CN111912990A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,涉及生物技术领域。所述检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:所述试剂R1的成分如下:缓冲液、无机盐离子、纳米二氧化锡、促凝剂、表面活性剂、防腐剂;试剂R2的成分和含量如下:缓冲液、羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒、鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体包被的胶乳颗粒、纳米二氧化锡、表面活性剂、防腐剂。本发明能够有效增强分析灵敏度和抗干扰能力。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外检测技术领域,具体涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是由中性粒细胞和某些上皮细胞如肾小管所表达和分泌的微量蛋白,其分子量约为25000Da,是由178个氨基酸组成的分泌型糖蛋白,为载脂蛋白家族新成员。目前研究发现,缺血性或肾毒性肾损伤时,NGAL由肾脏大量表达,并被释放到血液和尿液中,血中NGAL含量在肾损伤发生后2小时内升高,使之成为早期且敏感的肾损伤标志物。
NGAL是肾损伤早期的生物标志,不仅仅存在于中性粒细胞中,还存在于其他一些组织细胞,特别是特定的上皮细胞内。NGAL浓度偏高通常出现在以下情况中:心血管手术患者,病危人员,脓血性或出血性休克,肾移植,静脉X线造影剂的反应和肾毒性治疗反映。50%以上的病人都会出现一定程度的急性肾功能衰竭,通常大病后期出现时的死亡率大大增加。
临床中对于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测主要采用胶乳免疫比浊法、采用免疫层析法、胶体金法等。其中免疫层析法操作繁琐,灵敏度低,检测结果多为定性;胶乳免疫比浊法由于试剂制备的复杂性使得其抗干扰能力和稳定性较差,灵敏度较低。
发明内容
本发明提供一种在能够有效增强分析灵敏度和抗干扰能力的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
为解决上述技术问题,本发明提供技术方案如下:
本发明提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,其中:
所述试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
进一步的,所述纳米二氧化锡的制备方法如下:
步骤1:向浓度为80mM的四氯化锡溶液中加入冰醋酸,在50-60℃条件下搅拌,并滴加0.4mol/L的氨水,得到氢氧化锡沉淀;
步骤2:使用纯化水清洗所述氢氧化锡沉淀,之后加热至80℃,得到氢氧化锡水溶胶;
步骤3:向所述氢氧化锡水溶胶中加入促凝剂,进行干燥处理后得到二氧化锡粉末;
步骤4:碾磨所述二氧化锡粉末,并将碾磨后的二氧化锡粉末置于550-600℃环境下煅烧3-5小时,最终制得纳米二氧化锡。
进一步的,所述步骤1中,氢氧化锡沉淀的pH值为1.0-2.0;所述步骤2中,所述氢氧化锡水溶胶的pH值为1.0-2.0。
进一步的,所述羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒直径为50-100nm,所述鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体包被的胶乳颗粒直径为200-300nm。
进一步的,所述表面活性剂的成分如下:
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠 5-15g/L
三氟丙基甲基环三硅氧烷 5-10g/L
使用无机盐离子调整pH至7.5-8.5。
进一步的,所述缓冲液为25℃,pH为7.5-8.5的EPPS-CABS、MES、Tris、磷酸盐中的一种或多种。
进一步的,所述防腐剂为吡硫钠、硫柳汞、PC300、叠氮化钠、苯酚中的一种或多种。
进一步的,所述无机盐离子为氯化钙、氯化锂、氯化钠、氯化镁中的一种或多种。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒采用优化的胶乳增强免疫比浊法,并且通过添加纳米二氧化锡(SnO2)颗粒,有效增强了试剂的分析灵敏度和抗干扰能力。本发明的试剂盒可以有效检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量,具有灵敏度高,稳定性好、线性范围宽等优点。
附图说明
图1为本发明的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒中实施例1-3与对比例1-3的试剂盒的稳定性对比曲线图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合具体实施例和附图进行详细描述。
实施例1:
本实施例的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,纳米二氧化锡的制备方法如下:
步骤1:向浓度为80mM的四氯化锡溶液中加入冰醋酸,在50-60℃条件下搅拌,并滴加0.4mol/L的氨水,得到氢氧化锡沉淀;
本步骤中,最终得到的氢氧化锡沉淀的pH值为1.0。
步骤2:使用纯化水清洗三遍氢氧化锡沉淀,之后加热至80℃,然后加入0.2mol/L的柠檬酸调整pH值为1.0,得到氢氧化锡水溶胶;
步骤3:向所述氢氧化锡水溶胶中加入促凝剂PEG8000,进行干燥处理后得到二氧化锡粉末;
步骤4:碾磨所述二氧化锡粉末,并将碾磨后的二氧化锡粉末置于550-600℃环境下煅烧4小时,最终制得纳米二氧化锡.
