CN105388285A - 一种检测h因子浓度的方法、设备及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域,提供一种检测H因子浓度的方法、设备及试剂盒,用于检测人血浆/血清/尿液中H因子浓度水平。包括配制用于检测H因子浓度水平的试剂盒;分别向待测样本和标准品中加入所述试剂Ⅰ,分别检测得到待测样本和标准品的吸光度值;继续向待测样本和标准品中加入所述试剂II,检测得到待测样本和标准品的吸光度值;利用得到的待测样本和标准品的吸光度值,得到待测样本中H因子浓度水平。本发明提供的H因子浓度水平检测方法的检测区间广,在4.66-800mg/l浓度范围内的H因子浓度都可以检测到,检测效率高,检测操作步骤简单,检测成本低,普适性高,能满足大规模临床检测需求。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,尤其涉及一种检测H因子水平检测的方法、设备和试剂盒。
背景技术
H因子(ComplementfactorH)最早是在1965年由Nilson等人首次发现并报道的,根据电泳位置将其命名为β1f-球蛋白(Nilsson,U.R.andH.J.Mueller-Eberhard,IsolationofBetaIf-GlobulinfromHumanSerumandItsCharacterizationastheFifthComponentofComplement.JExpMed,1965.122:p.277-98.),其属于H因子蛋白家族成员中最具特征性的一员。H因子家族蛋白基因位于1q32人类补体激活调节基因簇区,是一组血浆中的糖蛋白,均由独立能折叠的短一致重复序列(shortconsensusrepeat,SCR)结构域构成(图1和图2)。H因子是由1213个氨基酸残基组成的的糖蛋白,分子量约为150kDa,由20个SCRs结构域组成,每个SCR由大约60个氨基酸组成,形成球状结构,含有四个保守的半胱氨酸残基(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),在Ⅰ~Ⅲ和Ⅱ~Ⅳ间形成二硫键,有利于其保持空间构象。肝脏是其主要的合成器官,此外,肾脏的系膜细胞、足细胞及肾小管上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、血小板、外周单个核细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、内皮细胞等也有所表达。正常人血循环中H因子含量丰富,浓度约为300-800mg/l,其水平高低受遗传和环境因素等共同影响。
H因子不同的SCR区可以分别与肝素、细胞表面的粘多糖、微生物表面的蛋白组分、C反应蛋白(CRP)、及C3b和C3d等补体分子相结合,发挥不同的生理功能(图3)。H因子的N端和C端分别具有不同的生物学功能:其N端的SCR1-4区主要在液相中通过辅助I因子参与降解旁路途径C3转化酶(C3bBb),同时还可以竞争性结合C3b而抑制C3转化酶(C3bBb)的形成;其C端主要和宿主细胞表面的粘多糖相结合,从而利于N端的SCR1-4在宿主细胞的表面抑制补体旁路途径的过度活化,保护宿主细胞免受损伤。最新的研究发现H因子还可以与凋亡细胞的碎片、DNA、组蛋白、核小体及annexin-II等成分相结合来调节清除凋亡细胞。
此外,H因子还可与多种细菌、病毒、真菌及寄生虫表面的补体结合蛋白相结合,介导细菌“免疫逃避”;H因子还可以与中性粒细胞、B淋巴细胞及单核细胞等表达的细胞表面受体如CR3、整合素以及L-选择素等相结合,介导细胞的粘附以及细胞因子的产生从而发挥免疫调节作用。
近年的研究发现,很多心血管疾病、肿瘤性疾病、感染性疾病、血液疾病、肾脏疾病、风湿性疾病、眼科疾病及产科疾病等的发生发展与H因子调节异常具有一定的相关性,即发病者位于染色体1q32“补体激活调节蛋白区”可能存在基因异常。如能准确检测患者血中补体H因子的水平,则可为疾病诊断提供帮助,并能提示疾病的严重程度,在一定程度上指导临床治疗,改善患者预后。
现有技术中,对于人体循环中补体H因子水平的检测方法主要有两种,一种是酶联免疫吸附法(ELISA),另一种是放射免疫扩散法。ELISA法检测时间长,操作步骤复杂;放射免疫扩散法虽检测时间短,但需有放射性保护。而且两种方法中单次可检测的样本量少,故两种检测方法都不能实现快速、准确地检测批量的补体H因子水平,不能满足临床的需求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的检测时间长、操作步骤复杂、单次检测样本量少等技术问题,本发明采用免疫透射比浊法和散射透射比浊法原理,提供一种可以快速检测血浆/血清/尿液中H因子水平、并可同时检测大量样本、操作简单的方法。该方法的检测区间广、对样本的保存条件要求较为宽泛、对样本的抗凝方法要求简单,具有较好的临床应用价值。
