CN103995128A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50∶20–60。还本发明还提供该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，反应迅速，稳定性好的特点，反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。

Description

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备

技术领域

本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备。

背景技术

1993年，在中性粒细胞内的过氧化物酶颗粒中发现中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白(NGAL)。NGAL的cDNA全长为5869bp，有198个氨基酸，包括N端由20个氨基酸组成的信号肽序列及其后含178个氨基酸残基的肽段，是分泌型蛋白，相对分子质量约为25KDa，等电点为8.40。

生理条件下，NGAL少量合成于骨髓中性粒细胞的中幼及晚幼阶段，炎症反应和恶性肿瘤可诱使其在多组织(如子宫、前列腺、唾液腺、肺、肾、气道及消化道上皮等)中大量生成，在急、慢性肾脏疾病中具有一定的预警作用。NGAL经肾小球滤过，大部分被近端小管重吸收，尿中基本不可见，故检测尿NGAL水平可判断肾小管重吸收功能。

NGAL蛋白通过受体介导的内吞作用进入细胞，一方面竞争性抑制细菌的铁摄取，另一方面与细菌来源趋化物N-甲酰基蛋亮苯丙肽结合，促进细胞释放趋化因子、白介素，对炎症反应起负反馈作用，参与体内的炎症反应。

NGAL比早期肾脏损伤的其他指标如肾脏损伤分子(kidney injurymolecular1，KIM-1)、Cry61(cysteine-rich protein61)、β2-微球蛋白等出现得早，NGAL水平与肾脏损伤程度呈正相关，血和尿的NGAL可作为诊断急性肾损伤(AKI)、急性肾功能衰竭(ARF)早期诊断的敏感、特异性的生物学标记物，在一定程度上可以反映AKI的严重程度及预后判断，且在慢性肾脏病(CKD)、继发性肾脏病中同样具有诊断及预警意义。

另外，NCAL参与了肿瘤的发生、增殖、侵袭，且在其中表现出明确的组织特异性；NGAL可通过清除ROS保护细胞免受损伤；NGAL在动脉粥样硬化斑块相关疾病(如心肌梗死、急性动脉粥样硬化性脑血管病等)中的表达均升高，这表明NGAL与动脉粥样硬化疾病发生发展相关。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及，已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。

乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法，如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。

本发明研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，比如：氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性；金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导，本发明以直径为35nm-60nm的胶体金颗粒进行试验，发现，灵敏度较差，无法满足临床中对灵敏度小于1ng/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min)，无法达到快速检验的要求。

发明内容

为了克服现有技术存在的错误教导，解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种基于胶体金免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。

根据本发明的一方面，提供一种基于胶体金免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了降钙素抗体的金纳米颗粒的溶液，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，优选67.2nm-72.4nm；所述金纳米颗粒和抗体质量比在50：20–60，优选50：40-60。

具体来讲，所述试剂R2为PH值5.0-9.5，优选6.0-8.5的溶液。

进一步地，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.4％以内的PEG20000，稳定剂为重量体积比2％以内的BSA，蔗糖的重量体积比为20％以下，甘油的重量体积比为20％以下。

作为优选，上述R2为含有粒径为72.4±1.5nm且标记了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的金纳米颗粒、重量体积比20％蔗糖、重量体积比0.2％PEG20000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油的，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗粒和抗体的重量比为50：40-60。

更进一步地，所述基于胶体金免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒还包括起缓冲和稳定作用的试剂R1，所述试剂R1为含有重量体积比0.2％BSA、重量体积比0.1％的NaN3和重量体积比0.05％Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。在本发明的试剂盒中，发明点主要在试剂R2，试剂R1也可以使用现有免疫比浊法中检测试剂盒的试剂R1。

上述试剂R2通过如下方法制备：

制备金纳米颗粒；

将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液；

偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂；

2800rpm离心2小时；

离心沉淀用含重量体积比20％蔗糖、重量体积比0.2％PEG20000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油，pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬，调整浓度至OD_540nm为0.2。

