CN113121681B - 一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于猪疾病免疫防控技术领域，具体涉及一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其应用。本发明将炎性因子与PEDV结合制备二联卵黄抗体，具体的为，通过基因工程手段在体外大量表达PEDV‑S1的22‑380AA肽段和TNF‑α，将纯化的两种重组蛋白与疫苗佐剂乳化后制作二联疫苗，免疫蛋鸡制备抗炎抗猪流行性腹泻卵黄抗体。本发明制备的卵黄抗体兼具抗炎和抗猪流行性腹泻病毒的作用，效果优于单一抗猪流行性腹泻病毒抗体防治效果，可通过将卵黄抗体直接口服或添加到猪饲料中的方式实现疾病防治。

Description

一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其应用
技术领域
本发明属于猪疾病免疫防控技术领域，涉及一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其应用，具体涉及一种PEDV-S1和TNF-α的二联卵黄抗体、其制备方法及在防治猪流行性腹泻产品开发中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的猪接触性肠道传染病，其特征为初生仔猪呕吐、腹泻、脱水。临床症状与猪传染性胃肠炎极为相似。从2010年下半年起，全国大部分地区的猪场开始大规模爆发PED，死亡仔猪有上千万头。猪流行性腹泻流行广泛，全国各地均出现严重的PED流行；主要感染10 日龄内仔猪，1-5日龄仔猪感染PEDV后出现呕吐、腹泻，在1-2天后脱水死亡，死亡率在 50% 以上；传统的疫苗无论是弱毒苗还是灭活苗保护效果都不佳，部分猪场采用返饲的方法控制，效果也不理想。
PEDV属于RNA病毒，具有容易变异的特性，发生疫情的猪场往往多种毒株并存，PEDV新毒株从S（纤突蛋白）基因到ORF3基因的同源性与原CV777毒株比较均存在一定程度上的变异。美国流行毒株与2012年中国安徽地区流行毒株的同源性达到99.5%。另外，PEDV感染免疫后其抗体持续时间较短，不能对母猪和仔猪提供坚实的免疫保护。因此，PEDV毒株的变异、传统的CV777毒株疫苗保护力差及抗体保护时间短为PED的防治带来了很大挑战。
目前对PED防控的主要方法是隔离、封锁发病猪/猪舍和返饲，这二种方法对于防控PED来说是迫不得已的办法，首先隔离、封锁发病猪/猪舍等安全措施只能保护未发病猪群免受感染，但其效果有很大的不确定性；其次返饲不能保护母猪不感染PEDV，另外返饲还可能带来其他风险，如其他疾病的交叉感染等。目前尚无有效的疫苗或生物制剂防治该疾病，养殖者常常对该病的暴发束手无策，给养猪业造成了重大的经济损失。
卵黄抗体是用特定抗原多次免疫产蛋母鸡，使机体产生相应的特异性抗体，并转移、贮存在卵黄中，经提取纯化的免疫球蛋白卵黄抗体，也称卵黄免疫球蛋白(Egg yolkimmunogbhin，IgY)。卵黄抗体具有产量高、性能稳定、安全性高、易获得、适用性广等特点。IgY己被广泛应用于许多疾病的防治。在食品中的应用也已经非常广泛。在猪的病原中，目前报道制备卵黄抗体的主要是引起胃肠道疾病的病原，如产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒等。制备卵黄抗体可采用病毒或抗原基因全长作为免疫原免疫蛋鸡获得抗体，对于PEDV而言，由S基因（4152nt）编码的S蛋白（由1383个氨基酸组成）是主要的结构蛋白（分子量约为152KD），属于I型的膜糖蛋白，分S1亚基和S2亚基二部分；S1位于N端并参与细胞受体的结合，S2主要参与病毒与细胞的融合过程，已有研究表明其S1亚基具有较好的免疫原性和中和抗体表位。另外，研究发现，PED发病后可诱导大量的炎性细胞因子表达，造成“细胞因子风暴”，这是仔猪死亡的重要原因。炎性细胞因子是一类主要由免疫系统细胞生成的具有强大生物学效应的内源性多肽，可介导多种免疫反应。炎性细胞在体内过度表达可引起多器官衰竭的症状。研究发现，PEDV感染仔猪后会诱导多种细胞因子表达量升高，包括TNF-α、IL-1β、IFN-β、IL-6和IL-10等，其中TNF-α、IL-1β、IL-6为促炎细胞因子可以诱导严重的炎症反应。目前已有以PEDV或S1蛋白作为免疫原制备卵黄抗体的报道，然而具有抗炎作用的特异性防治猪流行性腹泻疾病卵黄抗体的研究及其在猪养殖中的应用研究目前均未见报道。
发明内容
针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其应用，具体提供了通过PEDV-S1和TNF-α二联抗原制备的卵黄抗体，使猪从短期的主动免疫转为长期持续的被动免疫，且使猪处于健康、免疫功能强的状态，从而达到长期保护猪免受病毒感染或及时清除病毒的目的，为猪流行性腹泻的防控提供了一种先进且行之有效的技术。
基于上述技术目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，所述卵黄抗体包括PEDV抗体及促炎因子抗体。