为实现本发明的目的,本发明一方面提供一种检测H因子浓度水平的方法,包括:
配制用于检测待测样本中H因子浓度水平的包括试剂Ⅰ和试剂II的试剂盒;
向待测样本中加入所述试剂Ⅰ,经孵育处理后得到第一检测样本,经检测后,得到所述待测样本的第一吸光度值A1;向所述第一检测样本中加入所述试剂II,经孵育处理后得到第二检测样本,经检测后得到所述待测样本的第二吸光度值A2;
向标准本中加入所述试剂Ⅰ,经孵育处理后得到第一检测标准品,经检测后,得到所述标准品的第一吸光度值B1;向所述第一检测标准品中加入所述试剂II,经孵育处理后得到第二检测标准品,经检测后得到所述待标准品的第二吸光度值B2;
利用得到的待测样本的第一吸光度值A1、第二吸光度值A2和标准品的第一吸光度值B1和第二吸光度值B2,得到待测样本中H因子浓度水平。
其中,所述利用得到的待测样本的第一吸光度值A1、第二吸光度值A2和标准品的第一吸光度值B1和第二吸光度值B2,得到待测样本中H因子浓度水平包括:
将待测样本的第一吸光度值A2与待测样本的第二吸光度值A1的差值除以标准品的第二吸光度值B2与第一吸光度值B1的差值,得到比值K;
将标准品H因子的已知浓度与得到比值K相乘,得到待测样本中H因子的浓度值C。
其中,所述试剂Ⅰ包括Tris缓冲液和质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400;所述试剂Ⅱ包括Tris缓冲液、质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400和体积浓度为400-800ml/L的血清抗H因子抗体。
优选的,所述所述试剂Ⅰ包括Tris缓冲液和质量百分比浓度为60g/L的PEG400;所述试剂Ⅱ包括Tris缓冲液、质量百分比浓度为60g/L的PEG400和体积浓度为600ml/L的血清抗H因子抗体。
其中,所述检测时设置的检测条件为温度37℃,主波长546nm或600nm、副波长700nm。
其中,所述待测样本为人血浆、人血清或人尿液。
其中,所述待测样本的保存温度为-80~38℃。
其中,所述待测样本的保存时间为0-28天。
其中,待测样本中H因子浓度为4.68-2000mg/L。
其中,所述待测样本量为500-1000。
其中,所述孵育处理的孵育温度为37℃,孵育时间为5min。
其中,所述血清抗H因子抗体来源于羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,其效价为1:64-128。
进一步的,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人或马抗人H因子中为单克隆抗体或多克隆抗体。
为实现本发明的目的,本发明另一方面提供一种检测H因子浓度水平的设备,包括:
配制用于检测待测样本中H因子浓度水平的包括试剂Ⅰ和试剂II的试剂盒;
吸光度值检测装置,用于:
对待测样本中加入了所述试剂Ⅰ后得到第一检测样本进行吸光度值检测,得到所述待测样本的第一吸光度值A1;
对第一检测样本中加入所述试剂II后得到的第二检测样本进行吸光度值检测,得到所述待测样本的第二吸光度值A2;
对标准品中加入了所述试剂Ⅰ后得到第一检测标准品进行吸光度值检测,得到所述标准品的第一吸光度值B1;
对第一检测标准品中加入所述试剂II后得到的第二检测标准品进行吸光度值检测,得到所述标准品的第二吸光度值B2;
H因子浓度水平计算装置,用于利用得到的待测样本的第一吸光度值A1、第二吸光度值A2和标准品的第一吸光度值B1和第二吸光度值B2,计算待测样本中H因子浓度水平。
其中,所述试剂Ⅰ包括Tris缓冲液和质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400;所述试剂Ⅱ包括Tris缓冲液、质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400和体积浓度为400-800ml/L的血清抗H因子抗体。
