WO1992020818A1 - High precision determination of glycerol, dihydroxyacetone or d-glyceraldehyde and composition therefor - Google Patents

High precision determination of glycerol, dihydroxyacetone or d-glyceraldehyde and composition therefor Download PDF

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WO1992020818A1
WO1992020818A1 PCT/JP1991/001786 JP9101786W WO9220818A1 WO 1992020818 A1 WO1992020818 A1 WO 1992020818A1 JP 9101786 W JP9101786 W JP 9101786W WO 9220818 A1 WO9220818 A1 WO 9220818A1
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glycerol
nadps
thio
nads
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PCT/JP1991/001786
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Inventor
Shigeru Ueda
Mamoru Takahashi
Hideo Misaki
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the present invention relates to a highly sensitive quantification method and a quantification composition for glycerol, dihydroxy-setone or D-glycerol TP-leur, which are important in the field of clinical tests, food tests, and the like, or substances using these as reaction products. .
  • dihydroxyacetone-D-glyceraldehyde which is a metabolite of glycer ⁇ -glycerol by glycerol dehydrogenase.
  • enzymatic methods for measuring glycerol contained in biological components and food components mainly include the following (1) a method using glycerol ⁇ -kinase, (2) a method using glycerol dehydrogenase, and (3) a method using glycerol ⁇ - It is roughly classified into a method using oxidase.
  • the method (1) is represented by the following reaction formula using glycerol o-lupinase.
  • the reaction proceeds to measure the amount of L-glycerol-3-phosphate or ADP stoichiometrically equivalent to glycerol.
  • This method is further divided into the following three methods (a), (b), and (c) according to the measurement method.
  • ADP produced by the above reaction is measured.
  • ADP is subjected to a reaction using, for example, pyruvate kinase and lactate dehydrogenase as shown in the following reaction formula, and the reduction of NADH is spectrophotometrically measured at 340 nm. Things.
  • L-glycerol-3-phosphate generated by the above reaction is measured.
  • L-glycerol-3-phosphate is first converted to L-glycerol-3-phosphate oxidase as shown in the following reaction formula.
  • hydrogen peroxide is produced by the reaction described above, and then a dye is produced using peroxidase in the presence of a chromogen, and the measurement is carried out spectrophotometrically (Japanese Patent Publication No. 1-31880).
  • glycerol dehydrogenase is used to react with glycerol + NAD-dihydropixyacetone + +) represented by the following formula:
  • the method of (3) include glycerol O by Kishida over zero, glycerol + 0 2 ⁇ glycerin port aldehyde + H 2 0 s represented by the following reaction scheme
  • glycerol is widely used in the clinical laboratory field for measuring serum triglyceride I), which is useful for diagnosing lipid metabolism disorders. That is, triglyceride is hydrolyzed into glycerol fatty acid using lipase, and the resulting glycerol is measured by any of the above methods.
  • the quantitative determination of griseoal is also used for analysis of various biological components and food components.
  • a reagent based on the principle of (1) (a) is used as a reagent for food analysis. Marketed as It is used to measure glycerol in wine and beer.
  • measurement of dihydroxyaceton is useful for diagnosis of glycogen disease. That is, if oral dihydric xyaceton is administered and serum levels increase, the patient is diagnosed with suspected glycogen disease. In the determination, NADH reduction was measured in the presence of glycerol D-kinase (BC 2.7.1.30) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (BC 1.1.1.8) in the presence of ATP. Yes (Biochemical Dictionary, P584, Tokyo Kagaku Doujin (1989)).
  • D-glyceraldehyde is an intermediate in D-fructose metabolism, and its quantification requires the determination of alcohol dehydrogenase (BC 1.1.1.1 & BC 1.1.1.2) or aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3 & BC 1.2 Glyceraldehyde-3-phosphate with glyceraldehyde-3-phosphate, or with glyceraldehyde-3-phosphate using triokinase (BC 2.7.1.28). It has been measured in the presence of dehydrogenase (BC 1.1.1.8) (Biochemical Dictionary, P362-363, Tokyo Chemical Dojin (1989)).
  • the target substance to be measured is often converted into spectroscopically detectable hydrogen peroxide, reduced NAD (P), etc. as in each of the above methods.
  • hydrogen peroxide is conjugated to peroxidase and led to a color reaction
  • this reaction is hindered by reducing substances such as ⁇ bilirubin ascorbate and substances containing SH groups.
  • reducing substances such as ⁇ bilirubin ascorbate and substances containing SH groups.
  • the detection of reduced NAD (P) is measured by absorption at 340 nra, the equilibrium of the reaction depends on the accumulation of reduced NAD (P) in the opposite direction to the production of reduced NAD (P). Therefore, there is a problem that PH management must be strictly performed.
  • a measurement method using a color reaction using dihydrophorase and nitroblue tetrazolium can prevent the product inhibition due to the accumulation of reduced NAD (P), but the formazan dye is hardly soluble. As a result, dyes easily adhere to test tubes and tubes, and application to automatic analyzers is difficult.
  • spectroscopy is the most widely used method for measuring substances that can be detected spectroscopically, but this method also has a limit in sensitivity, and the content of the analyte If the number is small, it is not suitable.
  • a so-called enzyme cycling method in which a capture enzyme is amplified using two kinds of enzymes is performed.
  • the NAD cycling method, CoA cycling method, ATP cycling method, etc. have been used, but none of these methods is used in routine analysis such as clinical tests because the operation is too complicated. It is the current situation.
  • the advantage of the sensitivity measurement method is that the amount of the sample required for measurement can be reduced as well as when the content of the analyte is small, so that a sample containing various components such as serum can be used When used for measurement, the effect of coexisting substances on the measurement system can be reduced. In addition, it is possible to reduce the number of items that can be tested with a limited amount of the sample, and if the sample is human blood, the amount of blood collected can be reduced. It can also reduce the psychological burden on people. Thus, increasing the detection sensitivity is an indispensable requirement in clinical tests, considering the need to use precious samples such as blood and the need to measure trace components. Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems.
  • glycerol dehydrogenase when performing an enzymatic reaction to generate dihydroxy-setone or D-glyceraldehyde using glycerol as a substrate, glycerol dehydrogenase was used as an enzyme.
  • a reaction system using, as a coenzyme one of the group consisting of thionicotinamide amide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as thio NADs) and thionicotinamide amide adenine dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as thio NADPs) is used.
  • the other was selected from the group consisting of nicotinamide adenine dinucleotides (NADs under £ 1) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphates (NADPs).
  • NADs under £ 1 nicotinamide adenine dinucleotides
  • NADPs nicotinamide adenine dinucleotide phosphates
  • the present invention relates to a subject containing one type of * ⁇ component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde,
  • D—Glyceroaldehyde (In the formula, A, represents a thio NADP, a thio NAD, a NADP or a NAD, A 2 represents a reduced product of A i, and B i represents a thio NADP or a thio NAD. Indicates reduced NADPs or reduced tiADs, Ai indicates NADPs or NADs, indicates reduced thioNADPs or reduced thioNADs, and indicates oxidized B i Bt products )
  • the present invention provides a test sample selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceroaldehyde, which comprises the above components (1), (2) and (3).
  • the present invention relates to a composition for determining the sensitivity of components.
  • FIG. 1 is a drawing showing the results of a rate assay at 400 mn with respect to the amount of glycerol in Example 1.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of late access at 400 nra with respect to the amount of glycerol in Example 2.
  • FIG. 3 is a drawing showing the results of the rate of no-dose at 400 nm with respect to the amount of L--phosphatidyl-DL-glycerol in Example 3.
  • FIG. 4 shows the amount of dihydroxycetone in Example 4.
  • 5 is a drawing showing the result of a late assay at 400 mn in Fig. 5.
  • Fig. 5 is a drawing showing the result of a late assay at 400 nm relative to the amount of glycerol in Example 5.
  • the glycerol dehydrogenase used in the present invention catalyzes a reversible reaction for producing dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde using at least glycerol as a substrate, and is selected from the group consisting of thioNADPs and thioNADs. Either one can be used as long as one is selected from the group consisting of NADPs and NADs.
  • glycerol dehydrogenase has three types of enzymes with different enzyme numbers. Among them, BC 1. 1. 1. 6 is an enzyme specific to (Cho) NADs, which controls the reaction of producing dihydroxyacetone using glycerol as a substrate.
  • a specific example is Escherichia coli ( B. Col i), Aerobacter aerogenes, Acetobacter suboxydans, and commercially available Bacillus megaterium (Toyo Brewery) Products), Benterobacter aerogenes (manufactured by Perlinger Mannheim), and those derived from Cell pi Monas sp.
  • thermostable enzyme derived from Bacillus stearothermofilus (Bacillus stear othermophi lus) is known (Japanese Patent Publication No. 1-17674).
  • Bacillus megaterium manufactured by Toyo Brewery Co.
  • the relative activity of the enzyme derived from Cellulomonas sp. (Manufactured by Toyobo Co., Ltd.) with respect to the coenzyme is 6.4% for the chi NADs, assuming that the NADs are 100%. , (Cho) did not act on NADPs.
  • BC 1.1.1.172 is an enzyme specific to (Cho) NADPs, which controls the reaction using D-glyceraldehyde as a product using glycerol as a substrate. Found in muscle. This enzyme is dominated by the reverse reaction at PH7, and NAD also exhibits 10% activity of NADP (Biochim. Biophys. Acta 258, 40-55, 1972). In addition, although an enzyme derived from Neurospora crassa has been reported (Journal of General Microbiology, 107, 289-296, 1978), this enzyme does not use (chi) MDs as coenzymes. .
  • those of EC 1.1.1.156 are enzymes specific to (Cho) NADPs, which are responsible for the reaction of using diglycol ester as a substrate to produce dihydroxy-setone, and . Found in cells of Luba (Dunal iel la parva).
  • enzymes of other origins other than the above-mentioned enzymes can be used as long as they have reactivity with glycerol as a substrate, and the specificity for the coenzyme is appropriately determined. It can be confirmed using a coenzyme and a substrate.
  • A, and coenzyme Chio-NADP of B 2, Chio NAD, NA DP class show NAD, as these Chio NADP or Chio NAD compound, for example Ji Onikochin'ami Doadenin Dinucleotide phosphate (Cho NADP), chonicotinamide dohypoxanthine dinucleotide phosphate, chonicotinamide dihydronucleotide (Cho NAD), and chonicotinamide dohypoxanthine dinucleotide.
  • NADPs or NADs examples include nicotine amide adenine dinucleotide phosphate (NADP), cetylpyridine adenine dinucleotide phosphate (acetyl NADP), acetyl viridine hypoxanthine dinucleotide phosphate, and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide.
  • NADP nicotine amide adenine dinucleotide phosphate
  • acetyl NADP cetylpyridine adenine dinucleotide phosphate
  • acetyl viridine hypoxanthine dinucleotide phosphate examples include nicotine amide adenine dinucleotide phosphate (NADP), cetylpyridine adenine dinucleotide phosphate (acetyl NADP), acetyl viridine hypoxanthine dinucleotide phosphate, and nicotinamide hypoxanthine dinucle
  • Examples include nucleotide phosphate (damino NADP), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), acetyl pyridine adenine dinucleotide (acetyl NAD), acetyl viridine hypoxanthine dinucleotide, and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (damino NAD).
  • the reduced forms of these coenzymes are Chio NADPHs and Chio! Displayed as iADHs, NADPHs, and NADHs.
  • the glycerol dehydrogenase used for the quantification uses only (thio) NAD as a coenzyme
  • the glycerol dehydrogenase to be used uses only (thio) NADP as a coenzyme from the above-mentioned NADs and NADs.
  • the glycerol dehydrogenase to be used further comprises both (thio) fJADs and (thio) NADP as entrapment enzymes, the above-mentioned chi-NADPs and NADPs.