抗体的活性容易受到蛋白酶的分解、高温变性、渗透压等影响，可加入稳定剂来稳定抗体的结构和活性。所述稳定剂可以是蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；其中，所述蛋白质优选牛血清白蛋白(BSA)或明胶；所述糖可以是单糖、二糖或者多糖，其中，单糖优选甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖；二糖优选乳糖和/或蔗糖；多糖优选海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种；所述无机盐优选卤素碱金属和碱土金属的无机盐，更优选氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。

本发明的试剂盒中，试剂R2还可以加入促凝剂，以增加抗原抗体反应速率。

本发明所提供试剂盒中R2可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种缓冲液体系；优选磷酸盐缓冲液体系。

本发明至少实现了如下有益效果：

本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，稳定性好的特点，反应时间短，显色反应时间小于30s，平衡时间小于2min，可用于检测血清或血浆中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量，适用于临床全自动生化分析仪。本发明试剂盒检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的灵敏度可以达到25ug/L，检测线性范围达0.0～8.0mg/L，检测上限可达8.0mg/L。

本发明试剂盒反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。

本发明的试剂盒采用胶体金标记抗体，降低了胶体金免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制造成本，具有较大的市场竞争力。

附图说明

图1：本发明实施例1-7检测的标准曲线。

图2：本发明实施例9-15检测的标准曲线。

具体实施方式

以下，将详细说明本发明的具体实施例，以便本领域技术人员能够更详细地理解本发明。

金纳米颗粒以类似胶体状态存在，又称胶体金。

本发明所提供基于胶体金免疫比浊法的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒中，试剂R1可以使用现有技术中免疫比浊法检测试剂盒中的试剂R1，即已有的商用品。具体来讲，试剂R1可以是含有0.2％BSA(w/v)作为稳定剂、0.1％NaN3(w/v)作为防腐剂和0.05％Tween20(w/v)作为促凝剂的，50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)，是一种促使抗原位点暴露促进抗原抗体反应的缓存液。

以下各实施例仅制备试剂R2。

实施例1

本实施例试剂R2的制备分为三步，首先制备胶体金溶液，然后将抗体偶联到金纳米颗粒上，最后和缓冲盐、促凝剂和防腐剂等混溶成完整的体系。

具体过程如下：

1)50nm的胶体金的制备按如下步骤：

在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入500ml超纯水；

加入5ml浓度为1％(w/v)氯金酸，600rpm左右高速搅拌，并加热至溶液沸腾，然后迅速将6ml浓度为1％(w/v)柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌10min，溶液颜色先变黑色，然后逐渐变紫红色；

关闭加热开关并继续搅拌10min，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到原体积500ml；

使用透射电镜观察制得的胶体金颗粒的大小，对1000粒进行统计后直径约为50.4±1.2nm，超滤除掉小分子后备用。

2)将抗体偶联到金纳米颗粒上，具体过程如下：

将待标记的抗体移入透析袋内，在10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中透析，以除去抗体溶液中的其他小分子物质；

透析后的抗体转移到离心管内，15000rpm离心60min，收集上清；

在紫外-可见分光度计上测量溶液OD_260nm吸收值，计算出溶液中抗体的浓度，并用10mM磷酸盐缓冲液将抗体稀释至1mg/ml(w/v)；

取10支1.5毫升的离心管，加入1毫升制备好的胶体金溶液；

用10％的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH9；

将1、2、4、8、10、20、40、60、80、100ul的抗体分别加到上述10支离心管中，震荡30分钟，此时每支试管中金纳米颗粒和抗体的质量比分别为50：1、50：2、50：4、50：8、50：10、50：20、50：40、50：60、50：80、50：100；

向上述溶液中加入100ul浓度为10％的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管，发现在金纳米颗粒和抗体的质量比达到50：100时，有颜色改变和少量的沉淀析出，这表明当比例达50：100时，是标记蛋白的最大需求量，金纳米颗粒和抗体的质量比小于50：100无颜色改变和无沉淀析出，；