优选地,所述试剂Ⅰ包括Tris缓冲液和质量百分比浓度为60g/L的PEG400;所述试剂Ⅱ包括Tris缓冲液、质量百分比浓度为60g/L的PEG400和体积浓度为600ml/L的血清抗H因子抗体。
特别是,所述血清抗H因子抗体来源于羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,其效价为1:64-128。
进一步的,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中为单克隆抗体或多克隆抗体。
其中,所述吸光度值检测装置是生化分析仪器或其它任意一种可以实现吸光度值检测的装置。
其中,所述H因子浓度水平计算装置是计算机或其它任意一种可以实现计算功能的装置。
为实现本发明的目的,本发明在一方面提供一种用于检测H因子的试剂盒,所述试剂盒可以用于检测H因子浓度水平的方法中或用于检测H因子浓度水平的设备中,包括:
包含Tris缓冲液和PEG400溶液的试剂Ⅰ;
包含Tris缓冲液、PEG400溶液和血清抗H因子抗体的试剂Ⅱ。
其中,所述试剂Ⅰ中PEG400溶液的质量百分比浓度为40-80g/L,优选为60g/L。
其中,所述试剂Ⅱ中PEG400溶液的质量百分比浓度为40-80g/L,优选为60g/L。
特别是,所述血清抗H因子抗体的体积浓度为400-800ml/L,优选为600ml/L。
特别是,所述血清抗H因子抗体来源于羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,其效价为1:64-128。
进一步的,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的优点:
1、本发明提供的方法检测区间广,在4.86-2000mg/l浓度范围内的H因子水平都可以检测。
2、本发明方法检测效率高,可以在5-10分钟内检测出一个样本的H因子的水平。
3、本发明方法对血液的保存条件要求低,保存温度在-80~37℃的血液样本、保存长达四个星期的血液样本、反复冻融过4次以内的血液样本都可以进行检测,且检测结果不受影响。
4、本发明方法对血液无抗凝要求,且EDTA或肝素抗凝的样本都可以检测,检测结果准确,不受影响。
5、本发明提供的方法操作简单,仅对待测样本和标准品前后的吸光度进行测定和计算,就可测定人体血浆/血清/尿液中H因子的水平,因此检测成本低,普适性高。
附图说明
图1是本发明背景技术中所述的H因子家族基因结构示意图;
图2是本发明背景技术中所述的H因子家族SCR结构示意图;
图3是本发明背景技术中所述的H因子与各种分子结合情况示意图;
图4是本发明实施例中所述的H因子浓度与吸光度OD值的对应曲线。
具体实施方法
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。需要说明的是,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1试剂盒
试剂盒中试剂按如下配比分别配制试剂Ⅰ和试剂Ⅱ:
试剂Ⅰ:Tris缓冲液为
PEG40060g/L。
试剂Ⅱ:Tris缓冲液为
PEG40060g/L
H因子抗血清600ml/L。
本发明提供的H因子抗血清为羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子为单克隆抗体或多克隆抗体。
实施例2试剂盒
试剂盒中试剂按如下配比分别配制试剂Ⅰ和试剂Ⅱ:
试剂Ⅰ:Tris缓冲液
PEG40040g/L。
试剂Ⅱ:Tris缓冲液
PEG40040g/L
H因子抗血清400ml/L。
本发明提供的H因子抗血清为羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子为单克隆抗体或多克隆抗体。
实施例3试剂盒
试剂盒中试剂按如下配比分别配制试剂Ⅰ和试剂Ⅱ:
试剂Ⅰ:Tris缓冲液
PEG40080g/L。
试剂Ⅱ:Tris缓冲液
PEG40080g/L
H因子抗血清800ml/L。
本发明提供的H因子抗血清为羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子为单克隆抗体或多克隆抗体。
作为选择,上述组分的配比也可以是,
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40040g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40060g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40040g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清600ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40060g/L