  • the above-mentioned NADs and NADPs, and their oxidized and reduced forms may be appropriately used.
  • two types of glycerol monoldehydrogenase are used in consideration of the relative activity between each coenzyme so that the enzyme cycling reaction proceeds most efficiently. It is preferable to select the coenzyme and set the ratio to be used, and further set the reaction pH within the optimum pH range for the forward reaction and the reverse reaction.
  • glycerols dihydroxyacetones or D-glyceraldehydes as described above that can be linked to an enzyme system that releases and produces glycerol
  • the substrate and its enzymatic activity in the enzyme system comprising the steps can also be measured.
  • enzyme systems are not particularly limited, but include, for example, the following various reaction systems.
  • the amount of glycerol released and produced can be quantified to quantify mono-, di- or triglycerides or to measure lipase activity.
  • D-glyceraldehyde Dihydrogen ⁇ -xyacetone phosphate + D-glyceraldehyde
  • the amount of free and formed D-glyceraldehyde can be determined to determine D-fructose-1-linic acid or fructosyl diphosphate. Aldolase activity can be measured.
  • D-fructose can be quantified or hexokinase activity can be measured by quantifying the finally generated D-glyceyl aldehyde.
  • the concentrations of and are preferably from 0.02 to 100 mM, particularly preferably from 0.05 to 20 raM, and the amount of glycerol dehydrogenase is from 10 to: L000u / nil, particularly preferably from 25 to 400 u / nil.
  • the amount can be appropriately determined depending on the type of the subject and the like, and a larger amount can be used.
  • quantification method of the present invention can be applied to the case where glycerol monodehydrogenase is used alone or in combination of two or more as a coenzyme with (Cho) MDs and (Cho) NADPs as coenzymes.
  • the cycling reaction can be formed by providing a reaction system for regeneration between B 1 and B 2 .
  • the second dehydrogenase does not substantially act on A i in this assay system, or that the second dehydrogenase does not substantially act on A 1, for example.
  • a 2 represents a reduced product of
  • B represents a reduced form when A i is thio NADPs or thio NADs the NA DP acids or a reduced NAD, when a! is NADP or NAD compound indicates reduction Chio NADP or reduced form Chio NAD
  • B 2 represents an oxidized product of the the B 2 Shows an enzymatic reaction that produces B!
  • the concentration of 0. 02 ⁇ : l00mM, preferably 0. 05 ⁇ 20MM especially, B 2 or Z and B! Is preferably 0.05 to 5000 / M, particularly preferably 5 to 500 juM, and the concentration of glycerol dehydrogenase is 5 to: I000u / ral, Particularly 25 ⁇ 500u / nil preferably, the second dehydrogenase may be 20 times (u / ml unit) adjusted to be above the Kra value for B 2 (NIM Unit), for example 1 ⁇ ; I00u / ml is preferable, and the substrate of the second dehydrogenase is preferably in an excess amount, for example, 0.05 to 20 mM.
  • NIM Unit a number of B 2
  • the substrate of the second dehydrogenase is preferably in an excess amount, for example, 0.05 to 20 mM.
  • the second dehydrogenase is supplementarily added for the regeneration of B1, whereby B! It is possible to reduce the amount of used, especially when B is expensive.
  • the reaction may be carried out using B 2 or a mixture of B 2 and B 2 instead of B.
  • the use amounts of Z and B 2 are not particularly limited, but generally 1 Z 10 mol or less of A i is preferable.
  • the second dehydrogenase and its substrate for example, when B 2 is a NAD compound or Chio MD acids, Ryo Turkey one Rudehidorogena one peptidase (BC 1.1.1.1) and ethanol, glycerol - 3-phosphate dehydrogenase (BC 1.1 .1.8) (from egret muscle)
  • glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (derived from egret skeletal muscle, liver, yeast, B.Coli) and D-glyceraldehyde aldehyde phosphate and phosphate, B
  • 2 is NADPs or thio NADPs
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase (BC 1.1.1.49) (derived from yeast) and glucose-6-phosphate
  • isocitrate dehydrogenase BC 1.1.1.42) (yeast Porcine myocardium)
  • isoquenic acid glutoxylate dehydrogenase (BC 1.2.1.17) (Pseudomonas oxalaticus), CoA and glyoxylic acid
  • phosphodalonic acid dehydrogenase (EC 1.1.1.44) (rat liver, brewer's yeast, B Coli) and 6-phospho-D-dalconic acid, glycemic alde
  • the quantification method of the present invention can be applied to two coenzymes when glycerol ⁇ -pi-nase is used alone or in combination of two or more (thio) NADs and (thio) NADPs as coenzymes.
  • Combination of NADs and NADs or NADPs Alternatively, when a combination of chi-NADPs and NADs is selected, the third dehydrogenase which forms a reaction of A 2 ⁇ A, does not act on the glycerol of the component (5) on the analyte. and by exerting a substrate for said third dehydrogenase, below reaction formula packaging reaction (as described E0, with the cycle I by Rukoto to impart reaction system for reproduction of a t between a 2) Can be formed.
  • the third dehydrogenase is preferably set or those incapable for substantially two installment, or substantially condition that can not act on the B 1 in this assay system, essentially e.g. the combination of selecting an enzyme which is not utilized as a coenzyme, a combination such as the third dehydrogenase ⁇ Genaze by quantitative Rangakari a 2 to select a condition that does not use substantially two installment is illustrated in. When quantifying, measure the amount of consumption. Third dehydrogenase
  • a 2 represents a reduced product of, B, A, represents A, thio NADPs or thio NADs, and reduced NA the DP acids or a reduced NAD
  • a! is when the NADP or NAD compound indicates reduction Chio NADP or reduced form Chio-NAD, B 2 represents B, and the oxidized product, the a 2 Shows the enzymatic reaction that produces A!
  • the concentration of is preferably 2 to 100 mM, particularly preferably 0.05 to 20 raM, and the concentration of A2 or A, is preferably 0.05 to 5000 juM, particularly 5
  • the concentration of glycerol dehydrogenase is preferably 10 to: I000u / ml.
  • the preferred 25 ⁇ 500u / ml, the third dehydrogenase may be adjusted to be on 20-fold amount (u / ml units) £ 1 of Km values ⁇ to A 2 ( ⁇ units), for example 1 100 u / ral is preferred, and the substrate for the third dehydrogenase is preferably in excess, for example, 0.05 to 20 mM.
  • the third dehydrogenase is added as a supplement for the regeneration of At, which makes it possible to reduce the amount of Ai used, and is particularly effective when A is expensive.
  • the reaction may be performed using A 2 or a mixture of and A 2 instead of.
  • the amount of At or Z and A 2 is not also the be particularly limited, in general, B! Is preferably 1 Z10 mol or less.
  • the third dehydrogenase and its substrate for example, when is a NAD or thio NAD, alcohol dehydrogenase (BC 1.1.1.1) and acetoaldehyde, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (BC.1.1.1.8) ( ⁇ from heron muscle) and ⁇ hydroxyacetone phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.12) (from ⁇ heron skeletal muscle, liver, yeast, E.
  • BC 1.1.1.1 alcohol dehydrogenase
  • acetoaldehyde acetoaldehyde
  • glycerol-3-phosphate dehydrogenase BC.1.1.1.8
  • EC 1.1.1.12 glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
  • Ai is NADPs or thio NADPs
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase EC 1.1.1.49
  • dalconolactone-6-phosphate derived from yeast
  • glyceraldehyde phosphate dehydrogenase BC 1.2. 1.13
  • plant chloroplasts 1,3-diphospho-D-glyceric acid.
  • a 2 is Chio NADH
  • Bi is NADH
  • the test solution It is possible to determine the amount of each in real time o
  • the quantification method of the present invention guides glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceraldehyde itself in a test solution to an enzyme cycling reaction, and is not easily affected by coexisting substances in the test solution.
  • the blank measurement of the solution can be omitted, and a simple measurement by late assay can be performed.
  • the above reagent Iral was placed in a cube, and 50 jul of 0, 2, 4, 6, 8, and 10 ju of glycerol solution was added, and the reaction was started at 37 t. Two minutes after the start of the reaction And the absorbance at 400 ⁇ at 5 minutes was read and the difference was determined The difference from the reagent blank was determined in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Figure 2. As is clear from FIG. The change in absorbance showed good linearity.
  • Glyceline mono-dehydrogenase manufactured by Toyobo Co., Ltd .: from Cellulomonionas sp.
  • ⁇ ⁇ MDP-specific glycerol dehydrogenase was purified from heron skeletal muscle according to Biochim. Biophys. Acta, 258, 40-55 (1972), and used for use.
  • the present invention uses coenzymes having different reduced absorption wavelengths so that no measurement error occurs, and the sensitivity can be increased by combining enzyme cycling reactions.
  • glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde in the sample can be quantified accurately.

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Abstract

Determination of glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde by reacting a specimen solution with a reagent containing: (1) glycerol dehydrogenase, (2) A1, and (3) B1 to form cycle (I) and determining the amount of A2 formed or the amount of B1 consumed; and a composition containing the ingredients (1), (2), and (3) for use in the above determination method. The method and the composition make it possible to determine a small amount of a specimen solution conveniently with high precision and are useful in the field of clinical inspection and food testing.

Description

明 細 書  Specification
グリセロール、 ジヒ ドロキシアセトンまたは D—グリセ πアルデヒ ドの.高感度 定量法および高感度定量用組成物  Highly sensitive method and composition for sensitive determination of glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceryl π-aldehyde
技術分野  Technical field
本発明は、 臨床検査、 食品検査等の分野において重要なグリセロール、 ジヒド ロキシ了セトンまたは D-グリセ TP—ル、 あるいはこれらを反応生成物とする物 質の高感度定量法および定量用組成物に関する。  The present invention relates to a highly sensitive quantification method and a quantification composition for glycerol, dihydroxy-setone or D-glycerol TP-leur, which are important in the field of clinical tests, food tests, and the like, or substances using these as reaction products. .
背景技術 Background art
—般に、 グリセ π—ルゃグリセロールのグリセロールデヒドロゲナーゼによる 代謝産物であるジヒドロキシァセトンゃ D-グリセロアルデヒドを測定すること は臨床検査や食品化学の上で極めて重要である。  In general, it is extremely important in clinical tests and food chemistry to measure dihydroxyacetone-D-glyceraldehyde, which is a metabolite of glycer π-glycerol by glycerol dehydrogenase.
従来、 生体成分や食品成分に含まれるグリセロールの酵素学的測定法は、 主に 次の（1)グリセ π—ルキナーゼを用いる方法、 （2)グリセロールデヒドロゲナーゼ を用いる方法、 及び（3)グリセ π—ルォキシダーゼを用いる方法に大別される。  Conventionally, enzymatic methods for measuring glycerol contained in biological components and food components mainly include the following (1) a method using glycerol π-kinase, (2) a method using glycerol dehydrogenase, and (3) a method using glycerol π- It is roughly classified into a method using oxidase.
(1)の方法は、 グリセ o—ルヰナーゼにより、 次の反応式で示される  The method (1) is represented by the following reaction formula using glycerol o-lupinase.
グリセロール + ATP → L -ダリセロール- 3 -リン酸 + ADP  Glycerol + ATP → L-Dalycerol-3-phosphate-ADP
なる反応を進行せしめ、 グリセロールと化学量論的に同量の L -グリセロール- 3 -リン酸または ADPを測定するものである。 この方法は測定法によって、 更に以下 の（a)、 （b)、 （c)の 3種類の方法に分けられる。 The reaction proceeds to measure the amount of L-glycerol-3-phosphate or ADP stoichiometrically equivalent to glycerol. This method is further divided into the following three methods (a), (b), and (c) according to the measurement method.
