CN101629960A - 铁测定试剂组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的试剂组合、包含其的试剂盒及其应用。所述试剂组合包括:(i)第一试剂,其包含缓冲剂和用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂;(ii)第二试剂,其包含铁的还原剂和适于与还原铁形成有色复合物的着色剂;其中所述第一试剂还含有表面活性剂。本发明的试剂组合不仅提高了铁测定试剂的测定线性范围,而且提高了试剂测定的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及铁浓度分析领域,更具体地,本发明涉及用于测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的试剂组合、包含其的试剂盒及其应用。
背景技术
人体内总铁含量为4克左右,其中三分之二的铁存在于血红蛋白中,余下三分之一存在于肝、脾、骨髓等组织中。血清中总铁含量为3-4毫克,存在形式为与转铁蛋白相结合,血清中铁的浓度通过红细胞产生或降解的速度来调节,血清中铁的含量反应了人体造血器官的功能。另外,体内铁存储量的动态也影响血清中铁的浓度,例如肝炎时,铁从肝细胞转移到其它组织,使血清铁浓度增高。血清铁浓度增高或降低不仅能反映造血功能疾病(缺铁性贫血、再生障碍性贫血、恶性贫血、溶血性贫血、白血病和红细胞增多症等),而且能反映其它系统的疾病(例如感染性疾病、急性肝炎、肝硬化、血色病和肾病等),因此血清中铁浓度的测定是临床上一项重要的检查项目。血清铁的正常参考值为男性:11~30μmol/L(60~170μg/dl),女性9~27μmol/L(50~150μg/dl)。
本发明为配合生化分析仪使用的,临床上测定血清中铁浓度的试剂。
目前市场上出售的血清铁试剂多是采用比色法,其原理为:血清样品与试剂组分中的变性剂反应,将与转铁蛋白结合的铁释放出来,成为游离铁,游离的三价铁离子与还原剂反应,还原为二价铁。然后与二价铁离子络合的显色剂反应,产生吸光物质,可进行比色测定。反应方程式为:
Fe2++显色剂→光吸收复合物
显色剂一般使用含-N=C-C=N-结构的生色原(如铬天青、菲罗啉和亚铁嗪等),与亚铁离子形成五元环,产生紫红色。在第一步即释放出游离铁的反应中,通常使用的缓冲液包括乙酸缓冲液、草酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸钾缓冲液和琥珀酸缓冲液等,缓冲液的pH值范围为2-4,缓冲液浓度范围为10-500mM。还原剂通常使用抗坏血酸、半胱氨酸、巯基乙酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等,浓度范围在0.1-500mM。
现有技术中存在的一种血清铁试剂包括以下各项:
R1干粉:抗坏血酸57mmol/L
R1液体:甘氨酸缓冲液(pH3.1)0.4mol/L,盐酸胍,防腐剂(叠氮钠)
R2液体:亚铁嗪5.0mmol/L
然而该血清铁试剂存在以下缺点:
(1)该血清铁试剂使用的还原剂是抗坏血酸,而抗坏血酸在溶液中极不稳定,其水溶液在室温下放置24小时即会被氧化成黄色,因此在试剂盒中只能配制成干粉的型式。这样在检测时需先用R1液体溶解R1干粉,配成R1工作液后再使用,操作步骤繁琐。且R1干粉在分装时,易产生瓶间差,导致测定结果重复性差;
(2)其中使用的防腐剂叠氮钠的毒性非常大,它阻断细胞色素电子运送系统。叠氮钠可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。大批量生产时使用大量叠氮钠,如果不经过严密防护会对工人身体产生伤害。另外,叠氮钠与酸性溶液反应会放出有毒气体,测定时操作者打开试剂瓶盖时可能会吸入有毒气体;
(3)其中使用甘氨酸作为酸性缓冲液,其酸性较弱,盐酸胍在其中的变性能力不强,因此试剂盒最低检出浓度高,灵敏度低。
US6274382B1公开了一种用于测定生物样品中铁浓度的组合试剂,其中特别添加金属阳离子(铟或钪)用于防止EDTA对测定的干扰。该文献并没有公开或启示在检测试剂中添加表面活性剂对于测定的灵敏度和测定的线性范围的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题:
