CN105466869A - 一种亚铁氧化酶的速率测定法 - Google Patents

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王丹峰
关晓辉
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
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Abstract

本发明公开了一种亚铁氧化酶的速率测定法，具体将血清样品在已知量的亚铁离子醋酸盐缓冲液(0.45mol/L，pH5.8)中孵育，在氧化酶作用下，亚铁离子被氧化成铁离子，孵育一定时间后，加入色素原亚铁嗪，形成有色络合物，在波长510m下测定出未被氧化的亚铁离子的含量，酶促反应前后亚铁离子浓度的差值表示亚铁离子被氧化的数量来测定亚铁氧化酶的浓度。本测定方法反应时间短，显色稳定，符合了全自动生化分析仪和分光光度计手工法操作的要求，又提高了检测的精密度。

Description

一种亚铁氧化酶的速率测定法
技术领域
本发明属于蛋白的测量领域，具体涉及一种亚铁氧化酶的速率测定法。
技术背景
Wilson病又称肝豆状核变性病，是一种常染色体隐性遗传病，此种病人血清中CP活性大大降低，且铜的吸收高于正常，导致铜在体内堆积，并主要沉积于肝、肾、大脑基底等部位，导致一系列临床症状，主要表现为：1.慢性进行性肝病及肝硬变。2.神经精神症状、如肌张力增强、语音不清等。3.角膜K-F环。该病的治疗主要包括：1.用青霉胺、BAL等排铜。2.饮食治疗。3.保肝治疗。
亚铁氧化酶具有酶活性，能催化亚铁离子成高铁离子，俗称铜氧化酶。亚铁氧化酶是生物源胺类氧化酶及铜的载体。同时亚铁氧化酶为急性时相反应蛋白，发生感染、炎症时血浆亚铁氧化酶水平明显升高；高危妊娠时亚铁氧化酶增高更为明显，其测定也用于高危妊娠的监测。亚铁氧化酶的另一作用，即它的抗氧化作用已越来越受到人们的重视。
目前，亚铁氧化酶的测定方法主要有酶催化法和免疫法。酶催化法对亚铁氧化酶是非专一的，游离的亚铁离子也会对结果产生影响，造成结果存在误差；免疫法，测试快速，准确率较高，但是需要大量的血清且对纯度要求较高，成本较高。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、快速定量检测亚铁氧化酶的速率测定法。
一种亚铁氧化酶的速率测定法，具体指的是：将15μl被测血清样品加入到1.75ml醋酸盐缓冲液中放置1分钟，加入375ul底物液，37℃下孵育5分钟，立即加入显色剂150ul，采用分光光度计在波长510nm下读取吸光度，计算出校准液和样品溶液在采用酶促反应前后亚铁离子浓度，运用两点校准法，第1校准液为0.00U/L，第2校准液为1200U/L。计算差值，得出亚铁离子被氧化的数量，通过终点法得出亚铁氧化酶的浓度。
所述醋酸盐缓冲液浓度为0.45mol/L，pH5.8。
所述的含有亚铁离子的底物液具体包含的组分及各组分用量如下：
Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.072g
硫脲4.95g
水1000ml
所述的显色剂具体包含的组分及各组分用量如下：
亚铁嗪0.445g
去离子水100ml
所述的校准液为：
校准液1：去离子水
校准液2：EDTA-Na325mmol/L。
去离子水作为第1种校准液给出反应介质中所有亚铁离子浓度的最大吸光度，即底物浓度；EDTA-Na3作为第2种校准液凋至零吸光度，即设定所有底物被氧化。
本发明的有益效果为：本发明创新性的提出两次校准实验来测定亚铁氧化酶的浓度，采用亚铁嗪作为色素原，亚铁嗪与亚铁离子有高度亲和性和显色效果，不与其他二价金属和三价铁离子结合，反应时间短，显色稳定，符合了全自动生化分析仪和分光光度计手工法操作的要求，又提高了检测的精密度。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本说明而不用于限制发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所依附权利要求书所限定的范围。
主要仪器和试剂：
亚铁离子醋酸盐缓冲液浓度为0.45mol/L，pH5.8。
Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.072g
硫脲4.95g
水1000ml
亚铁嗪0.445g
去离子水100ml
校准液1：新鲜去离子水
校准液2：EDTA-Na325mmol/L
具体步骤如下：
1.将15μl被测样品加入到1.75ml醋酸盐缓冲液中放置1分钟，加入375ul底物液，37℃下孵育5分钟，立即加入亚铁嗪溶液150ul，采用UV-2201分光光度计在波长510nm下读取吸光度，运用两点校准法，第1校准物(去离子水)为0.00U/L，第II校准物(EDTA)为1200U/L。为校正空白，可在第二波长700nm测定空白读数。
2.有色复合物的吸光度与亚铁离子浓度在60μmol/L范围内是呈线性。在反应介质中，色素原浓度在300μmol/L以上可获得最大吸光度。
3.在第1校准点.亚铁离子浓度为30μmol/L，并给出一个吸光度1.2A，第2校准点，亚铁离子浓度为0.0μmol/L，给出第二吸光度0.0A，通过这种较正测出亚铁离子被氧化的量为0～30μmol/L范围。在此校正系统中，1μmol/L亚铁离子被氧化所对应的亚铁氧化酶浓度，可通过如下公式计算：
酶浓度＝(C1-C2)·t-1·df
C1：开始反应时底物浓度：30umol/L
C2：酶促反应后底物浓度：C1-C2＝△Cs
T：酶和底物的孵育时间：设定3.8min。
df：样本稀释比例：反应总体积/样本体积：2290μl/15μl即所加入试剂和样品总量与加入样品的比例。
酶浓度＝(△Cs/3.8)·(2290/15)＝△Cs·40U/L
4.依据3的工作曲线，求出被测样品的亚铁氧化酶浓度为267.97ng/ml。

Claims (5)

1.一种亚铁氧化酶的速率测定法，其特征是：包括如下步骤，将15μl被测血清样品加入到1.75ml醋酸盐缓冲液中放置1分钟，加入375ul含有亚铁离子的底物液，37℃下孵育5分钟，加入显色剂150ul，采用分光光度计在波长510m下读取吸光度，计算出校准液和样品溶液在采用酶促反应前后亚铁离子浓度，运用两点校准法，第1校准液为0.00U/L，第2校准液为1200U/L；计算差值，得出亚铁离子被氧化的数量，通过终点法得出亚铁氧化酶的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种亚铁氧化酶的速率测定法，其特征在于：所述醋酸盐缓冲液浓度为0.45mol/L，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种亚铁氧化酶的速率测定法，其特征在于：所述的含有亚铁离子的底物液具体包含的组分及各组分用量如下：
Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.072g
硫脲4.95g
水1000ml。
4.根据权利要求1所述的一种亚铁氧化酶的速率测定法，其特征在于：所述的显色剂具体包含的组分及各组分用量如下：
亚铁嗪0.445g
去离子水100ml。
5.根据权利要求1所述的一种亚铁氧化酶的速率测定法，其特征在于：所述的第1校准液为：去离子水；
第2校准液为：EDTA-Na325mmol/L。
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CN101169447A (zh) * 2006-10-24 2008-04-30 苏州艾杰生物科技有限公司 亚铁离子诊断/测定试剂盒及亚铁离子的浓度测定方法
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