CN100504356C

CN100504356C - 精浆锌检测试剂和精浆锌检测试剂盒

Info

Publication number: CN100504356C
Application number: CNB2004100400354A
Authority: CN
Inventors: 傅剑华; 刘瑜; 胡家纯; 何林; 何小红
Original assignee: HUAKANG BIOMEDICAL ENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Current assignee: HUAKANG BIOMEDICAL ENGINEERING Co Ltd SHENZHEN
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2024-06-16
Also published as: CN1584552A

Abstract

本发明公开了一种精浆锌检测试剂，包括用于屏蔽无机物的显色液A、用于屏蔽有机物的显色液B和含有锌离子的锌标准品，所述显色液A为含有硫脲或硫脲衍生物、氟化物、显色剂5-Br-PAPS的缓冲液。该精浆锌定量检测试剂方法学评价指标高，回收率和干扰率较理想，回收率可控制在95～105%范围内，干扰率绝对值小于3%，操作简单、快捷，适合临床常规检测，可分别有450nm、560nm比色，适合不同条件的实验室操作，采用标准曲线检测结果可自动从酶标仪输出。

Description

精浆锌检测试剂和精浆锌检测试剂盒

【技术领域】

本发明涉及一种体外诊断试剂，具体适合于精浆锌定量检测。

【背景技术】

精浆锌在男性精液分析中一直占有很重要的地位，锌参与精子生成、受精的各个环节中都起作用，锌也是前列腺功能的评价指标之一。

精浆锌定量测定主要有原子吸收分光光度法、PAR显色法、5-Br-PAPS显色法。原子吸收分光光度法准确性高、方法灵敏，但需要用到特殊仪器。PAR显色法操作简单，适于常规开展，但严格来说其方法学评价指标不高，回收率和干扰率不理想。5-Br-PAPS显色法是世界卫生组织(WHO)推荐的精浆锌检测方法，操作简单，试剂稳定，其方法学评价指标明显优于PAR显色法，此方法试剂配方为保密配方。

为了更好促进男性不育检测的发展，建立一种方法特异、灵敏度高、能适合常规开展的精浆锌检测试剂及方法显得特别重要。

【发明内容】

本发明的目的就是解决现有技术的问题，提出一种高方法学评价指标、回收率和干扰率好、并适于常规开展的精浆锌定量检测试剂以及精浆锌检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明提出了一种精浆锌检测试剂，包括用于屏蔽无机物的显色液A、用于屏蔽有机物的显色液B和含有锌离子的锌标准品，所述显色液A为含有硫脲或硫脲衍生物、氟化物和显色剂5-Br-PAPS(2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenol，disodium salt，dihydrate)的缓冲液。

进一步地，所述显色液A还包括焦磷酸盐。所述显色液B为含酮肟类有机物的无水有机醇溶液。

优选地，所述显色液A中的氟化物为氟化钠，焦磷酸盐为焦磷酸钠，显色液B中的酮肟类有机物为丁二酮肟，无水有机醇为无水乙醇。

按重量百分比计，所述显色液A中的硫脲含量为2-6％、氟化钠含量为0.1-0.2％、焦磷酸钠含量为0.05-0.1％、5-Br-PAPS含量为0.15-0.45％；所述显色液B中的丁二酮肟含量为0.5-2.0％；所述锌标准品中的锌离子含量不超过1.5mmol/L。

所述锌标准品为一个或多个锌离子含量不超过1.5mmol/L的不同浓度的标准品。

为实现上述目的，本发明还提出了一种利用上述的精浆锌检测试剂检测精浆锌含量的方法，包括以下步骤：

1)配制反应液：将显色液A和显色液B按一定体积比混合；

2)制作样本：将适量精浆用去离子水以一定比例稀释；

3)将稀释后的精浆与步骤1)所述的反应液混合后装入测定管，将锌标准品与步骤1)的反应液混合后装入测定管；

4)检测：用仪器检测精浆和锌标准品的吸光度，并计算精浆中的锌含量。

步骤4)所述的仪器为酶标仪。

所述锌标准品的用量在酶标仪上比色时吸光度不超过3.0的用量。

步骤4)所述的吸光度检测是在波长为450nm或560nm处进行比色，步骤4)所述的装精浆的测定管和装锌标准品的测定管特性相同。

5-Br-PAPS与锌离子结合后，产物颜色深浅与锌离子浓度成正比，通过酶标仪检测测定管反应产物的颜色深浅并同时结合锌标准管反应物的颜色深浅，从而计算出测定管锌离子浓度。

