WO2006107094A1 - グルコースの測定方法及び測定試薬 - Google Patents

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Suzuyo Shibata
Tatsuhiko Tanaka
Haruyo Soya
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Definitions

  • the present invention relates to a glucose measuring method and reagent, and a method for reducing errors due to fructose during glucose measurement.
  • the present invention is particularly useful in fields such as chemistry, life science, analytical chemistry, and clinical testing. Background art
  • Glucose is the most important substance as a biological energy source, and the concentration of glucose in a biological sample is regulated by various factors such as sugar absorption from the intestinal tract, gluconeogenesis in the liver, and synthesis and degradation of glycogen. Yes.
  • glucose in biological samples is the most powerful in diagnosing diabetes and is an indispensable test for detecting hypoglycemia and diagnosing endocrine diseases.
  • a reduction method, a condensation method, an enzymatic measurement method, and the like are used as a reduction method, a condensation method, an enzymatic measurement method, and the like.
  • an enzymatic measurement method for example, a method using glucose oxidase, a method using glucose dehydrogenase, or hexokinase (hereinafter sometimes abbreviated as HK) and glucose mono-phosphate dehydration are used. And the like (hereinafter also abbreviated as HK-G 6 PDH method).
  • the measurement principle of the HK-G 6 PDH method is as follows. Darcos in the sample produces glucose mono-phosphate and adenosine-5'-diphosphate by the action of hexokinase in the presence of adenosine-5'-triphosphate. This glucose-6-phosphate is converted to 6-phosphodarconic acid by the action of G 6 PDH, and at the same time oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter sometimes abbreviated as NAD) or oxidized nicotinamide adenine dinuclear acid.
  • NAD oxidized nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP Leotidolinic acid
  • N AD H nicotine amide adenine dinucleotide
  • NA DPH reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the HK-G 6 PDH method is widely used in clinical tests as a method that can accurately measure glucose (for example, clinical test method revised 3rd edition, pages 524-529, 1990) .
  • the concentration of dalcose in normal rabbit serum is 3.5 to 8 mM (65 to 105 mg / d L), whereas hexokinase glucose Since the Km value is as low as several mM, the end point method has been considered an appropriate measurement method. However, in diabetics, etc., the glucose concentration in urine is higher than that in healthy people (about 1 O gd L). Needed to be diluted.
  • the HK-G 6 P D H method has a problem that when glucose is present in the sample, the measured value of glucose receives a positive error.
  • an object of the present invention is to provide a method and a reagent capable of accurately measuring the dalcose concentration even in a sample containing fructose.
  • the present inventor has found that boric acid or glucose in a method for measuring dalcose in a sample using hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. It has been found that by containing the derivative or a salt thereof, the concentration of darcose can be accurately measured even in a sample containing Fruc I ⁇ I, and the present invention has been completed. That is, the present invention provides the following inventions.
  • a measurement method for measuring glucose using hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase the measurement is performed in the presence of boric acid or a derivative thereof or a salt thereof. Measuring method of glucose.
  • Hexokinase glucose-6-phosphate dehydrogenase, adenosine 1 5'-triphosphate, oxidized nicotinamide adenine dinucleotide or oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, and boric acid or its derivatives
  • a glucose measurement reagent comprising these salts.
  • the glucose concentration can be accurately measured even in a sample containing fructose. It is. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention relates to a method for measuring glucose, comprising boric acid or a derivative thereof or a salt thereof, in a method for measuring glucose using hexokinase and glucose monophosphate dehydrogenase, Reduces errors due to glucose measurement reagents containing boric acid or its derivatives or their salts in glucose measurement reagents containing kinase and glucose monophosphate 6-phosphate dehydrogenase, and fructose It is a method to do.
  • boric acid or its derivatives or salts thereof include boric acid, tetraboric acid, phenylboronic acid, sodium borate, potassium borate, magnesium borate, lithium borate, calcium borate, and sodium tetraborate.
  • Liu ⁇ , Potassium tetraborate, Magnesium tetraborate, Lithium tetraborate, Calcium tetraborate, Sodium phenylboronate, Phenylboronate Liu Can be mentioned.
  • the concentration of this boric acid or its derivative or a salt thereof is not particularly limited.
  • it in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent, it is in the range of 0.5 to 40 OmM.
  • the range of 5 to 100 mM is particularly preferable.
  • the concentration of boric acid or a derivative thereof or a salt thereof does not cause a problem even if the concentration exceeds 40 OmM, but a sufficient effect is obtained up to that amount.
  • Tetraborate salts such as sodium tetraborate are known to decompose into 4 molecules of hydrofluoric acid in an aqueous solution. Therefore, tetraborate is used as boric acid or its derivatives or salts thereof. When used, for example, it can be set to one-fourth of the above-mentioned concentration range.
  • the concentration of boric acid or a derivative thereof or a salt thereof may be in the above range.
  • the step method two-reagent system
  • the concentration of boric acid or its derivative or salt in the measurement reaction solution after mixing is in the above range.
  • Boric acid or a derivative thereof or a salt thereof may be contained in either the first reagent or the second reagent.
  • boric acid or its derivative or a salt thereof in the measurement reaction solution after mixing falls within the above concentration range, boric acid or its derivative or these salts are contained in the first and second reagents. It may be included in both. The same applies when the measurement method and measurement reagent are multi-step methods (3 or more reagents).