H因子抗血清800ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清400ml/L;
试剂Ⅰ:Tris缓冲液PEG40080g/L
试剂Ⅱ:Tris缓冲液PEG40080g/L
H因子抗血清600ml/L;中的任意一种,其配制的试剂盒性能接近于优选实施例配制的试剂盒的性能。
进一步的,上述试剂盒中的所用的H因子抗血清为本羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子中的一种,所述羊抗人H因子、免抗人H因子、鼠抗人H因子、马抗人H因子或驴抗人H因子为单克隆抗体或多克隆抗体。
需要说明的是,由于本发明采用了液态的PEG400,故本发明提供的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ为液态,因此试剂溶解度高、与待测样本结合能力强、促进聚合快,反应充分、迅速,2min内就可以与待测样本反应完成,得到检测结果、准确率达99%以上。
本发明配制的试剂适用于不同技术规格的生化仪,例如:
1个80ml容量的试剂Ⅰ与1个20ml容量的试剂Ⅱ组成的一个试剂盒可以用于贝克曼库尔特自动生化分析仪进行H因子浓度检测;
2个60ml容量的试剂Ⅰ与2个15ml容量的试剂Ⅱ组成的一个试剂盒可以用于日立全自动生化分析仪进行H因子浓度检测;
3个67ml容量的试剂Ⅰ与2个20ml容量的试剂Ⅱ组成的一个试剂盒可以用于奥林帕斯全自动生化分析仪进行H因子浓度检测;
4个3.7ml容量的试剂Ⅰ与1个3.7ml容量的试剂Ⅱ组成的一个试剂盒可以用于德国西门子全自动生化分析仪进行H因子浓度检测。
实施例4试剂盒性能的测定
对实施例1-3配制的试剂盒中的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ进行性能评估,判断试剂盒是否符合美国临床实验室标准化组织的相关标准,即CLSI标准。
1、试剂外观
在有光条件下分别目测实施例1-3的试剂盒中的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ,试剂Ⅰ均为无色澄清透明液体,试剂Ⅱ均为淡黄色澄清液体,皆没有沉淀和杂质出现,说明试剂盒中为正常试剂。
2、试剂空白吸光度
分别取实施例2-4的RⅠ240μl,加蒸馏水5μl,置37℃孵育5min后,并分别加入向相对应的RⅡ60μl,置37℃孵育5min后,在7060自动生化分析仪上,用340nm波长进行测定,测得实施例2-4的吸光度值均为0.01,小于0.04。说明试剂盒中为正常空白对照。
3、精密度测定
3.1批内精密度试验方法
在仪器正常工作条件下,用同一批试剂,连续测试(约200mg/L)样本20次,计算其测量值的平均值和标准差(SD),再按以下公式计算变异系数(CV%)的值,得到变异系数为1.2%,远小于10%,因此本申请的试剂盒稳定。
SD={∑(Xi-X)2/(N-1)}1/2
I=1
式中:SD-标准偏差;CV-变异系数;次测定值的均值;Xi是第i次的测定值;N-测量次数。
3.2批间精密度试验方法
在仪器正常工作条件下,取三个批号试剂,每个批号取一套,分别测定(约200mg/L)样本各3次。然后计算每批测定结果的均值和三批试剂测定结果的总均值按照下列公式求出三个批号试剂的测定均值的相对极差(%),得到相对极差为2.1%,小于10%,因此本申请的试剂盒效果好。
式中:为中最大值,为中最小值。
4、准确度测定
在仪器正常工作条件下,试剂使用北京大学第一医院肾内科提供的标准品经定标后,测定已知浓度的样本,重复测定10次,测量结果的均值的相对偏差为1.0%,因此误差较小,测量准确度高。
5、分析灵敏度测定
RⅠ试剂240μl,加入200mg/L样本5μl,置37℃孵育5min后,加入RⅡ60μl,置37℃孵育5min后,在7060自动生化分析仪用340nm波长(副波长700nm),测得吸光度值为720,小于0.10,因此本试剂盒可以灵敏地反映出样本的吸光度。
6、稳定性测定