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠复配表面活性剂的成分如下:
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠 5g/L
三氟丙基甲基环三硅氧烷 5g/L
使用盐酸调整pH至7.5。
本实施例中,羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法如下:
取66nm羧基胶乳颗粒2mL,加入8mL浓度为0.1mol/L的EPPS-CABS(pH值为8.25,25℃)缓冲液,30℃振荡2小时,然后加入羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体10mg,调整振荡速率200r/min,温度45℃,振荡10小时。然后,加入0.12mL封闭剂(组分如下:BSA 25g/L,乙二胺20g/L),调整振荡速率150r/min,温度35℃,振荡24小时。然后,超声40分钟(Φ6变幅杆,功率60%),最终所得溶液即为羊抗人多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液。
鼠抗人NGAL单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法如下:
取225nm羧基胶乳颗粒1.5mL,加入8.5mL浓度为0.1mol/L的EPPS-CABS(pH值为8.25,25℃)缓冲液,30℃振荡2小时,然后加入鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体5mg,调整振荡速率200r/min,温度45℃,振荡10小时。然后,加入0.1mL封闭剂(组分如下:BSA 25g/L,乙二胺20g/L),调整振荡速率150r/min,温度35℃,振荡24小时。然后,超声40分钟(Φ6变幅杆,功率60%),最终所得溶液即为鼠抗人单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液。
本实施例的检测方法:采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪(如日立7180全自动分析仪、OLYMPUS AU640等),利用终点法进行测定,将试剂R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上,在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本,操作如表1。
表1
计算:中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量(ng/mL)=(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准。
实施例2:
本实施例的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,纳米二氧化锡的制备方法如下:
步骤1:向浓度为80mM的四氯化锡溶液中加入冰醋酸,在50-60℃条件下搅拌,并滴加0.4mol/L的氨水,得到氢氧化锡沉淀;
本步骤中,最终得到的氢氧化锡沉淀的pH值为1.5。
步骤2:使用纯化水清洗三遍氢氧化锡沉淀,之后加热至80℃,然后加入0.2mol/L的柠檬酸调整pH值为1.5,得到氢氧化锡水溶胶;
步骤3:向所述氢氧化锡水溶胶中加入促凝剂PEG8000,进行干燥处理后得到二氧化锡粉末;
步骤4:碾磨所述二氧化锡粉末,并将碾磨后的二氧化锡粉末置于550-600℃环境下煅烧4小时,最终制得纳米二氧化锡.
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠复配表面活性剂的成分如下:
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠 10g/L
三氟丙基甲基环三硅氧烷 7g/L
使用氢氧化钠调整pH至8.0。
本实施例中,羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法如下:
取85nm羧基胶乳颗粒3mL,加入10mL浓度为0.1mol/L的EPPS-CABS(pH值为8.25,25℃)缓冲液,30℃振荡2小时,然后加入羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体20mg,调整振荡速率200r/min,温度45℃,振荡10小时。然后,加入0.3mL封闭剂(组分如下:BSA 25g/L,乙二胺20g/L),调整振荡速率150r/min,温度35℃,振荡24小时。然后,超声40分钟(Φ6变幅杆,功率60%),最终所得溶液即为羊抗人多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液。
鼠抗人NGAL单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法如下:
取260nm羧基胶乳颗粒2mL,加入10mL浓度为0.1mol/L的EPPS-CABS(pH值为8.25,25℃)缓冲液,30℃振荡2小时,然后加入鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体10mg,调整振荡速率200r/min,温度45℃,振荡10小时。然后,加入0.2mL封闭剂(组分如下:BSA 25g/L,乙二胺20g/L),调整振荡速率150r/min,温度35℃,振荡24小时。然后,超声40分钟(Φ6变幅杆,功率60%),最终所得溶液即为鼠抗人单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液。
检测方法同实施例1的检测方法。
实施例3:
本实施例的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R2的成分和含量如下:
其中,纳米二氧化锡的制备方法如下:
步骤1:向浓度为80mM的四氯化锡溶液中加入冰醋酸,在50-60℃条件下搅拌,并滴加0.4mol/L的氨水,得到氢氧化锡沉淀;
本步骤中,最终得到的氢氧化锡沉淀的pH值为2。
