba de sobrecarga de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mismos del ejemplo 7.
Los mismos del ejemplo 1.
El mismo del ejemplo 7
La figura 12 muestra la relación entre la
\Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de glucosa y la
\Delta mioinositol en la prueba de sobrecarga de alimentos para
cada grupo. Según se muestra en la figura 12, la
\Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de glucosa y la
\Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de alimentos
resultaron muy coherentes entre sí para cada grupo. Estos
resultados revelan que las alteraciones ligeras de la tolerancia a
la glucosa y el defecto secretor de insulina se pueden detectar
determinando los niveles de mioinositol en orina antes y después de
una ingesta de alimentos, aun cuando no se realice una prueba de
sobrecarga de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
De los mostrados en el ejemplo 7, 32 personas
que presentaron glucosa en orina negativa (inferior a 50 mg/dL) 2
horas después de la comida.
Los mismos del ejemplo 1.
El mismo del ejemplo 7, con la excepción de que
las personas con una \Deltamioinositol de 7 \mug/mg Cre o
superior en la prueba de sobrecarga de alimentos se incluyeron en
el grupo (+), mientras que el resto se incluyó en el grupo (-).
Los resultados se recogen en la figura 13. Según
se muestra en la figura 13, incluso en el caso de las personas con
glucosa en orina negativa 2 horas después de la comida, muchas de
las personas del grupo \Deltamioinositol (+) presentaron mayores
\SigmaPG en la prueba de sobrecarga de glucosa, en comparación
con las pertenecientes al grupo \Deltamioinositol (-). Estos
resultados revelan que, incluso en el caso de las personas con
glucosa en orina negativa 2 horas después de la comida, el grado de
alteración de la tolerancia a la glucosa se puede determinar de
forma no invasiva mediante la determinación de los niveles de
mioinositol en orina antes y después de una ingesta de
alimentos.
Según lo descrito anteriormente, la presente
invención da a conocer un procedimiento para la detección de
alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o de la
secreción precoz alterada de insulina de una forma no invasiva y
cómoda con una buena reproducibilidad.
(1) (a) Nombre y dirección de la organización
depositaria, en la que se han depositado los presentes materiales
biológicos:
Nombre: Depositario del Organismo Internacional
de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial
Avanzada;
Dirección: Centro 6 Tsukuba,
1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki,
Japón;
(b) Fecha de depósito en la organización citada
en (a): 12 de octubre de 2000 (fecha del depósito original);
(c) Número de depósito para el depósito otorgado
por la organización citada en (a): FERM BP-7323.
Claims (9)
1. Método para la eliminación de glucosa en una
muestra, caracterizado porque se utilizan simultáneamente
ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa
para la reacción de eliminación de glucosa en la muestra.
2. Método para la determinación cuantitativa del
nivel de mioinositol en una muestra utilizando enzimáticamente
mioinositol dehidrogenasa en presencia de tio-NAD y
NADH, caracterizado porque se utilizan en combinación dos
tipos de cinasas, de manera que dichos dos tipos de cinasas son
ATP-hexocinasa y un agente eliminador de ADP.
3. Método para la determinación cuantitativa del
nivel de mioinositol, según la reivindicación 2, en el que el
agente eliminador de ADP es ADP-hexocinasa.
4. Compuesto para la determinación cuantitativa
de mioinositol, caracterizado porque el compuesto comprende
como mínimo:
- 1)
- tio-NAD;
- 2)
- NADH;
- 3)
- mioinositol dehidrogenasa;
- 4)
- dos tipos de cinasas, de manera que dichos dos tipos de cinasas son ATP-hexocinasa y un agente eliminador de ADP.
5. Compuesto para la determinación cuantitativa
de mioinositol, según la reivindicación 4, en el que el agente
eliminador de ADP es ADP-hexocinasa.
6. Compuesto para la determinación cuantitativa
de mioinositol, según las reivindicaciones 4 ó 5,
caracterizado porque el compuesto comprende además un tampón
seleccionado entre:
Bicina(N,N-Bis(hidroxietil)glicina),
Tris(Tris(hidroximetil)aminometano);
TEA(Trietanolamina), y
Tricina(N-Tris(hidroximetil)-metilglicina).
7. Compuesto para la determinación cuantitativa
de mioinositol, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6,
caracterizado porque la concentración final de
tio-NAD es de 0,1mM o más.
8. Compuesto para la determinación cuantitativa
de mioinositol, caracterizado porque la concentración final
de tio-NAD es de 2 a 10 mM.
9. Método para la eliminación de la glucosa de
una muestra, que comprende como mínimo las siguientes fases:
hacer reaccionar ATP con glucosa de la muestra
para convertirlas en ADP y
glucosa-6-fosfato; y
hacer reaccionar el ADP obtenido de este modo
con glucosa de la muestra para convertirlas en AMP y
glucosa-6-fosfato.
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|---|---|---|---|
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