JPH04341197A - Process for high-sensitivity determination of glycerol, dihydroxyacetone or d-glyceroaldehyde and composition therefor - Google Patents
Process for high-sensitivity determination of glycerol, dihydroxyacetone or d-glyceroaldehyde and composition thereforInfo
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Abstract
Description
【０００１】0001
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、食品検査等
の分野において重要なグリセロール、ジヒドロキシアセ
トンまたはＤ−グリセロ−ル、あるいはこれらを反応生
成物とする物質の高感度定量法および定量用組成物に関
する。[Industrial Application Field] The present invention is a highly sensitive method for quantifying glycerol, dihydroxyacetone, D-glycerol, or substances containing these as reaction products, which are important in the fields of clinical testing, food testing, etc. Regarding the composition.
【０００２】0002
【従来の技術】一般に、グリセロールやグリセロールの
グリセロールデヒドロゲナーゼによる代謝産物であるジ
ヒドロキシアセトンやＤ−グリセロアルデヒドを測定す
ることは臨床検査や食品化学の上、極めて重要である。BACKGROUND OF THE INVENTION Generally, the measurement of glycerol and dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde, which are metabolites of glycerol by glycerol dehydrogenase, is extremely important in clinical tests and food chemistry.
【０００３】従来、生体成分や食品成分に含まれるグリ
セロールの酵素学的測定法は、主に次の（１）グリセロ
ールキナーゼを用いる方法、（２）グリセロールデヒド
ロゲナーゼを用いる方法、（３）グリセロールオキシダ
ーゼを用いる方法に大別される。[0003] Conventionally, enzymatic methods for measuring glycerol contained in biological components and food components mainly include the following (1) method using glycerol kinase, (2) method using glycerol dehydrogenase, and (3) method using glycerol oxidase. It is broadly divided into methods used.
【０００４】（１）の方法は、グリセロールオキシダー
ゼにより、次の反応式で示されるグリセロール ＋
ＡＴＰ → Ｌ−グリセロール−３−リン酸
＋ ＡＤＰなる反応を進行せしめ、グリセロールと化
学量論的に同量のＬ−グリセロール−３−リン酸または
ＡＤＰを測定するものである。この方法は測定法によっ
て、更に以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の３種類の方法
に分けられる。[0004] Method (1) uses glycerol oxidase to produce glycerol +
ATP → L-glycerol-3-phosphate
+ ADP reaction is allowed to proceed, and L-glycerol-3-phosphate or ADP, which is stoichiometrically the same as glycerol, is measured. This method can be further divided into the following three methods (a), (b), and (c) depending on the measurement method.
【０００５】（ａ）上記反応により生成したＡＤＰを測
定するもので、ＡＤＰをピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒ
ドロゲナーゼを用いた反応に付し、ＮＡＤＨの減少を３
４０ｎｍにおいて分光学的に測定するものである。ホス
ホエノールピルビン酸 ＋ ＡＤＰ → ピル
ビン酸 ＋ ＡＴＰピルビン酸 ＋ ＮＡＤＨ
→ 乳酸 ＋ ＮＡＤ(a) This method measures ADP produced by the above reaction. ADP is subjected to a reaction using pyruvate kinase and lactate dehydrogenase, and the decrease in NADH is
It is measured spectroscopically at 40 nm. Phosphoenolpyruvate + ADP → Pyruvate + ATPPyruvate + NADH
→ Lactic acid + NAD
【０００６】（ｂ）上
記反応により生成したＬ−グリセロール−３−リン酸を
測定するもので、Ｌ−グリセロール−３−リン酸をＬ−
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた反
応に付し、ＮＡＤＨの増加を３４０ｎｍにおいて分光学
的に測定するものである。尚、本方法においては、フェ
ナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）またはジアホラーゼ
とニトロブルーテトラゾリウムを共存させた比色法を用
いる方法も提唱されている。Ｌ−グリセロール−３−リ
ン酸 ＋ ＮＡＤ →ジヒドロキシアセトンリン
酸 ＋ ＮＡＤＨ(b) Measures L-glycerol-3-phosphate produced by the above reaction.
It is subjected to a reaction using glycerol-3-phosphate dehydrogenase, and the increase in NADH is measured spectroscopically at 340 nm. In addition, in this method, a method using a colorimetric method in which phenazine methosulfate (PMS) or diaphorase and nitro blue tetrazolium coexist is also proposed. L-glycerol-3-phosphate + NAD → dihydroxyacetone phosphate + NADH
【０００７】（ｃ）上記反応により生成したＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を測定するもので、まずＬ−グリセ
ロール−３−リン酸をＬ−グリセロール−３−リン酸オ
キシダーゼを用いた反応に付して過酸化水素を生じせめ
、その後、色原体の共存下にペルオキシダーゼを用いて
色素を生じせしめて分光学的に測定するものである（特
公平１−３１８８０号公報）。Ｌ−グリセロール−３−
リン酸 ＋ Ｏ２ →ジヒドロキシアセトンリン
酸 ＋ Ｈ２Ｏ２Ｈ２Ｏ２ ＋ 色原体 →
色素 ＋ Ｈ２Ｏ(c) To measure L-glycerol-3-phosphate produced by the above reaction, first, L-glycerol-3-phosphate is subjected to a reaction using L-glycerol-3-phosphate oxidase. Hydrogen peroxide is produced, and then a dye is produced using peroxidase in the presence of a chromogen and measured spectroscopically (Japanese Patent Publication No. 1-31880). L-glycerol-3-
Phosphoric acid + O2 → dihydroxyacetone phosphoric acid + H2O2H2O2 + chromogen →
Dye + H2O
【０００８】（２）の方法は、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼにより、次の反応式で示されるグリセロール
＋ ＮＡＤ → ジヒドロキシアセトン ＋
ＮＡＤＨなる反応を進行せしめ、グリセロールと化学
量論的に同量のＮＡＤＨを測定するものである（特開平
１−１１７８００号公報）。In method (2), glycerol is produced using glycerol dehydrogenase as shown in the following reaction formula.
+ NAD → dihydroxyacetone +
This method allows a reaction called NADH to proceed and measures the same amount of NADH stoichiometrically as glycerol (Japanese Patent Laid-Open No. 1-117800).
【０００９】（３）の方法は、グリセロールオキシダー
ゼにより、次の反応式で示されるグリセロール ＋
Ｏ２ → グリセロアルデヒド ＋ Ｈ２Ｏ
２なる反応を進行せしめ、グリセロールと化学量論的に
同量の過酸化水素を（１）（ｃ）と同様の方法で測定す
るものである（特開昭５３−１３０４８８号公報）。Method (3) uses glycerol oxidase to produce glycerol +
O2 → glyceraldehyde + H2O
The second reaction is allowed to proceed, and the amount of hydrogen peroxide stoichiometrically equivalent to that of glycerol is measured in the same manner as in (1) and (c) (Japanese Unexamined Patent Publication No. 130488/1983).
【００１０】これらの、グリセロールの酵素学的測定法
は、臨床検査分野では、脂質代謝異常の診断に有用であ
る血清中トリグリセリドの測定の際に広く用いられてい
る。すなわち、トリグリセリドをリパーゼを用いてグリ
セロールと脂肪酸に加水分解し、生じたグリセロールを
上記いずれかの方法で測定するものである。また、グリ
セロールの定量は、その他にも様々な生体成分や食品成
分の分析にも利用され、例えば、食品分析用試薬として
（１）（ａ）の原理に基づく試薬がキットとして市販さ
れており、ワインやビール中などのグリセロールの測定
に利用されている。[0010] These enzymatic methods for measuring glycerol are widely used in the field of clinical testing to measure serum triglycerides, which are useful in diagnosing lipid metabolic disorders. That is, triglyceride is hydrolyzed into glycerol and fatty acids using lipase, and the resulting glycerol is measured by any of the above methods. In addition, the quantitative determination of glycerol is also used to analyze various other biological components and food components. For example, reagents based on the principle of (1) (a) are commercially available as kits as reagents for food analysis. It is used to measure glycerol in wine and beer.