根据以上结果，将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10％的碳酸钾调整溶液的pH值至9；

将小于50ml的抗体加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，在此过程中抗体同纳米颗粒在库仑力和范德华力的作用下，突破胶体颗粒表面的水化层实现接触，在静电力和范德瓦尔德力的相互作用，胶体颗粒同蛋白质分子实现偶联；

3)试剂R2的配制按如下步骤进行：

在偶联后的胶体金溶液中加入一定量的BSA作为稳定剂，终浓度为1％(w/v)，搅拌5min使之完全溶解；

在上述溶液中加入一定量的PEG20000，终浓度为0.2％(w/v)，搅拌10分钟；

将上述溶液移至离心管中，用2800rpm离心2h，弃上清，保留沉淀；

用浓度为20％蔗糖作为稳定剂、0.2％PEG20000作为促凝剂、0.5％BSA作为稳定剂、和5％甘油作为稳定剂的10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)重悬沉淀物，调整浓度至OD_540nm为0.2；

得到R2溶液，分装备用。

实施例2

实施例2与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例2制备的胶体金颗粒粒径为55nm。

制备55nm颗粒加入还原剂1％柠檬酸钠为5.6ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为56.2±1.5nm。

实施例3

实施例3与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例3制备的胶体金颗粒粒径为62.2nm。

制备62.2nm颗粒加入还原剂1％柠檬酸钠为5.4ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为62.2±1.1nm。

实施例4

实施例4与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例4制备的胶体金颗粒粒径为67nm。

制备67nm颗粒加入还原剂1％柠檬酸钠为5.2ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为67.2±1.5nm。

实施例5

实施例5与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例5制备的胶体金颗粒粒径为72nm。

制备72nm颗粒加入还原剂1％柠檬酸钠为5.1ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为72.4±1.5nm。

实施例6

实施例6与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例6制备的胶体金颗粒粒径为79nm。

制备79nm颗粒加入还原剂1％柠檬酸钠为4.9ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为79.1±1.6nm。

实施例7

实施例7与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例7制备的胶体金颗粒粒径为83nm。

制备83nm颗粒加入还原剂1％柠檬酸钠为4.7ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为83.5±1.6nm。

实施例8

基于胶体金免疫比浊的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的临床使用效果测定：

(1)本发明试剂盒的测试条件及参数如下

a)测定步骤：先加入240ul试剂R1，然后加入3ul样本，37℃孵育5min后加入60ul试剂R2，在540nm波长测量吸光度，三秒后读取第一点数据，反应5分钟后读取另一点，得到吸光度值的差值。

b)计算方法：6点定标法，以样条函数为计算模式。根据吸光度与参考血清的值做工作曲线，样品含量可根据其吸光度值在工作曲线上算出。

(2)检测标准曲线

通过本发明的方法，采用日立7180型自动分析仪检测6种不同含量的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白参考品，根据结果做标准曲线，X轴表示中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量，Y轴表示吸光度差值。

(3)通过上述的方法对上述实施例中制备的7个试剂盒测定标准曲线，分析最优粒径。结果如下：

金纳米颗粒大小为50.4nm时，y＝-0.0013x+1.5871，R²＝0.3449；

金纳米颗粒大小为56.2nm时，y＝-0.0058x+1.6005，R²＝0.9316；

金纳米颗粒大小为62.2nm时，y＝-0.1311x+1.5892，R²＝0.9878；

金纳米颗粒大小为67.2nm时，y＝-0.1337x+1.5913，R²＝0.989；

金纳米颗粒大小为72.4nm时，y＝-0.1376x+1.5998，R²＝0.9923；

金纳米颗粒大小为79.1nm时，y＝-0.1341x+1.501，R²＝0.955；

金纳米颗粒大小为83.5nm时，y＝-0.1107x+1.0179，R²＝0.3897。

(4)对上述结果，进行灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性分析。

灵敏度定义为测试体系对不同浓度的标准样品测试值的差异，差异越大表明约灵敏，没有差异则表明体系过于稳定，不能引起比浊改变。灵敏度可以通过拟合后的标准曲线的斜率的绝对值表征。