  • glucose in a sample is measured using hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase may be derived from any origin, and for example, the following can be used.
  • hexokinase examples include those collected from yeast or microorganisms such as Saccharomyces, Aspergillus, and Leuconococcus. Also included are those produced by gene recombination technology that incorporates these genes into microorganisms such as E. coli, or those whose properties have been improved by genetic modification.
  • the concentration of hexokinase varies depending on the origin of the enzyme, etc., but it is in the range of 50 to 500 U / L in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent. It is particularly preferable that the range of 200 to 2700 U / L is particularly preferable.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase examples include those collected from microorganisms such as Leuconostoc genus, Bacillus genus, Pedi genus Coccus genus, and Saccharomyces genus. Also included are those produced by genetic recombination technology that incorporates these genes into microorganisms such as E. coli, or those whose properties have been improved by genetic modification.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase varies depending on the origin of the enzyme, etc., but in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent, 300 to 10 A range of 0 0 0 UZL is preferable, and a range of 6 0 0 to 4 80 0 U / L is particularly preferable.
  • glucose in a sample may be measured by a reaction rate method.
  • the antagonistic inhibitor for hexokinase may be any one that can make the apparent Km value of hexokinase to glucose higher than the glucose concentration in the measurement system.
  • Examples of competitive inhibitors for hexokinase used in the present invention include N-benzoyldarcosamine, N-acetyldarcosamine and the like.
  • the concentration of the competitive inhibitor for hexokinase is preferably in the range of 10 to 30 OmM, particularly preferably in the range of 30 to 10 OmM, in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent. .
  • the concentration of adenosine-5′-triphosphate used in the present invention is preferably in the range of 0.5 to 50 mM in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent, A range of ⁇ to 15 mM is particularly preferred.
  • the concentration of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide or oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate may be in the range of 0.2 to 2 OmM in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent. Preferably, a range of 0.5-4 mM is particularly preferred.
  • magnesium salts in addition to the above components, magnesium salts, known preservatives, stabilizers and the like can be appropriately used as necessary.
  • the pH during glucose measurement is preferably in the range of pH 5 to 10 and particularly preferably in the range of pH 7 to 9.
  • buffer solution used so as to be in the above pH range a conventionally known buffer solution having a buffer capacity in the above pH range can be appropriately used.
  • buffers that can be used include phosphoric acid, ⁇ ⁇ ris (hydroxymethyl) aminomethane, imidazole, glycylglycine, MES, Bis-Tris, ADA, AC ES, Bis-Tris Mouth bread, PIPES, MO PS 0, MO PS, BES, HEPES, TES, DIPSO, TA PSO, PO PSO, HEPPS, HEPPSO, Tricine, Bicine, TA PS, CHES, CA PSO
  • each buffer such as CAPS or a salt thereof can be mentioned.
  • the measuring method and measuring reagent of the present invention may be implemented and configured by a one-step method (one-reagent system) or a multi-step method (multi-reagent system) such as a two-step method (two-reagent system). You may configure.
  • the concentration of each component described above, pH, etc. may be in the above-mentioned range
  • the multi-step In the case of the method (multi-reagent system), when the components are mixed at the ratio of each addition amount when measuring glucose, the concentration range of each component described above, the PH range, etc. What is necessary is just to determine the concentration of each reagent component.
  • the sample for measuring glucose is not particularly limited.
  • examples of such samples include baboon or animal blood, serum, blood clot, urine, spinal fluid, saliva, sweat and other body fluids, baboon or animal kidney, heart, lung, brain and other organs.
  • Extracts Extracts from skeletal muscle, bone marrow, skin, nerve tissue, etc .; Extracts from hair, etc .; Extracts or suspensions from rabbit or animal feces; Extracts from cells.
  • glucose-6-phosphate and adenosine mono-5′-diphosphate are produced.
  • the resulting glucose mono-phosphate was changed to 6-phosphodarconic acid using G 6 PDH, and simultaneously oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ( NAD P) changes to reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD PH).
  • concentration of dalcose can be determined by measuring the absorbance of NADH or NADPH that is sometimes produced.
  • the rate of increase of NADH or NADPH produced is determined by the absorbance at the wavelength in the ultraviolet region (330 to 350 nm). Depending on the amount of change, the glucose concentration can be determined.
  • glucose it is preferable to measure glucose by a reaction rate method.
  • the method for reducing the error due to fructose at the time of measuring glucose is boric acid or a derivative thereof in the measuring method for measuring glucose using hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • the measurement is conducted in the presence of these salts.
  • Preparation of the present invention ⁇ first reagent C for measuring Dalcos according to the above-mentioned reagent components and concentrations, except that the boric acid concentration of the present invention 1 of the first reagent A for glucose measurement is 8 OmM. Went.
  • the present invention 1 of the present invention ⁇ Except that the boric acid concentration of the first reagent A for glucose measurement is set to 160 mM, the present invention-first reagent D for measuring glucose D according to the reagent components and concentrations of 1 above was prepared.
  • the boric acid concentration was adjusted by adding 10 OmM boric acid and 15 mM sodium tetraborate.
  • the present invention 1 of the present invention is the same as the reagent component and concentration of the present invention 1 except that the boric acid concentration of the first reagent A for glucose measurement is 180 mM. Prepared. The boric acid concentration was adjusted by adding 10 OmM boric acid and 2 OmM tetraborate.