【００１１】また、ジヒドロキシアセトンの測定はグリ
コーゲン病の診断に有用であり、この場合ジヒドロキシ
アセトンを経口投与し、血清中の濃度が増加する場合に
はグリコーゲン病の疑いがある。この定量に際しては、
ＡＴＰの存在下グリセロールキナーゼ（ＥＣ ２．７．
１．３０）とグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．８）を共存させて、ＮＡＤＨの
減少を測定することが行なわれている（生化学辞典，Ｐ
５８４，東京化学同人（１９８９））。[0011] Measurement of dihydroxyacetone is also useful in diagnosing glycogen disease; in this case, when dihydroxyacetone is orally administered and the concentration in serum increases, glycogen disease is suspected. For this quantification,
Glycerol kinase (EC 2.7.
1.30) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.8) to measure the decrease in NADH (Biochemistry Dictionary, p.
584, Tokyo Kagaku Doujin (1989)).
【００１２】さらに、Ｄ−グリセロアルデヒドはＤ−フ
ルクトース代謝の中間体であり、この定量に際しては、
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１
＆ ＥＣ １．１．１．２）またはアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．３ ＆ ＥＣ １．２．
１．４）を用いたり、あるいはトリオキナーゼ（ＥＣ
２．７．１．２８）でグリセロアルデヒド−３−リン酸
に導いたのち、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ
５．３．１．１．）、グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．８）を共存させて測定
することが行なわれている（生化学辞典，Ｐ３６２−３
６３，東京化学同人（１９８９））。Furthermore, D-glyceraldehyde is an intermediate in D-fructose metabolism, and when quantifying it,
Alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1
& EC 1.1.1.2) or aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3 & EC 1.2.
1.4) or triokinase (EC
2.7.1.28) to glyceraldehyde-3-phosphate, and then triosephosphate isomerase (EC
5.3.1.1. ) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.8) have been coexisting for measurement (Biochemistry Dictionary, P362-3).
63, Tokyo Kagaku Doujin (1989)).
【００１３】一般的に、酵素を用いて分析する場合、上
記の各方法のように測定をしようとする対象物質を分光
学的に検出可能な過酸化水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に
変換する場合が多い。しかしながら、過酸化水素はペル
オキシダーゼと共役させて呈色反応に導かれるが、この
反応はアスコルビン酸やビリルビン等の還元物質やＳＨ
基含有物質等により妨害を受けるという欠点がある。ま
た、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の検出は前述のように３４０ｎ
ｍの吸収で測定する場合は還元型ＮＡＤ（Ｐ）の蓄積に
よって反応の平衡が還元型ＮＡＤ（Ｐ）生成と逆方向に
かたよるため、ｐＨ管理を厳密に行わなくてはならない
という問題を有している。更に、ジアホラーゼ、ニトロ
ブルーテトラゾリウムを用いた呈色反応を利用した測定
法も、還元型ＮＡＤ（Ｐ）蓄積による生成物阻害は防ぐ
ことはできるものの、ホルマザン色素は難溶性であるた
め試験管やチューブへの色素の付着が起こりやすく、自
動分析装置への応用は困難である。Generally, when analyzing using an enzyme, the target substance to be measured is converted into spectroscopically detectable hydrogen peroxide, reduced NAD (P), etc. as in each of the above methods. Often. However, hydrogen peroxide is conjugated with peroxidase and led to a coloring reaction, but this reaction involves reducing substances such as ascorbic acid and bilirubin, and SH
It has the disadvantage of being interfered with by group-containing substances and the like. In addition, the detection of reduced NAD (P) was performed at 340n as described above.
When measuring by absorption of m, there is a problem that the pH must be strictly controlled because the accumulation of reduced NAD (P) shifts the reaction equilibrium in the opposite direction to the production of reduced NAD (P). ing. Furthermore, measurement methods that utilize color reactions using diaphorase and nitroblue tetrazolium can prevent product inhibition due to accumulation of reduced NAD(P), but because formazan dyes are poorly soluble, they cannot be used in test tubes or tubes. It is difficult to apply it to automatic analyzers because dyes tend to adhere to it.
【００１４】また現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては分光分析機を用いる方法が最も普及してい
るが、これも感度上に限界が有り、測定対象物の含量が
少ない場合は適さないという欠点があった。[0014] Currently, the most popular method for measuring this detectable substance is to use a spectroscopic analyzer, but this also has a limit in sensitivity and is not suitable when the content of the substance to be measured is small. There was a drawback that there was no
【００１５】そこで、測定対象物の含量が少ない場合や
、測定対象物を含む被検体が少量である場合などは、分
光分析よりも感度の優れた蛍光分析や発光分析等が用い
られている。しかしながら、これらの方法も臨床検査等
の汎用検査においては、機器の普及という点からはあま
り適したものではなかった。[0015] Therefore, when the content of the object to be measured is small, or when the sample containing the object to be measured is small, fluorescence analysis, luminescence analysis, etc., which are more sensitive than spectroscopic analysis, are used. However, these methods are not very suitable for general-purpose tests such as clinical tests from the viewpoint of widespread use of the equipment.
【００１６】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、当該物質が等量の補酵素などに変換できる場
合は、２種類の酵素を用いて補酵素を増幅する、いわゆ
る酵素サイクリング法が行われている。例えば、ＮＡＤ
サイクリング法、ＣｏＡサイクリング法、ＡＴＰサイク
リング法等が用いられているが、これらの方法はいずれ
も臨床検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑す
ぎるために用いられていないのが現状である。[0016] In addition, as another method for measuring a trace amount of a substance, if the substance can be converted into an equal amount of coenzyme, etc., the so-called enzyme cycling method, in which the coenzyme is amplified using two types of enzymes, is used. It is being done. For example, N.A.D.
Although cycling methods, CoA cycling methods, ATP cycling methods, etc. have been used, the current situation is that none of these methods is used in routine analyzes such as clinical tests because the operations are too complicated.
【００１７】従って、分光分析機器にも適応が可能なグ
リセロール、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロ
アルデヒドの高感度測定法の開発が望まれている。[0017]Therefore, it is desired to develop a highly sensitive measuring method for glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde which can also be applied to spectroscopic analysis instruments.
【００１８】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合には、共存
物質によるその測定系に及ぼす影響を小さくすることが
できる。また、ある限られた被検体量で検査できる項目
数を増やすことも可能であり、更には検体が人血液であ
る場合などは、採血量を減らすことができるため、被採
血者への心理的な負担を軽減することもできる。このよ
うに、検出感度を高くすることは、臨床検査においては
血液という貴重な検体を用いることや微量成分を測定す
る必要性から考えて、必然の要求である。The advantage of the high-sensitivity measurement method is that it is possible to reduce the amount of sample required for measurement, not only when the content of the target substance is small, but also when it is possible to reduce the amount of sample required for measurement. When used for a specimen, the influence of coexisting substances on the measurement system can be reduced. In addition, it is possible to increase the number of items that can be tested with a limited amount of sample, and furthermore, in cases where the sample is human blood, the amount of blood collected can be reduced, which reduces the psychological impact on the person receiving blood. It can also reduce the burden. In this way, increasing the detection sensitivity is an inevitable requirement in view of the use of precious specimens such as blood in clinical tests and the necessity of measuring trace components.
【００１９】[0019]
【発明が解決しようとする課題】前述のごとく、グリセ
ロールの測定法は種々報告されているが、いずれも未だ
に満足のいくものではなく、正確で高感度な測定法が望
まれていた。[Problems to be Solved by the Invention] As mentioned above, various methods for measuring glycerol have been reported, but none of them are yet satisfactory, and an accurate and highly sensitive measuring method has been desired.
