JP6502505B2 - 組換え糖タンパク質のグリコシル化の調節方法 - Google Patents

組換え糖タンパク質のグリコシル化の調節方法 Download PDF

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Description

本発明は、組換え糖タンパク質のグリコシル化の調節方法（A method for controlling glycosylation of recombinant glycoprotein）に関する。
エタネルセプト（Etanercept）は、ヒトｐ７５ＴＮＦ-α受容体（ＴＮＦＲ、ＴＮＦ-α受容体）のリガンド結合部分をヒトＩｇＧＩのＦｃ断片に結合したＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質であり、２００２年にアムジェン（Amgen）によりエンブレル（Enbrel）という商品名で発売された。エタネルセプトは体内で細胞表面のＴＮＦ-α受容体とＴＮＦ-αとが結合することを競争的に阻害することにより、ＴＮＦ-αに関連した免疫反応を抑制する。したがって、エタネルセプトはＴＮＦ-α阻害剤であって、リウマチ関節炎、乾癬、強直性脊椎炎などに使用されており、血管炎、アルツハイマー病及びクローン病に適用するための臨床研究が進行中である。
一方、遺伝子組換え医薬品は、遺伝子操作技術を用いて製造されるペプチドまたはタンパク質などを有効成分とする医薬品である。生命工学技術を利用すると、自然状態で得にくい多量の高純度組換えタンパク質を得ることができるという利点があるが、目的タンパク質の遺伝子が外部から宿主細胞に挿入されるものであるため発現構造体自体は不安定になることがある。また、人体ではなく微生物や動植物の細胞などで発現させてタンパク質を生産するため、組換えタンパク質は構造的、物理化学的、免疫化学的、生物学的性質または特性の面から天然型タンパク質との差が出ることがある（非特許文献１）。
特に、糖タンパク質の場合、宿主細胞の種類、組換え体の操作方法、培養条件によってグリコシル化（glycosylation）するかどうかと糖鎖の構造や形態が異なることがある。すなわち、糖タンパク質の生産過程で糖鎖構造や糖鎖を構成する成分当たりの量の違いなどにより、様々な種類のグリコフォーム（glycoform）が生成され、生産条件の違いによる不均一性（heterogeneity）が存在するようになることがある。糖鎖構造が互いに異なる糖タンパク質の場合、生体内動態または組織分布が天然型と異なったり、天然型に対して拮抗作用をして有害反応を起こすこともあり、長期間連続投与すると抗原として作用して免疫学的問題を引き起こすこともある。
このように糖鎖は薬理効果と体内動態に影響を与えうる重要な要素になり得るため、糖鎖構造を調節することは医薬品用の組換え糖タンパク質の製品開発及び大量生産技術の開発分野で非常に重要である。
これに関連して、先行文献の韓国公開特許２０１１-０１３９２９２はタンパク質グリコシル化の制御及びそれに関連した組成物及び方法について記載しており、韓国公開特許２０１２-０１３４１１６は治療糖タンパク質上のＮ-グリコシル化部位占有を増加させる方法について記載している。
韓国公開特許２０１１-０１３９２９２ 韓国公開特許２０１２-０１３４１１６ 米国特許７，９１５，２２５； ５，６０５，６９０；Re．３６，７５５
グォンオソク外、ＦＤＣ法制研究第５巻第１、２号、１３-２１、２０１０
このような背景下、本発明者らは組換え糖タンパク質のグリコシル化を調節する方法を開発しようと鋭意研究努力した結果、インスリンを含む培地を使用した場合、組換え糖タンパク質の糖鎖パターンを調節することができることを確認して、本発明を完成した。
本発明の主な目的は、組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む微生物をインスリンを含む培地で培養する段階を含む、組換え糖タンパク質のグリコシル化パターン（glycosylation pattern）を調節する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、（ａ）培養培地で組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培養して成長させる成長段階；（ｂ）前記培地にインスリンを添加して培養して糖タンパク質を生産する生産段階を含む、組換え糖タンパク質の糖鎖パターンを調節する方法を提供することにある。
本発明に係る組換え糖タンパク質の糖鎖パターン調節方法は、組換え糖タンパク質の活性、折りたたみ、分泌、安定性、血漿内半減期及び免疫反応などを調節することができる。
ｐＣＵＣＢｉＮ-ｍＳｉｇ-ＴＮＦｃｅｐｔの切断地図を示すものである。 本発明の一実施例における細胞培養時間（単位：日）に応じる生存細胞数（単位１０５ 細胞/ｍｌ）及び生存率（％）を示すものである。
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む微生物をインスリンを含む培地で培養する段階を含む、組換え糖タンパク質のグリコシル化パターン（glycosylation pattern）を調節する方法を提供する。