  • the first invention of the present invention 1 except that the boric acid concentration of the first reagent A for glucose measurement is 320 mM, the present invention
  • the first reagent F for glucose measurement was prepared.
  • the boric acid concentration was adjusted by adding 10 OmM boric acid and 55 mM sodium tetraborate.
  • the present invention 1 The first reagent Glucose measurement A
  • the present invention is the same as the reagent components and concentrations in 1 except that the boric acid concentration of the first reagent A for glucose measurement A is 640 mM. Was prepared. The boric acid concentration was adjusted by adding boric acid 10 OmM and sodium tetraborate 13 5 mM.
  • control / first reagent for glucose measurement was prepared according to the reagent components and concentrations of the above (1) except that the boric acid of the first invention / glucose measurement first reagent was not included.
  • Hexokinase (derived from yeast) 4000 U / L
  • Samples were prepared by adding fructose to rabbit serum so that the addition concentration was 400, 800, 1 200, 1 600, or 2000 Omg / dL. Further, a sample added with physiological saline in place of the fructose was used as a non-fluxed sample (concentration of fructose added was OmgZd L).
  • the glucose concentration in each of the two samples was measured with the first reagent and the second reagent prepared in 1 above.
  • the measurement of glucose in the measurement reagent of the present invention was performed with a 7 1 70 S-type automatic analyzer manufactured by Hitachi, Ltd. After adding 20 L of the first reagent for glucose measurement (A to G) prepared in (1) to (7) of 1 above and mixing, the mixture was reacted at 37 ° C for 5 minutes, The second reagent for glucose measurement 1 OOL prepared in (9) of 1 above was added, and the amount of change in absorbance per unit time at a wavelength of 3400 nm was measured. Then, the samples with known glucose concentrations were measured as described above, and the glucose concentrations in the five types of samples were determined by comparing the measured values with the measured values of the five types of samples.
  • the measurement was performed in the same manner by changing the first reagent to the control / first reagent for measuring glucose prepared in (8) above.
  • Fig. 1 The measurement results of the sample are shown in Fig. 1.
  • the measured glucose value is affected by the fructose in the sample. It can be seen that there is a positive error.
  • the present invention in which boric acid or boric acid and sodium tetraborate are contained in the first reagent ⁇
  • the positive error of this measured value decreases. It can be seen that it has been improved. It can also be seen that the effect of avoiding the effects of fructose contained in this sample increases as the concentration of boric acid in the first reagent increases.
  • the measurement method of the present invention containing boric acid or a derivative thereof or a salt thereof, and It was confirmed that the measurement reagent was effective in avoiding the influence of fructose contained in the sample. In other words, it was confirmed that the concentration of dalcose could be measured accurately even for samples containing fructose.
  • the present invention prepared in (1) to (7) of Example 1, 1 and the first reagents A to G for glucose measurement were used as they were.
  • the first reagent for measuring glucose / glucose prepared in (8) of Example 1 was used as it was.
  • the sample prepared in 2 of Example 1 was used as it was.
  • the glucose concentration in each of the two samples was measured in the same manner as in Example 1-3 using the first reagent ⁇ to G and the second reagent prepared in 1 above.
  • the measurement results of the sample are shown in Fig. 2.
  • Fig. 2 when the first reagent for measuring glucose, which does not contain boric acid in the first reagent, was used, the measured glucose value was affected by the fructose in the sample. It can be seen that there is a positive error. It can also be seen that the measured glucose level increases as the added fructose concentration in the sample increases, and the degree of positive error increases.
  • the present invention in which boric acid or boric acid and sodium tetraborate are contained in the first reagent ⁇
  • the positive error of this measured value decreases. It can be seen that this is improved.
  • the effect of avoiding the effects of fructose contained in this sample is that the concentration of boric acid in the first reagent is It turns out that it gets bigger as it gets higher.
  • the measurement method of the present invention containing boric acid or a derivative thereof or a salt thereof, and It was confirmed that the measurement reagent was effective in avoiding the influence of fructose contained in the sample. In other words, it was confirmed that the concentration of dalcose could be measured accurately even for samples containing fructose.
  • Figures 1 and 2 show the effect of avoiding the effects of full course.