现有的技术方法中还原剂多使用的是抗坏血酸,而抗坏血酸在溶液中极不稳定,其水溶液在室温下放置24小时即会被氧化成黄色,因此在试剂盒中只能配制成干粉的型式。这样在检测时需先用R1液体溶解R1干粉,配成R1工作液后再使用,操作步骤繁琐。
解决现有技术方法中防腐剂叠氮钠对人体造成伤害的问题。
解决现有技术方法检测灵敏度不高的问题。
本发明采用的技术方案:
因此,本发明的一个目的是提供一种用于测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的试剂组合,所述试剂组合包括:
(i)第一试剂,其包含缓冲剂和用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂;
(ii)第二试剂,其包含铁的还原剂和适于与还原铁形成有色复合物的着色剂;
其中所述第一试剂还含有表面活性剂。
在本发明的一个优选实施方案中,所述表面活性剂选自Triton、Lutensol ON50或ON60。
Triton X-100化学名称:聚乙二醇辛基苯基醚;商购来源:UNI-CHEM公司
Lutensol ON50/60化学名称:C10羰基醇乙氧基化合物;商购来源:BASF公司(ON50/60的区别在于链长不同)。
在本发明的另一个优选实施方案中,所述生物样品是血清样品。
在本发明的另一个优选实施方案中,所述第一试剂和第二试剂是水溶液的形式或者是适于制备水溶液的干燥混合物的形式。
在本发明的另一个优选实施方案中,所述组合试剂其特征还在于以下各项中的一项或多项:
(i)所述第一试剂的pH值在2至4之间并且所述缓冲剂选自乙酸、草酸盐、磷酸盐、甘氨酸、磷酸钾、琥珀酸和柠檬酸,优选柠檬酸;
(ii)用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂是硫脲或盐酸胍;
(iii)所述铁的还原剂选自抗坏血酸、半胱氨酸、巯基乙酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽;
(iv)所述着色剂选自含-N=C-C=N-结构的生色原,优选铬天青、菲罗啉和亚铁嗪;和
(v)所述表面活性剂的浓度范围为1~5(w/v)%。
本发明的另一个目的是提供一种测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的试剂盒,其包含上述任一实施方案所述的试剂组合。
在本发明试剂盒的一个优选实施方案中,所述第一试剂和第二试剂都为水溶液形式,并且缓冲剂的浓度为0.05~1.0mol/L,还原剂浓度为5~200mmol/L,用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂的浓度为0.02~0.5mol/L。
本发明的另一个目的是提供一种测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的方法,包括使用上述任一实施方案所述的试剂组合来测定生物样品中的铁浓度。
在本发明测定方法的一个优选实施方案中,所述第一试剂和第二试剂都为水溶液形式,并且缓冲剂的浓度为0.05~1.0mol/L,还原剂浓度为5~200mmol/L,用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂的浓度为0.02~0.5mol/L。
应当理解,在本发明的技术方案中,上述特征可以任意组合。
本发明的一个优选组合双试剂如下:
R1水溶液:柠檬酸0.05~1.0mol/L
硫脲0.02~0.5mol/L
ON50(或ON60)1~5%(w/v)
R2水溶液:抗坏血酸钠5~200mmol/L
亚铁嗪0.5~12mmol/L
本发明的技术效果
本发明人意外地发现,通过在铁检测试剂中加入表面活性剂能够扩大试剂的线性测定范围,并且能够大大提高检测的灵敏度。本发明使用的配方使得试剂盒测定的线性得到较大改善,在1.0μmol/L~179μmol/L(5.57μg/dL~1000μg/dL)范围内,测定值的线性误差不超过±15%。灵敏度大大提高,使最低检测限达到0.146μmol/L。
不希望受限于具体理论,但推测本发明中加入表面活性剂(Triton或Lutensol ON50或ON60)的作用是降低试剂液体表面张力,使液体能更好地与生化分析仪中的样品杯接触,从而得到更好的精密度、更宽的线性范围和更高的灵敏度。