前記糖タンパク質（glycoprotein）は糖がポリペプチドの特定のアミノ酸と結合したタンパク質を意味し、前記糖は、例えば１または２以上の単糖類が結合された糖鎖からなることを意味することができる。一例として、前記糖鎖は糖タンパク質にいくつかの単糖類が結合されたオリゴ糖であり、フコース、Ｎ-アセチルグルコサミン、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、シアル酸などの単糖類、グルコース、キシロース、マンノース-６-リン酸またはその分枝された形態などを含むことができる。
一例として、前記組換え糖タンパク質は免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。前記免疫グロブリンは免疫グロブリン（immunoglobulin; Ig）の重鎖及び軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた鎖不変領域２（ＣＨ２）、重鎖不変領域（ＣＨ３）及びヒンジ（hinge）部分を含む免疫グロブリンの一部分であるＦｃを含むものであってもよい。
他の一例として、前記組換え糖タンパク質はＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質であってもよい。
前記ＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor）はＴＮＦ-αに結合する受容体タンパク質を意味する。前記ＴＮＦＲタンパク質はＴＮＦＲＩ（ｐ５５）タンパク質またはＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）タンパク質の両方を含み、好ましくはＴＮＦＲIIタンパク質であるが、これに限定されない。また、前記ＴＮＦＲＩＩはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B）と混用することができる。前記ＴＮＦＲIIタンパク質は４つのドメイン及び膜通過（transmembrane）領域に分けられ、その例として２３５個のアミノ酸から構成されている４つのドメイン及び膜通過領域を含むＴＮＦＲIIタンパク質であってもよいが、これに限定されない。前記ＴＮＦＲIタンパク質及びＴＮＦＲIIタンパク質に関する情報は、米国国立衛生研究所ＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができ、その例としてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒがＮＰ_００１０５６またはＰ２０３３３のタンパク質であってもよいが、これに限定されない。
前記ＴＮＦＲタンパク質は人体内で過発現されると多様な疾患を起こすものとして知られているＴＮＦ-αに結合する活性を有するため、これを利用して自己免疫疾患のようなＴＮＦ-αにより媒介される疾病の治療に利用することができる。そのため、免疫グロブリンのＦｃ領域をＴＮＦＲタンパク質に融合させて半減期を増大させた融合タンパク質の形態で製作して利用することができる。
前記ＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor）-Ｆｃ融合タンパク質はＴＮＦＲタンパク質すべてまたは一部分が免疫グロブリンのＦｃ領域と酵素作用によって結合されるか、または遺伝子操作を通じて前記二つのポリペプチドが一つのポリペプチドで発現された結果物を意味する。前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質はＴＮＦＲタンパク質と免疫グロブリンのＦｃ領域とが直接結合されたペプチドリンカー（peptide linker）を通じて結合されてもよいが、これに限定されない。前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の非限定的な例としてエタネルセプトが含まれてもよい（特許文献３）。
前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質はＴＮＦＲタンパク質の全部または一部を免疫グロブリンＦｃ領域と融合して製作することができ、その例としてＴＮＦＲＩＩタンパク質の１〜２３５番のアミノ酸部位とヒンジ（hinge）部分を含む免疫グロブリンＦｃ領域の２３２個のアミノ酸を融合することができるが、これらに限定されない。また、前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は発現しようとする宿主細胞に応じてコドン最適化（codon optimization）することができ、その例としてＣＨＯ細胞に特異的にコドン最適化されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質であってもよいが、これらに限定されない。前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は前記アミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的にＴＮＦ-αに結合する活性を有するタンパク質であれば、すべて含む。また、このような類似性を有する配列として前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれることは自明である。
