MX2011004198A - Anticerpos que unen a il-12 y metodos para purificar los mismos. - Google Patents

Anticerpos que unen a il-12 y metodos para purificar los mismos.

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Abstract

Se describen en la presente los anticuerpos IL-12 que incluyen las porciones de unión a antígeno de los mismos. Se presentan los métodos para el aislamiento y purificación de los anticuerpos anti-lL-12 a partir de una matriz de muestra. Estos anticuerpos anti-IL-12 se pueden utilizar en un contexto clínico así como en la investigación y desarrollo. También se describen las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-IL-12 aislados.

Description

ANTICUERPOS QUE UNEN A IL-12 Y METODOS PARA PURIFICAR LOS MISMOS Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Esta Solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense Número de Serie 61/196,752, presentada el 20 de octubre de 2008, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Antecedentes de la Invención La interleucina humana 12 (IL-12) se ha caracterizado como una citocina con una estructura única y efectos pleiotrópicos. La IL-12 desempeña una función crítica en la patología asociada a varias enfermedades que implican las respuestas inmunológicas e inflamatorias. Una revisión de IL-12, sus actividades biológicas, y su función en la enfermedad se puede encontrar en Gately y colaboradores (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495-521.
Estructuralmente, IL-12 es una proteína heterodimérica que comprende una subunidad (p35) de 35 kDa y una subunidad (p40) de 40 kDa, ambos están unidas juntas por un enlace de disulfuro (refereido como "subunidad p70"). La proteína heterodimérica es producida principalmente por las células de presentación de antígeno tal como monocitos, macrófagos, y células dendríticas. Estos tipos de células también secretan un exceso de subunidad p40 con relación a la subunidad p70. Las subunidades p40 y p35 no se relacionan genéticamente y no se ha reportado que posean actividad biológica, aunque el homodímero p40 puede funcionar como un antagonista de IL-12.
Funcionalmente, IL-12 desempeña una función fundamental en la regulación de equilibrio entre los linfocitos tipo 1 (Th1) y tipo 2 (Th2) de auxiliar T específicos para el antígeno. Las células Th1 y Th2 controlan el inicio y progreso de los trastornos autoinmunes y IL-12 es crítica en la regulación de la diferenciación y maduración del linfocito Th1. Las citocinas liberadas por las células Th1 son inflamatorias e incluyen el interferón-? (EFNy), IL-2 y linfotoxina. Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 para facilitar la inmunidad humoral, reacciones alérgicas, e inmunosupresión.
De acuerdo con la preponderancia de las respuestas de Th1 en enfermedades autoinmunes y actividades proinflamatorias de EFNy, IL-12 desempeñan una función principal en la patología se asocia a muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias tal como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, y enfermedad de Crohn .
Los pacientes humanos con MS han demostrado un aumento en la expresión de IL-12 según lo documentado por los niveles de ARNm p40 en placas de MS agudas. Además, el estímulo ex vivo de las células de presentación de antígeno con las células T de expresión de CD40L de los pacientes con MS dio lugar a la producción creciente de IL-12 en comparación con las células T de control, de acuerdo con la observación que las interacciones de CD40/CD40L son inductores potentes de IL-12.
Los niveles elevados de p70 de IL-12 se han detectado en el sinovio de los pacientes con RA en comparación con los controles sanos. El perfil de expresión de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de citocina en el sinovio de RA identificó de manera predominante las citocinas de Th1. IL-12 también parece desempeñar una función crítico en la patología asociada a la enfermedad de Crohn. La expresión creciente de IFNY y IL-12 se ha observado en la mucosa intestinal de pacientes con esta enfermedad. El perfil de secreción de citocina de las células T de lámina propria de pacientes con CD es característico de una respuesta predominante de Th1, que incluye los niveles ampliamente elevados de IFNy. Por otra parte, las secciones de tejido de colon de pacientes con CD muestran una abundancia de macrófagos que expresan IL-12 y células T que expresa IFNy.
Debido a la función de IL-12 humano en una variedad de trastornos humanos, las estrategias terapéuticas se han diseñado para inhibir o contrarrestar la actividad de IL-12. Particularmente, los anticuerpos que unen, y neutralizan, IL-12 se han buscado como medios para inhibir la actividad de IL-12. Es importante que un régimen terapéutico comprenda los anticuerpos anti-IL-12 de pureza elevada. La presente invención trata esta necesidad sin el uso de una columna de proteína A o una etapa de purificación basada en proteína A equivalente.
Breve Descripción de la Invención En ciertas modalidades, la presente invención se dirige a los anticuerpos aislados purificados y fragmentos de anticuerpo que unen IL-12 así como a las composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos y fragmentos. En ciertas modalidades, la invención pertenece a los anticuerpos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que unen IL-12 humano. Los anticuerpos anti-IL-12 aislados de la presente invención se pueden utilizar en un contexto clínico así como en la investigación y desarrollo. En ciertas modalidades, la presente invención se dirige al anticuerpo anti-IL-12 que comprende las secuencias de cadena pesada y ligera identificadas en SEC ID NO. 1 y 2.
Ciertas modalidades de la invención se dirigen hacia métodos para purificar los anticuerpos anti-IL-12, o porciones de unión a antígeno de los mismos, de una matriz de muestra para hacerlas sustancialmente libres de las proteínas de célula hospedadora ("HCP", por su abreviatura en inglés). En ciertos aspectos, la matriz de muestra (o simplemente "muestra") comprende una línea celular utilizada para producir los anticuerpos anti-IL-12 de la presente invención. Particularmente los aspectos, la muestra comprende una línea celular usada para producir los anticuerpos humanos anti-IL-12.
En ciertas modalidades de la presente invención una matriz de muestra que comprende el anticuerpo anti-IL-12 posible, o porción de unión a antígeno de los mismos, se somete a un ajuste de pH. En ciertos aspectos, el pH se ajusta a aproximadamente 3.5. El pH bajo, entre otras cosas, promueve la reducción y/o desactivación de los virus sensibles a pH que pueden contaminar la muestra. Después de un periodo de tiempo conveniente, el pH se ajusta a aproximadamente 5.0 y la muestra se somete a la cromatografía de intercambio iónico para producir un eluato. En ciertos aspectos, el eluato de intercambio iónico se recolecta y someta adicionalmente a la cromatografía interactiva hidrofóbica para producir un eluato. El eluato de cromatografía interactiva hidrofóbica se puede entonces recolectar para el procesamiento o uso adicional.
En ciertas modalidades la presente invención proporciona un método para purificar los anticuerpos de IL-12 que comprende una etapa de recuperación primaria, entre otras cosas, elimina las células y residuos celulares. En ciertas modalidades del método descrito anteriormente, la etapa de recuperación primaria incluye una o más etapas de centrifugación o filtración profunda. Por ejemplo, y a modo no limitante, tales etapas de centrifugación se pueden realizar a aproximadamente 7000 x g a aproximadamente 11,000 x g. Además, ciertas modalidades del método descrito anteriormente incluirán una etapa de filtración profunda, tal como una etapa de filtración profunda deslipidizante.