另外,本发明的还原剂可以使用抗坏血酸钠,抗坏血酸钠在溶液中的稳定性强,其水溶液在37℃可稳定2周,2~8℃可稳定一年。因此,使用本发明可将试剂配制成液体双试剂,使检测时的操作步骤减少,提高工作效率。
此外,本发明优选使用柠檬酸作为酸性缓冲液,柠檬酸本身可以起到防腐的作用,因此试剂中不再添加叠氮钠作为防腐剂,使试剂在生产和使用过程中的安全性大大提高。
与US6274382 B1的技术方案相比,本发明技术方案的主要区别在于使用Triton或Lutensol ON50或ON60作表面活性剂,且不用特别添加金属阳离子(对比文件中需添加铟、钪离子)。与US6274382B1相比,本发明的优点是:
1.提高了试剂测定的线性范围。目前的铁测定试剂的线性范围一般在143μmol/L以下,而本发明的试剂测定的线性范围上限可达到179μmol/L;
2.提高了试剂测定的灵敏度,最低检测限可达到0.146μmol/L;
3.价格便宜。
附图说明
图1表示测定铁浓度的线性范围;
图2表示本发明的铁测定试剂测定人血清样品和质控血清的实验结果。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明,所述实施例仅是意图举例说明本发明,而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1血清铁浓度测定
本发明的一种试剂盒包括组合试剂,该组合试剂包括第一试剂R1和第二试剂R2。
R1水溶液:柠檬酸0.4mol/L(北京益利精细化学品有限公司)
硫脲0.1mol/L(SIGMA-ALDRICH)
Triton-X 1005%(w/v)(UNI-CHEM)
R2水溶液:抗坏血酸钠57mmol/L(北京欣经科生物技术有限公司)
亚铁嗪9.0mmol/L(SIGMA-ALDRICH)
在日立7180型全自动生化仪上进行测定,设定参数见下表1:
表1
Hitachi | 7180 |
测定模式 | Endpoint2 |
反应时间 | 10 |
测定点 | 16~34 |
波长 | 700/570 |
样品体积 | 16 |
R1体积 | 200 |
R2体积 | - |
R3体积 | 40 |
R4体积 | - |
INC/DEC | INC |
校准类型 | 线性 |
校准点 | 1 |
Span.Point | 1 |
SD范围 | 0.1 |
Duplicate Limit | 500 |
单位 | μmol/L |
STD(1)Conc | 1 |
STD(2)Conc | * |
预期值 | ** |
K因子 | - |
铁校准液使用0-60μM硫酸铁氨溶液。
操作步骤
使用试剂的操作步骤为:参数设置→试剂配制→装载试剂→校准→质控→加载样品→结果计算
①参数设置
试剂所适用于不同全自动生化分析仪的参数设置详见参数表(表1)。同时请仔细阅读所使用的全自动生化分析仪操作说明书。并对输入的参数进行复核和确认。
②试剂配制
试剂为液体双试剂,试剂开瓶即可使用。用后及时置于2~8℃保存。
③装载试剂
拧下试剂瓶盖,检查试剂中是否存在气泡,如有气泡,可用移液器将其去除;将试剂放入试剂盘中;按照仪器使用说明,输入试剂信息,并对试剂信息进行确认和追加。以保障正确的分析项目设定、正确的试剂位,足够的试剂残留分析量,以及试剂在有效期内。
④校准
校准品:使用试剂盒配套校准液进行校准操作。
校准周期:校准间隔时间为21天;以下情况须重新定标:
(1)试剂更换批号时;
(2)出现质控漂移时;
(3)仪器做完保养后;
(4)重要零件更换时。
校准确认:操作结束后,应对校准结果进行复核和确认。如果校准结果超出了允许范围,应按照各实验室室内标准操作程序采取各种有效的纠正措施及时纠正,进行再校准,并在确认校准结果在控后开始样品检测。
⑤质控
质控品:建议采用Roche Precinorm U(正常范围质控)和Precipath U(病理范围质控)两个水平的血清进行室内质控。质控品值的使用方法和质控范围参见Precinorm U和Precipath U说明书。
质控品测定:每天对患者样品进行检测之前,须进行质量控制,以保障测试系统的准确性。每次须测定上述两个水平的质控血清。
质控品测定结果确认:质控品测值范围应适合于每个实验室的需要,质控品测定结果应在允许范围内。如出现失控情况,应按照各实验室室内标准操作程序采取各种有效的纠正措施及时纠正,并在确认重新回复到控制状态后开始样品检测。
⑥加载样品