前記Ｆｃは、免疫グロブリン（immunoglobulin; Ig）の重鎖及び軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた重鎖不変領域２（ＣＨ２）、重鎖不変領域（ＣＨ３）及びヒンジ（hinge）部分を含む免疫グロブリンの一部分を意味する。また、本発明のＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然型アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異する配列を有することを意味する。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来であり、さらに好ましくは、ＩｇＧ１由来であるが、いずれのサブクラス（つまりＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）から得られてもよい。
前記Ｆｃ部位はＦｃ部位をコードする遺伝子を組換えベクターを用いて遺伝工学的に製造したり、精製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体からパパイン、ペプシンなどの適切なタンパク質の切断酵素で切断して得ることができる。
前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることができる。本発明の一実施例では、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとしてｐＣＵＣＢｉＮ-ｍＳｉｇ-ＴＮＦｃｅｐｔベクターを使用し、これをＣＨＯ細胞に形質導入してＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。
本発明で前記微生物は、宿主細胞または形質転換体と同じ意味で使用することができる。非限定的な例として、動物細胞株、植物または酵母宿主であってもよい。本発明の一実施例では、前記微生物としてＣＨＯ細胞（Chinese Hamster Ovarian ovary cell）を使用したが、前記組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異することができる限り、これに限定されない。
前記ポリヌクレオチドは、微生物内で発現されることができれば、微生物の染色体内に挿入されて位置するか染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドを含ませる方法は、当業界で使用される方法であれば限定されず使用することができる。一例として、自体的に発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で微生物内に含まれてもよい。他の一例として、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように、適切な調節配列に作動可能に結合された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含む発現ベクターにより変異させる方法を使用することができる。前記調節配列は転写を開始することができるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそれ自体に統合されてもよい。前記発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。
前記組換え糖タンパク質のグリコシル化パターン（glycosylation pattern）は、糖タンパク質のグリコシル化（glycosylation）を通じて表される糖鎖の発現様相を意味する。例えば、タンパク質に結合するグリコシル化の有無、糖の種類、グリコシル化タイプ、糖の含量、モル比を含む単糖類（成分当り）の組成、糖鎖の位置、配列を含む糖鎖の構造、グリコシル化位置、グリコシル化占有率、糖鎖の数、または構造別相対含量などを含むものであってもよい。組換え糖タンパク質の糖鎖パターンに応じて、生物活性または生体内の安定性に差を引き起こすことができる。
本発明でインスリンは、組換え糖タンパク質のＮ-結合グリコシル化（N-linked glycosylation）を調節するものであってもよい。本発明で、前記Ｎ-結合グリコシル化はＮ-グリコシル化と同じ意味で使用することができる。一例として、前記インスリンは、組換え糖タンパク質のＮ-グリカンの含量を減少させるものであってもよい。本発明で前記Ｎ-グリカンは、Ｎ-糖鎖と同じ意味で使用することができ、糖がタンパク質のアスパラギンアミノ酸に結合した場合を意味することができる。