【００２０】[0020]
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、グ
リセロールを基質としてジヒドロキシアセトンまたはＤ
−グリセロアルデヒドを生成する酵素反応を実施するに
当り、酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼを使用
する反応系において、補酵素として、一方にチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ類
という）およびチオニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェート類（以下チオＮＡＤＰ類という）から
なる群より選ばれた１つを使用し、他方に、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド類（以下ＮＡＤ類という）
およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート類（以下ＮＡＤＰ類という）からなる群より選ばれ
た１つを使用するという、特定の２種類の補酵素を使用
するサイクリング反応を見出した。且つこの反応におい
て、チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類の還元型の吸収
波長は４００ｎｍ付近であり、ＮＡＤ類およびＮＡＤＰ
類の還元型の吸収波長は３４０ｎｍ付近であって異なる
吸収波長域であることから、どちらか一方の補酵素の変
化量のみを、いずれか一方の吸収波長における吸光度を
測定することによって定量することにより、吸光度の測
定に際して他物質の吸収波長の混雑が回避できる酵素サ
イクリング反応が実施でき、高感度なグリセロール、ジ
ヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロアルデヒドの定
量が可能であることを確認し、本発明を完成するに至っ
た。[Means for Solving the Problems] Under these circumstances, the present inventors have made extensive studies to solve the above problems, and have found that dihydroxyacetone or D
- When carrying out an enzymatic reaction to produce glyceraldehyde, in a reaction system using glycerol dehydrogenase as an enzyme, thionicotinamide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as thioNADs) and thionicotinamide adenine are used as coenzymes. One selected from the group consisting of dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as thioNADPs) is used, and the other is nicotinamide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as NADs).
and nicotinamide adenine dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as NADPs), a cycling reaction using two specific types of coenzymes was discovered. In addition, in this reaction, the absorption wavelength of the reduced form of thioNADs and thioNADPs is around 400 nm;
The absorption wavelength of the reduced form of the above-mentioned coenzymes is around 340 nm, which is a different absorption wavelength range. Therefore, the amount of change in only one of the coenzymes can be quantified by measuring the absorbance at one of the absorption wavelengths. The present invention was completed by confirming that an enzyme cycling reaction that avoids crowding of absorption wavelengths of other substances when measuring absorbance is possible, and that it is possible to quantify glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceraldehyde with high sensitivity. I ended up doing it.
【００２１】すなわち、本発明はグリセロール、ジヒド
ロキシアセトンおよびＤ−グリセロアルデヒドからなる
群より選ばれた１種の被検成分を含有する被検体に、（
１） チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる１つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
群より選ばれる１つとを補酵素とし、少なくともグリセ
ロールを基質としてジヒドロキシアセトンまたはＤ−グ
リセロアルデヒドを生成する可逆反応をなすグリセロー
ルデヒドロゲナーゼ、（２） Ａ１（３） Ｂ１を含有
する試薬を作用せしめて、次の反応式That is, the present invention provides a test substance containing one test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde,
1) One selected from the group consisting of thioNADPs and thioNADs and one selected from the group consisting of NADPs and NADs are used as coenzymes, and dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde is produced using at least glycerol as a substrate. A reagent containing glycerol dehydrogenase, (2) A1 (3) B1, which undergoes a reversible reaction, is reacted with the following reaction formula:
【００２２】[0022]
【化２】[Case 2]
【００２３】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイク
リング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２
またはＢ１の量を測定することを特徴とするグリセロー
ル、ジヒドロキシアセトンおよびＤ−グリセロアルデヒ
ドからなる群より選ばれた１種の被検成分の高感度定量
法、並びに上記（１）、（２）および（３）を含有する
ことを特徴とするグリセロール、ジヒドロキシアセトン
およびＤ−グリセロアルデヒドからなる群より選ばれた
１種の被検成分の高感度定量用組成物を提供するもので
ある。(In the formula, A1 is thioNADP, thioNA
Class D indicates NADPs or NADs, A2 indicates the reduced product of A1, B1 indicates reduced NADPs or reduced NADs when A1 is thioNADPs or thioNADs, and A1 indicates NADP. or NADs indicates reduced thioNADPs or reduced thioNADs, and B2 indicates the oxidized product of B1), and A2 changed by the reaction
or a highly sensitive quantitative method for one kind of test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde, and the above (1), (2) and The present invention provides a composition for highly sensitive determination of one type of test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone, and D-glyceraldehyde, which is characterized by containing (3).
【００２４】本発明において用いられる、グリセロール
デヒドロゲナーゼは、少なくともグリセロールを基質と
してジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロアルデヒ
ドを生成する可逆反応を触媒するものであって、チオＮ
ＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれた１
つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれ
た１つとを補酵素とするものならいずれをも用いること
ができる。[0024] Glycerol dehydrogenase used in the present invention catalyzes a reversible reaction that uses at least glycerol as a substrate to produce dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde.
1 selected from the group consisting of ADPs and thioNADs
Any coenzyme containing one selected from the group consisting of NADPs and NADs can be used.
【００２５】本酵素は、動物組織、植物、バクテリア等
に広く存在する。酵素ハンドブック〔朝倉書店（１９８
３年）〕によれば、グリセロールデヒドロゲナーゼには
、酵素番号の異なる３種類の酵素が存在する。そのうち
ＥＣ １．１．１．６のものは、（チオ）ＮＡＤ類に特
異的な酵素であり、グリセロールを基質としてジヒドロ
キシアセトンを生産物とする反応をつかさどり、その具
体例としては、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）、アエロバク
ター アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒ
ｏｇｅｎｅｓ）、アセトバクター サボキシダンス（
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）由来
のものや、市販されれているものとしてバチルス メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
）（東洋醸造社製）、エンテロバクター アエロゲネ
ス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
（ベーリンガーマンハイム社製）、セルロモナス エ
スピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）（東洋紡
社製）由来のもの等が挙げられる。また、バチルス
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の耐熱性酵素も知
られている（特公平１−１７６７４号公報）。[0025] This enzyme is widely present in animal tissues, plants, bacteria, etc. Enzyme Handbook [Asakura Shoten (198)
3)], there are three types of glycerol dehydrogenase with different enzyme numbers. Among them, EC 1.1.1.6 is an enzyme specific to (thio)NADs, and is responsible for the reaction that uses glycerol as a substrate and dihydroxyacetone as a product. Coli), Aerobacter aerogenes
ogenes), Acetobacter saboxidans (
Acetobacter suboxydans and commercially available Bacillus megaterium.
) (manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.), Enterobacter aerogenes
(manufactured by Boehringer Mannheim), and those derived from Cellulomonas sp. (manufactured by Toyobo). Also, Bacillus
Bacillus stea
A thermostable enzyme derived from S. rothermophilus is also known (Japanese Patent Publication No. 1-17674).
【００２６】これらのうち、バチルス メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（東洋醸
造社製）由来の酵素の補酵素に対する相対活性は、ＮＡ
Ｄ類を用いたときを１００％とすると、チオＮＡＤ類で
７．６％であり、（チオ）ＮＡＤＰ類には作用しない。
また、セルロモナス エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐ．）（東洋紡社製）由来の酵素の補酵素に
対する相対活性はＮＡＤ類を用いたときを１００％とす
ると、チオＮＡＤ類で６．４％であり、（チオ）ＮＡＤ
Ｐ類には作用しない。Among these, the relative activity of the enzyme derived from Bacillus megaterium (manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.) with respect to the coenzyme is
If the use of Class D is 100%, it is 7.6% for thioNADs and does not act on (thio)NADPs. In addition, Cellulomonas sp.
nas sp. ) (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) relative activity for coenzymes is 6.4% for thio-NADs, when using NADs is 100%, and (thio)NADs are 6.4% for coenzymes.
It does not affect Class P.
【００２７】また、ＥＣ １．１．１．７２のものは、
（チオ）ＮＡＤＰ類に特異的な酵素であり、グリセロー
ルを基質としてＤ−グリセロアルデヒドを生産物とする
反応をつかさどり、ウサギ骨格筋に見出されている。こ
の酵素はｐＨ７では逆反応が支配的であり、（チオ）Ｎ
ＡＤ類も（チオ）ＮＡＤＰ類の１０％の活性を示す（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２５８
， ４０−５５， １９７２）。また、ニュウロスポラ
クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）
由来の酵素についての報告もなされているが（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ， １０７，２８９−２９６， １９７８）、この
酵素は（チオ）ＮＡＤ類は補酵素としない。[0027] Furthermore, the one of EC 1.1.1.72 is
It is an enzyme specific to (thio)NADPs, responsible for the reaction that uses glycerol as a substrate and D-glyceraldehyde as a product, and has been found in rabbit skeletal muscle. In this enzyme, the reverse reaction is dominant at pH 7, and (thio)N
ADs also show 10% of the activity of (thio)NADPs (B
iochim. Biophys. Acta 258
, 40-55, 1972). Also, Neurospora crassa
There have also been reports on the origin of the enzyme (Jour
nal of General Microbiolo
gy, 107, 289-296, 1978), this enzyme does not use (thio)NADs as a coenzyme.