En ciertas modalidades del método descrito anteriormente, la etapa de intercambio iónico puede ser cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, o una combinación de ambas. Este etapa puede incluir múltiples etapas de intercambio iónico tal como una etapa de intercambio catiónico seguida por una etapa de intercambio aniónica o inversamente. En ciertos aspectos, la etapa de intercambio iónico implica un proceso de intercambio iónico de dos etapas. Tales procesos de dos etapas pueden ser realizados, por ejemplo, y a modo no limitante, por una primera etapa de intercambio catiónico, seguido por una segunda etapa de intercambio aniónico. Una columna de intercambio catiónico ejemplar es una columna cuya fase fija comprende grupos aniónicos, tal como una columna CM HyperDF™. Esta etapa de cromatografía de captura de intercambio iónico facilita el aislamiento de los anticuerpos anti-IL-12 de la mezcla de recuperación primaria. Una columna de intercambio de aniónico conveniente es una columna cuya fase fija comprende grupos catiónicos. Un ejemplo de tal columna es una columna Q Sepharose™. Una o más etapas de intercambio iónico aislan los anticuerpos anti-IL-12 reduciendo las impurezas tal como proteínas de célula hospedadora y DNA y, en caso pertinente, la proteína de matriz de afinidad. Este procedimiento de intercambio aniónico es un modo de flujo directo de la cromatografía en donde los anticuerpos anti-IL-12 no interactúan ni se unen a la resina de intercambio aniónico (o fase sólida). Sin embargo, muchas impurezas interactúan y se unen a la resina de intercambio aniónico.
En ciertas modalidades, una primera y segunda etapas de intercambio iónico se realiza después de la recuperación primaria. En alguna de tales modalidades, la muestra de intercambio iónico se somete a una etapa de filtración intermedia, antes de la primera etapa de intercambio iónico, entre las dos etapas de intercambio iónico, o ambas. En ciertos aspectos, esta etapa de filtración comprende la ultrafiltración/diafiltración de captura ("UF/DF", por su abreviatura en inglés). Entre otras actividades, tal filtración facilita la concentración e intercambio de solución amortiguadora de los anticuerpos anti-IL-12 y porciones de unión a antígeno de los mismos.
Ciertas modalidades de la invención proporcionan un método que comprende una o más etapas de cromatografía interactiva hidrofóbica ("HIC"). Una columna de HIC conveniente es una cuya fase fija comprende grupos hidrofóbicos. Un ejemplo no limitante de tal columna es una columna Phenyl Sepharose™ HP. En ciertas circunstancias los anticuerpos anti-IL-12 formarán agregados durante el proceso de aislamiento/purificación. La inclusión de uno o más etapas de HIC facilita la reducción o eliminación de tales agregaciones. HIC también ayuda a la eliminación de impurezas. En ciertas modalidades la etapa de HIC utilizan una solución amortiguadora con alto contenido de sal para promover la interacción de los anticuerpos anti-IL-12 (o agregaciones de los mismos) con la columna hidrofóbica. Los anticuerpos anti-IL-12 se pueden entonces eluir usando concentraciones más bajas de sal.
En ciertas modalidades, el eluato de HIC se filtra usando un filtro de eliminación viral por ejemplo, pero sin limitarse a, un filtro Ultipor DV50™ (Pall Corporation, East Hills, N.Y.). Filtros alternativos, tal como filtros Viresolve™ (Millipore, Billerica, Mass.); filtros Zeta Plus VR™ filtra (CUNO; Meriden, Conn.); y filtros Planova™ (Asahi Kasei Pharma, Planova División, Buffalo Grove, III.), puede también utilizarse en tales modalidades.
En ciertas modalidades, la invención se dirige uno o más composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo y un portador aceptable. En un aspecto, la composición además comprende uno o más anticuerpos o porción de unión a antígeno del mismo además del anticuerpo anti-IL-12. En otro aspecto, las composiciones además comprenden uno o más agentes farmacéuticos.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 describe las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti-IL-12 (ABT-847).
Descripción Detallada de la Invención La presente invención se dirige a los anticuerpos que unen IL-12. En un aspecto, la invención pertenece a los anticuerpos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que unen a IL-12 humano. El anticuerpo anti-IL-12 aislado de la presente invención se puede utilizar en un contexto clínico así como en la investigación y desarrollo. La presente invención también pertenece a los métodos para purificar los anticuerpos anti-IL-12, o porciones de unión a antígeno de los mismos. Los anticuerpos anti-IL-12 convenientes que se pueden purificar en el contexto de la presente invención se describen en la Patente Estadounidense No. 6,914,128 (que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) que incluyen, pero no se limitan al anticuerpo anti-IL-12 identificado en esa patente como J695, y que se ha identificado posteriormente como ABT-874. Las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de ABT-874 se presentan en la figura 1 y SEC ID NO: 1 y 2. La presente invención también se relaciona con las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-IL-12 o porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente.
Para mayor claridad y de modo no limitante, esta descripción detallada se divide en las siguientes porciones secundarias: 1. Definiciones; 2. Generación de anticuerpo; 3. Producción de anticuerpo; 4. Purificación de anticuerpo; 5. Métodos de análisis de pureza de muestra; 6. Modificaciones adicionales; 7. Composiciones farmacéuticas; y 8. Usos de anticuerpo. 1. Definiciones Para poder entender más fácilmente la presente invención, primero se definen ciertos términos.
El término "anticuerpo" incluye una molécula de inmunoglobulina compuesta por cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (CDR, por su abreviación en inglés), entremezcladas con las regiones que son más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR, por su abreviación en inglés). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, ubicadas de la terminal amino a la terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "porción de anticuerpo") incluye los fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hlL-12). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por los fragmentos de un anticuerpo integral. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que comprende los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace de disulfuro en la región conectora; (iii) un fragmento Fd que comprende los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que comprende los dominios VL y VH de una sola ramificación de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341:544-546, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia), que comprende un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, sean codificados por los genes separados, se pueden unir, usando los métodos recombinantes, por un enlace sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se unen para formar las moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); ver, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 85:5879-5883, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Tales anticuerpos de cadena simple también se piensan para estar comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También son comprendidas otras formas de anticuerpos de cadena simple, tal como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptido, pero usando un enlace que es demasiado corto para permitir la unión entre los dos dominios en la misma cadena, para de tal modo forzar a los dominios a unirse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P., y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., y colaboradores (1994) Structure 2:1121-1123, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Además, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula más grande de inmunoadhesión, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con uno o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para hacer una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., y colaboradores (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia) y el uso de un residuo de cisteína, ucn péptido marcador y una etiqueta de polihistidina de terminal C para hacer las moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., y colaboradores (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). Las porciones de anticuerpo, tal como los fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar de los anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tal como digestión de papaina o pepsina, respectivamente, de los anticuerpos completos. Por otra parte, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesion se pueden obtener usando las técnicas de ADN recombinante estándar, según lo descrito en la presente. En un aspecto, las porciones de unión a antígeno son dominios completos o pares de dominios completos.