本発明でインスリンは、組換え糖タンパク質のＯ-結合グリコシル化（O-linked glycosylation）を調節するものであってもよい。本発明で、前記Ｏ-結合グリコシル化はＯ-グリコシル化と同じ意味で使用することができる。他の一例として、前記インスリンは、組換え糖タンパク質のＯ-グリカンの含量を減少させるものであってもよい。本発明で、前記Ｏ-グリカンはＯ-糖鎖と同じ意味で使用することができ、糖がタンパク質のセリンまたはスレオニンアミノ酸に結合した場合を意味することができる。
本発明でインスリンは、組換え糖タンパク質のＮ-結合グリコシル化及びＯ-結合グリコシル化を調節するものであってもよい。
本発明の一実施例で、インスリンの添加が糖タンパク質の糖鎖パターンに影響を与えることが表れた（表２）。特に、インスリンの添加によりＮ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が変化することが表れた。具体的に、インスリンの添加によりＮ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が減少するように調節できることを確認した。特に糖タンパク質を生産することができる細胞の培養段階の中、生産段階におけるインスリンの添加が糖鎖パターンの調節に重要であることを確認した。
前記インスリンの濃度は、全体の培地体積に対して０．０００１ｍｇ/Ｌ〜１ｇ/Ｌであってもよい。本発明の一実施例では、インスリンの濃度の増加に応じて、Ｎ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が減少するように調節できることを確認した（表２）。
前記培地は、当業界で糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む微生物または宿主細胞を培養するために使用されるものであれば限定されず使用することができる。一例として、前記培地は、グルタミン酸（L-Glutamine）、チミジン（Thymidine）、アラニン（Alanine）、アルギニン（Arginine、monohydrochloride）、アスパラギン（Asparagine、monohydrate）、アスパラギン酸（Aspartic acid）、システイン（Cysteine）、グリシン（Glycine）、ヒスチジン（Histidine）、イソロイシン（Isoleucine）、ロイシン（Leucine）、リジン（Lysine、monohydrochloride）、メチオニン（Methionine）、フェニルアラニン（Phenylalanine）、プロリン（Proline）、セリン（Serine）、トレオニン（Threonine）、トリプトファン（Tryptophan）、チロシン（Tyrosine、disodium salt、dehydrate）、バリン（Valine）などのアミノ酸を含むことができる。他の一例として、前記培地は、グルコース（Glucose）、炭酸水素ナトリウム（Sodium bicarbonate）、塩化ナトリウム（Sodium chloride）、塩化カルシウム（Calcium chloride、ananhydrous）、硫酸第二銅（Cupric sulfate、pentahydrate）、硝酸（II）鉄（Ferric nitrate、nonahydrate）、硫酸（I）鉄（Ferrous sulfate、heptahydrate）、塩化カリウム（Potassium chloride）、硫酸マグネシウム（Magnesium sulfate、ananhydrous）、塩化マグネシウム（Magnesium chloride、ananhydrous）、リン酸ナトリウム（Sodium phosphate、monobasicまたはdibasic、monohydrate）、硫酸亜鉛（Zinc sulfate、heptahydrate）、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、プトレシンジヒドロクロライド（Putrescine、dihydrochloride）、ピルビン酸ナトリウム（Sodium pyruvate）、ビオチン（Biotin）、パントテン酸カルシウム（D-Calcium pantothenate）、塩化コリン（Choline Chloride）、シアノコバラミン（Cyanocobalamin）、葉酸（Folic acid）、イノシトール（i-Inositol）、ニコチンアミド（Nicotinamide）、ピリドキサール（Pyridoxal、monohydrochloride）、ピリドキシン（Pyridoxine、monohydrochloride）、リボフラビン（Riboflavin）、チアミン（Thiamine、monohydrochloride）、グルコース（glucose、anhydrous）、塩化カリウム（Potassium Chloride）、リン酸ナトリウム（NaH2PO4・H2O）、炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）、HEPES（free acid）、デキストラン硫酸（Dextran Sulfate）、塩化ナトリウム（Sodium Chloride）、アスコルビン酸（Ascorbic acid）、D-ビオチン（D-Biotin）、塩化コリン（Choline Chloride）、葉酸（Folic acid）、Ｈｙｐｅｐ １５１０、またはそれらのうち２以上の組み合わせを含むことができる。初期種培養時、発現量の増加のためにＭＴＸを追加で含むことができる。