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Abstract

本発明は、ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いたグルコースを測定する方法において、ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩を含有させることを特徴とするグルコースの測定方法である。また、本発明は、ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を含むグルコース測定試薬において、ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩を含有することを特徴とするグルコースの測定試薬である。更に、本発明は、ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いてグルコースを測定する測定方法において、ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の共存下で測定を行うことにより、フルクトースによる誤差を低減する方法である。

Description

明 細 書 グルコースの測定方法及び測定試薬 技術分野
本発明は、 グルコースの測定方法及び測定試薬並びにグルコース測定時 のフルク卜ースによる誤差を低減する方法に関するものである。
本発明は、 特に、 化学、 生命科学、 分析化学及び臨床検査等の分野にお いて有用なものである。 背景技術
グルコースは、 生体のエネルギー源として最も重要な物質であり、 生体 試料中のグルコース濃度は、 腸管からの糖吸収や肝臓での糖新生とグリコ 一ゲンの合成や分解等の諸因子によって調節されている。
また、 生体試料中のグルコースの測定は、 糖尿病の診断に最も有力であ るとともに、 低血糖症の発見や内分泌疾患の診断等にも欠くことのできな い検査となっている。
このグルコースの測定方法としては、 還元法、 縮合法、 及び酵素的測定 法等が用いられている。 これらのうち、 酵素的測定法としては、 例えば、 グルコースォキシダーゼを用いる方法、 グルコース脱水素酵素を用いる方 法、 又はへキソキナーゼ （以下、 H Kと略すこともある） とグルコース一 6—リン酸脱水素酵素 （以下、 G 6 P D Hと略すこともある） を用いる方 法 （以下、 H K— G 6 P D H法と略すこともある） 等が挙げられる。
H K - G 6 P D H法の測定原理は以下の通りである。 試料中のダルコ一 スは、 アデノシン— 5 ' —三リン酸の存在下でへキソキナーゼの作用によ り、 グルコース一 6—リン酸とアデノシン— 5 ' —二リン酸を生成する。 このグルコース— 6—リン酸は G 6 P D Hの作用により、 6—ホスホダル コン酸となり、 同時に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （以 下、 N A Dと略すこともある） 又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク レオチドリン酸 （以下、 N A D Pと略すこともある） が、 還元型ニコチン アミドアデニンジヌクレオチド （以下、 N AD Hと略すこともある） 又は 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 （以下、 NA D P H と略すこともある） に変化する。 この時に生成する NA D H又は NA D P Hの吸光度を測定することによりグルコース濃度を求める。
この H K— G 6 P D H法は、 正確にグルコースを測定できる方法として 臨床検査で広く使用されている（例えば、臨床検査法提要 改訂第 3 1版， 524〜5 2 9頁， 1 9 98年）。
また、 この H K— G 6 P D H法においては、 正常ヒ卜血清中のダルコ一 ス濃度は 3. 5〜8 mM (6 5〜1 05 mg/d L) であるのに対し、 へ キソキナーゼのグルコースに対する Km値が数 mM程度と小さいため、 終 末点法が適当な測定方法とされてきた。 しかしながら、 糖尿病患者等にお いては、 尿中のグルコース濃度が健常人に比べて高濃度となる （約 1 O g d L程度） ため、 このような患者の尿試料を測定する場合には、 試料を 希釈する必要があった。
このため、 H K— G 6 P D H法においても、 へキソキナーゼに対する拮 抗阻害剤を使用することにより、 へキソキナーゼのグルコースに対する見 かけの Km値を測定系におけるグルコース濃度よりも大きくし、 反応速度 法での測定を可能とした方法が開発されている。 この方法によれば、 ダル コース濃度の高い試料でも希釈せずにグルコースを測定することが可能と なっている。
しかしながら、 この H K— G 6 P D H法においては、 試料中にフルク卜 ースが存在する場合、 グルコースの測定値に正誤差を受けるという問題が あった。
すなわち、 試料中にフルク卜ースが存在する場合、 このフルク！ ^一スは へキソキナーゼの作用によりフルク I ^一ス— 6—リン酸となる。 このフル ク卜ース一 6—リン酸は、 試料中のイソメラーゼにより、 グルコース— 6 一リン酸に変換される。 このグルコース一 6—リン酸は G 6 P DHの作用 により、 6—ホスホダルコン酸となり、 同時に N A D又は NA D Pが N A D H又は N A D P Hに変化することにより、 N A D H又は N A D P Hが増 加することになる。 このため、 見かけのグルコース測定値が上昇し、 正誤 差を生じるという問題があった。
フルク卜ースは、 輸液等に添加されているため、 これらを使用した患者 の試料は、 フルク卜ースによる正誤差を受けるおそれがあった。 発明の開示
したがって、 本発明の課題は、 フルク卜ースを含有する試料でも、 ダル コース濃度を正確に測定することができる方法及び試薬を提供することで ある。
本発明者は、 上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、 へキ ソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素を用いた試料中のダル コースを測定する方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの 塩を含有させることにより、 フルク I ^一スを含有する試料でも、 ダルコ一 ス濃度を正確に測定できることを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下の発明を提供する。
( 1 ) へキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素を用いてグ ルコースを測定する測定方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこ れらの塩の共存下で測定を行うことを特徴とする、グルコースの測定方法。