La frase "interleucina humana 12" (abreviada en la presente como hlL-12, o IL-12), según lo utilizado en la presente, incluye una citocina humana que es secretada principalmente por los macrófagos y células dendríticas. El término incluye una proteína heterodimérica que comprende una subunidad de 35 kD (p35) y una subunidad de 40 kD (p40) que se unen juntas con un enlace de disulfuro. La proteína heterodimérica es referida como una "subunidad p70". La estructura de IL-12 humana se describe adicionalmente en, por ejemplo, Kobayashi, y colaboradores (1989) J. Exp Med. 170:827-845; Seder, y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, y colaboradores (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, y colaboradores (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia. El ácido nucleico que codifica IL-12 está disponible como acceso GenBank No. NM_000882 y la secuencia de polipéptido está disponible como acceso GenBank No. NP_000873.2. El término IL-12 humana se piensa para incluir IL-12 humana recombinante (rh IL-12), que se puede preparar por métodos de expresión recombinante estándar.
Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se utilizan alternativamente en la presente. Estos términos, que se reconocen en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácido que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat y colaboradores (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 y, Kabat, E. A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Qinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3.
Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.
El término "anticuerpo humano" incluye los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden a las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana según lo descrito por Kabat y colaboradores (ver, Kabat, y colaboradores (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en CDRs y particularmente CDR3. Las mutaciones se pueden introducir usando el "método de mutagénesis selectiva". El anticuerpo humano puede tener por lo menos una posición reemplazada por un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido de aumento de actividad que no sea codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. El anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones sustituidas por los residuos de aminoácido que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. En otras modalidades, se sustituyen hasta diez, hasta cinco, hasta tres o hasta dos posiciones. En una modalidad, estos reemplazos están dentro de las regiones CDR. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", según lo utilizado en la presente, no se piensa para incluir los anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas del línea germinal de otra especie mamífera, tal como ratón, se han injertado en las secuencias estructurales humanas.
La frase "método de mutagénesis selectiva" incluye un método para mejorar la actividad de un anticuerpo seleccionando y mutando individualmente los aminoácidos de CDR en por lo menos una posición de mutagénesis, posición de hipermutación , y/o contacto selectivo conveniente. Un anticuerpo humano "selectivamente mutado" es un anticuerpo que comprende una mutación en una posición seleccionada usando un método de mutagénesis selectiva. En otro aspecto, el método de mutagénesis selectiva se piensa para proporcionar un método para mutar preferiblemente los residuos de aminoácido individuales seleccionados en CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada (más adelante referida como H1, H2, y H3, respectivamente), o CDR1 , CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena ligera (más adelante referida como L1, L2, y L3, respectivamente) de un anticuerpo. Los residuos de aminoácido se pueden seleccionar de posiciones de mutagénesis selectiva, posiciones de contacto, o posiciones de hipermutación. Los aminoácidos individuales se seleccionan con base en su posición en la región de variable de cadena ligera o pesada. Se debe entender que una posición de hipermutacion también puede ser una posición de contacto. En un aspecto, el método de mutagénesis selectiva es un "método dirigido". El leguaje "método dirigido" se piensa para incluir un método para mutar residuos de aminoácido individuales seleccionados en CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada o CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo de una manera dirigida, por ejemplo, un "método dirigido por grupos" o "método dirigido por CDRs". En el "método dirigido por grupos", los residuos de aminoácido en los grupos particulares se dirigen para las mutaciones selectivas que incluyen los grupos I (incluyendo L3 y H3), II (incluyendo H2 y L1) e III (incluyendo L2 y H1), los grupos son enumerados en el orden de preferencia para el direccionamiento. En el "método dirigido por CDRs", los residuos de aminoácido individuales en las CDRs particulares, se dirigen para las mutaciones selectivas con el orden de preferencia para el direccionamiento como sigue: H3, L3, H2, L1, H1 y L2. El residuo de aminoácido seleccionado es mutado, por ejemplo, a por lo menos dos de otros residuos de aminoácido, y se determina el efecto de la mutación sobre la actividad del anticuerpo. La actividad se mide como un cambio de la especificidad/afinidad de unión del anticuerpo, y/o de la potencia de neutralización del anticuerpo. Se debe entender que el método de mutagénesis selectiva se puede utilizar para la optimización de cualquier anticuerpo derivado de cualquier fuente incluyendo la expresión en fago, animales transgénicos con genes de línea germinal IgG humanos, y anticuerpos humanos aislados de las células B humanas. El método de mutagénesis selectiva se puede utilizar en los anticuerpos que no se pueden optimizar adicionalmente usando la tecnología de expresión en fago. Se debe entender que los anticuerpos de cualquier fuente incluyendo la expresión en fago, animales transgénicos con genes de línea germinal IgG humanos, anticuerpos humanos aislados de células B humanas, pueden someterse a mutación inversa antes o después del método de mutagénesis selectiva.
La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humana recombinante combinatoria, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Taylor, L. D., y colaboradores (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de las secuencias del gene de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (ver, Kabat, E. A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NEH No. 91-3242). En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a la mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humanas en la mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se deriven y relacionen con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos recombinantes son el resultado del método de mutagénesis selectiva o mutación inversa o ambos.
Un "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diversas especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente hlL-12 está sustancialmente libre de los anticuerpos que unen específicamente antígenos distintos a hll_-12). Un anticuerpo aislado que une específicamente hlL-12 puede unir las moléculas de IL-12 de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material y/o químico celulares.
Un "anticuerpo de neutralización" (o un "anticuerpo que neutralizó la actividad de hlL-12") incluye un anticuerpo cuya unión a hlL-12 da lugar a la inhibición de la actividad biológica de hlL-12. Esta inhibición de la actividad biológica de hll_-12 se puede determinar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hll_-12, tal como inhibición de la proliferación de blastos humana de fitohemaglutinina en un análisis de proliferación de blastos de fitohemaglutinina (PHA, por su abreviatura en inglés), o la inhibición del receptor de unión en un análisis de unión del receptor IL-12 humano. Estos indicadores de la actividad biológica de hlL-12 se pueden determinar por uno o más de varios análisis in vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica.
Un "anticuerpo de neutralización" (o un "anticuerpo que neutralizó la actividad de hlL-12") incluye un anticuerpo cuya unión a hlL-12 da lugar a la inhibición de la actividad biológica de hlL-12. Esta inhibición de la actividad biológica de hlL-12 se puede determinar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hlL-12, tal como inhibición de la proliferación en blastos de fitohemaglutinina en un análisis de proliferación en blastos de fitohemaglutinina (PHA, por su abreviatura en inglés), o la inhibición de la unión del receptor en un análisis de unión del receptor IL-12 humano. Estos indicadores de la actividad biológica de hlL-12 se pueden determinar por uno o más de varios análisis in vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica.
El término "actividad" incluye actividades tal como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-h I L- 12 que une a un antígeno de IL-12 y/o la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-12 cuya unión a hlL-12 inhibe la actividad biológica de hlL-12, por ejemplo, inhibición de la proliferación de blastos de PHA o inhibición de la unión del receptor en un análisis de unión del receptor IL-12 humano.
La frase "resonancia de plasmón superficial" incluye un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecíficas en tiempo real por la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ.). Para otras descripciones, ver Jonsson, U., y colaboradores (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., y colaboradores (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., y colaboradores (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnsson, B., y colaboradores (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente.
El término "Koff", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno.
El término "Kd", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.