步骤2:使用纯化水清洗三遍氢氧化锡沉淀,之后加热至80℃,然后加入0.2mol/L的柠檬酸调整pH值为2,得到氢氧化锡水溶胶;
步骤3:向所述氢氧化锡水溶胶中加入促凝剂PEG8000,进行干燥处理后得到二氧化锡粉末;
步骤4:碾磨所述二氧化锡粉末,并将碾磨后的二氧化锡粉末置于550-600℃环境下煅烧4小时,最终制得纳米二氧化锡。
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠复配表面活性剂的成分如下:
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠 15g/L
三氟丙基甲基环三硅氧烷 10g/L
使用盐酸调整pH至8.5。
本实施例中,羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法如下:
取100nm羧基胶乳颗粒4mL,加入20mL浓度为0.1mol/L的EPPS-CABS(pH值为8.25,25℃)缓冲液,30℃振荡2小时,然后加入羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体45mg,调整振荡速率200r/min,温度45℃,振荡10小时。然后,加入0.8mL封闭剂(组分如下:BSA 25g/L,乙二胺20g/L),调整振荡速率150r/min,温度35℃,振荡24小时。然后,超声40分钟(Φ6变幅杆,功率60%),最终所得溶液即为羊抗人多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液。
鼠抗人NGAL单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法如下:
取300nm羧基胶乳颗粒3mL,加入10mL浓度为0.1mol/L的EPPS-CABS(pH值为8.25,25℃)缓冲液,30℃振荡2小时,然后加入鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体20mg,调整振荡速率200r/min,温度45℃,振荡10小时。然后,加入0.5mL封闭剂(组分如下:BSA 25g/L,乙二胺20g/L),调整振荡速率150r/min,温度35℃,振荡24小时。然后,超声40分钟(Φ6变幅杆,功率60%),最终所得溶液即为鼠抗人单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液。。
检测方法同实施例1的检测方法。
对比例1:
本对比例的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒包试剂R1和试剂R2,其中,
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液和鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法同实施例1。
检测方法同实施例1的检测方法。
对比例2:
本对比例的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2,其中:
试剂R1的成分和含量如下:
试剂R2的成分和含量如下:
羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液和鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体包被的胶乳颗粒溶液的制备方法同实施例2。
检测方法同实施例1的检测方法。
对比例3:
本对比例采用市场常见的国家食品药品监督管理局认可的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)检测试剂盒。该试剂盒未采用双胶乳颗粒体系,也未添加纳米二氧化锡(SnO2)颗粒和马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠复配表面活性剂溶液。
精密度试验:
取具有溯源性的高值质控物(靶值215ng/mL)、低值质控物(靶值82ng/mL)各一份,分别用实施例1-3和对比例1-3配制试剂盒,进行对照检测,对每份质控物进行20次检测,将共20次检测结果计算平均值、标准差和变异系数,结果见表2。
表2-1高值质控物精密度试验结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
平均值(X) | 217.44 | 216.10 | 215.76 | 212.90 | 213.52 | 214.62 |
标准偏差(S) | 1.761 | 1.621 | 1.769 | 7.537 | 7.857 | 9.357 |
变异系数CV | 0.81% | 0.75% | 0.82% | 3.54% | 3.68% | 4.36% |
表2-2低值质控物精密度试验结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
平均值(X) | 83.48 | 82.16 | 82.90 | 81.10 | 83.72 | 81.26 |
标准偏差(S) | 1.461 | 1.487 | 1.509 | 3.990 | 4.077 | 4.608 |
变异系数CV | 1.75% | 1.81% | 1.82% | 4.92% | 4.87% | 5.67% |
由表2-1和表2-2可以看出,与对比例1-3相比,实施例1-3配制的检测试剂盒的检测数值更接近靶值,标准偏差和变异系数均明显偏小,具有更高的批内精密度。
准确度试验:
取具有溯源性的高值质控物(靶值215ng/mL)、低值质控物(靶值82ng/mL)各一份,分别用实施例1-3和对比例1-3配方配制试剂,制得中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)检测试剂盒进行对照检测,各检测5次,计算平均值,与质控物靶值进行对照。结果见3。
表3-1高值质控物准确度试验结果
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
最大值 | 215.72 | 215.57 | 215.53 | 216.10 | 216.48 | 226.08 |