(a)上記反応により生成した ADPを測定するもので、 ADPを例えば下記反応式の 如くピルビン酸キナーゼ、 乳酸デヒドロゲナーゼを用いた反応に付し、 NADHの減 少を 340nmにおいて分光学的に測定するものである。  (a) ADP produced by the above reaction is measured.ADP is subjected to a reaction using, for example, pyruvate kinase and lactate dehydrogenase as shown in the following reaction formula, and the reduction of NADH is spectrophotometrically measured at 340 nm. Things.
ホスホェノールピルビン酸 + ADP → ピルビン酸 + ATP  Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
ピルビン酸 + NADH → 乳酸 + NAD  Pyruvate + NADH → Lactate + NAD
(b)前記反応により生成した L -グリセロール- 3 -リン酸を測定するもので、 L -グリセロール- 3 -リン酸を下記反応式の如く L -グリセロール- 3 -リン酸デヒド ロゲナーゼを用いた反応に付し、 NADHの増加を 340 において分光学的に測定す るものである。 尚、 本方法においては、 フヱナジンメ トサルフヱート （PMS) ま たはジァホラーゼとニトロブルーテトラゾリゥムを共存させた比色法を用いる方 法も提唱されている。 (b) L-glycerol-3-phosphate generated by the above reaction is measured, and L-glycerol-3-phosphate is reacted with L-glycerol-3-phosphate dehydrogenase according to the following reaction formula. And the increase in NADH is measured spectrophotometrically at 340. Things. In addition, in this method, a method using a colorimetric method in which phenazine metsulfate (PMS) or diaphorase and nitroblue tetrazolium coexist has been proposed.
Lーグリセロール- 3—リン酸 + NAD →  L-glycerol-3-phosphate + NAD →
ジヒドロキシ了セトンリン酸 + NADH  Dihydroxy R-Setone Phosphate + NADH
(c)上記反応により生成した L-グリセロール- 3 -リン酸を測定するもので、 下 記反応式のようにまず L-グリセロール- 3 -リン酸を L-グリセロール- 3 -リン酸 ォキシダーゼを用いた反応に付して過酸化水素を生じせしめ、 その後、 色原体の 共存下にペルォキシダーゼを用いて色素を生じせしめて分光学的に測定するもの である （特公平 1 - 31880号公報） 。  (c) L-glycerol-3-phosphate generated by the above reaction is measured.L-glycerol-3-phosphate is first converted to L-glycerol-3-phosphate oxidase as shown in the following reaction formula. In this method, hydrogen peroxide is produced by the reaction described above, and then a dye is produced using peroxidase in the presence of a chromogen, and the measurement is carried out spectrophotometrically (Japanese Patent Publication No. 1-31880).
L-グリセロール- 3 -リン酸 + 02 → L-glycerol-3-phosphate + 0 2 →
ジヒドロキシァ トンリ ン酸 + H302 Dihydroxy § Tonri phosphate + H 3 0 2
H202 + 色原体 — 色素 + H20 H 2 0 2 + Chromogen — Dye + H 2 0
(2)の方法は、 グリセロールデヒドロゲナーゼにより、 次の反 ¾S式で示される グリセロール + NAD - ジヒド πキシアセトン + ΝΜ)Η  In the method (2), glycerol dehydrogenase is used to react with glycerol + NAD-dihydropixyacetone + +) represented by the following formula:
なる反応を進行せしめ、 グリセロールと化学量論的に同量生成する NADHを分光学 的に測定するものである （特開平 1-117800号公報） 。  The following reaction proceeds, and NADH, which is stoichiometrically produced in the same amount as glycerol, is measured spectrophotometrically (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-117800).
(3)の方法は、 グリセロールォキシダーゼにより、 次の反応式で示される グリセロール + 02 → グリセ口アルデヒド + H20s The method of (3) include glycerol O by Kishida over zero, glycerol + 0 2 → glycerin port aldehyde + H 2 0 s represented by the following reaction scheme
なる反応を進行せしめ、 グリセロールと化学量論的に同量生成する過酸化水素を (l) (c)と同様の方法で測定するものである （特開昭 53-130488号:公報） 。 (C) Hydrogen peroxide produced in the same amount as glycerol is measured in the same manner as in (l) and (c) (JP-A-53-130488: JP).
これらの、 グリセ n—ルの酵素学的測定法は、 臨床検査分野では、 脂質代謝異 常の診断に有用である血清中トリグリセ I) ドの測定の際に広く佣いられている。 すなわち、 トリグリセリ ドをリパーゼを用いてグリセ口一ル^肪酸に加水分解 し、 生じたグリセロールを上記いずれかの方法で測定するものである。 また、 グ リセ口ールの定量は、 その他にも様々な生体成分や食品成分 ί3分析にも利用され、 例えば、 食品分折用試薬として（1) (a)の原理に基づく試薬がキ トとして市販さ れており、 ワインゃビール中などのグリセ α—ルの測定に利用されている。 These enzymatic methods for measuring glycerol are widely used in the clinical laboratory field for measuring serum triglyceride I), which is useful for diagnosing lipid metabolism disorders. That is, triglyceride is hydrolyzed into glycerol fatty acid using lipase, and the resulting glycerol is measured by any of the above methods. In addition, the quantitative determination of griseoal is also used for analysis of various biological components and food components. For example, a reagent based on the principle of (1) (a) is used as a reagent for food analysis. Marketed as It is used to measure glycerol in wine and beer.
また、 ジヒドロキシアセ ト ンの測定はグリコーゲン病の診断に有用である。 す なわち、 ジヒド口キシァセ トンを経口投与し、 血清中の濃度が増加する場合には グリコーゲン病の疑いがあると診断される。 この定量に際しては、 ATPの存在下 グリセ D—ルキナーゼ（BC 2.7.1.30)とグリセロール- 3 -リン酸デヒドロゲナー ゼ（BC 1.1.1.8)を共存させて、 NADHの減少を測定することが行なわれている （生 化学辞典， P584, 東京化学同人 (1989)) 。  In addition, measurement of dihydroxyaceton is useful for diagnosis of glycogen disease. That is, if oral dihydric xyaceton is administered and serum levels increase, the patient is diagnosed with suspected glycogen disease. In the determination, NADH reduction was measured in the presence of glycerol D-kinase (BC 2.7.1.30) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (BC 1.1.1.8) in the presence of ATP. Yes (Biochemical Dictionary, P584, Tokyo Kagaku Doujin (1989)).
さらに、 D-グリセ口アルデヒドは D-フルク トース代謝の中間体であり、 この 定量に際しては、 了ルコールデヒドロゲナーゼ（BC 1.1.1.1 & BC 1.1.1.2)また はアルデヒドデヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.3 & BC 1.2.1.4)を用いたり、 あるい はトリオキナーゼ（BC 2.7.1.28)でグリセロアルデヒド- 3-リン酸に導いたのち、 ト リオースリン酸ィソメラーゼ（EC 5.3.1.1.)、 グリセロール -3-Dン酸デヒド 口ゲナーゼ（BC 1.1.1.8)を共存させて測定することが行なわれている （生化学辞 典， P362-363, 東京化学同人 (1989)) 。  In addition, D-glyceraldehyde is an intermediate in D-fructose metabolism, and its quantification requires the determination of alcohol dehydrogenase (BC 1.1.1.1 & BC 1.1.1.2) or aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3 & BC 1.2 Glyceraldehyde-3-phosphate with glyceraldehyde-3-phosphate, or with glyceraldehyde-3-phosphate using triokinase (BC 2.7.1.28). It has been measured in the presence of dehydrogenase (BC 1.1.1.8) (Biochemical Dictionary, P362-363, Tokyo Chemical Dojin (1989)).
一般に、 酵素を用いて分析する場合、 上記の各方法のように測定をしょうとす る対象物質を分光学的に検出可能な過酸化水素や還元型 NAD (P)等に変換すること が多い。 しかしながら、 過酸化水素はペルォキシダーゼと共役させて呈色反応に 導かれるが、 この反応はァスコルビン酸ゃビリルビン等の還元物質や SH基含有物 質等により妨害を受けるという欠点がある。 また、 還元型 NAD (P)の検出は前述の ように 340nraの吸収で測定する場合は還元型 NAD (P)の蓄積によつて反応の平衡が 還元型 NAD (P)生成と逆方向にかたよるため、 PH管理を厳密に行わなくてはならな いという間題を有している。 更に、 ジ了ホラーゼ、 ニトロブルーテトラゾリゥム を用いた呈色反応を利用した測定法も、 還元型 NAD (P)蓄積による生成物阻害は防 ぐことはできるものの、 ホルマザン色素は難溶性であるため試験管やチューブへ の色素の付着が起こりやすく、 自動分析装置への応用は困難である。  Generally, when performing analysis using enzymes, the target substance to be measured is often converted into spectroscopically detectable hydrogen peroxide, reduced NAD (P), etc. as in each of the above methods. . However, although hydrogen peroxide is conjugated to peroxidase and led to a color reaction, there is a drawback that this reaction is hindered by reducing substances such as ゃ bilirubin ascorbate and substances containing SH groups. As described above, when the detection of reduced NAD (P) is measured by absorption at 340 nra, the equilibrium of the reaction depends on the accumulation of reduced NAD (P) in the opposite direction to the production of reduced NAD (P). Therefore, there is a problem that PH management must be strictly performed. Furthermore, a measurement method using a color reaction using dihydrophorase and nitroblue tetrazolium can prevent the product inhibition due to the accumulation of reduced NAD (P), but the formazan dye is hardly soluble. As a result, dyes easily adhere to test tubes and tubes, and application to automatic analyzers is difficult.
また現在、 分光学的に検出可能な物質を測定する方法としては分光分析機を用 いる方法が最も普及しているが、 これも感度上に限界が有り、 測定対象物の含量 が少ない場合は適さないという欠点があつた。 Currently, spectroscopy is the most widely used method for measuring substances that can be detected spectroscopically, but this method also has a limit in sensitivity, and the content of the analyte If the number is small, it is not suitable.
そこで、 測定対象物の含量が少ない場合や、 測定対象物を含む被検体が少量で ある場合などは、分光分析よりも感度の優れた蛍光分析や発光分析等が用いられ ている。 しかしながら、 これらの方法も機器の普及という点から、 臨床検査等の 汎用検査としては、 あまり適したものではなかった。  Therefore, when the content of the measurement target is small, or when the amount of the analyte containing the measurement target is small, fluorescence analysis, luminescence analysis, and the like, which are more sensitive than spectroscopic analysis, are used. However, these methods were not very suitable as general-purpose tests such as clinical tests because of the spread of equipment.
また、 微量の物質を測定するその他の方法としては、 当該物質が等量の補酵素 などに変換できる場合は、 2種類の酵素を用いて捕酵素を増幅する、 いわゆる酵 素サイクリング法が行われている。 例えば、 NADサイクリング法、 CoAサイクリン グ法、 ATPサイクリング法等が用いられているが、 これらの方法はいずれも臨床 検査等のルーチン分析においては、 搔作が煩雑すぎるために用いられていないの が現状である。  In addition, as another method for measuring a trace amount of a substance, when the substance can be converted into an equal amount of a coenzyme, a so-called enzyme cycling method in which a capture enzyme is amplified using two kinds of enzymes is performed. ing. For example, the NAD cycling method, CoA cycling method, ATP cycling method, etc. have been used, but none of these methods is used in routine analysis such as clinical tests because the operation is too complicated. It is the current situation.
従って、 分光分析機器にも適用が可能なグリセロール、 ジヒド キシアセトン または D-グリセ αアルデヒドの髙感度測定法の開発が望まれていた。  Therefore, the development of a sensitive method for measuring glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceric aldehyde that can be applied to spectroscopic instruments has been desired.