【００２８】更に、ＥＣ １．１．１．１５６のものは
、（チオ）ＮＡＤＰ類に特異的な酵素であり、グリセロ
ールを基質としてジヒドロキシアセトンを生産物とする
反応をつかさどり、緑藻ドゥナリエラ パルバ（Ｄｕ
ｎａｌｉｅｌｌａ ｐａｒｖａ）の細胞に見出されてい
る。Furthermore, EC 1.1.1.156 is an enzyme specific to (thio)NADPs, and is responsible for the reaction that uses glycerol as a substrate and dihydroxyacetone as a product.
naliella parva).
【００２９】本発明においては、基質であるグリセロー
ルに対して反応性を有するものであれば、上述の酵素以
外の他の起源の酵素も使用することができ、その補酵素
に対する特異性は適宜、補酵素と基質とを用いて確認す
ることができるものである。[0029] In the present invention, enzymes of other origin than the above-mentioned enzymes can be used as long as they have reactivity with the substrate glycerol, and the specificity for the coenzyme can be determined as appropriate. This can be confirmed using a coenzyme and a substrate.
【００３０】また、本発明において、Ａ１およびＢ２の
補酵素はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、
ＮＡＤ類を示すが、このうちチオＮＡＤＰ類またはチオ
ＮＡＤ類としては、例えばチオニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）、チオニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェー
ト、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオ
ＮＡＤ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチドが挙げられる。また、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類
としては、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニ
ンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）、
アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェート、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
ホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンア
デニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙
げられる。なおこれら補酵素の還元型は、各々チオＮＡ
ＤＰＨ類、チオＮＡＤＨ類、ＮＡＤＰＨ類、ＮＡＤＨ類
として表示する。In the present invention, coenzymes A1 and B2 include thioNADPs, thioNADs, NADPs,
Examples of thioNADPs or thioNADs include thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate (thioNADP), thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate, and thionicotinamide adenine dinucleotide (thioNAD). , thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide. Further, examples of NADPs or NADs include nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate (acetylNADP),
Acetylpyridine Hypoxanthine Dinucleotide Phosphate, Nicotinamide Hypoxanthine Dinucleotide Phosphate (Deamino NADP), Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD), Acetyl Pyridine Adenine Dinucleotide (Acetyl NAD), Acetyl Pyridine Hypoxanthine Dinucleotide, Nicotinamide Hypoxanthine Examples include dinucleotides (deamino NAD). The reduced forms of these coenzymes are thioNA and
Displayed as DPHs, thioNADHs, NADPHs, and NADHs.
【００３１】本発明においてはＡ１およびＢ１において
例えばＡ１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１がＮＡＤ
（Ｐ）類である場合、Ｂ１はチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類であ
ることが必要である。In the present invention, in A1 and B1, for example, when A1 is thioNAD(P), B1 is N
It must be an AD(P)H class, and A1 is NAD
(P), B1 needs to be thioNAD(P)H.
【００３２】また定量に用いるグリセロールデヒドロゲ
ナーゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合は、
上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いるアミ
ノ酸類デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤＰ類のみを補
酵素とする場合は、上述のチオＮＡＤＰ類およびＮＡＤ
Ｐ類より、更に用いるグリセロールデヒドロゲナーゼが
（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補酵
素にする場合は上述のチオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ
類と上述のＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類より適宜選択し、
それらの酸化型、還元型を適宜用いればよい。Furthermore, when glycerol dehydrogenase used for quantitative determination uses only (thio)NADs as a coenzyme,
From the above-mentioned thioNADPs and NADs, when the amino acid dehydrogenase used uses only (thio)NADPs as a coenzyme, the above-mentioned thioNADPs and NADs
From the P group, when the glycerol dehydrogenase to be used uses both (thio)NADs and (thio)NADPs as coenzymes, the above-mentioned thioNADs and thioNADPs are used.
and the above-mentioned NADs and NADPs,
The oxidized and reduced forms thereof may be used as appropriate.
【００３３】本発明の高感度定量法を用いて測定を行う
場合には、酵素サイクリング反応が最も効率よく進行す
るように、使用するグリセロールデヒドロゲナーゼの各
補酵素間の相対活性を考慮して２種の補酵素の選択とそ
の使用する比率の設定を行い、更に反応ｐＨを正反応／
逆反応の至適ｐＨ範囲にて設定するのが好ましい。When performing measurements using the highly sensitive quantitative method of the present invention, two types of glycerol dehydrogenase are used, taking into consideration the relative activity between each coenzyme, so that the enzyme cycling reaction proceeds most efficiently. Select the coenzyme and set the ratio to be used, and further adjust the reaction pH to
It is preferable to set the pH within the optimum pH range for the reverse reaction.
【００３４】また、本発明の定量法によれば被検体中の
グリセロールの定量のみならず、グリセロールにグリセ
ロールデヒドロゲナーゼを反応させた場合の反応生成物
であるジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロアルデ
ヒドの定量も可能である。Furthermore, according to the quantitative method of the present invention, it is possible not only to quantify glycerol in a sample, but also to quantify dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde, which are reaction products when glycerol is reacted with glycerol dehydrogenase. It is.
【００３５】また、本発明の高感度定量法を用いれば、
グリセロール、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセ
ロアルデヒドを遊離、生成する酵素系における基質やそ
の酵素活性を測定することもできる。更に、本発明の高
感度定量法を用いれば、上記のようなグリセロール、ジ
ヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロアルデヒドを遊
離、生成する酵素系と連結し得る単一の、もしくは複数
の工程からなる酵素系における基質やその酵素活性をも
測定することができる。これらの酵素系は、特に限定さ
れるものではないが、例えば以下に示す種々の反応系が
挙げられる。[0035] Furthermore, if the highly sensitive quantitative method of the present invention is used,
It is also possible to measure substrates and their enzyme activities in enzyme systems that release or produce glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceraldehyde. Furthermore, if the highly sensitive assay method of the present invention is used, the enzyme system consisting of a single or multiple steps that can be linked to the enzyme system that liberates or produces glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde as described above can be used. Substrates and their enzymatic activities can also be measured. These enzyme systems are not particularly limited, and include, for example, the various reaction systems shown below.
【００３６】（１）ホスファチジルグリセロールとホス
フォリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）の酵素反応系。
この系において、遊離、生成するグリセロールを定量す
ることにより、ホスファチジルグリセロールの定量また
はホスフォリパーゼＤの活性測定をすることができる。
ホスファチジルグリセロール ＋Ｈ２Ｏ→ グリセ
ロール ＋ ホスファチジン酸(1) Enzyme reaction system of phosphatidylglycerol and phospholipase D (EC3.1.4.4). In this system, phosphatidylglycerol or phospholipase D activity can be measured by quantifying the amount of glycerol released or produced. Phosphatidylglycerol +H2O→ Glycerol + Phosphatidic acid
【００３７】（２）モノ、ジまたはトリグリセライドと
リパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）の酵素反応系。この
系において、遊離、生成するグリセロールを定量するこ
とにより、モノ、ジまたはトリグリセライドの定量ある
いはリパーゼの活性測定をすることができる。(2) Enzyme reaction system of mono-, di- or triglyceride and lipase (EC 3.1.1.3). In this system, mono-, di-, or triglycerides or lipase activity can be determined by quantifying the amount of glycerol released or produced.