上述检测精浆锌含量的方法所用的检测试剂包括用于屏蔽无机物的显色液A、用于屏蔽有机物的显色液B和含有锌离子的锌标准品，所述显色液A为至少含有硫脲或硫脲衍生物、氟化物、5-Br-PAPS的磷酸盐缓冲液。所述显色液A中还可以加入焦磷酸盐。所述显色液B还可以为含酮肟类有机物的无水有机醇溶液。所述显色液A中的氟化物优选氟化钠，焦磷酸盐优选焦磷酸钠，显色液B中的酮肟类有机物优选丁二酮肟，无水有机醇优选无水乙醇。

一种精浆锌检测试剂盒，包括显色液A 120-200ul、显色液B 20-80ul和锌标准品；所述显色液A包含有硫脲或硫脲的衍生物含量为2-6％、氟化物含量为0.1-0.2％的磷酸盐缓冲液；所述显色液B是包含有酮肟类有机物含量为0.5-2.0％的无水有机醇溶液；所述锌标准品中锌离子含量不超过1.5mmol/L。

采用上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于：1)方法学评价指标高，达到WHO推荐产品的性能水平。2)回收率和干扰率好，通常所用的精浆锌检测试剂中的显色液A都是只含有硫脲或硫脲的衍生物，或者只含有氟化物，这两种检测试剂的回收率不理想，其他无机离子对显色的平均干扰率绝对值大于5％，而本发明既含有硫脲或硫脲的衍生物，又含有氟化物，通过两类物质的协同作用，回收率和干扰率较理想，特别是将硫脲或硫脲的衍生物、氟化物、5-Br-PAPS和焦磷酸盐四者合用时，回收率达到95～105％，干扰率绝对值小于3％。3)操作简单、快捷，适合临床常规检测。4)实际检测证明，通过配备显色液和稀释样本的比例，显色后的产物可分别在450nm、560nm处比色，适合不同条件的实验室操作。5)采用标准曲线检测结果可自动从酶标仪输出。

【具体实施方式】

实施例一、一种精浆锌检测试剂，是由下列成份组成：(1)显色液A：含硫脲或衍生物含量为2-6％、氟化物含量为0.1-0.2％、焦磷酸盐含量为0.05-0.1％、5-Br-PAPS含量为0.15-0.45％的磷酸盐缓冲液；(2)显色液B：含酮肟类有机物含量为0.5-2.0％的无水有机醇溶液；(3)锌标准品：锌离子含量不超过1.5mmol/L的一个或一个以上的锌标准品。

所述锌标准品为按如下方法制得的标准品贮存液和一个或一个以上的其它标准品：

1)标准品贮存液：锌离子含量为5-15mmol/L的去离子溶液；

2)标准1：去离子水；

3)标准2：取1毫升标准贮存液，用去离子水定容至1000毫升，4℃保存；

4)标准3：取2毫升标准贮存液，用去离子水定容至1000毫升，4℃保存；

5)标准4：取4毫升标准贮存液，用去离子水定容至1000毫升，4℃保存；

6)标准5：取6毫升标准贮存液，用去离子水定容至1000毫升，4℃保存；

7)标准6：取8毫升标准贮存液，用去离子水定容至1000毫升，4℃保存；

8)标准7：取10毫升标准贮存液，用去离子水定容至1000毫升，4℃保存。

实施例二、与实施例一不同的是：所述显色液A中的含硫脲或衍生物优选硫脲，氟化物优选氟化钠，焦磷酸盐优选焦磷酸钠，所述显色液B中的酮肟类有机物优选丁二酮肟，无水有机醇优选无水乙醇。硫脲含量为6％、氟化钠含量为0.1％、焦磷酸钠含量为0.1％、5-Br-PAPS含量为0.45％的磷酸盐缓冲液；丁二酮肟含量为2.0％的无水有机醇溶液；锌标准品为锌离子含量不超过1.5mmol/L的7个锌标准品。此配方中硫脲和5-Br-PAPS浓度大，对无机物的屏蔽性好，加大了检测的线性范围，超过此值时对于临床检测没有实际意义。