线性相关系数即相关性方程的R值，表明试验测试结果和拟合曲线的重合度，R值越高，表明线性越好。

线性范围即测试对应的结果中呈线性关系的区间，线性范围宽有利于测试更大范围浓度的样品。

稳定性是指在该体系中胶体金稳定存在、不发生团聚或沉淀的程度，一般来讲颗粒越大越容易聚沉，引起浊度的改变，颗粒越小越稳定，对待测试剂浓度变化不敏感，即灵敏度差。将待测试剂放置在40℃的环境中，以稳定性时间的时间长短来表示稳定性的好坏，测试时间是12月。

通过上述四个参数的对比，我们可以从中选出最适合的粒径范围，将各种金颗粒尺寸条件下的结果汇总于表1。

表1

综合比较以上结果，可发现，粒径大于等于62.2nm的纳米颗粒，灵敏度才能达到要求，可以选择62.2nm-79.1nm胶体金纳米颗粒，而大于83.5nm的胶体金颗粒由于太大，稳定性较差。

实施例9

试剂R2的制备过程参照实施例1。根据实施例8的测试结果，选择具有较优性质的72.4nm的胶体金纳米颗粒作为本体系，改变胶体表面偶联的抗体量。将抗体偶联到直径约为72.4±1.5nm金纳米颗粒上，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：100。

实施例10

与实施例9的差别在于，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：80。

实施例11

与实施例9的差别在于，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：60。

实施例12

与实施例9的差别在于，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：40。

实施例13

与实施例9的差别在于，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：20。

实施例14

与实施例9的差别在于，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：10。

实施例15

与实施例9的差别在于，金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50：1。

实施例16

采用实施例8中的方法，对实施例9至15中制备的试剂盒进行分析比较。测试结果如下。

金颗粒的量：抗体的量＝50：100时，y＝-0.1018x+0.9597，R²＝0.3574；

金颗粒的量：抗体的量＝50：80时，y＝-0.1211x+1.1445，R²＝0.5305

金颗粒的量：抗体的量＝50：60时，y＝-0.1302x+1.5184，R²＝0.9722

金颗粒的量：抗体的量＝50：40时，y＝-0.1346x+1.6089，R²＝0.9781

金颗粒的量：抗体的量＝50：10时，y＝-0.0066x+1.5937，R²＝0.6457

金颗粒的量：抗体的量＝50：1时，y＝-0.0002x+1.58516，R²＝0.04419

将上述七种试剂盒结果汇总比较到表2：

表2

综合以上结果，金纳米颗粒和抗体浓度之比在50：20-60之间时灵敏度高、线性关系好，同时线性范围广以及稳定性较好，可以选择，更优选是50：40-60。

实施例17

通过实施例8和实施例16，我们已经优化出了试剂盒R2的最佳条件，现在对R2中稳定剂、促凝剂的条件进行优化。

选用金纳米颗粒为72.4±1.5nm，金纳米颗粒和抗体的比例在50：60，试剂R2选择为磷酸盐缓冲液溶液，分别选择pH4.0、5.0、6.0、7.2、8.5、9.5、10.0七个点，表3为三个条件下灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性试验结果。

表3

从上表中得数据可以看出，在pH为4.0和10.0时，该试剂盒无论在灵敏度、线性相关系数、线性范围还是稳定性上都不满足试验室的要求，因此pH的边界范围是5.0-9.5，其中在6.0-8.5范围内灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性试验结果最好，且数值相近，表明该范围内pH影响不显著。

同上，选择金纳米颗粒为72.4±1.5nm，金纳米颗粒和抗体的比例在50：60，促凝剂选择PEG20000，浓度的范围为0～0.4％(w/v)，选择0、0.1％、0.2％和0.4％4个水平，见表4。

表4

从上表中得数据可以看出，在凝剂选择PEG20000在0～0.4％(w/v)范围内灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性试验结果相近，表且在0.2％最优。

同上，选择金纳米颗粒为72.4±1.5nm，金纳米颗粒和抗体的比例在50：60，稳定剂选择BSA、蔗糖和甘油，其中BSA浓度分别选择0、0.5％、和1％和2％4个水平；蔗糖选择0、5％、10％和20％4个水平；甘油选择0、5％、10％和20％4个水平；对以上进行3因素和4水平的正交试验，建立L16(45)正交表，进行16次试验，从中选出最优条件，见表5和表6。