( 2 ) へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を使用することを特徴とする、 前記 （1 ) 記載のグルコースの測定方法。
( 3 ) ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩が、 ホウ酸又はフエニル ボロン酸あるいはこれらの塩であることを特徴とする、前記（1 )又は（2 ) に記載のグルコースの測定方法。
( 4 ) へキソキナーゼ、 グルコース— 6—リン酸脱水素酵素、 アデノシン 一 5 ' —三リン酸、 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸 化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、 及びホウ酸又はその 誘導体あるいはこれらの塩を含有することを特徴とする、 グルコース測定 試薬。 ( 5 )更に、へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を含むことを特徴とする、 前記 （4 ) 記載のグルコース測定試薬。
( 6 ) ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩が、 ホウ酸又はフエニル ボロン酸あるいはこれらの塩であることを特徴とする、前記（4 )又は（5 ) に記載のダルコース測定試薬。
( 7 ) へキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素を用いてグ ルコースを測定する測定方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこ れらの塩の共存下で測定を行うことにより、 フルク卜ースによる誤差を低 減する方法。
( 8 ) グルコースを測定する測定方法が、 へキソキナーゼに対する拮抗阻 害剤を使用するものであることを特徴とする、 前記 （7 ) 記載のフルク卜 ースによる誤差を低減する方法。
( 9 ) ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩が、 ホウ酸又はフエニル ボロン酸あるいはこれらの塩であることを特徴とする、前記（7 )又は（8 ) に記載のフルク I ^一スによる誤差を低減する方法。
本発明によれば、 へキソキナーゼ及びグルコース一 6—リン酸脱水素酵 素を用いたグルコースを測定する方法において、 フルク卜ースを含有する 試料でも、 グルコース濃度を正確に測定することができるものである。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 へキソキナーゼ及びグルコース一 6—リン酸脱水素酵素を用 いたグルコースを測定する方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいは これらの塩を含有させることを特徴とするグルコースの測定方法、 へキソ キナーゼ及びグルコース一 6—リン酸脱水素酵素を含むグルコース測定試 薬において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩を含有することを 特徴とするグルコースの測定試薬、 並びにフルク卜ースによる誤差を低減 する方法である。
( 1 ) ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩
本発明の試料中のグルコースの測定方法、 及び測定試薬において使用す るホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩としては、 例えば、 ホウ酸、 四ホウ酸、 フエニルボロン酸、 ホウ酸ナトリウム、 ホウ酸カリウム、 ホウ 酸マグネシウム、 ホウ酸リチウム、 ホウ酸カルシウム、 四ホウ酸ナ卜リウ 厶、 四ホウ酸カリウム、 四ホウ酸マグネシウム、 四ホウ酸リチウム、 四ホ ゥ酸カルシウム、 フエニルボロン酸ナトリウム、 フエニルボロン酸力リウ 厶、 フエ二ルポロン酸マグネシウム、 フエニルボロン酸リチウム、 フエ二 ルボロン酸カルシウム等を挙げることができる。
このホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の濃度は、 特に限定され ないが、 例えば、 試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、 0 . 5〜4 0 O m Mの範囲にあることが好ましく、 5〜 1 0 0 m Mの範囲 が特に好ましい。 また、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の濃度 は、 4 0 O m Mを超えて含有させても問題はないが、 その量までで充分な 効果が得られる。
なお、 四ホウ酸ナトリウム等の四ホウ酸塩は、 水溶液中では 4分子のホ ゥ酸に分解することが知られているため、 ホウ酸又はその誘導体あるいは これらの塩として、 四ホウ酸塩を使用する場合は、 例えば、 前記した濃度 範囲の 4分の 1とすることができる。
また、 本発明の測定方法及び測定試薬が、 1ステップ法 （1試薬系） で ある場合には、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の濃度は、 上記 の範囲のものとすればよく、 2ステップ法 （2試薬系） である場合には、 試料と第 1試薬を試料中のグルコースを測定する際の各々の添加量の比で 混合した際、 及び試料と第 1試薬及び第 2試薬を試料中のグルコースを測 定する際の各々の添加量の比で混合した際に、 この混合後の測定反応液中 のホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の濃度が上記の範囲となるよ うに、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩を第 1試薬又は第 2試薬 のいずれかに含ませればよい。
また、 混合後の測定反応液中のホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの 塩の濃度が上記濃度範囲に入るのであれば、 ホウ酸又はその誘導体あるい はこれらの塩は第 1試薬と第 2試薬の両方に含ませてもよい。 これは、 測定方法及び測定試薬が多ステップ法 （3試薬以上） の場合も 同様である。
( 2 ) へキソキナーゼ及びグルコース— 6 —リン酸脱水素酵素
本発明においては、 へキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素 酵素を使用して、 試料中のグルコースの測定を行う。
ここで、 へキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素は、 ど の様な起源、 由来のものでもよく、 例えば、 以下のものを使用することが できる。