前記培養は灌流培養（perfusion culture）であってもよい。前記培養は、微生物の周りに培養液を流しながら培養することを意味することができる。灌流培養を通じてインスリンの濃度を目的とする糖鎖パターンにより容易に調節することができる。
別の態様として、本発明は、（ａ）培養培地で組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培養して成長させる成長段階；及び（ｂ）前記培地にインスリンを添加して培養して糖タンパク質を生産する生産段階を含む、組換え糖タンパク質の糖鎖パターンを調節する方法を提供する。
一例として、前記組換え糖タンパク質は免疫グロブリン融合タンパク質であってもよい。他の一例として、前記組換え糖タンパク質はＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質であってもよい。これは前記した通りである。
前記（ａ）段階である成長段階は、種培養段階をさらに含むものであってもよい。
前記（ａ）段階の培地は、インスリンを含まないものであってもよい。
前記（ｂ）段階は、目的とする糖鎖パターンによりインスリン濃度を相異して添加するものであってもよい。本発明の一実施例で、成長段階におけるインスリンの添加によりＮ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が変化することが表した。具体的に、インスリンの添加によりＮ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が減少するように調節し得ることを確認した。特に糖タンパク質を生産し得る細胞の培養段階の中、生産段階におけるインスリンの添加が糖鎖パターンの調節に重要であることを確認した。
前記インスリンの濃度は、全体培地体積に対して０．０００１ｍｇ/Ｌ〜１ｇ/Ｌであってもよい。インスリンの濃度の増加に応じて、Ｎ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が減少するように調節し得ることを確認した（表２）。
インスリンは、組換え糖タンパク質のＮ-結合グリコシル化（N-linked glycosylation）及びＯ-結合グリコシル化（O-linked glycosylation）を調節するものであってもよい。一例として、前記インスリンは組換え糖タンパク質のＮ-グリカンの含量を減少させるものであってもよい。他の一例として、前記インスリンは、組換え糖タンパク質のＯ-グリカンの含量を減少させるものであってもよい。
別の態様として、本発明は、インスリンを含む組換え糖タンパク質の糖鎖パターン調節用培地組成物を提供する。前記インスリンは、全体培地に対して０．０００１ｍｇ/Ｌ〜１ｇ/Ｌで含まれてもよい。
例えば、前記培地は、微生物の培養段階中、生産段階でのみ使用されているものであってもよい。
以下、本発明を下記例により詳細に説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのもので、下記の例により本発明の範囲が制限されるものではない。
実施例１．糖タンパク質生産用細胞株の製造
１−１．ベクターの製造
制限酵素（Restriction enzyme）の処理、プラスミドＤＮＡの精製、ＤＮＡ切片の接合及び大腸菌の形質転換などの分子生物学で一般的に使用されている方法は、ＳａｍｂｒｏｏｋなどのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版）で紹介された方法に最小限の変形を加え実施した。
ＨＵＶＥＣ細胞株から分離されたｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡライブラリーを
利用してヒトｐ７５ ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）遺伝子をクローニングし、これをヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合してＴＮＦＲ-ＩｇＧ１を得た。これを利用してｐＴＯＰ-ＢＡ-ＲＬ-ｐＡベクター（大韓民国公開特許第１０-２０１２-００５９２２２号； 「ＣＭＶｅ」、「ＣＢ」、及び「β-アクチンイントロン」を持っている）を鋳型とし、図１の切断地図のようにｐＣＵＣＢｉｎ-ｍＳｉｇ-ＴＮＦｃｅｐｔベクターを製造した。
１−２．母細胞培養
ＣＨＯ/ｄｈｆｒ-（CHO DXB11）を母細胞に使用した。ＣＨＯ/ｄｈｆｒ-はチャイニーズハムスター の卵巣細胞から分離された後、突然変異を介してジヒドロ葉酸還元酵素（Dihydrofolate Reductase、DHFR）遺伝子が欠乏された細胞である。