髙感度測定法がもたらす利点としては、 測定対象物の含量が少ない場合はもと より、 測定に必要な検体量を減らすことができるため、 例えば血清のように種々 の成分を含むものを被検体に用いる場合には、 共存物質によるその測定系に及ぼ す影響を小さくすることができる。 また、 ある限られた被検体量で検査できる項 目数を增やすことも可能であり、 更には検体が人血液である場合などは、 採血量 を滹らすことができるため、 被採血者への心理的な負担を軽滅することもできる。 このように、 検出感度を髙くすることは、 臨床検査においては血液という貴重な 検体を用いることや微量成分を測定する必要性から考えて、 必然の要求である。 かかる実情において、 本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、 グリセロールを基質としてジヒドロキシ了セトンまたは D-グリセロアルデヒド を生成する酵素反応を実施するに当り、 酵素としてグリセロールデヒドロゲナー ゼを使用する反応系において、 補酵素として、 一方にチォニコチンアミ ドアデニ ンジヌクレオチド類 （以下チォ NAD類という） およびチォニコチンアミ ドアデニ ンジヌクレオチドホスフヱート類 （以下チォ NADP類という） からなる群より選ば れた 1つを使用し、 他方に、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド類 （£1下 NA D類という） およびニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート釋 （以 下 NADP類という） からなる群より選ばれた 1つを使用するという、 特定の 2種類 の補酵素を使用するサイクリング反応を見出した。 且つこの反応において、 チォ NAD類およびチォ NADP類の還元型の吸収波長は 400nra付近であり、 NAD類および DP類の還元型の吸収波長は 340nm付近であつて異なる吸収波長域であることから、 どちらか一方の補酵素の変化量のみを、 いずれか一方の吸収波長における吸光度 を測定することによって定量することにより、 吸光度の測定に際して他物質の吸 収波長の混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、 髙感度なグリセ口 ール、 ジヒドロキシァセトンまたは D-グリセ口アルデヒドの定量が可能である ことを確認し、 本発明を完成するに至った。 利 点 The advantage of the sensitivity measurement method is that the amount of the sample required for measurement can be reduced as well as when the content of the analyte is small, so that a sample containing various components such as serum can be used When used for measurement, the effect of coexisting substances on the measurement system can be reduced. In addition, it is possible to reduce the number of items that can be tested with a limited amount of the sample, and if the sample is human blood, the amount of blood collected can be reduced. It can also reduce the psychological burden on people. Thus, increasing the detection sensitivity is an indispensable requirement in clinical tests, considering the need to use precious samples such as blood and the need to measure trace components. Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, when performing an enzymatic reaction to generate dihydroxy-setone or D-glyceraldehyde using glycerol as a substrate, glycerol dehydrogenase was used as an enzyme. In a reaction system using, as a coenzyme, one of the group consisting of thionicotinamide amide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as thio NADs) and thionicotinamide amide adenine dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as thio NADPs) is used. Choice The other was selected from the group consisting of nicotinamide adenine dinucleotides (NADs under £ 1) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphates (NADPs). We have found a cycling reaction that uses two specific coenzymes: one. In addition, in this reaction, the absorption wavelengths of the reduced forms of NADs and NADPs are around 400 nra, and the absorption wavelengths of the reduced forms of NADs and DPs are around 340 nm, which are different absorption wavelength ranges. By quantifying only the change in one of the coenzymes by measuring the absorbance at either one of the absorption wavelengths, an enzyme cycling reaction that can avoid crowding of the absorption wavelength of other substances when measuring the absorbance is performed. The present inventors have confirmed that glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde can be quantitatively determined with high sensitivity, and have completed the present invention.
発明の開示 Disclosure of the invention
本発明はグリセロール、 ジヒドロキシァセトンおよび D -グリセロアルデヒド からなる群より選ばれた 1種の被 *¾成分を含有する被検体に、  The present invention relates to a subject containing one type of * 被 component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde,
(1) チォ NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくともグリセロールを 基質としてジヒ ドロキシァセトンまたは D-グリセロアルデヒ ドを生成する可逆 反応をなすグリセ口ールデヒ ドロゲナーゼ、  (1) Dihydroxyacetone or D-glyceroaldehyde using one selected from the group consisting of thio NADPs and thio NADs and one selected from the group consisting of NADPs and NADs as coenzymes and using at least glycerol as a substrate Glyceride aldehyde dehydrogenase, which undergoes a reversible reaction to produce
(2) A ,  (2) A,
(3) B :  (3) B:
を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式 （ I ) The following reaction formula (I)
A A A A
グリセ π—ル  Glycee π-le
デヒ ドロゲナーゼ  Dehydrogenase
ジヒ ドロキシアセ トン  Jihi-Droxyaceton
グリセロール または （ I )  Glycerol or (I)
D—グリセロアルデヒ ド (式中、 A ,はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は A iの 還元型生成物を示し、 B iは A！がチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NA DP類または還元型 tiAD類を、 A iが NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP類 または還元型チォ NAD類を示し、 B i B tの酸化型生成物を示す） D—Glyceroaldehyde (In the formula, A, represents a thio NADP, a thio NAD, a NADP or a NAD, A 2 represents a reduced product of A i, and B i represents a thio NADP or a thio NAD. Indicates reduced NADPs or reduced tiADs, Ai indicates NADPs or NADs, indicates reduced thioNADPs or reduced thioNADs, and indicates oxidized B i Bt products )
で表されるサイクリング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する A 2または の量を測定することを特徵とするグリセロール、 ジヒドロキシアセトンおよ び グリセ口アルデヒドからなる群より選ばれた 1種の被検成分の髙感度定量 法に係るものである。 In represented brought form a cycling reaction, glycerol and Toku徵measuring the amount of A 2 or changed by the reaction, one of the test selected from the group consisting of dihydroxyacetone and glycerin port aldehyde It relates to a method for determining the sensitivity of components.
また、 本発明は上記成分 (1)、 （2)および (3)を舍有することを特徵とするグリ セロール、 ジヒ ドロキシァセ トンおよび D-グリセロアルデヒ ドからなる群より 選ばれた 1種の被検成分の髙感度定量用組成物に係るものである。  Also, the present invention provides a test sample selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceroaldehyde, which comprises the above components (1), (2) and (3). The present invention relates to a composition for determining the sensitivity of components.
図面の簡単な説明  BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 実施例 1における、 グリセロール量に対する 400mnにおけるレイ トァ ッセィの結果を示す図面である。 図 2は、 実施例 2における、 グリセロール量に 対する 400nraにおけるレイ トアツセィの結果を示す図面である。 図 3は、 実施例 3における、 L - -ホスファチジル- DL -グリセ口一ル量に対する 400nmにおける レイ トァ"ノセィの結果を示す図面である。 図 4は、 実施例 4における、 ジヒド キシァセトン量に射する 400mnにおけるレイ トアツセィの結果を示す図面である。 図 5は、 実施例 5における、 グリセロール量に对する 400nmにおけるレイ トァ"ノ セィの結果を示す図面である。  FIG. 1 is a drawing showing the results of a rate assay at 400 mn with respect to the amount of glycerol in Example 1. FIG. 2 is a drawing showing the results of late access at 400 nra with respect to the amount of glycerol in Example 2. FIG. 3 is a drawing showing the results of the rate of no-dose at 400 nm with respect to the amount of L--phosphatidyl-DL-glycerol in Example 3. FIG. 4 shows the amount of dihydroxycetone in Example 4. 5 is a drawing showing the result of a late assay at 400 mn in Fig. 5. Fig. 5 is a drawing showing the result of a late assay at 400 nm relative to the amount of glycerol in Example 5.
発明を実施するための最良の形態 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明において用いられるグリセロールデヒドロゲナーゼは、 少なくともグリ セロールを基質としてジヒドロキシァセトンまたは D-グリセロアルデヒドを生 成する可逆反応を触媒するものであって、 チォ NADP類およびチォ NAD類からなる 群より選ばれた 1つと、 NADP類および NAD類からなる群より選ばれた 1つとを補 薛素とするものならいずれをも用いることができる。  The glycerol dehydrogenase used in the present invention catalyzes a reversible reaction for producing dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde using at least glycerol as a substrate, and is selected from the group consisting of thioNADPs and thioNADs. Either one can be used as long as one is selected from the group consisting of NADPs and NADs.
本酵素は、 動物組織、 植物、 バクテリア等に広く存在する。 酵素ハンドブック 〔朝倉書店 （1983年） 〕 によれば、 グリセロールデヒドロゲナーゼには、 酵素番 号の異なる 3種類の酵素が存在する。 そのうち BC 1. 1. 1. 6のものは、 （チォ） NAD 類に特異的な酵素であり、 グリセロールを基質としてジヒドロキシァセトンを生 産物とする反応をつかさどり、 その具体例としては、 大腸菌 （B. Col i) 、 ァェ ロノヾクター 了エロゲネス (Aerobacter aerogenes) 、 ァセト ノヾクタ一 サボキ シダンス （Acetobacter suboxydans) 由来のものや、 市販されているものとして バチルス メガテリゥム （Baci l lus megaterium) (東洋醸造社製） 、 ェンテロ ノヾ夕夕一 了ェ ϋゲネス (Bnterobacter aerogenes) (ぺーリンガーマンノヽィム 社製） 、セル πモナス エスピー （Cel lulomonas sp. ) (東洋紡社製） 由来のも の等が挙げられる。 また、 バチルス ステアロザーモフィラス （Baci l lus stear othermophi lus) 由来の耐熱性酵素も知られている （特公平 1-17674号公報） 。 これらのうち、 ノ チルス メガテリゥム （Baci l lus megaterium) (東洋醸造 社製） 由来の酵素の補酵素に対する相対活性は、 NAD類を用いたときを 100%とす ると、 チォ NAD類で 7. 6%であり、 （チォ） NADP類には作用しなかった。 また、 セル 口モナス エスピー （Cel lulomonas sp. ) (東洋紡社製） 由来の酵素の補酵素に 対する相対活性は NAD類を用いたときを 100%とすると、 チォ NAD類で 6. 4%であり 、 （チォ） NADP類には作用しなかった。 This enzyme is widely found in animal tissues, plants, bacteria and the like. Enzyme handbook According to Asakura Shoten (1983), glycerol dehydrogenase has three types of enzymes with different enzyme numbers. Among them, BC 1. 1. 1. 6 is an enzyme specific to (Cho) NADs, which controls the reaction of producing dihydroxyacetone using glycerol as a substrate. A specific example is Escherichia coli ( B. Col i), Aerobacter aerogenes, Acetobacter suboxydans, and commercially available Bacillus megaterium (Toyo Brewery) Products), Benterobacter aerogenes (manufactured by Perlinger Mannheim), and those derived from Cell pi Monas sp. (Manufactured by Toyobo). Can be Also, a thermostable enzyme derived from Bacillus stearothermofilus (Bacillus stear othermophi lus) is known (Japanese Patent Publication No. 1-17674). Of these, the relative activity of the enzyme derived from Bacillus megaterium (manufactured by Toyo Brewery Co.) with respect to the coenzyme is 100% when the NADs are used. 6%, and had no effect on (Cho) NADPs. The relative activity of the enzyme derived from Cellulomonas sp. (Manufactured by Toyobo Co., Ltd.) with respect to the coenzyme is 6.4% for the chi NADs, assuming that the NADs are 100%. , (Cho) did not act on NADPs.