へキソキナーゼとしては、 例えば、 酵母またはサッカロマイセス属、 ァ スペルギルス属、 ロイコノス卜ック属等の微生物等から採取されたものを 挙げることができる。 また、 これらの遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み 込む遺伝子組み換え技術により製造したもの、 又は遺伝子の改変等により 性質を改良したものも含まれる。
また、 へキソキナーゼの濃度は、 酵素の起源等によっても最適濃度は異 なるが、 試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、 5 0〜5 0 0 0 U / Lの範囲にあることが好ましく、 2 0 0〜 2 7 0 0 U / Lの範 囲が特に好ましい。
また、 グルコース— 6—リン酸脱水素酵素としては、 例えば、 ロイコノ ストック属、 バチルス属、 ぺディ才コッカス属、 サッカロマイセス属等の 微生物等から採取されたものを挙げることができる。 また、 これらの遺伝 子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により製造したも の、 又は遺伝子の改変等により性質を改良したものも含まれる。
また、 グルコース— 6—リン酸脱水素酵素の濃度は、 酵素の起源等によ つても最適濃度は異なるが、 試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中 において、 3 0 0〜 1 0 0 0 0 U Z Lの範囲にあることが好ましく、 6 0 0〜4 8 0 0 U / Lの範囲が特に好ましい。
( 3 ) へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤
本発明においては、 へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を使用すること により、 試料中のグルコースを反応速度法で測定してもよい。 ここで、 へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤とは、 へキソキナーゼのグ ルコースに対する見かけの K m値を測定系におけるグルコース濃度よりも 大きくできるものであればよい。 本発明で使用される、 へキソキナーゼに 対する拮抗阻害剤としては、 例えば、 N—ベンゾィルダルコサミン、 N— ァセチルダルコサミン等を挙げることができる。
また、 へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤の濃度は、 試料と測定試薬を 混合した後の測定反応液中において、 1 0〜30 OmMの範囲にあること が好ましく、 30〜 1 0 OmMの範囲が特に好ましい。
(4) 測定における他の構成成分
本発明で使用される、 アデノシン— 5 ' —三リン酸の濃度は、 試料と測 定試薬を混合した後の測定反応液中において、 0. 5〜5 0 mMの範囲に あることが好ましく、 〗〜 1 5mMの範囲が特に好ましい。
また、 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチ ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の濃度は、 試料と測定試薬を混合 した後の測定反応液中において、 0. 〜 2 OmMの範囲にあることが好 ましく、 0. 5〜4 mMの範囲が特に好ましい。
更に、 本発明においては、 前記の成分の他に、 マグネシウム塩、 公知の 防腐剤、 又は安定化剤等を必要に応じて適宜使用することができる。
(5) グルコース測定時の p H
本発明において、 グルコース測定時の p Hは、 p H 5〜 1 0の範囲にあ ることが好ましく、 P H 7〜 9の範囲が特に好ましい。
また、 前記の p H範囲となるように使用する緩衝液としては、 前記の p H範囲に緩衝能がある従来公 7知の緩衝液を適宜.使用することができる。 このような緩衝液として使用できるものとしては、 例えば、 リン酸、 卜 リス （ヒドロキシメチル） ァミノメタン、 イミダゾール、 グリシルグリシ ン、 M E S、 B i s - T r i s、 A DA, AC E S、 B i s - T r i sプ 口パン、 P I P E S、 MO P S 0、 MO P S, B E S、 H E P E S、 T E S、 D I P S O、 TA P S O、 PO P S O、 H E P P S、 H E P P S O、 T r i c i n e、 B i c i n e、 TA P S, C H E S、 CA P S O、 若し くは C A P S又はこれらの塩等の各緩衝剤を挙げることができる。
(6) 試薬等の構成、 及び構成成分の濃度等
本発明の測定方法及び測定試薬は、 1ステップ法 （1試薬系） で実施、 構成してもよく、 又は 2ステップ法 （2試薬系） 等の多ステップ法 （多試 薬系）.で実施、 構成してもよい。
また、 本発明の測定方法及び測定試薬が 1ステップ法 （1試薬系） であ る場合は、 前記した各構成成分の濃度、 及び p H等は前記の範囲のものと すればよく、 多ステップ法 （多試薬系） である場合には、 前記構成成分を グルコースを測定する際の各々の添加量の比で混合した時に、 前記した各 構成成分の濃度範囲、 及び P H範囲等となるように各試薬の構成成分の濃 度等を定めればよい。
(7) 試料
本発明において、 グルコースの測定を行う試料は特に限定されない。 このような試料としては、 例えば、 ヒ卜又は動物の血液、 血清、 血槳、 尿、 髄液、 唾液、 汗等の体液、 ヒ卜若しくは動物の腎臓、 心臓、 肺、 脳等 の臓器等の抽出液；骨格筋、 骨髄、 皮膚、 又は神経組織等の抽出液；毛髪 等の抽出液、 ヒ卜又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液等が 挙げられる。
(8) グルコースの測定方法
本発明のグルコースの測定方法及び測定試薬を用いてグルコースを測定 する場合の例を具体的に説明する。
グルコースを測定する場合には、 例えば、 試料にアデノシン— 5 ' —三 リン酸の存在下でへキソキナーゼを作用させると、 グルコース— 6—リン 酸とアデノシン一 5' —二リン酸を生成する。 次いで、 生じたグルコース 一 6—リン酸を G 6 P D Hを用いて、 6—ホスホダルコン酸に変化させ、 同時に、 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （NAD) 又は酸 化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 （NAD P) が、 還元 型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （NADH) 又は還元型ニコチ ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 （NAD PH) に変化する。 この 時に生成する N A D H又は N A D P Hの吸光度を測定することによりダル コース濃度を求めることができる。