表5：稳定剂的3因素和4水平表

表6：正交试验方案及正交试验结果

通过以上的正交试验，最佳的灵敏度和精密度以及线性范围出现在，金纳米颗粒为72.4±1.5nm，金纳米颗粒和抗体的比例在50：40-60，10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中含有20％蔗糖作为稳定剂、0.2％PEG20000作为促凝剂、0.5％BSA作为稳定剂和5％甘油作为稳定剂。

实施例18

试剂R2金纳米颗粒为72.4±1.5nm，金纳米颗粒和抗体的比例在50：60，10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中含有20％蔗糖作为稳定剂、0.2％PEG20000作为促凝剂、0.5％BSA作为稳定剂和5％甘油作为稳定剂。

(1)灵敏度试验

上述试剂盒的最佳灵敏度达25ug/L。

(2)线性测定

取病人的异常高值血清1份(①)和正常人血清1份(⑤)，取等体积的①和⑤混合构成③，取等体积的①和③混合构成②，取等体积的③和⑤混合构成④。测定①～⑤血清中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量。测定结果表明，上述试剂盒血清稀释效应不明显，具有良好的线性。

(3)精密度试验

用检测蛋白定值质控、正常人混合血清和肾功异常病人混合血清一份，连续测定20天，每天测定三次，计算日内及日间精密度。测定结果表明定值质控的平均值为2.8mg/L,其日内不精密度为2.2％，日间不精密度为1.8％。正常人混合血清的平均值为0.26mg/L，日内不精密度为3.1％，日间不精密度为2.5％。肾功异常病人血清的平均值为5.7mg/L,日内不精密度为1.08％，日间不精密度为0.76％。这些测定结果表明此试剂盒的精密度可满足临床要求。

(4)干扰试验

在正常人血清中各自添加一定量的胆红素、牛血红蛋白、脂肪乳剂和类风湿因子，使其达到表7中所示的浓度，同时加入同等体积的去离子水作为无干扰物血清，同时测定这些标本的浓度，结果见表7。表7的结果表明以干扰程度为10％作为该测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中抗坏血酸在4.5g/L，胆红素在500M以下，血红蛋白在5g/L以下，脂肪乳剂在0.3％以下，肝素钠在62.5U/ml以下，类风湿因子在100IU/mL以下，不影响测定，结果见表7。

表7

尽管已参照优选实施例表示和描述了本发明，但本领域技术人员应该理解，在不脱离由权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对这些实施例进行各种修改和变换。

Claims (10)

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50：20–60。 

2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为67.2nm-72.4nm。 

3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50：40-60。 

4.权利要求2或3任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值5.0-9.5的溶液。 

5.权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值6.0-8.5的溶液。 

6.权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，所述稳定剂为蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；所述蛋白质为牛血清白蛋白或明胶；所述糖为单糖、二糖或者多糖；所述无机盐为卤素碱金属和碱土金属的无机盐；试剂R2为是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种的组合。 

7.权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述促凝剂为重量体积比0.4％以内的PEG20000，所述稳定剂为重量体积比2％以内的牛血清白蛋白，所述蔗糖的重量体积比为20％以下，所述甘油的重量体积比为20％以下。 

8.权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为含有粒径为72.4±1.5nm且标记了中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的金纳米颗粒、重量体积比20％蔗糖、重量体积比0.2％PEG20000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗粒和抗体的重量比为50：40-60。 

9.权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试剂R1，所述试剂R1为含有重量体积比0.2％BSA、重量体积比0.1％的NaN3和重量 体积比0.05％Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。 

10.制备权利要求1-9任意一项所述试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括： 

制备金纳米颗粒； 

将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液； 

偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂； 

2800rpm离心2小时； 

离心沉淀用含重量体积比20％蔗糖、重量体积比0.2％PEG20000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油，pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬，调整浓度至OD_540nm为0.2。