La frase "molécula de ácido nucleico" incluye las moléculas de ADN y las moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero en un aspecto es ADN bicatenario.
La frase "molécula de ácido nucleico aislada", según lo utilizado en la presente con referencia a los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3), por ejemplo los que unen hlL-12 (incluyendo "anticuerpos aislados"), que incluyen una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de nucleótido que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótido que codifican los anticuerpos o porciones de anticuerpo que unen los antígenos distintos de hlL-12, cuyas otras secuencias pueden evadir naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. Así, por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo anti-l L-12 h no contiene ninguna otra secuencia que codifica otras regiones VH que unen los antígenos distintos a IL-12. La frase "molécula de ácido nucleico aislada" también se piensa para incluir las secuencias que codifican los anticuerpos bivalentes biespecíficos, tal como diacuerpos en los cuales las regiones VH y VL no contienen ninguna otra secuencia distinta a las secuencias del diacuerpo.
La frase "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") incluye una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que tales términos están pensados para referirse no sólo a la célula objeto particular sino a la progenie de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones sucesivas debido a la mutación o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula madre, pero aún estar incluida dentro del alcance del término "célula hospedadora" según lo utilizado en la presente.
El término "modificación", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse al cambio de uno o más aminoácidos en los anticuerpos o porciones de unión de antígeno del mismo. El cambio puede ser producido agregando, sustituyendo o suprimiendo un aminoácido en uno o más posiciones. El cambio se puede producir usando técnicas conocidas, tal como mutagénesis de PCR.
El término "aproximadamente", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a intervalos de aproximadamente 10-20% mayor que o menor que el valor referido. En ciertas circunstancias, un experto en la técnica reconocerá que, debido a la naturaleza del valor referido, el término "aproximadamente" puede significar más o menos que una desviación de 10-20% de ese valor.
La frase "reducción/desactivación viral", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a una disminución del número de partículas virales en una muestra particular ("reducción"), así como una disminución de la actividad, por ejemplo, pero sin limitarse a, la infectividad o capacidad de réplica, de partículas virales en una muestra particular ("desactivación"). Tales disminuciones del número y/o actividad de las partículas virales pueden estar en el orden de aproximadamente 1% a aproximadamente 99%, preferiblemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 99%, más preferiblemente de aproximadamente 30% a aproximadamente 99%, muy preferiblemente de aproximadamente 40% a aproximadamente 99%, incluso más preferiblemente de aproximadamente 50% a aproximadamente 99%, aún más preferiblemente de aproximadamente 60% a aproximadamente 99%), incluso muy preferiblemente de aproximadamente 70% a aproximadamente 99%, aún muy preferiblemente de aproximadamente 80% a aproximadamente 99%, e incluso aún muy preferiblemente de aproximadamente 90% a aproximadamente 99%. En ciertas modalidades no limitantes, la cantidad de virus, si lo hay, en el producto de anticuerpo purificado es de menos de DI50 (la cantidad de virus que infectará a 50 por ciento de una población objeto) para ese virus, preferiblemente por lo menos diez veces menor que DI50 para ese virus, más preferiblemente por lo menos cien veces menor que DI50 para ese virus, y muy preferiblemente por lo menos 1000 veces menor que DI50 para ese virus.
La frase "posición de contacto" incluye una posición de aminoácido en CDR1, CDR2 o CDR3 de la región variable de cadena pesada o de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo que es ocupado por un aminoácido que entra en contacto con el antígeno en una de las veintiséis estructuras de anticuerpo-antígeno conocidas. Si un aminoácido de CDR en cualquiera de las veintiséis estructuras determinadas conocidas de los complejos de anticuerpo-antígeno entra en contacto con el antígeno, entonces ese aminoácido se puede considerar como que ocupa una posición de contacto. Las posiciones de contacto tienen una probabilidad más alta de ser ocupadas por un aminoácido que entra en contacto con los antígenos que en una posición de no contacto. En un aspecto, una posición de contacto es una posición de CDR que contiene un aminoácido que entra en contacto con el antígeno en más de 3 de las 26 estructuras (>1.5%). En otro aspecto, una posición de contacto es una posición de CDR que contiene un aminoácido que entra en contacto con el antígeno en más de 8 de las 25 estructuras (>32%). 2. Generación del anticuerpo El término "anticuerpo" según lo utilizado en esta sección se refiere a un anticuerpo intacto o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los anticuerpos de la presente descripción se pueden generar por una variedad de técnicas, incluyendo inmunización de un animal con el antígeno de interés seguido por metodologías de anticuerpo monoclonal convencionales, por ejemplo, la técnica de hibridación de célula somática estándar Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque los procedimientos de hibridación de célula somática son preferidos, en principio, otras técnicas para producir el anticuerpo monoclonal se pueden utilizar, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de los linfocitos B.
Un sistema animal preferido para preparar los hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. Los asociados de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión también son conocidos.
Un anticuerpo preferiblemente puede ser un anticuerpo humano, quimérico, o humanizado. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente descripción se pueden preparar con base en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no humano preparado según lo descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener del hibridoma no humano de interés y diseñarse para contener secuencias de inmunoglobulina de murino (por ejemplo, humana) usando técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden unir a las regiones constantes humanas usando los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4,816,567 de Cabilly y colaboradores). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones de CDR de murino se pueden insertar en una estructura humana usando los métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,225,539 de Winter, y las Patentes Estadounidenses Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y colaboradores).
En una modalidad no limitante, los anticuerpos de esta descripción son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-12, TNFa, o IL-18 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), KM Mouse® (Medarex, Inc.), y XenoMouse® (Amgen).
Por otra parte, los sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para producir los anticuerpos de la descripción. Por ejemplo, se puede utilizar los ratones que llevan un transcromosoma humano de cadena pesada y un transcromosoma humano de cadena ligera, referidos como "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA §1:112-121. Además, las vacas que llevan los transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera se han descrito en la técnica (por ejemplo, Kuroiwa y colaboradores (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 y la Solicitud PCT No. WO 2002/092812) y se pueden utilizar para producir los anticuerpos anti-IL-12 de esta descripción.
Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención, que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos anti-IL-12, o una porción de unión a antígeno de los mismos, o los anticuerpos relacionados a anti-IL-12 descritos en la presente, se pueden aislar por el análisis de una biblioteca de anticuerpo combinatoria recombinante, por ejemplo, una biblioteca de expresión en fago scFv, preparada usando ADNcs de VL y VH humanos preparados del ARNm derivado de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y analizar tales bibliotecas se conocen en la técnica. Además de los kits comercialmente disponibles para generar las bibliotecas de expresión en fago (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, número de catálogo 27-9400-01; y el kit de expresión en fago Stratagene SurfZAPTM, número de catálogo 240612, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente), los ejemplos de los métodos y reactivos particularmente favorables para el uso en la generación y análisis de las bibliotecas de expresión en anticuerpo se pueden encontrar en , por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,223,409 de Ladner y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/18619 de Kang y colaboradores; Publicación PCT No. WO 91/17271 de Dower y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/20791 de Winter y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/15679 de arkland y colaboradores; Publicación PCT No. WO 93/01288 de Breitling y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/01047 de McCafferty y colaboradores; Publicación PCT No. WO 92/09690 de Garrard y colaboradores; Fuchs y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y colaboradores (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse y colaboradores (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths y colaboradores (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins y colaboradores (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Gram y colaboradores (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y colaboradores (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y colaboradores (1991) PNAS 88:7978-7982; cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente.