【００３８】（３）Ｄ−フルクトース−１−リン酸とフ
ルクトースジリン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１
３）の酵素反応系。この系において、遊離、生成するＤ
−グリセロアルデヒドを定量することにより、Ｄ−フル
クトース−１−リン酸の定量またはフルクトースジリン
酸アルドラーゼの活性測定をすることができる。Ｄ−フ
ルクトース−１−リン酸→ ジヒドロキシアセトンリ
ン酸 ＋ Ｄ−グリセロアルデヒド(3) D-fructose-1-phosphate and fructose diphosphate aldolase (EC4.1.2.1
3) Enzyme reaction system. In this system, free and generated D
- By quantifying glyceraldehyde, it is possible to quantify D-fructose-1-phosphate or measure the activity of fructose diphosphate aldolase. D-fructose-1-phosphate → dihydroxyacetone phosphate + D-glyceraldehyde
【００３９】（４）（３）のＤ−フルクトース−１−リ
ン酸がＤ−フルクトース、ＡＴＰとヘキソキナーゼ（Ｅ
Ｃ ２．７．１．３）の酵素反応系由来である場合。こ
の場合、最終的に生成するＤ−グリセロアルデヒドを定
量することにより、Ｄ−フルクトースの定量またはヘキ
ソキナーゼの活性測定をすることができる。Ｄ−フルク
トース ＋ ＡＴＰ → Ｄ−フルクトース−１
−リン酸 ＋ ＡＤＰ(4) D-fructose-1-phosphate in (3) is combined with D-fructose, ATP and hexokinase (E
C 2.7.1.3) When derived from the enzyme reaction system. In this case, D-fructose or hexokinase activity can be determined by quantifying D-glyceraldehyde that is finally produced. D-fructose + ATP → D-fructose-1
-Phosphoric acid + ADP
【００４０】本発明における
、Ａ１およびＢ１の量は被検体中のグリセロール、ジヒ
ドロキシアセトンおよびＤ−グリセロアルデヒドからな
る群より選ばれた１種の被検成分に比較して過剰量であ
ること、かつグリセロールデヒドロゲナーゼのＡ１およ
びＢ１それぞれに対するＫｍ値に比較して過剰量である
ことが必要であり、特に被検成分の２０〜１００００倍
モルが好ましい。[0040] In the present invention, the amounts of A1 and B1 are in excess compared to one test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone, and D-glyceraldehyde in the test sample, and It is necessary that the amount is in excess compared to the Km values for each of glycerol dehydrogenase A1 and B1, and particularly preferably 20 to 10,000 times the molar amount of the test component.
【００４１】本発明の定量用組成物においては、Ａ１お
よびＢ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５
〜２０ｍＭが好ましく、グリセロールデヒドロゲナーゼ
の量は１０〜１０００ｕ／ｍｌ、特に２５〜４００ｕ／
ｍｌが好ましいが、その量は被検体の種類等により適宜
決定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。[0041] In the quantitative composition of the present invention, the concentration of A1 and B1 is between 0.02 and 100mM, especially 0.05mM.
~20mM is preferred, and the amount of glycerol dehydrogenase is 10-1000u/ml, especially 25-400u/ml.
ml is preferable, but the amount can be appropriately determined depending on the type of subject, etc., and a larger amount can also be used.
【００４２】また、本発明定量法はグリセロールデヒド
ロゲナーゼが単独でまたは２種以上の組み合わせによっ
て（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補
酵素とする場合において、２つの補酵素にチオＮＡＤ類
とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せ、またはチオ
ＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せを
選んだときには、更に被検体に（４）成分のグリセロー
ルに作用せず、Ｂ２→Ｂ１の反応を形成する第二のデヒ
ドロゲナーゼおよび該第二のデヒドロゲナーゼの基質を
作用せしめることにより、後記反応式（化３）のごとく
、Ｂ１とＢ２の間にＢ１の再生のための反応系を付与す
ることにより当該サイクリング反応を形成せしめ得る。[0042] In addition, in the assay method of the present invention, when glycerol dehydrogenase uses both (thio)NADs and (thio)NADPs as coenzymes either alone or in combination of two or more, thioNADs are added to the two coenzymes. When selecting a combination of and NADs or NADPs, or a combination of thioNADPs and NADs or NADPs, it also does not act on the component (4) glycerol and forms a B2→B1 reaction. The cycling is performed by providing a reaction system for regenerating B1 between B1 and B2, as shown in the reaction formula (Chemical formula 3) below, by allowing a second dehydrogenase to act on the second dehydrogenase and a substrate for the second dehydrogenase. A reaction can be formed.
【００４３】この場合、第二のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＡ１に作用しないものである
か、あるいは実質的にＡ１に作用し得ない条件を設定す
ることが好ましく、例えばＡ１を本質的に補酵素として
利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択する組合せ、
Ａ１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲナーゼが
実質的にＡ１に作用しない条件を選択する組合せ等が例
示される。定量の際には反応により生成したＡ２の量を
測定する。In this case, it is preferable that the second dehydrogenase does not substantially act on A1 in this measurement system, or that conditions are set such that it cannot substantially act on A1. a combination of selecting a second dehydrogenase that is not used as a coenzyme;
Examples include combinations in which conditions are selected in which the second dehydrogenase does not substantially act on A1 depending on the quantitative relationship between A1 and B2. For quantitative determination, the amount of A2 produced by the reaction is measured.
【００４４】[0044]
【化３】[Chemical formula 3]
【００４５】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２→Ｂ１はＢ２
を補酵素としてＢ１を生成する酵素反応を示す）(In the formula, A1 is thioNADP, thioNA
Class D indicates NADPs or NADs, A2 indicates a reduced product of A1, B1 indicates reduced NADPs or reduced NADs when A1 is thioNADPs or thioNADs, and A1 indicates NADP. or NADs indicates reduced thioNADPs or reduced thioNADs, B2 indicates the oxidized product of B1, and B2→B1 indicates B2
(This shows an enzymatic reaction that produces B1 using as a coenzyme)
【００
４６】上記の成分（４）を用いる定量用組成物において
、Ａ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜
２０ｍＭが好ましく、Ｂ２または／およびＢ１の濃度は
０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μＭが好まし
く、グリセロールデヒドロゲナーゼの濃度は５〜１００
０ｕ／ｍｌ、特に２５〜５００ｕ／ｍｌが好ましく、第
二のデヒドロゲナーゼはＢ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位
）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位）以上になるように調製す
ればよく、例えば１〜１００ｕ／ｍｌが好ましく、また
第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０
５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種類等
により適宜決定することができ、これ以上の量を用いる
こともできる。00
46] In the quantitative composition using the above component (4), the concentration of A1 is 0.02 to 100mM, particularly 0.05 to 100mM.
20mM is preferred, the concentration of B2 or/and B1 is preferably 0.05-5000μM, especially 5-500μM, and the concentration of glycerol dehydrogenase is 5-100μM.
0 u/ml, especially 25 to 500 u/ml is preferable, and the second dehydrogenase may be prepared to have an amount (in u/ml) or more 20 times the Km value (in mM) for B2, for example, 1 to 100 u/ml. /ml and the substrate for the second dehydrogenase is present in excess, e.g.
5-20mM is preferred. These amounts can be appropriately determined depending on the type of subject, etc., and larger amounts can also be used.
【００４７】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。また、Ｂ１の代わりにＢ２あるい
はＢ１とＢ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。こ
の場合、Ｂ１または／およびＢ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以
下が好ましい。The second dehydrogenase is added as an auxiliary for the regeneration of B1, and this makes it possible to reduce the amount of B1 used, which is particularly effective when B1 is expensive. Furthermore, the reaction may be performed using B2 or a mixture of B1 and B2 instead of B1. In this case, the amount of B1 and/or B2 used is not particularly limited, but is generally preferably 1/10 mole or less of A1.
【００４８】第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ｂ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類の
ときは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．１）とエタノール、グリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ筋肉由
来）とＬ−グリセロール−３−リン酸、グリセロアルデ
ヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１２
）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とＤ
−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、Ｂ２がＮＡＤＰ
類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）（酵
母由来）とグルコース−６−リン酸、イソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４２）（酵母、ブタ心
筋由来）とイソクエン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ １．２．１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキ
シル酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １
．１．１．４４）（ラット肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアル
デヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１
３）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３
−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．２．１．７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が
挙げられる。As the second dehydrogenase and its substrate, for example, when B2 is NAD or thioNAD, alcohol dehydrogenase (EC 1.1.
1.1) and ethanol, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.8) (derived from rabbit muscle) and L-glycerol-3-phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.1) .1.12
) (derived from rabbit skeletal muscle, liver, yeast, and E. coli) and D
-Glyceraldehyde phosphoric acid and phosphoric acid, B2 is NADP
or thioNADPs, glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) (derived from yeast) and glucose-6-phosphate, isocitrate dehydrogenase (EC 1.1.1.42) (yeast, derived from porcine heart muscle) and isocitrate, glyoxylate dehydrogenase (EC 1.2.1.17) (Pseudomon
as oxalaticus) and CoA and glyoxylate, phosphogluconate dehydrogenase (EC 1
．． 1.1.44) (rat liver, brewer's yeast, E.Col
i) and 6-phospho-D-gluconic acid, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.2.1.1
3) (derived from plant chloroplasts) and D-glyceraldehyde-3
- Phosphate and phosphate, benzaldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.7) (Pseudomonas
fluorescens) and benzaldehyde.