按照仪器使用说明,在生化分析仪工作屏幕上进行样品登记和登记项目的确认。检查样品中是否存在气泡,如有气泡,应用移液器将其除去。按照登记的位置,将样品放置在样品盘相应的位置。对编号样品的项目进行确认,以保证此样品的检测项目为血清铁。
⑦结果计算
在上述步骤均完成后,仪器进入自动分析测定过程。测定结束后,生化分析仪将给出每个样品的分析值。
转换因数:μg/dL×0.179=μmol/L
实施例2测定铁浓度的线性范围
以硫酸铁氨的分析物纯品(天津南开化工厂)配制线性范围检测的样品。用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品,混合成至少5个稀释浓度(Xi)(用蒸馏水做溶剂稀释,测定步骤同前)。用铁试剂盒分别测定稀释浓度样品,重复测定3次,分别求出测定均值(Yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量,以测定均值(Yi)为因变量,求出线性回归方程。按照下面公式计算线性回归的相关系数(r)。
式中:
Xi——样品的测定浓度均值;
Yi——与测定浓度均值相对应的稀释浓度值;
i——1,2,3,......,n;
n——测定样本数。
线性测定结果:R2=1.000,线性良好(参见附图1和表2)。在1.0μmol/L~179μmol/L(5.57μg/dL~1000μg/dL)范围内,测定值的线性误差不超过±15%。
表2
测值1 | 测值2 | 测值3 | 平均测值 | 稀释值 |
1.84 | 1.90 | 1.92 | 1.89 | 0.90 |
31.73 | 31.32 | 31.37 | 31.47 | 29.09 |
61.51 | 61.38 | 61.48 | 61.46 | 58.18 |
121.25 | 120.12 | 121.59 | 120.99 | 116.35 |
182.72 | 182.35 | 181.41 | 182.16 | 174.53 |
185.58 | 186.31 | 185.38 | 185.76 | 179.00 |
实施例3试剂盒灵敏度测定
实验方案:用硫酸铁氨分析物纯品制备梯度稀释的样品,样品配制后,两小时内在奥林巴斯AU400型全自动分析仪上使用以上实施例1所述的试剂盒进行测定。一天内,每个梯度测值10次,取其吸光度数值,计算平均值。
统计学处理方法:计算每个样品测定的平均值、标准偏差S和变异系数CV。
当CV小于等于20%时,对应检测限样品具有的平均浓度,即为功能灵敏度。
当|Ai-A0-3SDi|≥3SD0时,所对应的浓度即为生物灵敏度。
3SD0所对应的浓度即为最低检测限。
±3SD0称为空白相应量。
其中Ai为稀释灵敏度样品i所对应的吸光度。
A0为空白样品所对应的吸光度。
3SD0为空白样品吸光度的标准偏差的三倍,
3SDi为稀释灵敏度样品i所对应的吸光度的标准偏差的三倍。
测定结果见表3和表4。
表3
分析 | 空白 | 样品 | 样品 | 样品 | 样品 | 样品 | 样品 | 样品 |
配制浓度 | 0.0 | 0.01562 | 0.03125 | 0.0625 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1.00 |
实测吸光度1 | 0.0098 | 0.0098 | 0.0100 | 0.0105 | 0.0107 | 0.0103 | 0.0112 | 0.0135 |
实测吸光度2 | 0.0101 | 0.0102 | 0.0104 | 0.0107 | 0.0110 | 0.0115 | 0.0116 | 0.0134 |
实测吸光度3 | 0.0105 | 0.0106 | 0.0107 | 0.0107 | 0.0111 | 0.0116 | 0.0115 | 0.0137 |
实测吸光度4 | 0.0104 | 0.0103 | 0.0106 | 0.0108 | 0.0108 | 0.0113 | 0.0117 | 0.0138 |
实测吸光度5 | 0.0099 | 0.0101 | 0.0100 | 0.0103 | 0.0101 | 0.0108 | 0.0115 | 0.0137 |
实测吸光度6 | 0.0103 | 0.0090 | 0.0097 | 0.0100 | 0.0102 | 0.0105 | 0.0111 | 0.0135 |