Los anticuerpos monoclonales humanos de esta descripción también se pueden preparar usando los ratones SCID en los cuales las células inmunes humanas se han reconstituido tal que una respuesta del anticuerpo humano se puede generar durante la inmunización. Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,476,996 y 5,698,767 de Wilson y colaboradores.
En una modalidad, los métodos de la invención incluyen los anticuerpos anti-IL 12 y porciones de anticuerpo, o anticuerpos relacionados a anti-IL-12 y porciones del anticuerpo, y anticuerpos humanos y porciones del anticuerpo con las propiedades equivalentes a los anticuerpos anti-IL-12 tal como unión de alta afinidad a hll_-12 con baja cinética de disociación y alta capacidad de neutralización. En un aspecto, la invención proporciona el tratamiento de un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se disocia de hlL-12 con una Kd de aproximadamente 1 x 10-8 M o menos y una constante de Koff de 1 x 10-3 s-1 o menos, ambas determinadas por resonancia de plasmón superficial. En las modalidades no limitantes específicas, un anticuerpo anti-IL-12 purificado de acuerdo con la invención inhibe competitivamente la unión de ABT-874 a IL-12 bajo condiciones fisiológicas.
En aún otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-IL-12 o fragmentos de los mismos, se pueden alterar en donde la región constante del anticuerpo se modifica para reducir por lo menos una función efectora biológica mediada por la región constante con relación a un anticuerpo sin modificar. Para modificar un anticuerpo de la invención tal que exhiba una unión reducida al receptor Fe, el segmento de región constante de inmunoglobulina del anticuerpo puede ser mutado en las regiones particulares necesarias para las interacciones del receptor Fe (FcR) (ver, por ejemplo, Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund y colaboradores (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente). La reducción de la capacidad de unión de FcR del anticuerpo puede también reducir otras funciones efectoras que dependen de las interacciones de FcR, tal como opsonización y fagocitosis y citotoxicidad celular dependiente de antígeno. 3. Producción de anticuerpo Para expresar un anticuerpo de la invención, los ADNs que codifican las cadenas integrales ligera y pesada se insertan en uno o más vectores de expresión tal que los genes sean unidos operativamente a las secuencias de control de transcripción y traducción. (Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,914,128, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). En este contexto, el término "unido operativamente" se piensa para dar a entender que un gen de anticuerpo es unido a un vector tal que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirven para su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en un vector separado o, más comúnmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo son insertados en un vector de expresión por los métodos estándar (por ejemplo, unión de los sitios de restricción complementarios en el fragmento y vector de gen de anticuerpo, o unión de extremo romo si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción del anticuerpo o secuencias de cadena pesada y ligera relacionadas al anticuerpo, el vector de expresión puede ya llevar las secuencias de región constante de anticuerpo. Por ejemplo, un método para convertir, anticuerpos anti-IL-12 o secuencias de VH y VL relacionadas al anticuerpo anti-IL-12 a los genes de anticuerpo integrales es insertarlos en vectores de expresión que ya pueden codificar las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera, respectivamente, tal que el segmento de VH se une operativamente a los segmentos de CH dentro del vector y el segmento VL se une operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector tal que el péptido señal es unido en la estructura a la terminal amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).
Además de los genes de cadena de anticuerpo, un vector de expresión recombinante de la invención puede llevar una o más secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. El término "secuencia reguladora" se piensa para incluir los promotores, reforzadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods ¡n Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tal como la elección de la célula hospedadora que se transformará, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras convenientes para la expresión en células hospedadoras mamíferas incluyen los elementos virales que dirigen los niveles de expresión de proteína en células mamíferas, tal como promotores y/o reforzadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/reforzador de CMV), virus 40 de simio (SV40) (tal como el promotor/reforzador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor posterior principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para la descripción adicional de los elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,168,062 de Stinski, Patente Estadounidense No. 4,510,245 de Bell y colaboradores y la Patente Estadounidense No. 4,968,615 de Schaffher y colaboradores, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia.
Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, un vector de expresión recombinante de la invención puede llevar una o más secuencias adicionales, tal como una secuencia que regula la réplica del vector en las células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de la réplica) y/o un gen marcador seleccionable. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospedadoras en las cuales se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel y colaboradores, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Por ejemplo, comúnmente el gene marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, a una célula hospedadora en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionares convenientes incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en células hospedadoras de dhfr con la selección/amplificación de metotrexato) y el nuevo gen (para la selección de G418).
Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede preparar por la expresión recombinante de los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de manera recombinante, una célula hospedadora es transfectada con uno o más vectores de expresión recombinante que lleva los fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo tal que las cadenas ligera y pesada son expresadas en la célula hospedadora y secretadas en el medio en el cual se cultivan las células hospedadoras, de cuyo medio los anticuerpos se pueden recuperar. Las metodologías de ADN recombinante estándar son utilizadas para obtener los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporan estos genes en vectores de expresión recombinante e introducen los vectores en las células hospedadoras, tal como las descritas en Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel y colaboradores (eds.) Current Protocols ¡n Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,397 y 6,914,128, cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente.
Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector de expresión que codifica las cadenas pesada y ligera es transfectado en una célula hospedadora por técnicas estándar. Varias formas del término "transfección" se piensan para comprender una gran variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación , precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque sea teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en las células hospedadoras procarioticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, tal como células hospedadoras mamíferas, es conveniente debido a que tales células eucarióticas, y particularmente las células mamíferas, son más probables que las células procarioticas se agrupen y secreten un anticuerpo plegado correctamente e inmunológicamente activo. La expresión en células procarioticas de los genes de anticuerpo se ha descrito como ineficaz para la producción de altas cantidades de anticuerpo activo (Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia).
Las células hospedadoras convenientes para la clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente son las células procariotas, levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Las células procariotas convenientes para el propósito incluyen eubacteria, tal como organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un anfitrión de clonación de E. Cóli conveniente es E. Coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tal como E. Coli B, E. Coli X1776 (ATCC 31.537), y E. Coli W3110 (ATCC 27.325) son convenientes. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.
Además de las células procariotas, los microbios eucarióticos tal como hongos filamentosos o levadura son anfitriones de clonación o expresión convenientes para los vectores de codificación de polipéptido. Saccharomyces Cerevisiae, o levadura de panadero común, es el más usado comúnmente entre los microorganismos hospedadores eucarióticos inferiores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en la presente, tal como Schizosaccharomyces pombe; anfitriones Kluyveromyces tal como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24, 178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tal como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y anfitriones Aspergillus tal como A. nidulans y A. niger.
Las células hospedadoras convenientes para la expresión de anticuerpos glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células de planta e insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes del baculovirus y las células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de los anfitriones tal como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden utilizar como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, y tabaco también se puede utilizar como anfitriones.