１−３．形質転換及び生産用細胞株選択
Ｐ７５ ＴＮＦ受容体（TNFR）遺伝子が含まれた前記ｐＣＵＣＢｉｎ-ｍＳｉｇ-ＴＮＦｃｅｐｔベクターとＣＨＯ/ｄｈｆｒ-（CHO DXB11）を利用して形質転換された細胞を作成しＭＴＸ濃度を利用して遺伝子を増幅させた。このうち基準を満たす候補を選んで、モノクローナルであるかどうかを評価した後、生産用細胞株として選択した。その後、前記細胞株をガラス瓶に入れ、液体窒素で保管した。
実施例２．糖タンパク質の生産用細胞株の培養及びタンパク質の回収
培養に使用される培地は、培養段階に応じて別に使用した。培地Ｘ０１１ＳＢ（Merck Millipore、Cat. No. 102443）５．８ｇ/Ｌにインスリンを添加した基本培地に、種培養段階（Seed Cultivation Phase）では無水グルコース（Sigma）１０ｇ/Ｌ及びＬ-グルタミン、グリシン、セリン（Sigma）をそれぞれ０．５８４ｇ/Ｌ添加した培地（Media EC-SI）を使用し、成長段階（Growth Phase）では無水グルコース５ｇ/Ｌ及びＬ-グルタミン、グリシン、セリンをそれぞれ０．５８４ｇ/Ｌを添加した培地（EC-GM）を使用し、生産段階（production Phase）では無水グルコース１５ｇ/L及びＬ-グルタミン、グリシン、セリンをそれぞ０．５８４ｇ/Ｌを添加した培地（EC-PM）を使用した。
実施例１で製造した細胞株が含まれたガラス瓶を水槽で早く解凍した後、１０ｍＬの培地が入っているファルコンチューブに細胞を移した。その後、遠心分離して上清液を１次に除去した。これを培地ＥＣ-ＳＩ １０ｍＬで再懸濁させた後、最終体積が５０ｍＬになるように三角フラスコに接種して５Ｌ ＣｅｌｌｉＧｅｎ３１０培養器を利用して作業量（Working Volume）基準で２Ｌ培養した。５回の種培養を経て、細胞数が２×１０６ 細胞/ｍＬに達すると、灌流培養を介してＥＣ-ＧＭ培地に交換を開始した。細胞数が増加するにつれて、培地を交換する速度を増加させて細胞がよく分化するようにした。細胞数（viable cell number）が１．５×１０７ 細胞/ｍＬに達すると（図２）培地をＥＣ-ＰＭ培地に交換し、成長段階から生産段階に進むようにした。計４回にわたって回収（harvest）を行い、回収されたタンパク質を精製した。結果値は、４回の平均値で計算した。
実施例３．グリカン（glycan）の含量分析
３-１．Ｏ-グリカン含量分析
実施例２で精製された試料は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．３バッファーで希釈して１．０ｍｇ/ｍＬ濃度の１００μLになるように準備した。各試料にＮ-グリコシダーゼＦ（Glycosidase F; 1U /μL、Roche）４μLとノイラミニダーゼ（Neuraminidase; 1U / 100μL、Roche）１μL、トリプシン（Trypsin; 1mg / mL、Promega）２μLを添加して、３７℃で１８時間反応させＬＣ-ＭＳ分析を行った。
前記試料を８０μL注入し、Ｃ１８ ＲＰカラム（4.6 mm×250 mm、5μm、300オングストローム;
Vydac、Cat. No. 218TP54）を使用してトリプシン分解ペプチド（Tryptic Peptide）を分析した。移動相Ａは、水中０．１%ＴＦＡ、移動相Ｂは８０%ＣＯＬＤ ＡＣＮ中０．１%ＴＦＡを利用し、グラジエント条件で１５０分間分析した。ＵＶ検出器（detector）を利用して、２１５ｎｍでペプチドを検出し、ＬＣを通過して出てきた物質は、質量分析計（Mass spectrometry; LTQ XL、Thermo）に結合してＭＳ分析を実行しＯ-グリコペプチドの相対面積比（Relative Area、％）を計算した。
３-２．Ｎ-グリカン含量分析
実施例２で精製された試料と標準品（エタネルセプト、Pfizer）をそれぞれ３．０ｍｇ/ｍＬになるように試料希釈液（２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ ６．３バッファー）で希釈し準備した。各試料１００μLとＮ-グリコシダーゼ Ｆ溶液６μLとを混合して３７℃で２０時間反応させた。反応が終わった溶液にエタノール４００μLを添加してボルテックスした。これを遠心分離した後、上清液だけを取ってエッペンドルフチューブに移し込めて、ｓｐｅｅｄ-Ｖａｃコンセントレータを利用して、溶液を完全に乾燥させた。乾燥させた試料に２-ＡＡ標識剤を１０μL加え混合した。４５℃で反応させた後、常温で冷した。
使い捨て培養チューブの上にＧｌｙｃｏＣｌｅａｎ Ｓカートリッジ（Cartridge）を載せた後、精製水、３０％酢酸、アセトニトリル（Acetonitrile）を順番に流した。その後、前記冷した試料をカートリッジの膜中央にロードした後、アセトニトリルを流した。Ｎ-グリカンを溶出させるため、カートリッジに精製水を加えてエッペンドルフチューブに集まるようにした。結果物であるグリカン水溶液を凍結乾燥させて分析するまで保管した。