また、 BC 1. 1. 1. 72のものは、 （チォ） NADP類に特異的な酵素であり、 グリセ口 一ルを基質として D -グリセロアルデヒドを生産物とする反応をつかさどり、 ゥ サギ骨格筋に見出されている。 この酵素は PH 7では逆反応が支配的であり、 NAD も NADPの 10%の活性を示す (Biochim. Biophys. Acta 258, 40-55, 1972) 。 ま た、 二ユウロスボラ クラッサ （Neurospora crassa) 由来の酵素についての報 告もなされているが （Journal of General Microbiology, 107, 289-296, 1978) 、 この酵素は（チォ） MD類は補酵素としない。  In addition, BC 1.1.1.172 is an enzyme specific to (Cho) NADPs, which controls the reaction using D-glyceraldehyde as a product using glycerol as a substrate. Found in muscle. This enzyme is dominated by the reverse reaction at PH7, and NAD also exhibits 10% activity of NADP (Biochim. Biophys. Acta 258, 40-55, 1972). In addition, although an enzyme derived from Neurospora crassa has been reported (Journal of General Microbiology, 107, 289-296, 1978), this enzyme does not use (chi) MDs as coenzymes. .
更に、 EC 1. 1. 1. 156のものは、 （チォ） NADP類に特異的な酵素であり、 グリセ口 一ルを基質としてジヒドロキシ了セトンを生産物とする反応をつかさどり、 緑藻 ドウナリエラ ノ、。ルバ (Dunal iel la parva) の細胞に見出されている。 本発明においては、 基質であるグリセロールに対して反応性を有するものであ れば、 上述の酵素以外の他の起源の酵素も使用することができ、 その補酵 に対 する特異性は適宜、 補酵素と基質とを用いて確認することができる。 Further, those of EC 1.1.1.156 are enzymes specific to (Cho) NADPs, which are responsible for the reaction of using diglycol ester as a substrate to produce dihydroxy-setone, and . Found in cells of Luba (Dunal iel la parva). In the present invention, enzymes of other origins other than the above-mentioned enzymes can be used as long as they have reactivity with glycerol as a substrate, and the specificity for the coenzyme is appropriately determined. It can be confirmed using a coenzyme and a substrate.
また、 本発明において、 A ,および B 2の補酵素はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NA DP類、 NAD類を示すが、 このうちチォ NADP類またはチォ NAD類としては、 例えばチ ォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフヱート （チォ NADP) 、 チォニコ チンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフユート、 チォニコチンアミ ド了 デ^ンジヌクレオチド （チォ NAD) 、 チォニコチンアミ ドヒポキサンチンジヌク レオチドが挙げられる。 また、 NADP類または NAD類としては、 例えばニコチンァ ミ ドアデニンジヌクレオチドホスフェート （NADP) 、 了セチルピリジンアデニン ジヌクレオチドホスフェート （ァセチル NADP) 、 ァセチルビリジンヒポキサンチ ンジヌクレオチドホスフェート、 ニコチンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチド ホスフェート （デァミノ NADP) 、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （NAD) 、 ァセチルビリジンアデニンジヌクレオチド （ァセチル NAD) 、 ァセチルビリジン ヒポキサンチンジヌクレオチド、 ニコチンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチド (デァミノ NAD) が挙げられる。 尚これら補酵素の還元型は、 各々チォ NADPH類、 チォ！ iADH類、 NADPH類、 NADH類として表示する。 Further, in the present invention, A, and coenzyme Chio-NADP of B 2, Chio NAD, NA DP class, show NAD, as these Chio NADP or Chio NAD compound, for example Ji Onikochin'ami Doadenin Dinucleotide phosphate (Cho NADP), chonicotinamide dohypoxanthine dinucleotide phosphate, chonicotinamide dihydronucleotide (Cho NAD), and chonicotinamide dohypoxanthine dinucleotide. Examples of NADPs or NADs include nicotine amide adenine dinucleotide phosphate (NADP), cetylpyridine adenine dinucleotide phosphate (acetyl NADP), acetyl viridine hypoxanthine dinucleotide phosphate, and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide. Examples include nucleotide phosphate (damino NADP), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), acetyl pyridine adenine dinucleotide (acetyl NAD), acetyl viridine hypoxanthine dinucleotide, and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (damino NAD). The reduced forms of these coenzymes are Chio NADPHs and Chio! Displayed as iADHs, NADPHs, and NADHs.
本発明においては A！および において例えば A！がチォ NAD (P)類である場合、 は MD(P) H類であることが必要であり、 が NAD(P)類である場合、 はチォ NAD (P) H類であることが必要である。  In the present invention, A! And for example A! If is a NAD (P), must be MD (P) H, and if is a NAD (P), must be a NAD (P) H. is there.
また定量に用いるグリセロールデヒドロゲナーゼが（チォ） NAD類のみを補酵素 とする場合は、 上述のチォ NAD類と NAD類より、 また、 用いるグリセロールデヒド πゲナーゼが (チォ） NADP類のみを補酵素とする場合は、 上述のチォ NADP類および NADP類より、 更に用いるグリセロールデヒドロゲナ一ゼが（チォ） fJAD類および（チ ォ） NADP類を共に捕酵素にする場合は上述のチォ NAD類およびチォ NADP類と上述 の NAD類および NADP類より適宜選択し、 それらの酸化型、 還元型を適宜用いれば よい。 本発明の高感度定量法を用いて測定を行う場合には、 酵素サイクリング反応が 最も効率よく進行するように、 使用するグリセ口一ルデヒドロゲナーゼ 各補酵 素間の相対活性を考慮して 2種の補酵素の選択と使用する比率の設定を行い、 更 に反応 pHを正反応 Z逆反応の至適 PH範囲に設定するのが好ましい。 In addition, when the glycerol dehydrogenase used for the quantification uses only (thio) NAD as a coenzyme, the glycerol dehydrogenase to be used uses only (thio) NADP as a coenzyme from the above-mentioned NADs and NADs. In this case, when the glycerol dehydrogenase to be used further comprises both (thio) fJADs and (thio) NADP as entrapment enzymes, the above-mentioned chi-NADPs and NADPs. And the above-mentioned NADs and NADPs, and their oxidized and reduced forms may be appropriately used. When the measurement is performed using the high-sensitivity quantification method of the present invention, two types of glycerol monoldehydrogenase are used in consideration of the relative activity between each coenzyme so that the enzyme cycling reaction proceeds most efficiently. It is preferable to select the coenzyme and set the ratio to be used, and further set the reaction pH within the optimum pH range for the forward reaction and the reverse reaction.
また、 本発明の定量法によれば被検体中のグリセ1 p—ルの定量のみならず、 グ リセロールにグリセロールデヒドロゲナーゼを反応させた場合の反応生成物であ るジヒドロキシァセトンまたは D-グリセロアルデヒドの定量も可能である。 また、 本発明の高感度定量法を用いれば、 グリセロール、 ジヒドロキシァセ ト ンまたは D-グリセロアルデヒドを遊離、 生成する酵素系における基質やその酵 素活性を測定することもできる。 更に、 本発明の高感度定量法を用いれば、 上記 のようなグリセ口ール、 ジヒドロキシァセ トンまたは D-グリセ口アルデヒドを 遊離、 生成する酵素系と連結し得る単一の、 もしくは複数の工程からなる酵素系 における基質やその酵素活性をも測定することができる。 これらの酵素系は、 特 に限定されるものではないが、 例えば以下に示す種々の反応系が挙げられる。 Further, according to the quantification method of the present invention not only glycerin 1 p-Le quantification in the subject, Ru reaction products der in the case of reaction of glycerol dehydrogenase grayed Riseroru dihydroxy § seton or D- glyceraldehyde Is also possible. Further, by using the highly sensitive quantification method of the present invention, it is also possible to measure a substrate in an enzyme system that releases and produces glycerol, dihydroxyaceton or D-glyceraldehyde, and its enzyme activity. Furthermore, by using the highly sensitive quantification method of the present invention, a single or a plurality of glycerols, dihydroxyacetones or D-glyceraldehydes as described above that can be linked to an enzyme system that releases and produces glycerol The substrate and its enzymatic activity in the enzyme system comprising the steps can also be measured. These enzyme systems are not particularly limited, but include, for example, the following various reaction systems.
( 1 ) ホスファチジルグリセロールとホスフォ リパーゼ D (BC 3. 1. 4. 4)の酵 素反応系。  (1) Enzymatic reaction system of phosphatidylglycerol and phospholipase D (BC 3.1.4.4).
ホスファチジルグリセロール + H20 Phosphatidylglycerol + H 2 0
→ グリセロール + ホスファチジン酸  → glycerol + phosphatidic acid
この系において、 遊離、 生成するグリセロールを定量することにより、 ホスフ ァチジルグリセ α—ルの定量またはホスフオリパーゼ Dの活性測定をすることが できる。  In this system, by determining the amount of glycerol released and generated, it is possible to determine the amount of phosphatidylglycerol or the activity of phospholipase D.
( 2 ) モノ、 ジまたはト リグリセライ ドとリパーゼ（EC 3. 1. 1. 3)の酵素反応 系。  (2) Enzymatic reaction system of lipase (EC 3.1.1.3) with mono-, di- or triglycerides.
グリセライ ド + nH20 → Ti脂肪酸 + グリセロール Glyceride + nH 20 → Ti fatty acid + glycerol
この系において、 遊離、 生成するグリセロールを定量することにより、 モノ、 ジまたはト リグリセライ ドの定量あるいはリパーゼの活性測定をすることができ る o ( 3 ) D-フルク ト一ス- 1 -リン酸とフルク トースジリン酸アルドラ一ゼ（BIn this system, the amount of glycerol released and produced can be quantified to quantify mono-, di- or triglycerides or to measure lipase activity.o (3) D-fructos-1-phosphate and fructosyl diphosphate aldolase (B
C 4. 1. 2. 13) の酵素反応系。 C 4. 1. 2. 13) Enzyme reaction system.
D -フ jレク トース - 1ーリン酸  D-frectose-1-phosphoric acid
→ ジヒド πキシアセトンリン酸 + D-グリセ口アルデヒド この系において、 遊離、 生成する D—グリセ口アルデヒドを定量することによ り、 D-フルク トース - 1 -りン酸の定量またはフルク トースジリン酸アルドラー ゼの活性測定をすることができる。  → Dihydrogen π-xyacetone phosphate + D-glyceraldehyde In this system, the amount of free and formed D-glyceraldehyde can be determined to determine D-fructose-1-linic acid or fructosyl diphosphate. Aldolase activity can be measured.
( 4 ) ( 3 ) の D-フルク トース- 1 -リン酸が D-フルク トース、 ATPとへキ ソキナーゼ (EC 2. 7. 1. 3)の酵素反応系由来である場合。  (4) The case where the D-fructose-1-phosphate in (3) is derived from an enzymatic reaction system of D-fructose, ATP and hexokinase (EC 2.7.1.3).
D -フルク ト―ス + ATP→ D-フルク トース— 1—リン酸 + ADP D-Fructose + ATP → D-Fructose— 1-phosphate + ADP
D-フ レク トース— 1 -リン酸→ D-fructose— 1-phosphoric acid →
ジヒドロキシァセトンリン酸 + D-グリセロアルデヒド  Dihydroxyacetone phosphate + D-glyceroaldehyde
この場合、 最終的に生成する D-グリセ口了ルデヒドを定量することにより、 D-フルクトースの定量またはへキソキナーゼの活性測定をすることができる。 本発明における、 A！および の使用量は被検体中のグリセロール、 ジヒドロ キシァセトンおよび D -グリセ口アルデヒドからなる群より選ばれた 1種の被検 成分に比較して過親量であること、 且つグリセロールデヒドロゲナーゼの A ,お よび B iそれぞれに対する Km値に比較して過剰量であることが必要であり、 特 に被検成分の 20〜： 10000倍モルが好ましい。  In this case, D-fructose can be quantified or hexokinase activity can be measured by quantifying the finally generated D-glyceyl aldehyde. In the present invention, A! The amounts of and used should be superparent compared to one test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde in the subject, and the amounts of glycerol dehydrogenase A, It is necessary to be in excess of the Km value for each of B and B i, and it is particularly preferable that the molar ratio of the test component is 20 to 10,000 times.