最小值 | 214.33 | 214.62 | 214.14 | 208.69 | 202.15 | 206.64 |
平均值 | 215.24 | 215.43 | 215.53 | 210.70 | 209.70 | 222.55 |
表3-2低值质控物准确度试验结果
由表3-1和表3-2可以看出,与对比例1-3相比,实施例1-3配制的检测试剂盒的检测数值更接近靶值,平均值与靶值的差值在1以内,具有更高的准确度。
灵敏度试验:
取具有溯源性的校准品由低到高稀释出7个浓度样本,分别用实施例1-3和对比例1-3配制的检测试剂盒进行检测,将检测结果与理论浓度相比较,结果见表4所示。
表4灵敏度试验结果
理论浓度 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
1ng/mL | 1.10 | 0.95 | 1.10 | 0.25 | 0.32 | 0.20 |
5ng/mL | 5.67 | 4.64 | 5.67 | 3.03 | 3.02 | 2.02 |
25ng/mL | 26.27 | 25.24 | 26.78 | 20.09 | 20.60 | 19.57 |
50ng/mL | 52.53 | 54.08 | 50.47 | 48.41 | 45.84 | 46.35 |
2000ng/mL | 2035.15 | 2037.21 | 2034.12 | 2035.06 | 2013.09 | 2082.66 |
3000ng/mL | 3062.36 | 3073.39 | 3078.24 | 2998.32 | 2989.75 | 2986.39 |
5000ng/mL | 5060.82 | 5052.06 | 5063.39 | 4383.17 | 4342.48 | 4229.18 |
从表4中可以看出,在样本浓度低至1ng/mL时,对比例1-3检测值为0.20~0.32,而实施例1-3配制的检测试剂盒仍可以检测出样本的准确值;并且与对比例1-3相比,实施例-3配制的检测试剂盒检测接近线性下限的低值样本(1-25ng/mL)时的准确度更高。另外,在样本浓度在线性上限5000ng/mL时,对比例1-3的检测值在4229.18~4383.17ng/mL之间,测试值明显偏低,而实施例-3配制的检测试剂盒仍可以检测出样本的准确值,这表明实施例1-3配制的检测试剂盒拥有更高的分析灵敏度、准确度及更宽的线性范围。
稳定性试验:
对实施例1-3和对比例1-3配置的检测试剂盒,分别均匀分装13组,每组的试剂量为R1为20mL,R2为5mL。将所有分装的检测试剂盒放置到2-8℃冰箱中,每月的同一天取出一组检测试剂盒中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白质控品(靶值为82ng/mL)进行检测,检测结果如图1所示。
由图1可知,在保存13个月时,对比例1-3配置的检测试剂盒的检测数值为63.54-66.00,与靶值相差16.00-18.46,并且检测值呈现明显的随储存时间延长而降低趋势;而实施例1-3配置的检测试剂盒的检测数值为81.04-83.51,与靶值相差0.51-1.51。这表明在2-8℃储存条件下实施例1-3配置的检测试剂盒拥有更高的稳定性。
综上所述,本发明通过优化中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体包被胶乳颗粒,采用双颗粒胶乳颗粒联用,分别包被多抗和单抗,有效提高了试剂的线性和分析灵敏度;添加马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠复配表面活性剂溶液,可以促进并维持抗体稳定,防止体系浑浊,显著增强了试剂的抗干扰能力;此外,添加的纳米二氧化锡(SnO2)特殊的纳米效应和荷电特性使其可以有效提高试剂中胶乳颗粒的分散度和稳定性,保证了试剂具有较好的检测灵敏度和稳定性。综上所述,本发明检测试剂盒通过以上措施,优化了反应体系,极大的提高了试剂的稳定性。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述纳米二氧化锡的制备方法如下:
步骤1:向浓度为80mM的四氯化锡溶液中加入冰醋酸,在50-60℃条件下搅拌,并滴加0.4mol/L的氨水,得到氢氧化锡沉淀;
步骤2:使用纯化水清洗所述氢氧化锡沉淀,之后加热至80℃,得到氢氧化锡水溶胶;
步骤3:向所述氢氧化锡水溶胶中加入促凝剂,进行干燥处理后得到二氧化锡粉末;
步骤4:碾磨所述二氧化锡粉末,并将碾磨后的二氧化锡粉末置于550-600℃环境下煅烧3-5小时,最终制得纳米二氧化锡。
3.根据权利要求2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述步骤1中,氢氧化锡沉淀的pH值为1.0-2.0;所述步骤2中,所述氢氧化锡水溶胶的pH值为1.0-2.0。
4.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体包被的胶乳颗粒直径为50-100nm,所述鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体包被的胶乳颗粒直径为200-300nm。
5.根据权利要求1至4中任一所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂的成分如下:
马来松香辛基酚聚氧乙烯醚双酯羧酸钠 5-15g/L
三氟丙基甲基环三硅氧烷 5-10g/L
使用无机盐离子调整pH至7.5-8.5。
6.根据权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为25℃,pH为7.5-8.5的EPPS-CABS、MES、Tris、磷酸盐中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为吡硫钠、硫柳汞、PC300、叠氮化钠、苯酚中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述无机盐离子为氯化钙、氯化锂、氯化钠、氯化镁中的一种或多种。
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