０．５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．６）を移動相Ａに、２５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．６）を移動相ＢにしてＨＰＬＣカラム（AsahiPak NH2P-50 4E、4.6×250 mm）でグラジエント条件で１３０分間分析した。蛍光検出器を利用して検出し、結果の解釈のため、Ｎ-グリカンの末端に存在するシアル酸（Sialic acid）の個数ごとにピークに対する面積の合計を計算した。シアル酸がない場合、中性、1つ（monosialyl）の場合-１電荷、２つ（disialyl）の場合、-２電荷で表示した。
実験例１．生産段階でインスリンを添加していない培地で細胞株を培養
前記実施例２の製造段階でインスリンを除いては、同じ培地で細胞株を培養した後、培養温度別のＮ-グリカンの含量（％）及びＯ-グリコペプチドの相対面積比（％）を分析し、下記表１に示した。
実験例２．生産段階でインスリン添加による糖鎖パターンの変化比較
前記実施例２の製造段階でインスリンの添加有無に応じて糖タンパク質の糖鎖パターンを比較して表２に示した。
その結果、糖タンパク質を生産し得る細胞の培養段階中、生産段階におけるインスリンの添加が糖タンパク質の糖鎖パターンに影響を与えることが表れた。特に、インスリンの添加によりＮ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量が変化することが表れた。具体的に、インスリンの添加によりＮ-グリカンおよび/またはＯ-グリカンの含量が減少するように調節し得ることを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないことを理解しなければならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
本発明に係る組換え糖タンパク質の糖鎖パターン調節方法は、特に成長段階におけるインスリンの添加によりＮ-グリカン及び/またはＯ-グリカンの含量を変化させることができるため、特に糖分子の結合の均一性が重要な医薬品用組換え糖タンパク質生産において有用に使用することができる。

Claims (12)

  1. 組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞をインスリンを含む培地で培養する段階を含む、組換え糖タンパク質のＮ-グリカン及び/又はＯ-グリカンの含量を減少させる方法であって、前記インスリンが、組換え糖タンパク質のＮ-グリカン及び/又はＯ-グリカンの含量を減少させるのに十分な濃度で培地中に含まれるものである、方法。
  2. 前記組換え糖タンパク質が、免疫グロブリン融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記組換え糖タンパク質が、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記インスリンの濃度が、全体培地体積に対して０．０００１ｍｇ/Ｌ〜１ｇ/Ｌである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記インスリンが、組換え糖タンパク質のＮ-結合グリコシル化（Ｎ-linked glycosylation）及びＯ-結合グリコシル化（Ｏ-linked glycosylation）を調節するものである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記培養が、灌流培養である、請求項１に記載の方法。
  7. （ａ）培養培地で組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養して成長させる成長段階；及び
    （ｂ）前記培地にインスリンを添加して培養して糖タンパク質を生産する生産段階を含む、組換え糖タンパク質のＮ-グリカン及び/又はＯ-グリカンの含量を減少させる方法であって、前記インスリンが、組換え糖タンパク質のＮ-グリカン及び/又はＯ-グリカンの含量を減少させるのに十分な濃度で培地中に含まれるものである、方法。
  8. 前記（ｂ）の生産段階が、目的とする糖鎖パターンに応じてインスリン濃度を相異して添加する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記組換え糖タンパク質が、免疫グロブリン融合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
  10. 前記組換え糖タンパク質が、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質である、請求項７に記載の方法。
  11. 前記インスリンの濃度が、全体培地体積に対して０．０００１ｍｇ/Ｌ〜１ｇ/Ｌである、請求項７に記載の方法。
  12. 前記培養が、灌流培養である、請求項７に記載の方法。
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