本発明の定量用組成物においては、 および の濃度は 0. 02~100mM、 特に 0. 05〜20raMが好ましく、 グリセロールデヒドロゲナーゼの量は 10〜： L000u/nil、 特 に 25〜400u/nilが好ましいが、 その量は被検体の種類等により適宜決定すること ができ、 これ以上の量を用いることもできる。  In the quantitative composition of the present invention, the concentrations of and are preferably from 0.02 to 100 mM, particularly preferably from 0.05 to 20 raM, and the amount of glycerol dehydrogenase is from 10 to: L000u / nil, particularly preferably from 25 to 400 u / nil. However, the amount can be appropriately determined depending on the type of the subject and the like, and a larger amount can be used.
また、 本発明定量法はグリセ口一ルデヒドロゲナーゼが単独でまたは 2種 上 の組み合わせによって（チォ） MD類および (チォ） NADP類を共に補酵素とする場合 において、 2つ ( 補酵素にチォ NAD類と NAD類もしくは NADP類との組合せ、 または チォ NADP類と NAD類もしくは NADP類との組合せを選んだときには、 更に被検体に 成分（4)のグリセロールに作用せず、 B 2→B ,の反応を形成する第二のデヒドロ ゲナーゼおよび該第二のデヒドロゲナ一ゼの基質を作用せしめることにより、 後 記反応式 （Π ) のごとく、 B ,と B 2の間に の再生のための反応系を付与する ことにより当該サイクリング反応を形成せしめ得る。 In addition, the quantification method of the present invention can be applied to the case where glycerol monodehydrogenase is used alone or in combination of two or more as a coenzyme with (Cho) MDs and (Cho) NADPs as coenzymes. If a combination of thiophene and NADs or NADPs, or a combination of thio NADPs and NADs or NADPs is selected, the By reacting a second dehydrogenase and a substrate of the second dehydrogenase, which do not act on the glycerol of the component (4) but form a reaction of B 2 → B, the following reaction formula (Π) As described above, the cycling reaction can be formed by providing a reaction system for regeneration between B 1 and B 2 .
この場合、 第二のデヒドロゲナーゼは、 この測定系において実質的に A iに作 用しないものであるか、 あるいは実質的に A ,に作用し得ない条件を設定するこ とが好ましく、 例えば A！を本質的に補酵素として利用しない第二のデヒド πゲ ナーゼを選択する組合せ、 A ,と B 2の量的関係により第二のデヒドロゲナーゼが 実質的に A iに作用しない条件を選択する組合せ等が例示される。 定量の際には 反応により生成した A 2の量を測定する。 In this case, it is preferable that the second dehydrogenase does not substantially act on A i in this assay system, or that the second dehydrogenase does not substantially act on A 1, for example. Selecting a second dehydrogenase π gate kinase that do not utilize essentially as coenzymes combinations, A, and combinations of second dehydrogenases by quantitative relation of B 2 to select the conditions that do not act on the substantially A i Is exemplified. When quantitative measures the amount of A 2 generated by the reaction.
グリセロール ( Π ) Glycerol (Π)
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0001
第二のデヒドロゲナーゼ  Second dehydrogenase
(式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は の 還元型生成物を示し、 B ,は A iがチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NA DP類または還元型 NAD類を、 A！が NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP類 または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は の酸化型生成物を示し、 は B 2を補酵素として B！を生成する酵素反応を示す） (Wherein represents thio NADPs, thio NADs, NADPs or NADs, A 2 represents a reduced product of, B, represents a reduced form when A i is thio NADPs or thio NADs the NA DP acids or a reduced NAD, when a! is NADP or NAD compound indicates reduction Chio NADP or reduced form Chio NAD, B 2 represents an oxidized product of the the B 2 Shows an enzymatic reaction that produces B!
上記の成分（4)を用いる定量用組成物において、 の濃度は 0. 02〜： l00mM、 特 に 0. 05〜20mMが好ましく、 B 2または Zおよび B！の濃度は 0. 05〜5000/ M、 特に 5〜500ju Mが好ましく、 グリセ口ールデヒドロゲナーゼの濃度は 5〜： I000u/ral、 特に 25〜500u/nilが好ましく、 第二のデヒドロゲナーゼは B2に対する Kra値 （niM単 位） の 20倍量 （u/ml単位） 以上になるように調整すればよく、 例えば 1〜； I00u/ml が好ましく、 また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、 例えば 0.05〜20mMが 好ましい。 これらの量は被検体の種類等により適宜決定することができ、 これ^ 上の量を用いることもできる。 In quantitative composition using the above-mentioned component (4), the concentration of 0. 02~: l00mM, preferably 0. 05～20MM especially, B 2 or Z and B! Is preferably 0.05 to 5000 / M, particularly preferably 5 to 500 juM, and the concentration of glycerol dehydrogenase is 5 to: I000u / ral, Particularly 25~500u / nil preferably, the second dehydrogenase may be 20 times (u / ml unit) adjusted to be above the Kra value for B 2 (NIM Unit), for example 1~; I00u / ml is preferable, and the substrate of the second dehydrogenase is preferably in an excess amount, for example, 0.05 to 20 mM. These amounts can be appropriately determined depending on the type of the subject and the like, and higher amounts can be used.
第二のデヒドロゲナーゼは B 1の再生のために補助的に添加するものであり、 これによつて B！の使用量を少なくすることが可能となり、 特に B が髙価な場合 は有效である。 また、 B,の代わりに B2あるいは と B2の混合物を用いて反応 を行ってもよい。 この場合、 または Zおよび B2の使用量は特に限定されるも のではないが、 一般的には A iの 1 Z10モル以下が好ましい。 The second dehydrogenase is supplementarily added for the regeneration of B1, whereby B! It is possible to reduce the amount of used, especially when B is expensive. The reaction may be carried out using B 2 or a mixture of B 2 and B 2 instead of B. In this case, the use amounts of Z and B 2 are not particularly limited, but generally 1 Z 10 mol or less of A i is preferable.
第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質としては、 例えば、 B2が NAD類または チォ MD類のときは、 了ルコ一ルデヒドロゲナ一ゼ（BC 1.1.1.1)とエタノール、 グリセロール- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ（BC 1.1.1.8) (ゥサギ筋肉由来） と The second dehydrogenase and its substrate, for example, when B 2 is a NAD compound or Chio MD acids, Ryo Turkey one Rudehidorogena one peptidase (BC 1.1.1.1) and ethanol, glycerol - 3-phosphate dehydrogenase (BC 1.1 .1.8) (from egret muscle)
-グ ijセロール- 3- ン酸、 グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（BC 1. 1.1.12) (ゥサギ骨格筋、 肝、 酵母、 B.Coli由来） と D-グリセ口アルデヒドリン 酸とリン酸、 B2が NADP類またはチォ NADP類のときは、 グルコース- 6-リン酸デ ヒドロゲナーゼ（BC 1.1.1.49) (酵母由来） とグルコース- 6-リン酸、 イソクェ ン酸デヒドロゲナーゼ（BC 1.1.1.42) (酵母、 ブタ心筋由来） とイソクェン酸、 グひォキシル酸デヒドロゲナーゼ（BC 1.2.1.17) (Pseudomonas oxalaticus由来) と CoAとグリオキシル酸、 ホスホダルコン酸デヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.44) (ラ ッ ト肝、 ビール酵母、 B. Coli由来） と 6-ホスホ -D-ダルコン酸、 グリセ口アル デヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（BC 1.2.1.13) (植物葉緑体由来） と D-グリセ口 アルデヒド- 3-リン酸とリン酸、 ベンズアルデヒドデヒド口ゲナーゼ（BC 1.2.1. 7) (Pseudomonas fluorescens由来）とペンズアルデヒド等が挙ばられる。 -G ij serol-3- acid, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (BC 1.1.1.12) (derived from egret skeletal muscle, liver, yeast, B.Coli) and D-glyceraldehyde aldehyde phosphate and phosphate, B When 2 is NADPs or thio NADPs, glucose-6-phosphate dehydrogenase (BC 1.1.1.49) (derived from yeast) and glucose-6-phosphate, isocitrate dehydrogenase (BC 1.1.1.42) (yeast Porcine myocardium), isoquenic acid, glutoxylate dehydrogenase (BC 1.2.1.17) (Pseudomonas oxalaticus), CoA and glyoxylic acid, phosphodalonic acid dehydrogenase (EC 1.1.1.44) (rat liver, brewer's yeast, B Coli) and 6-phospho-D-dalconic acid, glycemic aldehyde phosphate dehydrogenase (BC 1.2.1.13) (derived from plant chloroplasts) and D-glycemic aldehyde-3-phosphate and phosphoric acid, benzaldehyde aldehyde Genaze (BC 1.2.1. 7) Penz aldehydes are roses elevation as (from Pseudomonas fluorescens).
更にまた、 本発明定量法はグリセロールデヒド πゲナ一ゼが単独であるいは 2 種以上の組み合わせによって（チォ） NAD類および（チォ） NADP類を共に補酵素とす る場合において、 2つの補酵素にチォ NAD類と NAD類もしくは NADP類との組合せ、 またはチォ NADP類と NAD類もしぐは NADP類との組合せを選んだときには、 更に被 検体に成分（5)のグリセロールに作用せず、 A 2→ A ,の反応を形成する第三のデ ヒドロゲナーゼおよび該第三のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめる事により 、 後記反応式 （E0 のごとく、 と A 2の間に A tの再生の為の反応系を付与す ることにより当該サイク I)ング反応を形成し得る。 Furthermore, the quantification method of the present invention can be applied to two coenzymes when glycerol π-pi-nase is used alone or in combination of two or more (thio) NADs and (thio) NADPs as coenzymes. Combination of NADs and NADs or NADPs, Alternatively, when a combination of chi-NADPs and NADs is selected, the third dehydrogenase which forms a reaction of A 2 → A, does not act on the glycerol of the component (5) on the analyte. and by exerting a substrate for said third dehydrogenase, below reaction formula packaging reaction (as described E0, with the cycle I by Rukoto to impart reaction system for reproduction of a t between a 2) Can be formed.
この場合、 第三のデヒドロゲナーゼは、 この測定系において実質的に に作 用し得ないものであるか、 あるいは実質的に B 1に作用し得ない条件を設定する ことが好ましく、 例えば を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する 組合せ、 と A 2の量的蘭係により第三のデヒド πゲナーゼが実質的に に作 用しない条件を選択する組合せ等が例示される。 定量の際には の消費量を測 定する。 第三のデヒドロゲナーゼ In this case, the third dehydrogenase is preferably set or those incapable for substantially two installment, or substantially condition that can not act on the B 1 in this assay system, essentially e.g. the combination of selecting an enzyme which is not utilized as a coenzyme, a combination such as the third dehydrogenase π Genaze by quantitative Rangakari a 2 to select a condition that does not use substantially two installment is illustrated in. When quantifying, measure the amount of consumption. Third dehydrogenase
セトン Seton
グリセロ  Glycero
デヒ ド
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Dehid
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(式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は の 還元型生成物を示し、 B ,は A ,がチォ NADP類またはチォ NAD類 ときは還元型 NA DP類または還元型 NAD類を、 A！が NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP類 または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は B ,の酸化型生成物を示し、 は A 2を補酵素として A！を生成する酵素反応を示す） (In the formula, represents thio NADPs, thio NADs, NADPs or NADs, A 2 represents a reduced product of, B, A, represents A, thio NADPs or thio NADs, and reduced NA the DP acids or a reduced NAD, a! is when the NADP or NAD compound indicates reduction Chio NADP or reduced form Chio-NAD, B 2 represents B, and the oxidized product, the a 2 Shows the enzymatic reaction that produces A!