取在规定贮存条件下2~8℃保存至有效期末前后二个月内的试剂检测其空白吸光度、精密度、准确度和分析灵敏度,得到其空白吸光度小于0.10;批内精密度的变异系数小于0.1%、批间精密度的相对极差小于15%以内;准确度在±10%的范围内;分析灵敏度大于0.04,符合厂家产品技术要求规定,且于2~8℃至少可保存12个月。另外,本产品线性相关性>0.9900,线性相关性良好。
上述测定均属正规操作,使用的容器均经过校准,生化仪的波长、灵敏度、稳定性均符合要求、温度准确、蒸馏水合格,标准物质含量或定值血清的靶值均经过验证。
经测定,本申请提供的试剂盒均符合美国临床实验室标准化组织的相关标准,即CLSI标准。
实施例5不同环境条件下的样本H因子浓度的检测
本实施例使用实施例1提供的试剂盒进行H因子浓度的检测。
1、样本的准备
采集新鲜的血液样本160例,将样本根据血液保存温度T、保存时间t和冻融次数K设置成如表1所示的处理组,以标准品的H因子浓度作为计量基础。
表1环境样本设置
2、样本的处理与检测
使用生化分析仪在温度环境为15-35℃、湿度环境为45-85%的条件下进行样本处理和测定
即:向5μl的样本中加入实施例2制得试剂Ⅰ溶液240μl,在生化分析仪中37℃孵育5min后在主波长340nm、副波长700nm的条件下测定其吸光值A1,测定后,再向样本中加入实施例2制得的含有H因子抗血清的试剂Ⅱ溶液,在生化分析仪中37℃孵育5min,发生免疫反应后,在主波长340nm、副波长700nm的条件下测定其吸光值A2,根据样本发生反应前后吸光值得到其差值A,即A=A2-A1。
3、H因子浓度的计算
3.1标准品的处理与测定
此操作条件与操作过程与步骤2相同,即向5μl的标准中加入实施例2制得的试剂Ⅰ溶液240μl,在生化分析仪中37℃孵育5min后在主波长340nm、副波长700nm的条件下测定其吸光值B1,测定后,再向标准品中加入实施例2制得的含有H因子抗血清的试剂Ⅱ溶液,在生化分析仪中37℃孵育5min,发生免疫反应后,在主波长340nm、副波长700nm的条件下测定其吸光值B2,根据标准品反应前后吸光值得到其差值B,即B=B2-B1。
3.2H因子浓度的计算
根据得到的样本反应前后的差值A、标准品反应前后的差值B及标准品的浓度c(mg/L)计算H因子的浓度C(mg/L),即:C=A/B·c,得到样本中H因子的浓度。
根据H因子浓度的结果值进行分析,得到如表2和表3所示的分析结果。
表2H因子浓度值分析结果Ⅰ
表3H因子浓度值分析结果Ⅱ
如表2所示的浓度值分析结果Ⅰ可知,使用本发明的试剂盒对不同冻融次数的样本、不同温度下的样本、不同保存时间的样本的检测结果差异都不显著,即本发明提供的H因子浓度检测的试剂盒及检测方法在不同冻融次数、温度及保存时间的影响下得到的检测结果一致,说明本发明提供的试剂盒及检测方法对样本的要求极低,且检测结果准确,可以满足临床测试标准。
为了进一步验证本试剂盒的准确性、灵敏度,本申请进行了多因素方差分析,分析结果如表2所示,在冻融次数与温度、冻融次数与保存时间、温度与保存时间、冻融次数与温度和保存时间的交叉因素影响下,H因子浓度值依然没有差异,即,样本即使在多因素的影响下,本申请提供的试剂盒及方法检测得到结果依然一致,进一步说明本发明提供的H因子浓度检测试剂盒及检测方法适用于不同条件下的样本检测,检测结果准确,可以完全满足临床测试标准。
实施例6不同浓度样本的H因子浓度的检测
在仪器正常工作条件下,测定如表4所示的已知浓度的样本,每个样本重复测定10次,测得结果的均值与已知浓度的相对偏差仅为1.0%。可见本申请提供的试剂盒可以检测浓度范围为4.66-800mg/L的样本,且检测结果准确,满足临床测试标准。
表4浓度样本设置
编号 | 浓度 | 编号 | 浓度 | 编号 | 浓度 | 编号 | 浓度 |
1 | 4.66 | 7 | 160 | 13 | 350 | 19 | 700 |
2 | 10 | 8 | 190 | 14 | 400 | 20 | 720 |
3 | 30 | 9 | 220 | 15 | 500 | 21 | 740 |
4 | 60 | 10 | 250 | 16 | 600 | 22 | 760 |
5 | 100 | 11 | 280 | 17 | 650 | 23 | 780 |
6 | 130 | 12 | 300 | 18 | 680 | 24 | 800 |
本发明的特点在于,本发明提供的方法检测区间广,在4.86-2000mg/l浓度范围内的H因子水平都可以检测;检测效率高,检测时间仅需1min,整个检测过程仅需5-10分钟;对血液的保存条件要求低,保存温度在-80~37℃的血液样本、保存长达四个星期的血液样本、反复冻融过4次以内的血液样本都可以进行检测,且检测结果不受影响,对血液无抗凝要求,EDTA或肝素抗凝的样本都可以检测。