【００４９】更にまた、本発明定量法はグリセロールデ
ヒドロゲナーゼが単独であるいは２種以上の組み合わせ
よって（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共
に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチオＮＡ
Ｄ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せ、または
チオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合
せを選んだときには、更に被検体に（５）成分のグリセ
ロールに作用せず、Ａ２→Ａ１の反応を形成する第三の
デヒドロゲナーゼおよび該第三のデヒドロゲナーゼの基
質を作用せしめる事により、後記反応式（化４）のごと
く、Ａ１とＡ２の間にＡ１の再生の為の反応系を付与す
ることにより当該サイクリング反応を形成し得る。Furthermore, in the assay method of the present invention, when glycerol dehydrogenase uses both (thio)NAD and (thio)NADP as coenzymes either alone or in combination of two or more, thioNAD is added to the two coenzymes.
When selecting a combination of Class D and NADs or NADPs, or a combination of thioNADPs and NADs or NADPs, it will not act on the glycerol of component (5) and will cause the A2→A1 reaction to occur. By acting on a third dehydrogenase that forms and a substrate for the third dehydrogenase, a reaction system for regenerating A1 is provided between A1 and A2 as shown in the reaction formula (Chemical formula 4) below. Such cycling reactions can be formed.
【００５０】この場合、第三のデヒドロゲナーゼは、こ
の測定系において実質的にＢ１に作用し得ないものであ
るか、あるいは実質的にＢ１に作用し得ない条件を設定
することが好ましく、例えばＢ１を本質的に補酵素とし
て利用しない酵素を選択する組合せ、Ｂ１とＡ２の量的
関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的にＢ１に作
用しない条件を選択する組合せ等が例示される。定量の
際にはＢ１の消費量を測定する。In this case, it is preferable that the third dehydrogenase is one that cannot substantially act on B1 in this measurement system, or that conditions are set such that it cannot substantially act on B1. Examples include a combination in which an enzyme that does not essentially use B1 as a coenzyme is selected, and a combination in which conditions are selected so that the third dehydrogenase does not substantially act on B1 due to the quantitative relationship between B1 and A2. At the time of quantitative determination, the consumption amount of B1 is measured.
【００５１】[0051]
【化４】[C4]
【００５２】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し
、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２→Ａ１はＡ２
を補酵素としてＡ１を生成する酵素反応を示す）(In the formula, A1 is thioNADP, thioNA
Class D indicates NADPs or NADs, A2 indicates the reduced product of A1, B1 indicates reduced NADPs or reduced NADs when A1 is thioNADPs or thioNADs, and A1 indicates NADP. or NADs indicates reduced thioNADPs or reduced thioNADs, B2 indicates the oxidized product of B1, and A2→A1 indicates A2
(shows the enzymatic reaction that produces A1 using as a coenzyme)
【００
５３】この成分（５）を用いる定量用組成物において、
Ｂ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２
０ｍＭが好ましく、Ａ２または／およびＡ１の濃度は０
．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μＭが好ましく
、グリセロールデヒドロゲナーゼの濃度は１０〜１００
０ｕ／ｍｌ、特に２５〜５００ｕ／ｍｌが好ましく、第
三のデヒドロゲナーゼはＡ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位
）の２０倍量（ｕ／ｍｌ単位）以上になるように調製す
ればよく、例えば１〜１００ｕ／ｍｌが好ましく、また
第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０
５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種類等
により適宜決定することができ、これ以上の量をもちい
ることもできる。00
53] In the quantitative composition using this component (5),
The concentration of B1 is between 0.02 and 100mM, especially between 0.05 and 2
0mM is preferred, and the concentration of A2 or/and A1 is 0
．． 05 to 5000 μM, particularly preferably 5 to 500 μM, and the concentration of glycerol dehydrogenase is 10 to 100 μM.
0 u/ml, especially 25 to 500 u/ml is preferable, and the third dehydrogenase may be prepared to have an amount (in u/ml) or more 20 times the Km value (in mM) for A2, for example, 1 to 100 u/ml. /ml and the third dehydrogenase substrate is present in excess, e.g.
5-20mM is preferred. These amounts can be appropriately determined depending on the type of subject, etc., and larger amounts can also be used.
【００５４】第三のデヒドロゲナーゼはＡ１の再生の為
に補助的に添加するものであり、これによってＡ１の使
用量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価な
場合には有効である。また、Ａ１の代わりにＡ２あるい
はＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。こ
の場合、Ａ１または／およびＡ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＢ１の１／１０モル以
下が好ましい。The third dehydrogenase is added as an auxiliary for regenerating A1, and this makes it possible to reduce the amount of A1 used, which is particularly effective when A1 is expensive. Further, the reaction may be performed using A2 or a mixture of A1 and A2 instead of A1. In this case, the amount of A1 and/or A2 used is not particularly limited, but is generally preferably 1/10 mole or less of B1.
【００５５】第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類の
ときは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．１）とアセトアルデヒド、グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ
筋肉由来）とジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロア
ルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）
と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、Ａ１がＮＡＤ
Ｐ類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）（
酵母由来）とグルコノラクトン−６−リン酸、グリセロ
アルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１
．１３）（植物葉緑体由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−
グリセリン酸等が挙げられる。As the third dehydrogenase and its substrate, for example, when A1 is NAD or thioNAD, alcohol dehydrogenase (EC 1.1.
1.1) and acetaldehyde, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC.1.1.1.8) (derived from rabbit muscle) and dihydroxyacetone phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.
12) (Rabbit skeletal muscle, liver, yeast, derived from E. Coli)
and 1,3-diphospho-D-glyceric acid, A1 is NAD
In the case of Ps or thioNADPs, glucose-6-
Phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) (
yeast-derived) and gluconolactone-6-phosphate, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (EC 1.2.1
．． 13) (derived from plant chloroplasts) and 1,3-diphospho-D-
Examples include glyceric acid.
【００５６】かくして、調製された本発明の定量用組成
物によって被検体中のグリセロール、ジヒドロキシアセ
トンまたはＤ−グリセロアルデヒドを測定するには、上
記成分（１）〜（３）、（１）〜（４）、あるいは（１
）〜（３）および（５）を含有する組成物に被検体０．
００１〜０．５ｍｌを加え、約３７℃の温度にて反応さ
せ、反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間
、例えば２分後と５分後の３分間、または２分後と７分
後の５分間における生成されたＡ２の量または消費され
たＢ１の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変
化によって測定すればよい。例えば、Ａ２がチオＮＡＤ
Ｈ、Ｂ１がＮＡＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付
近の吸光度の増加により測定するか、あるいはＢ１の消
費を３４０ｎｍ付近の吸光度の減少により測定し、既知
濃度のグリセロール、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−
グリセロアルデヒドを用いて測定したときの値と比較す
れば、被検液中のそれぞれの量をリアルタイムで求める
ことができる。In order to measure glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde in a subject using the quantitative composition of the present invention thus prepared, the above-mentioned components (1) to (3), (1) to ( 4) or (1
) to (3) and (5).
001 to 0.5 ml is added and reacted at a temperature of about 37°C, and for several minutes to several tens of minutes between two points after a certain time from the start of the reaction, for example, 3 minutes after 2 minutes and 5 minutes, or 2 The amount of A2 produced or the amount of B1 consumed for 5 minutes after 5 minutes and 7 minutes may be measured by changes in absorbance based on the respective absorption wavelengths. For example, A2 is thioNAD
When H, B1 is NADH, the production of A2 is measured by the increase in absorbance around 400 nm, or the consumption of B1 is measured by the decrease in absorbance around 340 nm, and the addition of known concentrations of glycerol, dihydroxyacetone or D-
By comparing the values with those measured using glyceraldehyde, the respective amounts in the test liquid can be determined in real time.
【００５７】また、本発明定量法は、被検液中のグリセ
ロール、ジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロアル
デヒドそのものを酵素サイクリング反応に導くものであ
り、被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検
液のブランク測定を省略することができ、レイトアッセ
イによる簡便な測定を成し得る。Furthermore, the quantitative method of the present invention is one in which glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceraldehyde itself in the test solution is introduced into an enzyme cycling reaction, and is not easily affected by coexisting substances in the test solution. Blank measurement of the test liquid can be omitted, and a simple measurement can be performed using a late assay.