Las células hospedadoras mamíferas convenientes para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster Chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, según lo descrito en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpo se introducen en las células hospedadoras mamíferas, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospedadoras por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual crecen las células hospedadoras. Otros ejemplos de las líneas de células hospedadoras mamíferas útiles son la línea CVI de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionaria humana (células subclonadas 293 ó 293 para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham y colaboradores, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, CHO, Urlaub y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de búfalo-rata (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y colaboradores, Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma hu mano (G2 Hep) , cuyas en señanzas completas son incorporadas en la presente por referencia .
Las cél u las hospedadoras se tra nsforma n con los vectores de expresión o clonación descritos anterio rmente pa ra la prod ucción de a nticuerpos y se cu ltiva n e n los med ios n utrientes convencionales mod ificados seg ú n sea apropiado para ind uci r a los promotores , seleccion ar a los transforma ntes , o amplifica r los genes q ue cod ifican las secuencias deseadas .
Las células hospedadoras usadas para producir un anticuerpo se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tal como F1 0™ de Ham (Sigma), Minimal Essential Médium™ ((MEM), (Sigma), RPMI- 1640 (Sigma), y Dulbecco's Modified Eagle's Médium™ ((DMEM), Sigma) son convenientes para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y colaboradores, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y colaboradores, Anal. Biochem. 102:255 (1 980), Patentes Estadounidenses Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ó 5, 122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de Referencia Estadounidense No. 30,985, se pueden utilizar como medios de cultivo para las células hospedadoras, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia. Cualquiera de estos medios se pueden complementar según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), soluciones amortiguadoras (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidína), antibióticos (tal como fármaco de gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes comúnmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario puede también ser incluido a las concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, por ejemplo temperatura, pH, y similares, son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica.
Las células hospedadoras también se pueden utilizar para producir las porciones de anticuerpos intactos, tal como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejem plo, en ciertas modalidades puede ser deseable transfectar la célula hospedadora con el ADN que codifica la cadena ligera o cadena pesada (pero no ambas) anticuerpo de esta invención. La tecnología de ADN recombinante también se puede utilizar para retirar parte o todo el ADN que codifica cualquiera o ambas cadenas ligera y pesada que no es necesario para unir I L-12, específicamente hlL-12. Las moléculas expresadas de tales moléculas de ADN truncadas también son comprendidas por los anticuerpos de la invención. Además, los anticuerpos bifuncionales se pueden producir en cuya cadena ligera y cadena pesada está un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera es específica para un antígeno distinto de I L-12, reticulando un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo por los métodos de reticulación químicos estándar.
En un sistema conveniente para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo, es introducido en las células dhfr-CHO por la transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo están cada uno unido operativamente a los elementos reguladores del reforzador de CMV/promotor de AdMLP para estimular los altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando la selección/amplificación de metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Las técnicas de biología molecular estándar se utilizan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.
Al usar las técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir de manera intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. En un aspecto, si el anticuerpo se produce de manera intracelular, como una primera etapa, los residuos de partículas, células hospedadoras o células lisadas (por ejemplo, resultantes de la homogeneización), se pueden eliminar, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración . Donde el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se pueden primero concentrar usando un filtro de concentración de proteína dispon ible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon™ o Millipore Pellicon™.
Antes del proceso de la invención , los procedimientos para la purificación de anticuerpos para eliminar los residuos celulares dependen inicialmente del sitio de la expresión del anticuerpo. Algunos anticuerpos se pueden secretar directamente de la célula en los medios de crecimiento circundantes; otros se hacen de manera intracelular. Para los últimos anticuerpos, la primera etapa de un proceso de purificación implica comúnmente: lisis de la célula , que se puede hacer por una variedad de métodos, incluyendo corte mecánico, choque osmótico, o tratamientos enzimáticos. Tal alteración libera el contenido completo de la célula en el homogenado, y además produce fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su tamaño pequeño. Éstos son eliminados generalmente por centrifugación diferenciada o por filtración . Donde se secreta el anticuerpo, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son generalmente primero concentrados usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon™ o Millipore Pellicon™. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, las células hospedadoras recombinantes también se pueden separar del medio de cultivo celular, por ejemplo, por filtración de flujo tangencial. Los anticuerpos se pueden recuperar adicionalmente del medio de cultivo usando los métodos de purificación de anticuerpo de la invención . 4. Purificación de anticuerpo 4.1 Purificación general del anticuerpo La invención proporciona un método para producir una preparación de anticuerpo purificada (o "reducida en HCP") de una mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP. El proceso de purificación de la invención comienza en la etapa de separación cuando el anticuerpo se ha producido usando los métodos descritos anteriormente y los métodos convencionales en la técnica. Comúnmente en la técnica, las mezclas de anticuerpo-HCP son sometidas a la captura de proteína A (por ejemplo, una columna de proteína A) como una etapa de purificación inicial, puesto que el anticuerpo se une a la proteína A mientras que la HCP fluirá directamente. Los métodos de purificación de la presente invención tienen la ventaja que no es necesario someter la mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP a la captura de proteína A (por ejemplo, una columna de proteína A) como una etapa inicial, o como cualquier etapa en el método de purificación. La tabla 1 presenta brevemente una modalidad de un esquema de purificación. Las variaciones de este esquema se consideran y están dentro del alcance de esta invención.
Tabla 1 - Etapas de purificación con su propósito asociado Etapa de purificación Propósito Clarificación de matriz de Recuperación primaria muestra Etapa de purificación Propósito Captura de anticuerpo, Cromatografía de intercambio reducción de proteína de célula catiónico hospedadora e impureza asociada Concentración e intercambio de Ultra filtración /día filtración solución amortiguadora Cromatografía de intercambio Reducción de proteínas de aniónico célula hospedadora y ADN Reducción de agregados de Cromatografía de Phenyl anticuerpo y proteínas de Sepharose™ HP célula hospedadora Eliminación de virus grandes, si Filtración viral están presentes Concentrar y formular el Ultrafiltración/diafiltración final anticuerpo Una vez que se haya obtenido una solución o mezcla clarificada que comprende el anticuerpo, la separación del anticuerpo de las otras proteínas producidas por la célula, tal como HCPs, se realiza usando una combinación de diferentes técnicas de purificación, que incluyen las etapas de separación de intercambio iónico y las etapas de separación de interacción hidrofóbica. Las etapas de separación separan las mezclas de proteínas de acuerdo con su carga, grado de hidrofobicidad, o tamaño. En un aspecto de la invención, la separación se realiza usando la cromatografía, que incluye la interacción catiónica, aniónica, e hidrofóbica. Varias y diferentes resinas de cromatografía están disponibles para cada una de estas técnicas, que permiten la adaptación exacta del esquema de purificación a la proteína particular implicada. La esencia de cada uno de los métodos de separación es que pueden hacer que las proteínas atraviesen a diferentes velocidades bajo una columna, alcancen una separación física que aumenta mientras pasan adicionalmente bajo la columna, o se adhirieran selectivamente al medio de separación, para entonces ser eluídas de manera diferenciada por diferentes solventes. En algunos casos, el anticuerpo se separa de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna y no lo hace el anticuerpo, es decir, el anticuerpo está presente en el flujo directo.