Claims (10)
1.一种检测H因子浓度的方法,其特征在于,包括:
配制用于检测待测样本中H因子浓度水平的包括试剂Ⅰ和试剂II的试剂盒;
向待测样本中加入所述试剂Ⅰ,经孵育处理后得到第一检测样本,经检测后,得到所述待测样本的第一吸光度值A1;向所述第一检测样本中加入所述试剂II,经孵育处理后得到第二检测样本,经检测后得到所述待测样本的第二吸光度值A2;
向标准本中加入所述试剂Ⅰ,经孵育处理后得到第一检测标准品,经检测后,得到所述标准品的第一吸光度值B1;向所述第一检测标准品中加入所述试剂II,经孵育处理后得到第二检测标准品,经检测后得到所述待标准品的第二吸光度值B2;
利用得到的待测样本的第一吸光度值A1、第二吸光度值A2和标准品的第一吸光度值B1和第二吸光度值B2,得到待测样本中H因子浓度水平。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述利用得到的待测样本的第一吸光度值A1、第二吸光度值A2和标准品的第一吸光度值B1和第二吸光度值B2,得到待测样本中H因子浓度水平包括:
将待测样本的第一吸光度值A2与待测样本的第二吸光度值A1的差值除以标准品的第二吸光度值B2和第一吸光度值B1的差值,得到比值K;
将标准品H因子的已知浓度与得到比值K相乘,得到待测样本中H因子的浓度值C。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述试剂Ⅰ包括Tris缓冲液和质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400;所述试剂Ⅱ包括Tris缓冲液、质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400和体积浓度为400-800ml/L的血清抗H因子抗体。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述孵育处理的孵育温度为37℃,孵育时间为5min。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述血清抗H因子抗体来源于羊抗人H因子、免抗人H因子或鼠抗人H因子中的一种,其效价为1:64-128。
6.一种检测H因子浓度水平的设备,其特征在于,包括:
配制用于检测待测样本中H因子浓度水平的包括试剂Ⅰ和试剂II的试剂盒;
吸光度值检测装置,用于:
对待测样本中加入了所述试剂Ⅰ后得到第一检测样本进行吸光度值检测,得到所述待测样本的第一吸光度值A1;
对第一检测样本中加入所述试剂II后得到的第二检测样本进行吸光度值检测,得到所述待测样本的第二吸光度值A2;
对标准品中加入了所述试剂Ⅰ后得到第一检测标准品进行吸光度值检测,得到所述标准品的第一吸光度值B1;
对第一检测标准品中加入所述试剂II后得到的第二检测标准品进行吸光度值检测,得到所述标准品的第二吸光度值B2;
H因子浓度水平计算装置,用于利用得到的待测样本的第一吸光度值A1、第二吸光度值A2和标准品的第一吸光度值B1和第二吸光度值B2,计算待测样本中H因子浓度水平。
7.如权利要求6所述的设备,其特征在于,所述试剂Ⅰ包括Tris缓冲液和质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400;所述试剂Ⅱ包括Tris缓冲液、质量百分比浓度为40-80g/L的PEG400和体积浓度为400-800ml/L的血清抗H因子抗体。
8.如权利要求7所述的设备,其特征在于,所述血清抗H因子抗体来源于羊抗人H因子、免抗人H因子或鼠抗人H因子中的一种,其效价为1:64-128。
9.一种用于检测H因子的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒可以用于权利要求1所述的方法中或权利要求6的设备中,包括:
包含Tris缓冲液和PEG400溶液的试剂Ⅰ;
包含Tris缓冲液、PEG400溶液和血清抗H因子抗体的试剂Ⅱ。
10.如权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述血清抗H因子抗体来源于羊抗人H因子、免抗人H因子或鼠抗人H因子中的一种,其效价为1:64-128。
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