【００５８】尚、本発明においてはＡ２またはＢ１の測
定に当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を
使用して定量を行うこともできる。In the present invention, when measuring A2 or B1, other known measuring methods can be used instead of absorbance measurement.
【００５９】[0059]
【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、また
、酵素サイクリング反応を組み合わせることによって感
度を増大させることができるため、少量の検体で迅速か
つ正確に被検体中のグリセロール、ジヒドロキシアセト
ンまたはＤ−グリセロアルデヒドを定量することができ
る。Effects of the Invention As described above, the present invention uses reduced coenzymes with different absorption wavelengths, so no measurement errors occur, and sensitivity can be increased by combining enzyme cycling reactions. Glycerol, dihydroxyacetone, or D-glyceraldehyde in a sample can be quantified quickly and accurately.
【００６０】[0060]
【実施例】次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれによって何等限定されるものではな
い。[Examples] Next, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto in any way.
【００６１】実施例１ グリセロールの定量＜試薬＞
４０ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０
．０）２ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製）０
．２ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母
工業（株）製）２ ｍＭ ＥＤＴＡ１００
ｍＭ 塩化アンモニウム１６８ ｕ／ｍｌ
グリセロールデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製：セルロモ
ナス エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｍｏｎａｓ ｓ
ｐ．）由来）＜操作＞上記試薬１ｍｌをキュベットにと
り、０、２０、４０、６０、８０、１００μＭのグリセ
ロール溶液をそれぞれ２０μｌ添加し、３７℃にて反応
を開始させた。反応開始後２分目と５分目の４００ｎｍ
における吸光度を読み取りその差を求めた。濃度０の値
を試薬ブランクとし、２０〜１００μＭのそれぞれのグ
リセロールの値からこの値を引き、その結果を図１に示
した。図１から明らかなように、グリセロール量に対す
る吸光度変化量は良好な直線性を示した。Example 1 Determination of glycerol <Reagent>
40 mM glycine NaOH buffer (pH 10
．． 0) 2 mM Thio-NAD (manufactured by Sigma) 0
．． 2mM reduced NAD (manufactured by Oriental Yeast Industry Co., Ltd.) 2mM EDTA100
mM ammonium chloride 168 u/ml
Glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.: Cellulomonas sp.
p. ) <Procedure> 1 ml of the above reagent was placed in a cuvette, 20 μl of each of 0, 20, 40, 60, 80, and 100 μM glycerol solutions were added, and the reaction was started at 37°C. 400nm 2nd and 5th minute after the start of the reaction
The absorbance was read and the difference was determined. The value of concentration 0 was used as a reagent blank, and this value was subtracted from the values of each glycerol from 20 to 100 μM, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 1, the amount of change in absorbance with respect to the amount of glycerol showed good linearity.
【００６２】実施例２ グリセロールの定量〈試薬〉
５０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２
ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製）０．１
ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母工業（株
）製）２００ ｍＭ 塩化カリウム１６８ ｕ
／ｍｌ グリセロールデヒドロゲナーゼ（東洋醸造
社製：バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来）＜操作＞上記試薬１ｍｌ
をキュベットにとり、０、２、４、６、８、１０μＭの
グリセロール溶液をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃に
て反応を開始させた。反応開始後２分目と５分目の４０
０ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を求めた。実施
例１と同様試薬ブランクとの差を求め、その結果を図２
に示した。図２から明らかなように、グリセロール量に
対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。Example 2 Determination of glycerol (reagent)
50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) 2
mM Thio-NAD (manufactured by Sigma) 0.1
mM Reduced NAD (manufactured by Oriental Yeast Industry Co., Ltd.) 200 mM Potassium chloride 168 u
/ml glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.: Bacillus megaterium)
(derived from megaterium) <Procedure> 1 ml of the above reagent
was placed in a cuvette, 50 μl of each of 0, 2, 4, 6, 8, and 10 μM glycerol solutions were added, and the reaction was started at 37°C. 40 at the 2nd and 5th minute after the start of the reaction
The absorbance at 0 nm was read and the difference was determined. As in Example 1, the difference from the reagent blank was determined, and the results are shown in Figure 2.
It was shown to. As is clear from FIG. 2, the amount of change in absorbance with respect to the amount of glycerol showed good linearity.
【００６３】実施例３ Ｌ−α−ホスファチジル−Ｄ
Ｌ−グリセロールの定量〈試薬〉５０ ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）１ ｍＭ 塩
化カルシウム２ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社
製）０．１ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタ
ル酵母工業（株）製）２００ ｍＭ 塩化カリ
ウム２ ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（東洋醸造社
製：ストレプトマイセス クロモフスカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ）由来）
１２０ ｕ／ｍｌ グリセロールデヒドロゲナーゼ
（東洋醸造社製：バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来）＜操作＞１０
ｍｇ／ｍｌのＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロ
ール溶液（クロロホルム：メタノール＝９８：２（シグ
マ社））をエバポレーターにて蒸発乾固し、２５００倍
容の０．５％トリトンＸ−１００（シグマ社）溶液を用
いて溶解させた（４．０μｇ／ｍｌ）。このものを水で
希釈し、０、０．８、１．６、２．４、３．２、４．０
μｇ／ｍｌのＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロ
ール溶液を調製した。上記試薬１ｍｌをキュベットにと
り、０、０．８、１．６、２．４、３．２、４．０μｇ
／ｍｌのＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール
溶液をそれぞれ５０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始
させた。反応開始後２分目と７分目の４００ｎｍにおけ
る吸光度を読み取りその差を求めた。実施例１と同様試
薬ブランクとの差を求め、その結果を図３に示した。図
３から明らかなように、Ｌ−α−ホスファチジル−ＤＬ
−グリセロール量に対する吸光度変化量は良好な直線性
を示した。Example 3 L-α-phosphatidyl-D
Quantification of L-glycerol <Reagent> 50 mM
Tris-HCl buffer (pH 8.9) 1mM Calcium chloride 2mM Thio-NAD (Sigma) 0.1mM Reduced NAD (Oriental Yeast Co., Ltd.) 200mM Potassium chloride 2u/ml Phospholipase D (Toyo) Manufactured by Jozo Co., Ltd.: Streptomyces chromofuscus (Stre
ptomyces chromofuscus))
120 u/ml glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyo Jozo Co., Ltd.: Bacillus megaterium
llus megaterium) <Operation> 10
A mg/ml L-α-phosphatidyl-DL-glycerol solution (chloroform:methanol = 98:2 (Sigma)) was evaporated to dryness in an evaporator, and 2500 times the volume of 0.5% Triton X-100 (Sigma) was added. (4.0 μg/ml). Dilute this with water to 0, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0
A μg/ml L-α-phosphatidyl-DL-glycerol solution was prepared. Transfer 1 ml of the above reagent to a cuvette and add 0, 0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 μg
50 μl of L-α-phosphatidyl-DL-glycerol solution of /ml was added to each, and the reaction was started at 37°C. The absorbance at 400 nm was read at 2 minutes and 7 minutes after the start of the reaction, and the difference was determined. The difference from the reagent blank was determined in the same manner as in Example 1, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 3, L-α-phosphatidyl-DL
-The change in absorbance with respect to the amount of glycerol showed good linearity.
【００６４】実施例４ ジヒドロキシアセトンの定量
＜試薬＞４０ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１０．０）２ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製
）０．２ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル
酵母工業（株）製）２ ｍＭ ＥＤＴＡ１００
ｍＭ 塩化アンモニウム１６８ ｕ／ｍｌ
グリセロールデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製：セル
ロモナス エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）由来）＜操作＞上記試薬１ｍｌをキュベット
にとり、０、２０、４０、６０、８０、１００μＭのジ
ヒドロキシアセトン溶液をそれぞれ２０μｌ添加し、３
７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と５分目
の４００ｎｍにおける吸光度を読み取りその差を求めた
。実施例１と同様試薬ブランクとの差を求め、その結果
を図４に示した。図４から明らかなように、ジヒドロキ
シアセトン量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示
した。Example 4 Quantification of dihydroxyacetone <Reagent> 40 mM Glycine NaOH buffer (pH 10.0) 2 mM Thio-NAD (manufactured by Sigma) 0.2 mM Reduced NAD (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) 2 mM EDTA100
mM ammonium chloride 168 u/ml
Glycerol dehydrogenase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.: Cellulomonas sp.
sp. ) <Procedure> Place 1 ml of the above reagent in a cuvette, add 20 μl each of 0, 20, 40, 60, 80, and 100 μM dihydroxyacetone solutions, and
The reaction was started at 7°C. The absorbance at 400 nm was read at 2 minutes and 5 minutes after the start of the reaction, and the difference was determined. As in Example 1, the difference from the reagent blank was determined, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 4, the amount of change in absorbance with respect to the amount of dihydroxyacetone showed good linearity.