この成分（5)を用いる定量用組成物において、 の濃度は 0.¾2〜100mM、 特に 0. 05〜20raMが好ましく、 A 2または および A ,の濃度は 0. 05〜5000 ju M、 特に 5 〜500 juMが好ましく、 グリセロールデヒドロゲナーゼの濃度は 10〜： I000u/ml、 特 に 25〜500u/mlが好ましく、 第三のデヒドロゲナーゼは A 2に对する Km値 （ιπΜ単位） の 20倍量 （u/ml単位） £1上になるように調整すればよく、 例えば 1〜100u/ralが 好ましく、 また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、 例えば 0.05〜20mMが好 ましい。 これらの量は被検体の種類等により適宜決定することができ、 これ £1上 の量を用いることもできる。 In the composition for quantification using this component (5), the concentration of is preferably 2 to 100 mM, particularly preferably 0.05 to 20 raM, and the concentration of A2 or A, is preferably 0.05 to 5000 juM, particularly 5 The concentration of glycerol dehydrogenase is preferably 10 to: I000u / ml. The preferred 25~500u / ml, the third dehydrogenase may be adjusted to be on 20-fold amount (u / ml units) £ 1 of Km values对to A 2 (ιπΜ units), for example 1 100 u / ral is preferred, and the substrate for the third dehydrogenase is preferably in excess, for example, 0.05 to 20 mM. These amounts can be appropriately determined depending on the type of the subject and the like, and an amount larger than this can be used.
第三のデヒドロゲナーゼは Atの再生の為に補助的に添加するものであり、 こ れによって A iの使用量を少なくすることが可能となり、 特に A が高価な場合に は有効である。 また、 の代わりに A2あるいは と A2の混合物を用いて反応 を行ってもよい。 この場合、 Atまたは Zおよび A2の使用量は特に限定されるも のではないが、 一般的には B！の 1 Z10モル以下が好ましい。 The third dehydrogenase is added as a supplement for the regeneration of At, which makes it possible to reduce the amount of Ai used, and is particularly effective when A is expensive. Alternatively, the reaction may be performed using A 2 or a mixture of and A 2 instead of. In this case, the amount of At or Z and A 2 is not also the be particularly limited, in general, B! Is preferably 1 Z10 mol or less.
第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質としては、 例えば、 が NAD類または チォ NAD類のときは、 アルコールデヒドロゲナーゼ（BC 1.1.1.1)とァセトアルデ ヒド、 グリセロール- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ（BC.1.1.1.8) (ゥサギ筋肉由来） と ^ヒドロキシァセトンリン酸、 グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（E C 1.1.1.12) (ゥサギ骨格筋、 肝、 酵母、 E.Coli由来） と 1,3-ジホスホ -D -ダリ セリン酸、 Aiが NADP類またはチォ NADP類のときは、 グルコース- 6 -リン酸デヒ ドロゲナーゼ (EC 1.1.1.49) (酵母由来） とダルコノラク トン- 6 -リン酸、 グリ セ アルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（BC 1.2.1.13) (植物葉緑体由来） と 1, 3-ジホスホ -D-グ ΰセリン酸等が挙げられる。  As the third dehydrogenase and its substrate, for example, when is a NAD or thio NAD, alcohol dehydrogenase (BC 1.1.1.1) and acetoaldehyde, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (BC.1.1.1.8) (由来 from heron muscle) and ^ hydroxyacetone phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.12) (from ゥ heron skeletal muscle, liver, yeast, E. coli) and 1,3-diphospho-D-daliceric acid, When Ai is NADPs or thio NADPs, glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) (derived from yeast) and dalconolactone-6-phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (BC 1.2. 1.13) (derived from plant chloroplasts) and 1,3-diphospho-D-glyceric acid.
かくして調製された本発明の定量用組成物によつて被検体中のグリセ D—ル、 ジヒドロキシァセトンまたは D-グリセ口了ルデヒドを測定するには、 上記成分 (1)〜(3)、 （1)〜(4)、 あるいは（1)〜(3)および (5)を舍有する組成物に被検体  In order to measure glycerol D-le, dihydroxyacetone or D-glycerol aldehyde in a subject using the composition for quantification of the present invention thus prepared, the components (1) to (3), ( 1) to (4) or the composition containing (1) to (3) and (5)
0.001〜 を加え、 約 37 の温度にて反応させ、 反応開始一定時間後の 2点間 の数分ないし数十分間、 例えば 2分後と 5分後の 3分間、 または 2分後と 7分後 の 5分間における生成された A 2の量または消費された B 1の量を、 それぞれの吸 収波長に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。 例えば、 A2がチォ NADH、 Biが NADHの場合、 A2の生成を 400nm付近の吸光度の増加により測定するか、 あ るいは B ,の消費を 340nm付近の吸光度の減少により測定し、 既知濃度のグリセ口 ール、 ジヒドロキシァセトンまたは D-グリセロアルデヒドを用いて測定したと きの値と比較すれば、 被検液中のそれぞれの量をリアルタイムで求めることがで さる o Add 0.001 to and react at a temperature of about 37.Some minutes to tens of minutes between two points after a certain time from the start of the reaction, for example, 3 minutes after 2 minutes and 5 minutes, or 7 minutes after 2 minutes. the amount or quantity of consumed B 1 of a 2 generated in 5 minutes after minute, may be measured by the change in absorbance based on the respective absorption wavelengths. For example, A 2 is Chio NADH, when Bi is NADH, is measured by the increase in absorbance around 400nm the production of A 2 or, Oh Or the consumption of B, measured by the decrease in absorbance around 340 nm, and compared with the values measured using known concentrations of glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde, the test solution It is possible to determine the amount of each in real time o
また、 本発明定量法は、 被検液中のグリセロール、 ジヒドロキシアセトンまた は D-グリセロアルデヒドそのものを酵素サイクリング反応に導くものであり、 被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、 被検液のブランク測定を省略する ことができ、 レイ トアツセィによる簡便な測定を成し得る。  In addition, the quantification method of the present invention guides glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceraldehyde itself in a test solution to an enzyme cycling reaction, and is not easily affected by coexisting substances in the test solution. The blank measurement of the solution can be omitted, and a simple measurement by late assay can be performed.
尚、 本発明においては A 2または B ,の測定に当たり、 吸光度測定の代わりに他 の公知の測定法を使用して定量を行うこともできる。 In the present invention per the measurements, A 2 or B, it may also be carried out quantitatively using other known measurement method, instead of the absorbance measurement.
実施例 Example
次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、 本発明はこれによって何等 限定されるものではない。  Next, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例 1 グリセロールの定量 Example 1 Determination of glycerol
<試薬 >  <Reagent>
40 m グリシン NaOH緩衝液 (ρΗΙΟ. 0)  40 m glycine NaOH buffer (ρΗΙΟ. 0)
2 mM チォ NAD (シグマ社製）  2 mM Chio NAD (Sigma)
0. 2 m 還元型 NAD (オリエンタル酵母工業 (株)製）  0.2 m reduced NAD (Oriental Yeast Co., Ltd.)
2 m 瞧  2 m 瞧
100 m 塩化アンモニゥ厶  100 m ammonium chloride
168 u/ml グリセロールデヒ ドロゲナ一ゼ （東洋紡社製：セルロモナス ェ スヒー (Cel l ulomoraonas sp. ) 由来)  168 u / ml glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyobo Co., Ltd .: derived from Cellulomonaonas sp.)
<操作〉  <Operation>
上記試薬 1 mlをキュべッ トにとり、 0、 20、 40、 60、 80、 IOO JU Mのグリセ口一 ル溶液をそれぞれ 20 ju l添加し、 37 :にて反応を開始させた。 反応開始後 2分目 と 5分目の 400nraにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 濃度 0の値を試薬 ブランクとし、 20〜； LOO JU Mのそれぞれのグリセロールの値からこの値を引き、 そ の結果を図 1に示した。 図 1から明らかなように、 グリセ π—ル量に対する吸光 度変化量は良好な直線性を示した。 1 ml of the above reagent was placed in a cuvette, and 20 jul of a 0, 20, 40, 60, 80, or 100 g solution of IOJUM was added thereto, and the reaction was started at 37 :. The absorbance at 400 nra at 2 minutes and 5 minutes after the start of the reaction was read to determine the difference. This value is subtracted from the value of each glycerol in LOO JUM, and the value of concentration 0 is taken as the reagent blank. The results are shown in FIG. As is evident from FIG. 1, the amount of change in absorbance with respect to the amount of glycerol showed good linearity.
実施例 2 グリセ π—ルの定量  Example 2 Determination of glycerol
<試薬 >  <Reagent>
50 ηι ト リス塩酸緩衝液 (PH8. 5)  50 ηι Tris HCl buffer (PH8.5)
2 IDM チォ NAD (シグマ社製）  2 IDM Chi NAD (Sigma)
0. 1 m 還元型 NAD (オリエンタル酵母工業 (株)製）  0.1 m reduced NAD (Oriental Yeast Co., Ltd.)
200 mM 塩化力リゥム  200 mM chloride room
168 u/ml グリセロールデヒドロゲナーゼ （東洋醸造社製：バチルス メガ テ ゥ厶 (Baci l lus megaterium) 由来)  168 u / ml glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyo Brewery: derived from Bacillus megaterium)
ぐ操作 >  Operation>
上記試薬 I ralをキュぺ "ノ トにとり、 0、 2、 4、 6、 8、 10ju のグリセロー ル溶液をそれぞれ 50 ju l添加し、 37tにて反応を開始させた。 反応開始後 2分目 と 5分目の 400πιηにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施例 1と同様試 薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 2に示した。 図 2から明らかなように、 グリセロール量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。  The above reagent Iral was placed in a cube, and 50 jul of 0, 2, 4, 6, 8, and 10 ju of glycerol solution was added, and the reaction was started at 37 t. Two minutes after the start of the reaction And the absorbance at 400πιη at 5 minutes was read and the difference was determined The difference from the reagent blank was determined in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Figure 2. As is clear from FIG. The change in absorbance showed good linearity.
実施例 3 L - α -ホスファチジル -DL-グリセロールの定量 Example 3 Determination of L-α-phosphatidyl-DL-glycerol
<試薬〉  <Reagent>
50 mM トリス塩酸緩衝液 (PH8. 9)  50 mM Tris-HCl buffer (PH8.9)
1 mM 塩化カルシウム  1 mM calcium chloride
2 mM チォ NAD (シグマ社製）  2 mM Chio NAD (Sigma)
0. 1 m 還元型 NAD (オリエンタル酵母工業 (秣)製）  0.1 m reduced NAD (Oriental Yeast Co., Ltd.)
200 m 塩化力リゥム  200 m chloride rim
2 u/ral ホスホリパーゼ D (東洋醸造社製：ストレブトマイセス クロモ フスカス (Streptomyces chromof uscus) 由来)  2 u / ral phospholipase D (manufactured by Toyo Brewery: derived from Streptomyces chromofuscus)
120 u/ml グリセロールデヒドロゲナーゼ （東洋醸造社製：バチルス メガ テリゥ厶 (Baci l lus megateri um) 由来) く操作〉 120 u / ml glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyo Brewery: derived from Bacillus megaterium) Operation>
lOmg/tnlの L- -ホスファチジル- DL-グリセ口ール溶液 （クロ口ホルム ： メタ ノール = 98 : 2 (シグマ社） ） をエバポレーターにて蒸発乾固し、 2500倍容の 0.5%トリ トン X-100 (シグマ社) 溶液を用いて溶解させた （4.0j g/inl) 。 この ものを水で希釈し、 8、 16、 24、 32、 40 g/mlの L- ホスファチジル- DL -ダリ セロール溶液を調製した。  lOmg / tnl of L- -phosphatidyl-DL-glycerol solution (cloform: methanol = 98: 2 (Sigma)) was evaporated to dryness using an evaporator and 2,500 times the volume of 0.5% triton X -100 (Sigma) solution (4.0 jg / inl). This was diluted with water to prepare 8, 16, 24, 32, and 40 g / ml L-phosphatidyl-DL-daricerol solutions.