硫脲的衍生物可以是硫代氨基脲、丙烯基硫脲等。酮肟还可以是丙酮肟和二乙酰一肟。

实施例三、与实施例二不同的是：硫脲含量为2％、氟化钠含量为0.2％、焦磷酸钠含量为0.05％、5-Br-PAPS含量为0.15％的磷酸盐缓冲液；丁二酮肟含量为0.5％的无水有机醇溶液；锌标准品为锌离子含量不超过1.5mmol/L的7个锌标准品。此配方中硫脲和5-Br-PAPS浓度小，可增强检测的灵敏度，低于此浓度时，会因为检测的线性范围偏小而致临床上含锌浓度高的样本检测不出。

实施例四、一种根据实施例一、二、三精浆锌检测试剂制作的试剂盒，其中：显色液A为120-200ul、显色液B为20-80ul、锌标准品中的每个标准品用量是在酶标仪上比色时吸光度不超过3.0的用量。

上述试剂盒的优选方案是：显色液A 150ul、显色液B 40ul、锌标准品包括至少一个标准品，每个标准品50ul。

实施例五、一种精浆锌检测试剂的制备方法，包括如下步骤：

A、显色液A的制作步骤

1)、称取硫脲20-60g，氟化钠1-2g，焦磷酸钠0.5-1.0g，搅拌溶于800ml pH7.4 0.2M磷酸盐缓冲液，加入0.5-1.5mg/ml 5-Br-PAPS 30ml，搅拌溶解；

2)、用磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH至7.2-7.6，过滤，4℃贮存；

B、显色液B的制作步骤

3)、称取丁二酮肟0.5-2.0g，溶于100ml无水乙醇，4℃贮存；

C、锌标准液贮存液(5-15mmol/L)的制作步骤

4)、将氧化锌粉末110℃烘烤，精确称取0.0407-0.1221g氧化锌加入去离子水约10ml、浓盐酸0.3ml，溶解完全后加入50ml去离子水混匀，再加入叠氮钠0.5g，待其溶解后用去离子水在容量瓶中稀释至100ml，4℃贮存。

实施例六、一种精浆锌检测试剂的制备方法，包括如下步骤：

A、显色液A的制作步骤

1)称取硫脲40g，氟化钠1.5g，焦磷酸钠0.75g，搅拌溶于800ml pH7.4 0.2M磷酸盐缓冲液，加入1mg/ml 5-Br-PAPS 30ml，搅拌溶解；

2)用磷酸盐缓冲液定容至1000ml，调节pH至7.4，过滤，4℃贮存；

B、显色液B的制作步骤

3)称取丁二酮肟4.7601g，溶于500ml无水乙醇，4℃贮存；

C、锌标准液贮存液(10mmol/L)的制作步骤

4)将氧化锌粉末110℃烘烤，精确称取0.0814g氧化锌加入去离子水约10ml、浓盐酸0.3ml，溶解完全后加入50ml去离子水混匀，再加入叠氮钠0.5g，待其溶解后用去离子水在容量瓶中稀释至100ml，4℃贮存。

实施例七、用精浆锌检测试剂检测精浆锌含量的方法为：

1)配制反应液：选择上述试剂中的任意一种，将显色液A和显色液B按一定体积比混合；

2)制作样本：将适量精浆用去离子水以一定比例稀释；

4)检测：根据配备显色液和稀释样本的比例，用酶标仪在450nm或560nm处比色，检测精浆和锌标准品的吸光度，并计算精浆中的锌含量。

实施例八、用精浆锌检测试剂检测精浆锌含量，具体步骤为：

一、试剂准备

临用前配制反应液。将显色液A与显色液B按相应的体积比4：1混合。

二、样本准备

将2000g精液标本离心10分钟，留取精浆，在无离子Eppendrof管内以去离子水1:61稀释精浆，充分混匀。

三、标准曲线制备

取无离子Eppendrof管5支，将100umol/L锌标准液以去离子水稀释配制为80、60、40、20和10umol/L浓度的锌标准液。以去离子水作为0umol/L标准液。将共7个浓度的标准液分别加入对应的7个标准管中。取7个浓度只是为了取平均值，使结果更精确。当然也可以是2、3、4、5或6个浓度。