また、 へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を使用し、 反応速度法により グルコースを測定する場合には、 生成する N A D H又は N A D P Hの増加 速度を、 紫外部 （3 3 0〜 3 5 0 n m ) の波長における吸光度変化量によ リ、 グルコース濃度を求めることができる。
なお、 本発明においては、 グルコースの測定を反応速度法により行うこ とが好ましい。
( 9 ) フルク卜ースによる誤差を低減する方法
本発明における、 グルコース測定時のフルク卜ースによる誤差を低減す る方法は、 へキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素を用い てグルコースを測定する測定方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるい はこれらの塩の共存下で測定を行うことによるものである。
このへキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素を用いてグ ルコースを測定する測定方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこ れらの塩の共存下でグルコースの測定を行うことにより、 試料中にフルク トースが含まれる場合であっても、 測定値にこのフルク卜ースによる誤差 が生じることを抑制でき、 精度が高いグルコース測定値を得ることができ る。
なお、本発明においては、へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を使用し、 反応速度法によりグルコースを測定する場合において好適である。
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれらの実 施例により限定されるものではない。
〔実施例 1〕
(フルク卜ースによる影響の回避効果の実証— 1 )
ホウ酸濃度を変化させた測定試薬を用いて、 試料に含まれるフルク I ^一 スによる影響の回避効果を確かめた。
1 . 測定試薬の調製
( 1 ) 本発明■グルコース測定用第 1試薬 Aの調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 P H を 7. 0 (20°C) に調整し、 ホウ酸濃度が 2 OmMの本発明 ·ダルコ一 ス測定用第 1試薬 Aを調製した。
卜リス緩衝液 1 2. 5 mM
塩化ナ卜リウ厶 3 5 mM
N—ベンゾィルダルコサミン 7 5 mM
N A D P 3 mM
ホウ酸 20 mM
(2) 本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Bの調製
前記 1の本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Aのホウ酸濃度を 4 OmM とすること以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに本発明 ·ダルコ一 ス測定用第 1試薬 Bの調製を行った。
(3) 本発明■グルコース測定用第〗試薬 Cの調製
前記 1の本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Aのホウ酸濃度を 8 OmM とすること以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに本発明 ·ダルコ一 ス測定用第 1試薬 Cの調製を行った。
(4) 本発明，グルコース測定用第 1試薬 Dの調製
前記 1の本発明■グルコース測定用第 1試薬 Aのホウ酸濃度を 1 6 0m Mとすること以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに本発明 ·ダルコ ース測定用第 1試薬 Dの調製を行った。 なお、 ホウ酸濃度は、 ホウ酸 1 0 OmMと四ホウ酸ナトリウム 1 5 mMを加えることにより調整を行った。
(5) 本発明，グルコース測定用第 1試薬 Eの調製
前記 1の本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Aのホウ酸濃度を 1 80m Mとすること以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに本発明 ·ダルコ ース測定用第 1試薬 Eの調製を行った。 なお、 ホウ酸濃度は、 ホウ酸 1 0 OmMと四ホウ酸ナ卜リゥ厶 2 OmMを加えることにより調整を行った。
(6) 本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Fの調製
前記 1の本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Aのホウ酸濃度を 3 20m Mとすること以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに本発明 ·ダルコ ース測定用第 1試薬 Fの調製を行った。 なお、 ホウ酸濃度は、 ホウ酸 1 0 OmMと四ホウ酸ナトリウム 5 5 mMを加えることにより調整を行った。
(7) 本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Gの調製
前記 1の本発明 ·グルコース測定用第 1試薬 Aのホウ酸濃度を 6 40 m Mとすること以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに本発明 ·グルコ ース測定用第 1試薬 Gの調製を行った。 なお、 ホウ酸濃度は、 ホウ酸 1 0 OmMと四ホウ酸ナトリウム 1 3 5 mMを加えることにより調整を行った。
(8) 対照 ·グルコース測定用第 1試薬の調製
前記 1の本発明 ·グルコース測定用第 1試薬のホウ酸を含有させないこ と以外は、 前記 1の試薬成分及び濃度の通りに対照 ·グルコース測定用第 1試薬の調製を行った。
(9) グルコース測定用第 2試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 P H を 8. 0 (20°C) に調整し、 グルコース測定用第 2試薬を調製した。
卜リス緩衝液 1 5 0 mM
酢酸マグネシゥ厶 60 m M
G 6 P D H (ロイコノス卜ック属由来） 7 200 U/L
へキソキナーゼ （酵母由来） 4000 U/L
A T P 2 N a 1 6 mM
2. 試料の調製
ヒ卜血清にフルク卜ースを、 添加濃度が 400、 800、 1 200、 1 600、又は 2 00 Omg/d Lになるように添加したものを試料とした。 更に、 フルク卜一スの代わりに生理食塩水を添加したものをフルク卜一 ス無添加試料 （フルク卜ース添加濃度が OmgZd L) とした。
3. 試料の測定
前記 2の各試料中のグルコース濃度を、 前記 1で調製した第 1試薬及び 第 2試薬にて測定した。