上述方案中，所述PEDV抗体的制备抗原为PEDV G2 毒株S1蛋白的22-380AA肽段。
上述方案中，所述促炎因子抗体的制备抗原为肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1（IL-1）家族系细胞因子。
进一步的，为TNF-α、IL-1β、IL-6中的一种。
更进一步的，为TNF-α。
本发明第二方面，提供第一方面所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法，所述制备方法为：通过基因工程手段获取PEDV S1蛋白的22-380AA肽段、TNF-α蛋白，调整S1和TNF-α最终的蛋白浓度为100μg/mL，与等体积的白油佐剂混合制成疫苗，对蛋鸡进行免疫得到免疫蛋，从所述免疫蛋中提取卵黄抗体。
所述PEDV S1蛋白的22-380AA肽段是以PEDV S1蛋白的全基因序列为模板，加入引物，PCR扩增S1蛋白22-380AA肽段基因，其序列如SEQ ID NO:3所示，构建重组质粒pGEX-4T-1-S1，转化到大肠杆菌，IPTG诱导表达制得；
所述引物序列为：
PEDV-S1(22-380)-F：5’-CTCGGATCCATGGATGTCACCAGGTGC-3’（SEQ ID NO:1）；
PEDV-S1(22-380)-R:5’-TATGCGGCCGCTTAGTAAGTATCCACTTTA-3’（SEQ ID NO:2）。
所述TNF-α蛋白是以猪肝脏提取的TNF-α序列为模板，加入引物，PCR扩增TNF-α基因，其序列如SEQ ID NO:6所示，构建重组质粒pGEX-4T-1-TNF-α，转化到大肠杆菌，IPTG诱导表达制得；
所述引物序列如下：
TNF-α-BamHI-F：5’-CTCGGATCCATGAGCACTGAGAGCATGA-3’（ SEQ ID NO:4）；
TNF-α-NotI-R：5’-TATGCGGCCGCTTACAGGGCAATGATCCCA-3’（ SEQ ID NO:5）。
所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法，具体步骤如下：
①抗原的制备：将pGEX-4T-1-S1和pGEX-4T-1-TNF-α重组大肠杆菌大量诱导表达，培养24h后收获培养基上清；采用NanoDrop2000 (Thermo Fisher) 分别测定S1和TNF-α蛋白浓度，-20℃保存；用无菌水分别调整S1和TNF-α最终的蛋白浓度为100μg/mL，将上述配制好的蛋白溶液作为水相，与等体积的白油佐剂混合，然后用均质机充分乳化20 min，制备成疫苗；
②免疫程序：用制备的疫苗分4次对开产前1个月左右的蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0 mL/只；
③制备卵黄稀释液：第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积比3-5:1混合稀释蛋黄液，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于30℃-37℃条件下预温1 h；
④提取卵黄蛋白：向蛋黄稀释液中加入终浓度为3-4%的PEG6000，充分搅拌均匀，静置4-6 h，充分反应；将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤；将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48 h；将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛灭活未知病毒并作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗病毒抗体的琼扩试验效价应不低于1:64；
⑤卵黄抗体分装：在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，即获得卵黄抗体成品，保存备用，保存温度为4-8℃。
本发明第三方面，提供第一方面所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体在制备防治猪流行性腹泻产品中的应用。
本发明第四方面，提供一种用于防治猪流行性腹泻的产品，其特征在于，所述产品为药物、饲料、饲料添加剂中的一种，所述产品包括第一方面所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体。
以上技术方案的有益效果是：
本发明在本领域首次成功制备具抗炎作用的PEDV卵黄抗体，精制后的卵黄抗体保护效果好，尤其是还具有抗炎、消炎的效果，总体效果优于市售的常规猪PEDV卵黄抗体，为PED治疗提供了新的治疗思路，能够显著推动养猪业的发展。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述 PEDV-S1基因PCR电泳图；
图2 为实施例1中所述PEDV-S1蛋白表达结果；
图3 为实施例2中所述TNF-α基因PCR电泳图；
图4为实施例2中所述 TNF-α蛋白表达结果；