四、检测步骤

根据配备显色液和稀释样本的比例，用酶标仪在450nm或560nm处比色。在去离子微孔内完成操作，加样方法如下表1(用酶标仪在450nm处比色)和表2(用酶标仪在560nm处比色)，每个测试均设复孔：

表1

表2

五、比色与计算

根据本技术领域的基础知识，标准管的吸光度/标准管的浓度＝测定管的吸光度/测定管的浓度，标准管的浓度是已知的，根据检测步骤检测出的标准管和测定管的吸光度，则可以计算出标准管的浓度＝标准管的吸光度/测定管的吸光度*测定管的浓度，即得出被检测精浆的浓度。标准管和测定管的吸光度可以采用450nm处比色得出的吸光度，也可以采用560nm处比色得出的吸光度。

用酶标仪为简化操作，标准液浓度乘以标本稀释系数(61)后，将所得参数输入酶标仪建立标准曲线，以适当的曲线拟合。若以560nm比色，则标准曲线以平滑曲线(二次方)方式拟合；若以450nm比色，则标准曲线以立方曲线(首选)或平滑曲线(二次方)方式拟合。仪器所判读结果即为已计算标本稀释系数的精浆实际锌浓度(mmol/L)。

标准实际浓度(umol/L) 输入酶标仪的应用浓度(mmol/L)

0 0

10 0.61

20 1.22

40 2.44

60 3.66

80 4.88

100 6.10

酶标仪打印输出结果，即为检测标本真实浓度(mmol/L)。

六、结果报告

锌最终检测结果以“μmol/一次射精”方式报告

一次射精锌量(μmol)＝精浆锌浓度(mmol/L)×一次射精的精液总体积(ml)

七、临床适用性

1、锌是前列腺功能指标之一，精浆锌、精浆酸性磷酸酶、精浆柠檬酸三个项目的联合定量检测，对前列腺炎具有诊断价值。

2、锌可帮助判断性腺分泌功能。

Claims

1.精浆锌检测试剂，包括用于屏蔽无机物的显色液A、用于屏蔽有机物的显色液B和含有锌离子的锌标准品，其特征在于：所述显色液A是含有硫脲或硫脲的衍生物、氟化钠和显色剂2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠(5-Br-PAPS)的磷酸盐缓冲液，所述显色液B为含酮肟的无水有机醇溶液，所述锌标准品为锌离子含量不超过1.5mmol/L的锌标准品。

2.如权利要求1所述的精浆锌检测试剂，其特征在于：所述显色液A还包括焦磷酸盐。

3.如权利要求2所述的精浆锌检测试剂，其特征在于：所述显色液A中的焦磷酸盐为焦磷酸钠，显色液B中的酮肟为丁二酮肟，无水有机醇为无水乙醇。

4.如权利要求3所述的精浆锌检测试剂，其特征在于：按重量百分比计，所述显色液A中的硫脲含量为2-6％、氟化钠含量为0.1-0.2％、焦磷酸钠含量为0.05-0.1％、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠含量为0.15-0.45％；所述显色液B中的丁二酮肟含量为0.5-2.0％。

5.如权利要求4所述的精浆锌检测试剂，其特征在于：所述锌标准品为一个或多个锌离子含量不超过1.5mmol/L的不同浓度的标准品。

6.如权利要求1-5中任一项所述的精浆锌检测试剂检测精浆锌含量的方法，包括以下步骤：

1)配制反应液：将显色液A和显色液B按4:1的体积比混合；

2)制作样本：将适量精浆用去离子水以1:61比例稀释；

7.如权利要求6所述的检测精浆锌含量的方法，其特征在于：步骤4)所述的仪器为酶标仪，锌标准品的用量在酶标仪上比色时吸光度不超过3.0的用量。

8.如权利要求6所述的检测精浆锌含量的方法，其特征在于：步骤4)所述的吸光度检测是在波长为450nm或560nm处进行比色。

9.一种精浆锌检测试剂盒，其特征在于：包括显色液A120-200μL、显色液B20-80μL和锌标准品；所述显色液A包含有硫脲或硫脲的衍生物含量为2-6％、氟化钠含量为0.1-0.2％、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠含量为0.15-0.45％的的磷酸盐缓冲液；所述显色液B是包含有酮肟含量为0.5-2.0％的无水有机醇溶液；所述锌标准品中锌离子含量不超过1.5mmol/L。