Según lo observado anteriormente, la adaptación exacta de un esquema de purificación se basa en la consideración de que la proteína sea purificará. En ciertas modalidades, las etapas de separación de la presente invención se utilizan para separar un anticuerpo de una o más HCPs. Los anticuerpos que se pueden purificar con éxito usando los métodos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos humanos lgA1 t lgA2, IgD, IgE, Igd, lgG2, lgG3, lgG4, y IgM. En ciertas modalidades, las estrategias de purificación de la presente invención excluyen el uso de la cromatografía de afinidad de proteína A, por ejemplo en el contexto de la purificación de los anticuerpos lgG3) puesto que los anticuerpos lgG3 se unen a la proteína A de manera ineficaz. Otros factores que permiten la adaptación específica de un esquema de purificación incluyen, pero no se limitan a: la presencia o ausencia de una región Fe (por ejemplo, en el contexto del anticuerpo integral con respecto a un fragmento Fab del mismo) debido a que la proteína A se une a la región Fe; las secuencias de línea germinal particulares utilizadas en la generación del anticuerpo de interés; y la composición de aminoácido del anticuerpo (por ejemplo, la secuencia primaria del anticuerpo así como la carga total/hidrofobicidad de la molécula). Los anticuerpos que comparten una o más característica se pueden purificar usando las estrategias de purificación adaptadas para aprovechar esa característica. 4.2. Recuperación primaria Las etapas iniciales de los métodos de purificación de la presente invención implican la primera fase de clarificación y recuperación primaria del anticuerpo de una matriz de muestra. Además, el proceso de recuperación primaria también puede ser un punto en el cual se reducen o desactivan los virus que pueden estar presentes en la matriz de muestra. Por ejemplo, cualquiera de uno o más de una variedad de métodos de reducción/desactivación viral se pueden utilizar durante la fase de recuperación primaria de la purificación que incluye la desactivación por calor (pasteurización), desactivación por pH, tratamiento con solvente/detergente, irradiación con rayos UV y ? y la adición de cierto químico que desactiva los agentes tal como ß-propiolactona o por ejemplo, fenantrolina de cobre como en la Patente Estadounidense No. 4,534,972, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, la matriz de muestra se expone a la reducción/desactivación viral por pH durante la fase de recuperación primaria.
Los métodos de reducción/desactivación viral por pH incluyen, pero no se limitan a, incubación de la mezcla durante un periodo de tiempo a pH bajo, y posteriormente neutralización del pH y eliminación de las macropartículas por filtración. En ciertas modalidades, la mezcla será incubada a un pH de entre aproximadamente 2 y 5, preferiblemente a un pH de entre aproximadamente 3 y 4, y más preferiblemente a un pH de aproximadamente 3.5. El pH de la mezcla de muestra se puede disminuir por cualquier ácido conveniente que incluye, pero no se limita a, ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico, u otros ácidos convenientes. La elección del nivel de pH depende en gran parte del perfil de estabilidad del producto de anticuerpo y componentes de la solución amortiguadora. Se conoce que la calidad del anticuerpo objeto durante la reducción/desactivación de virus a pH bajo, es afectada por el pH y la duración de la incubación a pH bajo. En ciertas modalidades la duración de la incubación a pH bajo será de 0.5 hr a 2 hr, preferiblemente 0.5 hr a 1.5 hr, y más preferiblemente la duración será de 1 hr. La reducción/desactivación de virus es dependiente en estos mismos parámetros además de la concentración de proteína, que puede limitar la reducción/desactivación a altas concentraciones. Así, los parámetros apropiados de la concentración de proteína, pH, y duración de la reducción/desactivación, se pueden seleccionar para alcanzar el nivel deseado de reducción/desactivación virales.
En ciertas modalidades, la desactivación viral se puede alcanzar vía el uso de filtros convenientes. Un ejemplo no limitante de un filtro conveniente es el filtro Ultipor DV50™ de Pall Corporation. Aunque ciertas modalidades de la presente invención utilicen tal filtración durante la fase de recuperación primaria, en otras modalidades se utiliza en otras fases del proceso de purificación, que incluyen la etapa penúltima o final de la purificación. En ciertas modalidades, los filtros alternativos se utilizan para la reducción/desactivación virales, tal como, pero sin limitarse a, filtros Viresolve™ (Millipore, Billerica, Mass.); filtros Zeta Plus VR™ (CUNO; Meriden, Conn.); y filtros Planova™ (Asahi Kasei Pharma, Planova División, Buffalo Grove, III.).
En esas modalidades donde se utiliza la desactivación viral, la mezcla de muestra se puede ajustar, según sea necesario, para las etapas de purificación adicionales. Por ejemplo, después de la desactivación viral a pH bajo el pH de la mezcla de muestra se ajusta comúnmente a un pH más neutral, por ejemplo, de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.5, antes de continuar el proceso de purificación. Además, la mezcla se puede enjuagar con agua para que la inyección (WFI) obtenga una conductividad deseada.
En ciertas modalidades, la recuperación primaria incluirá una o más etapas de centrifugación para clarificar adicionalmente la matriz de muestra y de tal modo ayudar a la purificación de los anticuerpos anti-IL-12, anti-TNFa, o anti-IL-18. La centrifugación de la muestra se puede implementar a, por ejemplo, pero sin limitarse a, 7,000 x g a aproximadamente 12,750 x g. En el contexto de la purificación a gran escala, tal centrifugación puede ocurrir en línea con un caudal determinado para alcanzar, por ejemplo, pero sin limitarse a, un nivel de turbiedad de 150 NTU en el sobrenadante resultante. Tal sobrenadante se puede entonces recolectar para la purificación adicional.
En ciertas modalidades, la recuperación primaria incluirá el uso de una o más etapas de filtración profunda para clarificar adicionalmente la matriz de muestra y de tal modo ayudar a la purificación de los anticuerpos de la presente invención. Los filtros profundos contienen el medio de filtración que tiene una densidad graduada. Tal densidad graduada permite que las partículas más grandes sean atrapadas cerca de la superficie del filtro mientras que partículas más pequeñas penetran las áreas abiertas más grandes en la superficie del filtro, sólo para quedar atrapadas en las aberturas más pequeñas más cerca al centro del filtro. En ciertas modalidades la etapa de filtración profunda puede ser una etapa de filtración profunda deslipidizante. Aunque ciertas modalidades utilizan las etapas de filtración profunda solamente durante la fase de recuperación primaria, otras modalidades utilizan los filtros profundos, que incluyen los filtros profundos deslipidizantes, durante una o más fases de purificación adicionales. Los ejemplos no limitantes de los filtros profundos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen los filtros profundos de Cuno™ modelo 30/60ZA (3 Corp.), y los cartuchos de filtro de doble capa Sartopore™ de 0.45/0.2 µ?t?. 4.3. Cromatografía de intercambio iónico En ciertas modalidades, la presente invención proporciona los métodos para producir una preparación de anticuerpo reducida en HCP de una mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP sometiendo la mezcla a por lo menos a una etapa de separación de intercambio iónico tal que sea obtenido un eluato que comprende el anticuerpo. La separación de intercambio iónico incluye cualquier método por el cual dos sustancias sean separadas con base en la diferencia de sus cargas iónicas respectivas, y puedan utilizar el material de intercambio catiónico o el material de intercambio aniónico.