图5为实施例3中所述卵黄抗体纯化图；
图5中，M为蛋白分子量标准，1为标准卵黄抗体，2为PEG6000沉淀后卵黄抗体，3为纯化后的卵黄抗体。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1 PEDV-S1基因在大肠杆菌中的表达
（1）PEDV-S1克隆及鉴定
以PEDV G2毒株（GenBank accession no. KU558701）S1蛋白的全基因序列为模板，以PEDV-S1(22-380)-F:5’-CTCGGATCCATGGATGTCACCAGGTGC-3’ ; PEDV-S1(22-380)-R:5’-TATGCGGCCGCTTAGTAAGTATCCACTTTA-3’，根据Q5®超保真 DNA 聚合酶说明书，进行PCR扩增，体系如下（50μL）：
Figure 399380DEST_PATH_IMAGE001
对反应体系进行充分混匀后，进行短暂低速离心后，进行PCR，反应条件如下：
Figure 30082DEST_PATH_IMAGE002
PCR扩增结束后对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示可扩增出一条1080bp的条带，扩增片段大小与预期结果一致（见图1）。
（2）重组pGEX-4T-1-PEDV-S1质粒的构建
参照试剂盒说明书对S1产物进行回收，对回收的S1片段及载体pGEX-4T-1进行BamHI和NotI双酶切（S1片段酶切体系见表1，pGEX-4T-1载体酶切体系见表2）。然后置于37℃水浴锅，酶切3h。
表1 S1片段酶切体系（50µL）
Figure 715141DEST_PATH_IMAGE003
表2 pGEX-4T-1载体酶切体系
Figure 332067DEST_PATH_IMAGE004
采用T4连接酶对酶切产物进行连接，体系为（20μL）
Figure 684551DEST_PATH_IMAGE005
混匀后，低速离心，室温过夜连接。随后按常规方法进行转化感受态细胞和 S1重组菌鉴定和序列测定，测定结果如SEQ ID NO:3所示。
（3）重组pGEX-4T-1-PEDV-S1的表达与纯化
将含有重组质粒的单菌落接种到Luria-Bertani（LB）肉汤中含有50 mg/L氨苄青霉素并在37℃下温育，当OD590达到0.6时，用0.5 mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在30℃诱导4h收获细胞，8000 rpm，4℃ 离心10 min，用15 mL预冷的PBS（pH=7.4）重悬菌体。然后进行超声破碎，在4℃，12000 rpm离心15 min，收集上清，根据ProteinIso GSTResin说明手册进行装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱。
装柱：重悬介质，根据待纯化的蛋白量，加入适量的介质到层析柱中，静置30 min。
平衡：用5-10倍柱体积的平衡缓冲液洗层析柱，至流出的液体与平衡液一致。
上样：样品的缓冲液应尽可能与平衡液一致。为了避免堵塞层析柱，样品上清液，通过0.45 µM的滤器过滤。
洗涤：用洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl，PH=8.0，10 mM还原型谷胱甘肽，最好现配现用）洗脱，收集流出液。
（4）重组蛋白的浓缩及测定
将纯化好的蛋白采用离心超滤浓缩的方法进行纯化。将纯化的蛋白加入到10K的蛋白超滤浓缩管中在4℃离心（注意离心的最大转速不能超过3000 g）浓缩到2mL时，加入PBS进行置换，最终使蛋白保存在PBS中，并对各个多肽分别取小样，进行SDS-PAGE的检测。对重组pGEX-4T-1-PEDV-S1蛋白成功诱导表达，经SDS-PAGE检测PEDV-S1蛋白的大小约为65KD（见图2）。
实施例2 猪TNF-α在大肠杆菌中的表达
（1）猪TNF-α克隆及鉴定
以猪肝脏提取的TNF-α序列为模板，以猪TNF-α-BamHI-F：5’-CTCGGATCCATGAGCACTGAGAGCATGA-3’;猪TNF-α-NotI-R：5’-TATGCGGCCGCTTACAGGGCAATGATCCCA-3’，根据Q5®超保真 DNA 聚合酶说明书，进行PCR扩增，体系如下（50μL）：
Figure 361520DEST_PATH_IMAGE006
对反应体系进行充分混匀后，进行短暂低速离心后，进行PCR，反应条件如下：
Figure 392930DEST_PATH_IMAGE007
PCR扩增结束后对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示可扩增出一条699bp的条带，扩增片段大小与预期结果一致（见图3）。
（2）重组pGEX-4T-1-TNF-α质粒的构建
参照试剂盒说明书对TNF-α产物进行回收，对回收的TNF-α片段及载体pGEX-4T-1进行BamHI和NotI双酶切（TNF-α片段酶切体系见表3，pGEX-4T-1载体酶切体系见表4）。然后置于37℃水浴锅，酶切3h。