实测吸光度7 | 0.0105 | 0.0102 | 0.0101 | 0.0102 | 0.0103 | 0.0110 | 0.0114 | 0.0137 |
实测吸光度8 | 0.0104 | 0.0105 | 0.0101 | 0.0103 | 0.0104 | 0.0114 | 0.0118 | 0.0141 |
实测吸光度9 | 0.0104 | 0.0104 | 0.0102 | 0.0102 | 0.0109 | 0.0117 | 0.0124 | 0.0139 |
实测吸光度10 | 0.0095 | 0.0096 | 0.0100 | 0.0103 | 0.0108 | 0.0114 | 0.0121 | 0.0140 |
表4
数值分析
吸光度均值 | 0.01018 | 0.01007 | 0.01018 | 0.01040 | 0.01063 | 0.01115 | 0.01163 | 0.01373 |
吸光度均差 | 0.00000 | 0.00011 | 0.00000 | 0.00022 | 0.00045 | 0.00097 | 0.00145 | 0.00355 |
吸光度标准偏差 | 0.00034 | 0.00048 | 0.00030 | 0.00026 | 0.00035 | 0.00048 | 0.00039 | 0.00023 |
吸光度CV | 439.24 | 119.30 | 78.43 | 49.38 | 27.21008 | 6.38 | ||
检出低限吸光度 | 0.00103 | |||||||
可能出现的吸光度最小值 | -0.001 | -0.001 | -0.001 | -0.001 | 0.000 | 0.000 | 0.003 | |
空白响应量的范围 | -0.0010 | 0.0010 | ||||||
检测低限 | 0.146 | |||||||
生物检测限 | 1.000 | |||||||
功能灵敏度 | 1.000 |
结论:本发明的铁试剂盒的最低检测限为0.146μmol/L,生物灵敏度为1μmol/L,功能灵敏度为1μmol/L。
实施例4表面活性剂对于试剂测定的影响
在本发明中,加入表面活性剂的作用是为了提高试剂测定的精密度、增强试剂的灵敏度以及提高试剂测定样品浓度的线性范围。
在本发明的铁测定试剂(见实施例1)中使用的表面活性剂最佳选择为ON50,以下是加入ON50的铁测定试剂与加Triton-X 100的铁测定试剂的实验数据比较:
1.精密度的比较:
根据以上实施例所述的方法,用加入ON50/Triton-X 100的铁测定试剂测定2个血清样品(编号175650和173043),每个样品各重复测定20次,所得结果如下:
加入ON50的铁测定试剂测定结果:
加Triton-X 100的铁测定试剂测定结果:
结果可见:加入ON50的铁测定试剂测定两个样品的变异系数分别为1.95%和0.98%,而加入Triton-X 100的铁测定试剂测定两个样品的变异系数分别为5.77%和6.51%。说明加入ON50比加Triton-X 100的试剂测定的精密度有很大提高。
2.功能灵敏度的比较
测定步骤:用硫酸铁氨分析物纯品制备梯度稀释的样品,样品配制后,2小时内在全自动生化分析仪上进行测定。一天内,每个浓度测值20次,取其吸光度数值,计算每个浓度样品测定的平均值、标准偏差和变异系数(CV),当CV≤15%时,对应检测限样品具有的平均浓度,即为功能灵敏度。
测定结果:
下表是加入ON50的铁测定试剂的测定结果
以下是加入Triton-X 100的铁测定试剂的测定结果
样品1 | 样品2 | 样品3 | 样品4 | 样品5 | 样品6 | 样品7 | 样品8 | |
配制浓度(μmol/L) | 0.0000 | 0.0156 | 0.0313 | 0.0625 | 0.1250 | 0.2500 | 0.5000 | 1.0000 |
实测吸光度1 | 0.0014 | 0.0009 | 0.0013 | 0.0019 | 0.0012 | 0.0010 | 00028 | 0.0048 |
实测吸光度2 | 0.0018 | 0.0031 | 0.0026 | 0.0008 | 0.0013 | 0.0010 | 0.0046 | 0.0060 |
实测吸光度3 | 0.0016 | 0.0006 | 0.0023 | 0.0011 | 0.0014 | 0.0014 | 0.0025 | 0.0048 |