上記試薬 lmlをキュべッ トにとり、 8、 16、 24、 32、 40 g/mlの L- -ホスフ ァチジル- DL -グリセ口ール溶液をそれぞれ 50 / i添加し、 37でにて反応を開始さ せた。 反応開始後 2分目と 7分目の 400ntnにおける吸光度を読み取りその差を求 めた。 実施例 1と同様試薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 3に示した。 図 3から明らかなように、 L- -ホスファチジル- DL-グリセ口ール量に対する吸光 度変化量は良好な直線性を示した。  Take 1 ml of the above reagent in a cuvette, add L-phosphatidyl-DL-glycerol solutions at 8, 16, 24, 32, and 40 g / ml to 50 / i, respectively. Let it start. The absorbance at 400 ntn at 2 minutes and 7 minutes after the start of the reaction was read to determine the difference. The difference from the reagent blank was determined as in Example 1, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 3, the amount of change in absorbance with respect to the amount of L--phosphatidyl-DL-glycerol showed good linearity.
実施例 4 ジヒ ドロキシァセ トンの定量 Example 4 Determination of dihydroxyacetone
<試薬>  <Reagent>
' 40 ιπΜ グリシン NaOH緩衝液（ρΗΙΟ.0)  '40 ιπΜ Glycine NaOH buffer (ρΗΙΟ.0)
2 mM チォ NAD (シグマ社製）  2 mM Chio NAD (Sigma)
0.2 mM 還元型 NAD (オ リエンタル酵母工業 (株)製）  0.2 mM reduced NAD (Oriental Yeast Co., Ltd.)
2 mM BDTA  2 mM BDTA
100 m 塩化了ンモニゥム  100 m salinated ammonium
168 u/ml グリセ口一ルデヒ ドロゲナーゼ （東洋紡社製：セルロモナス ェ スヒ一 (Cellulomonionas sp. ) 由来)  168 u / ml Glyceline mono-dehydrogenase (manufactured by Toyobo Co., Ltd .: from Cellulomonionas sp.)
<操作 >  <Operation>
上記試薬 lmlをキュベッ トにとり、 0、 20、 40、 60、 80、 IOOJUMのジヒドロキ シアセ トン溶液をそれぞれ 20 il添加し、 37でにて反応を開始させた。 反応開始 後 2分目と 5分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施例 1 と同様試薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 4に示した。 図 4から明らかな ように、 ジヒドロキシァセトン量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。 実施例 5 グリセ n—ルの定量 1 ml of the above reagent was placed in a cuvette, and 20 il of each of 0, 20, 40, 60, 80 and IOOJUM solution of dihydroxyxiatone was added, and the reaction was started at 37. The absorbance at 400 nm at 2 minutes and 5 minutes after the start of the reaction was read to determine the difference. The difference from the reagent blank was determined as in Example 1, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 4, the change in absorbance with respect to the amount of dihydroxyacetone showed good linearity. Example 5 Determination of glycerol
ぐ試薬〉  Reagent>
50 αι リ ン酸緩衝液 (ΡΗ7. 5)  50 αι phosphate buffer (ΡΗ7.5)
5 raM チォ NADP (シグマ社製）  5 raM Chio NADP (manufactured by Sigma)
0. 1 IDM 還元型 NADP (オリエンタル酵母工業 (秣)製）  0.1 IDM reduced NADP (Oriental Yeast Kogyo (Haya))
54 u/ml グリセロールデヒドロゲナーゼ （ゥサギ骨格筋由来）  54 u / ml glycerol dehydrogenase (from egret skeletal muscle)
<操作 >  <Operation>
ゥサギ骨格筋より、 Biochim. Biophys. Acta, 258, 40-55 (1972)に準じて MDP に特異的なグリセロールデヒドロゲナーゼを精製し、 使用に洪した。  グ リ MDP-specific glycerol dehydrogenase was purified from heron skeletal muscle according to Biochim. Biophys. Acta, 258, 40-55 (1972), and used for use.
上記試薬 l mlをキュべッ トにとり、 0、 20、 40、 60、 80、 IOO JU Mのグリセ口一 ル溶液をそれぞれ 40 ju l添加し、 37でにて反応を開始させた。 反応開始後 2分目 と？分目の 400nmにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施例 1と同様試 薬ブランクとの差を求め、 その結果を図 5に示した。 図 5から明らかなように、 グリセ口ール量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。  One milliliter of the above reagent was placed in a cuvette, and 40 jul of a 0, 20, 40, 60, 80, or 100 mM glycerol solution of IOJUM was added, and the reaction was started at 37. 2 minutes after the start of the reaction? The absorbance at 400 nm at the minute was read and the difference was determined. The difference from the reagent blank was determined as in Example 1, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 5, the amount of change in absorbance with respect to the amount of glycerol showed good linearity.
産業上の利用可能性 Industrial applicability
上述のごとく、 本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素を用いるため測定誤 差が生じず、 また、 酵素サイクリング反応を組み合わせることによって感度を増 大させることができるため、 少量の検体で迅速かつ正確に被検体中のグリセロー ル、 ジヒドロキシァセトンまたは D-グリセロアルデヒドを定量することができ る。  As described above, the present invention uses coenzymes having different reduced absorption wavelengths so that no measurement error occurs, and the sensitivity can be increased by combining enzyme cycling reactions. In addition, glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde in the sample can be quantified accurately.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. グリセロール、 ジヒドロキシアセ トンおよび D-グリセ口アルデヒ ドからな る群より選ばれた 1種の被検成分を舍有する被検体に、  1. To a subject having one test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone, and D-glycerol aldehyde,
(1) チォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフユ一ト類 （以下チォ NADP 類という） およびチォニチコンアミ ドアデニンジヌクレオチド類 （以下チォ NAD 類という） からなる群より選ばれる 1つと、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオ チドホスフヱ一ト類 （以下 NADP類という） およびニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチド類 （以下 NAD類という） からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくともグリセロールを基質としてジヒ ドロキシァセトンまたは D-グリセ口 了ルデヒドを生成する可逆反応をなすグリセロールデヒドロゲナーゼ、  (1) one selected from the group consisting of thionicotinamide adodenine dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as thio NADPs) and thioniticon amide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as thio NADs); One selected from the group consisting of leotide phosphates (hereinafter referred to as NADPs) and nicotinamide dodenine dinucleotides (hereinafter referred to as NADs) as a coenzyme, and at least glycerol as a substrate for dihydroxyacetone or D-glycerose. Glycerol dehydrogenase which forms a reversible reaction to produce aldehyde
(2)  (2)
(3) B ,  (3) B,
を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式 （ I ) The following reaction formula (I)
ジヒ ドロキシアセトン Dihydroxyacetone
グリセロール または ( I )  Glycerol or (I)
D-グリセ口了ルデヒ ド
Figure imgf000021_0001
D-Glycee
Figure imgf000021_0001
(式中、 はチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 A 2は A ,の 還元型生成物を示し、 B ,は A iがチォ NADP類またはチォ NAD類のときは還元型 NA DP類または還元型 NAD類を、 A！が NADP類または NAD類のときは還元型チォ NADP類 または還元型チォ NAD類を示し、 B 2は B ,の酸化型生成物を示す） (In the formula, represents thio NADPs, thio NADs, NADPs or NADs, A 2 represents a reduced product of A, and B, represents when A i is thio NADPs or thio NADs. (Reduced NADPs or reduced NADs; A! Represents NADPs or NADs, which means reduced thio NADPs or reduced thio NADs, and B 2 represents the oxidized product of B,)
で表わされるサイクリング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する A 2また は の量を測定することを特徴とするグリセロール、 ジヒ ドロキシァセトンぉ よび D -グリセロアルデヒドからなる群より選ばれた 1種の被検成分の髙感度定 In represented by brought form a cycling reaction, glycerol and measuring the amount of A 2 or changed by the reaction, dihydric Dorokishiasetono and D - 1 type of test selected from the group consisting of glyceraldehyde Sensitivity of components
2. fiADP類が、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフヱート （NADP) 、 ァセチルビリジンアデニンジヌクレオチドホスフヱート （ァセチル NADP) 、 ァセ チルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエートおよびニコチンアミ ド ヒポキサンチンジヌクレオチドホスフヱ一ト （デァミノ NADP) からなる群より選 ばれたものである請求項 1記載の髙感度定量法。 2. fiADPs are nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), acetyl pyridine adenine dinucleotide phosphate (acetyl NADP), acetyl pyridine hypoxanthine dinucleotide phosphate, and nicotinamide hyponucleotide. 2. The method according to claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of xanthine dinucleotide phosphate (damino NADP).
3. MD類が、 ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （NAD) 、 ァセチルピリジ ンァデニンジヌクレオチド （ァセチル NAD) 、 ァセチルビリジンヒポキサンチン ジヌクレオチドおよびニコチンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチド （デァミノ MD) からなる群より選ばれたものである請求項 1記載の高感度定量法。  3. The MDs are selected from the group consisting of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), acetylpyridin adenine dinucleotide (acetyl NAD), acetylviridine hypoxanthine dinucleotide and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (damino MD). 2. The highly sensitive quantitative method according to claim 1, wherein the method is performed.
4. チォ NADP類が、 チォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドホスフヱート （ チォ NADP) およぴチォニコチンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエ一 トからなる群より選ばれたものである請求項 1記載の髙感度定量法。  4. The method according to claim 1, wherein the thioNADPs are selected from the group consisting of thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate (thioNADP) and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate.髙 Sensitivity determination method as described.
5. チォ NAD類が、 チォニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （チォ NAD) およ びチォニコチンアミ ドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ばれたも のである請求項 1記載の髙感度定量法。  5. The method according to claim 1, wherein the thio-NADs are selected from the group consisting of thionicotinamide adenine dinucleotide (thio-NAD) and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide.
6. 次の成分（1)〜(3)  6. The following components (1) to (3)
(1) NADP類およびチォ NAD類からなる群より選ばれる 1つと、 NADP類および NAD類 からなる群より選ばれる 1つとを補酵素とし、 少なくともグリセロールを基質と してジヒドロキシァセトンまたは D-グリセロアルデヒドを生成する可逆反応を なすグリセ σ—ルデヒドロゲナーゼ、  (1) One selected from the group consisting of NADPs and thio NADs and one selected from the group consisting of NADPs and NADs are used as coenzymes, and at least glycerol is used as a substrate for dihydroxyacetone or D-glycero. Glycee σ-rudehydrogenase, which undergoes a reversible reaction to produce aldehydes,
(2) A t (2) A t
(3) Β χ  (3) Β χ
(A tはチォ NADP類、 チォ NAD類、 NADP類または NAD類を示し、 B ,は A ,がチォ NA DP類またはチォ NAD類のときは還元型 NADP類または還元型 NAD類を、 A！が NADP類 または fiAD類のときは還元型チォ NADP類または還元型チォ NAD類を示す）  (A t represents thio NADPs, thio NADs, NADPs or NADs, and B, when A, is thio NADPs or thio NADs, represents reduced NADPs or reduced NADs; Is NADPs or fiADs, indicates reduced-thio NADPs or reduced-thio NADs)
を舍有することを特徵とするグリセコール、 ジヒドロキシァセトンおよび D -グ リセロアルデヒドからなる群より選ばれた 1種の被検成分の高感度定量用組成物。 A composition for highly sensitive determination of one test component selected from the group consisting of glyceol, dihydroxyacetone, and D-glyceroaldehyde, characterized by having the following characteristics:
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SHADAN HOJIN NIHON SEIKAGAKU-KAI (author), "Biochemical Experiment Lecture 5 Enzyme research (upper)", 20 August 1975. *

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