表3 TNF-α片段酶切体系（50µL）
Figure 547968DEST_PATH_IMAGE008
表4 pGEX-4T-1载体酶切体系
Figure 754958DEST_PATH_IMAGE009
采用T4连接酶对酶切产物进行连接，体系为（20μL）
Figure 727462DEST_PATH_IMAGE010
混匀后，低速离心，室温过夜连接。随后按常规方法进行转化感受态细胞和 TNF-α重组菌鉴定和序列测定，测定结果见SEQ ID NO:6。
（3）重组pGEX-4T-1-TNF-α的表达与纯化
将含有重组质粒的单菌落接种到Luria-Bertani（LB）肉汤中含有50 mg/L氨苄青霉素并在37℃下温育，当OD590达到0.6时，用0.5 mM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在30℃诱导4h收获细胞，8000 rpm，4℃ 离心10 min，用15 mL预冷的PBS（pH=7.4）重悬菌体。然后进行超声破碎，在4℃，12000 rpm离心15 min，收集上清，根据ProteinIso GSTResin说明手册进行装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱。
装柱：重悬介质，根据待纯化的蛋白量，加入适量的介质到层析柱中，静置30 min。
平衡：用5-10倍柱体积的平衡缓冲液洗层析柱，至流出的液体与平衡液一致。
上样：样品的缓冲液应尽可能与平衡液一致。为了避免堵塞层析柱，样品上清液，通过0.45 µM的滤器过滤。
洗涤：用洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl，PH=8.0，10 mM还原型谷胱甘肽，最好现配现用）洗脱，收集流出液。
（4）重组蛋白的浓缩及测定
将纯化好的蛋白采用离心超滤浓缩的方法进行纯化。将纯化的蛋白加入到10K的蛋白超滤浓缩管中在4℃离心（注意离心的最大转速不能超过3000 g）浓缩到2mL时，加入PBS进行置换，最终使蛋白保存在PBS中，并对各个多肽分别取小样，进行SDS-PAGE的检测。对重组pGEX-4T-1-TNF-α蛋白成功诱导表达，经SDS-PAGE检测TNF-α蛋白的大小约为52KD（见图4）。
实施例3 抗PEDV-S1和TNF-α卵黄抗体的制备
（1）免疫原的制备：将重组大肠杆菌大量诱导表达，培养24h后收获培养基上清；采用分光光度计测定S1和TNF-α蛋白浓度，-20℃保存；用无菌水分别调整S1和TNF-α最终的蛋白浓度为 100 μg/mL，将上述配制好的蛋白溶液作为水相，与等体积的白油佐剂混合，然后用均质机充分乳化20 min，制备而成疫苗；
（2）用制备的疫苗分4次对开产前1个月左右的蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0 mL/只；
（3）第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到35℃纯净水按体积比3:1混合稀释蛋黄液，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于35℃条件下预温1 h；
（4）向蛋黄稀释液中加入PEG6000，混合后PEG6000的质量分数为3%，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6 h，充分反应；
（5）将反应后的上清液抽出，分别用100和200目滤网粗滤；
（6）将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24 h；
（7）将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛灭活未知病毒并作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗PEDV和猪TNF-α抗体的琼扩试验效价应不低于1:64；
（8）在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，即获得卵黄抗体成品，保存备用，保存温度为4-8℃。卵黄抗体纯化图见图5。
实施例4 卵黄抗体的质量检验
（1）安全性检验
用7日龄仔猪10头，肌肉多点注射本发明实施例3制备的卵黄抗体2.0 mL，观察14日，易感仔猪全部健康存活，说明本发明的卵黄抗体的安全性好。
（2）无菌检验
按照《中华人民共和国兽药典》（2015版）执行，结果本发明的卵黄抗体无细菌、支原体和外源病毒污染。
实施例5 抗PEDV-S1和TNF-α卵黄抗体防治PED效果比较
选取15头健康的5日龄仔猪，5头仔猪作为对照组，另10头仔猪作为两个实验组，对照组仔猪每头灌服2mL生理盐水，每日早中晚各口服一次，两个实验组每头猪早中晚分别灌服一次2mL纯化的抗PEDV-S1和TNF-α联合抗体、抗PEDV-S1卵黄抗体，各组连续服用三天。第四日对实验组仔猪和对照组仔猪分别灌服 l mL 106 TCID50/ mL PEDV 细胞培养病毒液，观察仔猪生长状况、精神状态并做记录仔猪何时出现临床症状。