【００６５】実施例５ グリセロールの定量〈試薬〉
５０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５
ｍＭ チオＮＡＤＰ（シグマ社製）０．１ ｍ
Ｍ 還元型ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業（株
）製）５４ ｕ／ｍｌ グリセロールデヒドロゲナ
ーゼ（ウサギ骨格筋由来）＜操作＞ウサギ骨格筋より、
Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２
５８， ４０−５５（１９７２）に準じてＮＡＤＰに特
異的なグリセロールデヒドロゲナーゼを精製し、使用に
供した。上記試薬１ｍｌをキュベットにとり、０、２０
、４０、６０、８０、１００μＭのグリセロール溶液を
それぞれ４０μｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた
。反応開始後２分目と７分目の４００ｎｍにおける吸光
度を読み取りその差を求めた。実施例１と同様試薬ブラ
ンクとの差を求め、その結果を図５に示した。図５から
明らかなように、グリセロール量に対する吸光度変化量
は良好な直線性を示した。Example 5 Determination of glycerol (reagent)
50 mM phosphate buffer (pH 7.5)5
mM ThioNADP (manufactured by Sigma) 0.1 m
M Reduced NADP (manufactured by Oriental Yeast Kogyo Co., Ltd.) 54 u/ml Glycerol dehydrogenase (derived from rabbit skeletal muscle) <Procedure> From rabbit skeletal muscle,
Biochim. Biophys. Acta, 2
58, 40-55 (1972), NADP-specific glycerol dehydrogenase was purified and used. Transfer 1 ml of the above reagent to a cuvette and
, 40, 60, 80, and 100 μM glycerol solutions were added in amounts of 40 μl each, and the reaction was started at 37° C. The absorbance at 400 nm was read at 2 minutes and 7 minutes after the start of the reaction, and the difference was determined. As in Example 1, the difference from the reagent blank was determined, and the results are shown in FIG. As is clear from FIG. 5, the amount of change in absorbance with respect to the amount of glycerol showed good linearity.
【図１】実施例１における、グリセロール量に対する４
００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。FIG. 1: 4 to the amount of glycerol in Example 1
2 is a drawing showing the results of a rate assay at 00 nm.
【図２】実施例２における、グリセロール量に対する４
００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。[Figure 2] 4 against the amount of glycerol in Example 2
2 is a drawing showing the results of a rate assay at 00 nm.
【図３】実施例３における、Ｌ−α−ホスファチジル−
ＤＬ−グリセロール量に対する４００ｎｍにおけるレイ
トアッセイの結果を示す図面である。FIG. 3: L-α-phosphatidyl- in Example 3
It is a drawing showing the results of a rate assay at 400 nm for the amount of DL-glycerol.
【図４】実施例４における、ジヒドロキシアセトン量に
対する４００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す
図面である。FIG. 4 is a drawing showing the results of a rate assay at 400 nm for the amount of dihydroxyacetone in Example 4.
【図５】実施例５における、グリセロール量に対する４
００ｎｍにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。FIG. 5: 4 against the amount of glycerol in Example 5
2 is a drawing showing the results of a rate assay at 00 nm.
Claims (6)
およびＤ−グリセロアルデヒドからなる群より選ばれた
１種の被検成分を含有する被検体に、（１） チオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以
下チオＮＡＤＰ類という）およびチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ類という）か
らなる群より選ばれる１つと、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート類（以下ＮＡＤＰ類という
）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる１つとを補
酵素とし、少なくともグリセロールを基質としてジヒド
ロキシアセトンまたはＤ−グリセロアルデヒドを生成す
る可逆反応をなすグリセロールデヒドロゲナーゼ、（２
） Ａ１（３） Ｂ１を含有する試薬を作用せしめて、
次の反応式 【化１】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を測定することを特徴とするグリセロール、ジヒドロ
キシアセトンおよびＤ−グリセロアルデヒドからなる群
より選ばれた１種の被検成分の高感度定量法。Claim 1: A test substance containing one test component selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone, and D-glyceraldehyde, (1) thionicotinamide adenine dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as thioNADPs) ) and thionicotinamide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as thioNADs); and nicotinamide adenine dinucleotide phosphates (hereinafter referred to as NADPs) and nicotinamide adenine dinucleotides (hereinafter referred to as NADs). glycerol dehydrogenase, which performs a reversible reaction to produce dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde using at least glycerol as a substrate, using one selected from the group consisting of (2) as a coenzyme;
) A1 (3) A reagent containing B1 is allowed to act,
The following reaction formula [Formula 1] (wherein A1 is thioNADPs, thioNADs, NAD
Ps or NADs, A2 represents the reduced product of A1, and B1 represents A1 is thioNADPs or thioNADs.
When using reduced NADPs or reduced NADs,
When A1 is NADPs or NADs, reduced thioN
Indicates ADPs or reduced thioNADs, B2 is B1
selected from the group consisting of glycerol, dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde, characterized in that the cycling reaction represented by the oxidized product of A highly sensitive quantitative method for one type of test component.
ンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチ
ルＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェートおよびニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）
からなる群より選ばれたものである請求項１記載の高感
度定量法。2. The NADPs are nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), acetylpyridine adenine dinucleotide phosphate (acetylNADP), acetylpyridine hypoxanthine dinucleotide phosphate, and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate (deaminoNADP).
The highly sensitive quantitative method according to claim 1, which is selected from the group consisting of:
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
ヒポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒ
ポキサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からな
る群より選ばれたものである請求項１記載の高感度定量
法。3. The NADs are selected from the group consisting of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), acetylpyridine adenine dinucleotide (acetyl NAD), acetyl pyridine hypoxanthine dinucleotide and nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (deamino NAD). The highly sensitive quantitative method according to claim 1, which is a method according to claim 1.
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ
）およびチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
チドホスフェートからなる群より選ばれたものである請
求項１記載の高感度定量法。4. The thioNADPs are thionicotinamide adenine dinucleotide phosphate (thioNADP).
) and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide phosphate.
アデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）およびチオニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群よ
り選ばれたものである請求項１記載の高感度定量法。5. The highly sensitive quantitative method according to claim 1, wherein the thioNAD is selected from the group consisting of thionicotinamide adenine dinucleotide (thioNAD) and thionicotinamide hypoxanthine dinucleotide.
ＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群より選ばれる１つ
と、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともグリセロールを基質と
してジヒドロキシアセトンまたはＤ−グリセロアルデヒ
ドを生成する可逆反応をなすグリセロールデヒドロゲナ
ーゼ、（２） Ａ１（３） Ｂ１（Ａ１はチオＮＡＤＰ
類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、
Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類のとき
は還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮ
ＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤＰ類
または還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有することを特
徴とするグリセロール、ジヒドロキシアセトンおよびＤ
−グリセロアルデヒドからなる群より選ばれた１種の被
検成分の高感度定量用組成物。[Claim 6] The following components (1) to (3) (1) NA
A reversible reaction in which one selected from the group consisting of DPs and thioNADs and one selected from the group consisting of NADPs and NADs are used as coenzymes, and dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde is produced using at least glycerol as a substrate. glycerol dehydrogenase, (2) A1 (3) B1 (A1 is thioNADP
, thioNADs, NADPs or NADs,
B1 contains reduced NADPs or reduced NADs when A1 is thio-NADPs or thio-NADs;
Glycerol, dihydroxyacetone and D
- A composition for highly sensitive quantitative determination of one type of test component selected from the group consisting of glyceraldehyde.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP3110343A JP3034979B2 (en) | 1991-05-15 | 1991-05-15 | Highly sensitive quantification method of glycerol, dihydroxyacetone or D-glyceraldehyde and composition for highly sensitive quantification |
| PCT/JP1991/001786 WO1992020818A1 (en) | 1991-05-15 | 1991-12-27 | High precision determination of glycerol, dihydroxyacetone or d-glyceraldehyde and composition therefor |
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