实测吸光度4 | 0.0025 | 0.0015 | 0.0010 | 0.0019 | 0.0010 | 0.0015 | 0.0032 | 0.0046 |
实测吸光度5 | 0.0015 | 0.0023 | 0.0012 | 0.0013 | 0.0016 | 0.0012 | 0.0028 | 0.0040 |
实测吸光度6 | 0.0015 | 0.0020 | 0.0026 | 0.0012 | 0.0008 | 0.0013 | 0.0023 | 0.0045 |
实测吸光度7 | 0.0018 | 0.0018 | 0.0013 | 0.0019 | 0.0009 | 0.0011 | 0.0040 | 0.0052 |
实测吸光度8 | 0.0021 | 0.0019 | 0.0018 | 0.0013 | 0.0008 | 0.0014 | 0.0028 | 0.0044 |
实测吸光度9 | 0.0019 | 0.0029 | 0.0025 | 0.0016 | 0.0009 | 0.0012 | 0.0022 | 0.0040 |
实测吸光度10 | 0.0009 | 0.0016 | 0.0015 | 0.0013 | 0.0007 | 0.0014 | 0.0036 | 0.0046 |
实测吸光度11 | 0.0021 | 0.0019 | 0.0023 | 0.0003 | 0.0013 | 0.0024 | 0.0036 | 0.0052 |
实测吸光度12 | 0.0016 | 0.0030 | 0.0028 | 0.0007 | 0.0008 | 0.0030 | 0.0024 | 0.0038 |
实测吸光度13 | 0.0021 | 0.0015 | 0.0011 | 0.0012 | 0.0011 | 0.0033 | 0.0028 | 0.0058 |
实测吸光度14 | 0.0008 | 0.0021 | 0.0012 | 0.0011 | 0.0013 | 0.0015 | 0.0032 | 0.0045 |
实测吸光度15 | 0.0018 | 0.0027 | 0.0014 | 0.0009 | 0.0014 | 0.0026 | 0.0028 | 0.0040 |
实测吸光度16 | 0.0022 | 0.0019 | 0.0011 | 0.0014 | 0.0007 | 0.0022 | 0.0032 | 0.0037 |
实测吸光度17 | 0.0029 | 0.0020 | 0.0005 | 0.0007 | 0.0013 | 0.0035 | 0.0024 | 0.0046 |
实测吸光度18 | 0.0016 | 0.0018 | 0.0017 | 0.0012 | 0.0010 | 0.0017 | 0.0033 | 0.0038 |
实测吸光度19 | 0.0016 | 0.0016 | 0.0012 | 0.0011 | 0.0009 | 0.0020 | 0.0032 | 0.0033 |
实测吸光度20 | 0.0025 | 0.0023 | 0.0015 | 0.0011 | 0.0007 | 0.0012 | 0.0023 | 0.0038 |
平均值 | 0.0018 | 0.0020 | 0.0016 | 0.0012 | 0.0011 | 0.0018 | 0.0030 | 0.0045 |
标准偏差 | 0.0005 | 0.0006 | 0.0007 | 0.0004 | 0.0003 | 0.0008 | 0.0006 | 0.0007 |
CV | 27.34% | 32.93% | 39.98% | 34.53% | 26.32% | 42.80% | 20.90% | 15.67% |
加入ON50的试剂的功能灵敏度为1μmol/L,而加Triton-X 100试剂的功能灵敏度>1μmol/L,可见加入ON50提高了试剂的功能灵敏度。
3.线性的比较
测定步骤:
3.1样品的制备.高值样本:用硫酸铁氨分析物纯品称量,溶于蒸馏水中,定容。
低值样本:取蒸馏水为低值样本。
将高值和低值样本按照下表进行梯度混合,共配制成10个浓度梯度。
样品序号 | 配制 | 浓度梯度(μmol/L) |
1 | 2/2 | 1.48 |
2 | 3/2 | 2.96 |
3 | 4/2 | 5.93 |
4 | 5/2 | 11.85 |
5 | 6/2 | 23.70 |