结果显示，前3d 实验组和对照组仔猪一切生理活动正常，精神活跃，进食正常。第4d口服PEDV病毒液后，12 h后对照组仔猪开始出现躁动不安，陆续出现腹泻症状，24 h后腹泻症状加重，并伴随呕吐现象，精神沉郁，食欲开始减退，36h仔猪开始废绝进食，对照组仔猪出现死亡，3d后对照组仔猪全部死亡。两个实验组在口服 PEDV病毒液后 24 h开始出现腹泻现象，但精神和进食仍然正常，36 h后分别有一头和两头仔猪腹泻症状开始加重，进食明显减少，在60 h后出现死亡，其它仔猪腹泻症状有所缓解，进食仍然正常，且全部痊愈。从结果看对照组未服用卵黄抗体死亡率高达100%，实验组服用抗PEDV-S1和TNF-α卵黄抗体、抗PEDV-S1卵黄抗体死亡率分别为20%和40%，保护率达到80%和 60%。因此，具抗炎作用的卵黄抗体（抗PEDV-S1和TNF-α卵黄抗体）的防治效果优于普通卵黄抗体。
实施例6 抗PEDV-S1和不同炎性因子联合的卵黄抗体防治PED效果比较
本实施例中，采用相同的制备方法制备抗PEDV-S1和IL-1β卵黄抗体、抗PEDV-S1和IL-6卵黄抗体，比较三种卵黄抗体的保护效果。
选取30头健康的5日龄仔猪，随机分为A、B、C三组，每组10只。A、B、C3组每头猪早中晚分别灌服一次2mL纯化的抗PEDV-S1和TNF-α卵黄抗体、抗PEDV-S1和IL-1β卵黄抗体、抗PEDV-S1和IL-6卵黄抗体，各组连续服用三天。第四日对3组仔猪分别灌服 l mL 106 TCID50/ mL PEDV 细胞培养病毒液，观察仔猪生长状况、精神状态并做记录仔猪何时出现临床症状。
结果显示，前3d 3组仔猪一切生理活动正常，精神活跃，进食正常。第4d口服PEDV病毒液后，24 h开始出现腹泻现象，60 h后出现死亡，A组死亡2只，B组、C组分别死亡3只。从结果看抗PEDV-S1和TNF-α卵黄抗体的保护效果优于其它两种抗体，即PEDV-S1和TNF-α的联合效果比联合IL-1β和IL-6的效果好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东贝瑞康生物科技有限公司
<120> 一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> PEDV-S1(22-380上游引物)
<400> 1
ctcggatcca tggatgtcac caggtgc 27
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> PEDV-S1(22-380下游引物)
<400> 2
tatgcggccg cttagtaagt atccacttta 30
<210> 3
<211> 1083
<212> DNA
<213> PEDV-S1(22-380AA肽段基因序列)
<400> 3
atggatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 60
gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 120
gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 180
tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 240
gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 300
gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 360
gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 420
catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 480
tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 540
ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca tgcttaatgt tactagtgct 600
ggtgaggatg gtatttttta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 660
gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 720
cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 780
gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 840
caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 900
tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 960
ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcaa atcctcactt agccaccttc 1020
gccatacctt tgggtgctac ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1080
taa 1083
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> TNF-α(上游引物)
<400> 4
ctcggatcca tgagcactga gagcatga 28
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> TNF-α(下游引物)
<400> 5
tatgcggccg cttacagggc aatgatccca 30
<210> 6
<211> 699
<212> DNA
<213> TNF-α(ORF基因)
<400> 6
atgagcactg agagcatgat ccgagacgtg gagctggcgg aggaggcgct cgccaagaag 60
gccgggggcc cccagggctc caggaggtgc ctgtgcctca gcctcttctc cttcctcctg 120
gtcgcaggag ccaccacgct cttctgccta ctgcacttcg aggttatcgg cccccagaag 180
gaagagtttc cagctggccc cttgagcatc aaccctctgg cccaaggact cagatcatcg 240
tctcaaacct cagataagcc cgtcgcccac gttgtagcca atgtcaaagc cgagggacag 300
ctccaatggc agagtgggta tgccaatgcc ctcctggcca acggcgtgaa gctgaaagac 360
aaccagctgg tggtgccgac agatgggctg tacctcatct actcccaggt cctcttcagg 420
ggccaaggct gcccttccac caacgttttc ctcactcaca ccatcagccg catcgccgtc 480
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccttgcca gagggagacc 540
cccgaggggg ccgaggccaa gccctggtac gaacccatct acctgggagg ggtcttccag 600
ctggagaagg atgatcgact cagtgccgag atcaacctgc ccgactatct ggactttgct 660
gaatctgggc aggtctattt tgggatcatt gccctgtga 699

Claims (6)

1.一种抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体为以PEDV G2毒株S1蛋白的22-380AA肽段为抗原进行制备的PEDV抗体及TNF-α抗体的组合。
2.如权利要求1所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体制备方法为：通过基因工程手段获取PEDV G2毒株S1蛋白的22-380AA肽段、TNF-α蛋白，分别调整S1蛋白22-380AA肽段和TNF-α最终的蛋白浓度为100μg/mL，与等体积的白油佐剂混合制成疫苗，对蛋鸡进行免疫得到免疫蛋，从所述免疫蛋中提取卵黄抗体。
3.如权利要求2所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其特征在于，所述PEDV G2毒株S1蛋白的22-380AA肽段是以PEDV G2毒株S1蛋白的全基因序列为模板，加入引物进行PCR扩增，构建重组质粒，转化到大肠杆菌，IPTG诱导表达制得；所述引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求2所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其特征在于，所述TNF-α蛋白是以猪肝脏提取的TNF-α序列为模板，加入引物进行PCR扩增，构建重组质粒，转化到大肠杆菌，IPTG诱导表达制得；所述引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
5.权利要求1-4任一项所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体在制备防治猪流行性腹泻产品中的应用。
6.一种用于防治猪流行性腹泻的产品，其特征在于，所述产品为药物、饲料、饲料添加剂中的一种，所述产品包括权利要求1-4任一项所述抗炎抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体。
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