本発明の測定試薬におけるグルコースの測定は、 日立製作所社製 7 1 7 0 S形自動分析装置にて行い、 前記 2で調製した試料の各〗 O Lに各々 前記 1の （1 ) 〜（7 )で調製した本発明 'グルコース測定用第 1試薬（A 〜G ) 2 0 0 Lを添加して、 混和後 3 7 °Cで 5分間反応させた後、 前記 1の （9 ) で調製したグルコース測定用第 2試薬 1 O O Lを添加し、 波 長 3 4 0 n mにおける単位時間当たりの吸光度変化量を測定した。そして、 グルコース濃度が既知の試料について、 前記の通り測定を行い、 この測定 値と前記の 5種類の試料の測定値を比較することにより、 前記 5種類の試 料中のグルコース濃度を求めた。
また、 第 1試薬を前記 1の （8 ) で調製した対照 ·グルコース測定用第 1試薬に変えて同様に測定を行った。
4 . 測定結果
試料の測定結果を図 1に示した。 図 1から明らかなように、 第 1試薬に ホウ酸を含有させていない対照 ·グルコース測定用第 1試薬を用いた場合 は、 試料中のフルク卜ースの影響を受けてグルコースの測定値に正誤差が 生じていることが分かる。 また、 試料中の添加フルク！ ^一ス濃度が高くな るにつれてグルコースの測定値が上昇しており、 正誤差の程度が大きくな つていることが分かる。
これに対し、 第 1試薬にホウ酸、 又はホウ酸及び四ホウ酸ナトリウムを 含有させた本発明■グルコース測定用第 1試薬 A〜Gを用いた場合は、 こ の測定値の正誤差が減少し改善されていることが分かる。 また、 この試料 に含まれるフルク卜ースの影響の回避効果は第 1試薬中のホウ酸の濃度が 高くなるにつれて大きくなっていることが分かる。
これらのことより、 へキソキナーゼ及びグルコース一 6—リン酸脱水素 酵素を用いた試料中のグルコースを測定する方法において、 ホウ酸又はそ の誘導体あるいはこれらの塩を含有させた本発明の測定方法及び測定試薬 は、 試料に含まれるフルク卜ースの影響を回避する効果のあることが確か められた。 すなわち、 フルク卜ースが含まれた試料であっても正確にダル コース濃度を測定できることが確かめられた。
〔実施例 2〕
(フルク卜一スによる影響の回避効果の実証一 2 ) ホウ酸濃度を変化させた測定試薬を用いて、 試料に含まれるフルク卜一 スによる影響の回避効果を確かめた。
1 . 測定試薬の調製
( 1 ) 本発明 'グルコース測定用第 1試薬 A〜Gの調製
実施例 1の 1の （1 ) 〜 （7 ) で調製した本発明，グルコース測定用第 1試薬 A〜Gをそのまま使用した。
( 2 ) 対照 ·グルコース測定用第 1試薬の調製
実施例 1の 1の （8 ) で調製した対照 ·グルコース測定用第 1試薬をそ のまま使用した。
( 3 ) グルコース測定用第 2試薬の調製
p Hを 9 . 0 ( 2 0 °C) に調整すること以外は、 実施例 1の 1の （9 ) で調製したグルコース測定用第 2試薬と同じ試薬成分及び濃度の通りに調 ¾τ つた。
2 . 試料の調製
実施例 1の 2で調製した試料をそのまま使用した。
3 . 試料の測定
前記 2の各試料中のグルコース濃度を、 前記 1で調製した第 1試薬 Α〜 G及び第 2試薬にて実施例 1の 3と同様にして測定を行った。
4 . 測定結果
試料の測定結果を図 2に示した。 図 2から明らかなように、 第 1試薬に ホウ酸を含有させていない対照 ·グルコース測定用第 1試薬を用いた場合 は、 試料中のフルク卜ースの影響を受けてグルコースの測定値に正誤差が 生じていることが分かる。 また、 試料中の添加フルク卜ース濃度が高くな るにつれてグルコースの測定値が上昇しておリ、 正誤差の程度が大きくな つていることが分かる。
これに対し、 第 1試薬にホウ酸、 又はホウ酸及び四ホウ酸ナトリウムを 含有させた本発明■グルコース測定用第 1試薬 A〜Gを用いた場合は、 こ の測定値の正誤差が減少し改善されていることが分かる。 また、 この試料 に含まれるフルク卜ースの影響の回避効果は第 1試薬中のホウ酸の濃度が 高くなるにつれて大きくなつていることが分かる。
これらのことより、 へキソキナーゼ及びグルコース一 6—リン酸脱水素 酵素を用いた試料中のグルコースを測定する方法において、 ホウ酸又はそ の誘導体あるいはこれらの塩を含有させた本発明の測定方法及び測定試薬 は、 試料に含まれるフルク卜ースの影響を回避する効果のあることが確か められた。 すなわち、 フルク卜ースが含まれた試料であっても正確にダル コース濃度を測定できることが確かめられた。 図面の簡単な説明
図 1及び図 2は、 フルク卜ースによる影響の回避効果を確認した図である。

Claims

1 . へキソキナーゼ及びグルコース— 6—リン酸脱水素酵素を用いてグルコース を測定する測定方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の共存 下で測定を行うことを特徴とする、 グルコースの測定方法。
2 . へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を使用することを特徴とする、 請求の範 囲第 1項記載のグルコースの測請定方法。
3 . ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩が、 ホウ酸又はフエニルボロン酸 あるいはこれらの塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項又は請求の範囲 第 2項に記載のグルコースの測定方法。
4 . へキソキナーゼ、 グルコース— 6—リン酸脱水素酵素、 アデノシン— 5 ' - 囲
三リン酸、 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンァ ミドアデニンジヌクレ才チドリン酸、 及びホウ酸又はその誘導体あるいはこれら の塩を含有することを特徴とする、 グルコース測定試薬。
5 . 更に、 へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を含むことを特徴とする、 請求の 範囲第 4項記載のグルコース測定試薬。
6 . ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩が、 ホウ酸又はフエ二ルポロン酸 あるいはこれらの塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 4項又は請求の範囲 第 5項に記載のグルコース測定試薬。
7 . へキソキナーゼ及びグルコース一 6—リン酸脱水素酵素を用いてグルコース を測定する測定方法において、 ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩の共存 下で測定を行うことにより、 フルク I ^一スによる誤差を低減する方法。
8 . グルコースを測定する測定方法が、 へキソキナーゼに対する拮抗阻害剤を使 用するものであることを特徴とする、 請求の範囲第 7項記載のフルク卜ースによ る誤差を低減する方法。
9 . ホウ酸又はその誘導体あるいはこれらの塩が、 ホウ酸又はフエニルボロン酸 あるいはこれらの塩であることを特徴とする、 請求の範囲第 7項又は請求の範囲 第 8項に記載のフルク卜ースによる誤差を低減する方法。
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