6 | 7/2 | 47.40 |
7 | 9/2 | 94.80 |
8 | (7+9)/2 | 142.31 |
9 | 9 | 189.60 |
10 | 9*1.3 | 232.70 |
3.2测定.对用加入ON50/Triton-X 100的铁测定试剂对样本进行测定,平行重复5遍。
3.3数据处理.从已收集的每5个数据计算出均值和标准差,除去离群值(即5次重复测定值和其对应值的差超过4个标准差)后,输入到SPSS统计学软件中进行回归分析,生成回归模型表、方差分析表、回归系数表及多项式回归的拟合曲线。
测定结果:
加入ON50的铁测定试剂对样品的测定结果:
浓度(μmol/L) | 测值1 | 测值2 | 测值3 | 测值4 | 测值5 | 平均值 | |
1 | 1.48 | 1.70 | 1.60 | 1.60 | 1.60 | 1.70 | 1.64 |
2 | 2.96 | 3.30 | 3.40 | 3.60 | 3.20 | 3.00 | 3.30 |
3 | 5.93 | 6.10 | 6.00 | 6.20 | 5.90 | 6.00 | 6.04 |
4 | 11.85 | 10.80 | 11.20 | 11.00 | 11.60 | 11.30 | 11.18 |
5 | 23.70 | 23.30 | 23.20 | 22.90 | 23.20 | 23.60 | 23.24 |
6 | 47.40 | 46.30 | 44.10 | 46.70 | 46.40 | 47.30 | 46.16 |
7 | 94.80 | 93.50 | 92.60 | 93.40 | 94.70 | 93.30 | 93.50 |
8 | 142.31 | 141.10 | 139.00 | 140.20 | 140.60 | 139.30 | 140.04 |
9 | 189.60 | 185.50 | 186.70 | 185.60 | 186.80 | 187.10 | 186.34 |
10 | 232.70 | 221.87 | 222.26 | 221.76 | 222.81 | 220.42 | 221.82 |
进行多项式拟合
一级方程y=0.0210+0.9831x
二级方程y=0.0443+0.9816x+8.8707E-06x2
三级方程y=0.2331+0.9575x+0.0004x2+-1.2678E-06x3
最佳拟合为一级方程
加入Triton-X 100的铁测定试剂对样品的测定结果:
浓度(μmol/L) | 测值1 | 测值2 | 测值3 | 测值4 | 测值5 | 平均值 | |
1 | 1.48 | 2.12 | 2.61 | 2.13 | 2.29 | 2.46 | 2.32 |
2 | 2.96 | 3.70 | 3.73 | 3.23 | 3.75 | 3.85 | 3.65 |
3 | 5.93 | 7.28 | 6.80 | 6.29 | 6.91 | 6.86 | 6.83 |
4 | 11.85 | 12.87 | 12.88 | 12.36 | 12.74 | 12.93 | 12.76 |
5 | 23.70 | 23.67 | 23.95 | 23.66 | 23.88 | 23.88 | 23.81 |
6 | 47.40 | 46.77 | 47.01 | 46.15 | 46.55 | 46.53 | 46.60 |
7 | 94.80 | 91.79 | 91.91 | 91.40 | 91.81 | 91.40 | 91.66 |
8 | 142.31 | 136.29 | 137.15 | 137.85 | 136.63 | 136.75 | 136.93 |
9 | 189.60 | 182.64 | 182.70 | 182.39 | 182.21 | 183.87 | 182.76 |
10 | 232.70 | 221.87 | 222.26 | 221.76 | 222.81 | 220.42 | 221.82 |
进行多项式拟合
一级方程y=1.0747+0.9570x
二级方程y=1.1203+0.9539x+1.7373E-05x2
三级方程y=0.9476+0.9759x+-0.0003x2+1.1598E-06x3
最佳拟合为三级方程
由此可见,对于浓度范围为1.48~232.70μmol/L的样品,加入ON50的铁测定试剂测定结果的线性优于加入Triton-X 100的铁测定试剂。
实施例5铁测定试剂测定人血清样品和质控血清
1.铁测定试剂测定人血清样品和质控血清的实验数据
(1)测定人血清样品
样品准备:按照临床实验室常规操作,收集正常人血清样本。接收样品后,在30分钟内将其离心,分离出血清。对反应吸光度有干扰的样品,如溶血和浑浊的样品等;标识不清或样品试管破裂的样品均为不合格样品。选用当天的样本,不使用贮存样本。
测定系统:实验选择奥林巴斯AU400全自动生化分析仪和本发明铁测定试剂盒(参见实施例1)组成的检测系统,进行血清中铁的测定,将本发明测定结果与罗氏(Roche)铁测定试剂盒的测定结果进行相关性评价。
结果见图2。根据线性回归的结果,R2≥0.95,相关性良好。系统误差符合临床要求。
(2)用铁试剂盒测定两个浓度(正常值和异常值)的质控血清,测定值与质控血清的靶值的偏差应不超过±15%。
正常值 异常值
测值1 | 20.79 | 测值1 | 31.70 |
测值2 | 21.48 | 测值2 | 31.81 |
测值3 | 21.19 | 测值3 | 32.14 |
平均测值 | 21.2 | 平均测值 | 31.9 |
靶值 | 21.5 | 靶值 | 30.9 |
偏差 | -1.6 | 偏差 | 3.2 |
2.铁测定试剂中不添加表面活性剂时的功能灵敏度检测结果检测方法同上。
检测结果:没有符合CV≤15%的配制浓度。即使在样品浓度高达2μmol/l时,CV仍高达102%,由此可见,未加入表面活性剂的铁测定试剂与加入表面活性剂(TritonX-100或ON50)的铁测定试剂相比,功能灵敏度大大降低。
Claims (9)
1.一种用于测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的试剂组合,所述试剂组合包括:
(i)第一试剂,其包含缓冲剂和用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂;
(ii)第二试剂,其包含铁的还原剂和适于与还原铁形成有色复合物的着色剂;
其中所述第一试剂还含有表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的试剂组合,其中所述表面活性剂选自Triton、Lutensol ON50或ON60。
3.根据权利要求1所述的试剂组合,其中所述生物样品是血清样品。
4.根据权利要求1所述的试剂组合,其中所述第一试剂和第二试剂是水溶液的形式或者是适于制备水溶液的干燥混合物的形式。
5.根据权利要求1至4中任何一项所述的试剂组合,其特征还在于以下各项中的一项或多项:
(i)所述第一试剂的pH值在2至4之间并且所述缓冲剂选自乙酸、草酸盐、磷酸盐、甘氨酸、磷酸钾、琥珀酸和柠檬酸,优选柠檬酸;
(ii)用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂是硫脲或盐酸胍;
(iii)所述铁的还原剂选自抗坏血酸、半胱氨酸、巯基乙酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽;
(iv)所述着色剂选自含-N=C-C=N-结构的生色原,优选铬天青、菲罗啉和亚铁嗪;和
(v)所述表面活性剂的浓度范围为1~5(w/v)%。
6.一种测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的试剂盒,其包含根据权利要求1至5中任何一项所述的试剂组合。
7.根据权利要求6的试剂盒,其中所述第一试剂和第二试剂都为水溶液形式,并且缓冲剂的浓度为0.05~1.0mol/L,还原剂浓度为5~200mmol/L,用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂的浓度为0.02~0.5mol/L。
8.一种测定含有转铁蛋白的生物样品中的铁浓度的方法,包括使用根据权利要求1至5中任何一项所述的试剂组合来测定生物样品中的铁浓度。
9.根据权利要求8的方法,其中所述第一试剂和第二试剂都为水溶液形式,并且缓冲剂的浓度为0.05~1.0mol/L,还原剂浓度为5~200mmol/L,用于释放与所述转铁蛋白结合的铁的试剂的浓度为0.02~0.5mol/L。
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