El uso de un material de intercambio catiónico contra un material de intercambio aniónico se basa en la carga total de la proteína. Por lo tanto, está dentro del alcance de esta invención utilizar una etapa de intercambio aniónico antes del uso de una etapa de intercambio catiónico, o una etapa de intercambio catiónico antes del uso de una etapa de intercambio aniónico. Además, está dentro del alcance de esta invención utilizar solamente una etapa de intercambio catiónico, sólo una etapa de intercambio aniónico, o cualquier combinación serial de las dos.
Al realizar la separación, la mezcla de anticuerpo inicial se puede poner en contacto con el material de intercambio iónico usando cualquiera de una variedad de técnicas, por ejemplo, usando una técnica de purificación por lotes o una técnica cromatográfica.
Por ejemplo, en el contexto de la purificación por lotes, el material de intercambio iónico se prepara en, o se equilibra de acuerdo con la solución amortiguadora inicial deseada. Durante la preparación, o equilibrio, se obtiene una mezcla de material de intercambio iónico. La solución de anticuerpo se pone en contacto con la mezcla para absorber el anticuerpo que se separará en el material de intercambio iónico. La solución que comprende las HCPs que no unen al material de intercambio iónico es separada de la mezcla, por ejemplo, para permitir que la mezcla se asiente y se retire el sobrenadante. La mezcla se puede someter a una o más etapas de lavado. Si se desea, la mezcla se puede poner en contacto con una solución de una conductividad más alta para desorber las HCPs que se han unido al material de intercambio iónico. Para eluir los polipéptidos unidos, se puede aumentar la concentración de sal de la solución amortiguadora.
La cromatografía de intercambio iónico también se puede utilizar como una técnica de separación de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas con base en las diferencias entre la carga total de las moléculas. Para la purificación de un anticuerpo, el anticuerpo debe tener una carga opuesta a la del grupo funcional unido al material de intercambio iónico, por ejemplo, resina, para la unión. Por ejemplo, los anticuerpos, que tienen generalmente una carga positiva total en la solución amortiguadora con un pH debajo de sus pl, se unirán bien al material de intercambio catiónico, que contienen grupos funcionales cargados negativamente.
En la cromatografía de intercambio iónico, los parches cargados en la superficie del soluto son atraídos por las cargas opuestas unidas a una matriz de cromatografía, haciendo que la fuerza iónica de la solución amortiguadora circundante sea baja. La elución es lograda generalmente aumentando la fuerza iónica (es decir, conductividad) de la solución amortiguadora para competir con el soluto por los sitios cargados de la matriz de intercambio iónico. El cambio del pH y de tal modo la alteración de la carga del soluto es otra manera de lograr la elución del soluto. El cambio en conductividad o pH puede ser gradual (elución de gradiente) o por etapas (elución de etapa).
Los sustituyentes aniónicos o catiónicos se pueden unir a las matrices para formar los soportes aniónicos o catiónicos para la cromatografía. Los ejemplos no limitantes de los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amina cuaternaria amina (Q). Los sustituyentes catiónicos incluyen carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonatos (S). Las resinas de intercambio iónico de celulosa tal como DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™, y CM-52™ están disponibles de Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido. Los intercambiadores iónicos basados en SEPHADEX® y unidos a locross también son conocidos. Por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM-, y SP- SEPHADEX® y DEAE-, Q-, CM- y S- SEPHAROSE® y SEPHAROSE® Fast Flow están disponibles de Pharmacia AB. Además, DEAE y CM derivados del copolímero etilenglicol-metacrilato tal como TOYOPEARL™ DEAE-650S o M y TOYOPEARL™ CM-650S o M están disponibles de Toso Haas Co., Philadelphia, Pa.
Una mezcla que comprende un anticuerpo e impurezas, por ejemplo, HCP, se carga en una columna de intercambio iónico, tal como una columna de intercambio catiónico. Por ejemplo, pero sin limitación, la mezcla se puede cargar a una carga de aproximadamente 80 g de proteína/l de resina dependiendo de la columna usada. Un ejemplo de una columna de intercambio catiónico conveniente es una columna de 80 cm de diámetro x 23 cm de largo cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 116 I. La mezcla cargada en esta columna catiónica puede lavarse posteriormente con solución amortiguadora de lavado (solución amortiguadora de equilibrio). El anticuerpo entonces se eluye de la columna, y se obtiene un primer eluato.
Esta etapa de intercambio iónico facilita la captura del anticuerpo de interés mientras que reduce las impurezas tal como HCPs. En ciertos aspectos, la columna de intercambio iónico es una columna de intercambio catiónico. Por ejemplo, pero sin limitación, una resina conveniente para tal columna de intercambio catiónico es la resina CM HyperDF. Estas resinas están disponibles de fuentes comerciales tal como Pall Corporation. Este procedimiento de intercambio catiónico se puede realizar en o a aproximadamente temperatura ambiente. 4.4. Ultrafiltración/diafiltración Ciertas modalidades de la presente invención utilizan etapas de ultrafiltración y/o diafiltración para purificar y concentrar adicionalmente la muestra de anticuerpo IL-12. La ultrafiltración se describe detalladamente en: Microfiltration and Ultrafiltration: Principies and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., 1996); y en: Ultrafiltration Handbook, Muñir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). Un proceso de filtración preferido es filtración de flujo tangencial según lo descrito en el catálogo de Millipore titulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96). La ultrafiltración generalmente es referida como filtración usando los filtros con un tamaño de poro más pequeño de 0.1 µ?t?. Utilizando los filtros que tienen tal pequeño tamaño de poro, el volumen de la muestra se puede reducir a través de la impregnación de la solución amortiguadora de muestra a través del filtro mientras que los anticuerpos IL-12 son conservados.
La diafiltración es un método que usa los ultrafiltros para eliminar e intercambiar las sales, azúcares, y solventes no acuosos, para separarse libremente de las especie unidas, para eliminar el material de bajo peso molecular, y/o para producir el cambio rápido de los ambientes iónicos y/o de pH. Los microsolutos son eliminados más eficientemente agregando el solvente a la solución que es ultrafiltrada a una velocidad aproximadamente igual a la velocidad de u Itratfi Itración . Esto lava las microespecies de la solución a un volumen constante, purificando con eficacia el anticuerpo conservado. En ciertas modalidades de la presente invención, una etapa de diafiltración se utiliza para intercambiar varias soluciones amortiguadoras usadas con respecto a la presente invención, opcionalmente antes de la cromatografía adicional u otras etapas de purificación, así como para eliminar las impurezas de las preparaciones del anticuerpo. 4.5. Cromatografía de interacción hidrofóbica La presente invención también ofrece los métodos para producir una preparación de anticuerpo reducida en HCP de una mezcla que comprende un anticuerpo y por lo menos una HCP que adicionalmente comprende una etapa de separación de interacción hidrofóbica. Por ejemplo, un primer eluato obtenido de una columna de intercambio iónico se puede someter a un material de interacción hidrofóbica tal que es obtenido un segundo eluato que tiene un nivel reducido de HCP. Las etapas de cromatografía de interacción hidrofóbica, por ejemplo las descritas en la presente, se realizan generalmente para eliminar los agregados de proteína, tal como agregados de anticuerpo, e impurezas relacionadas al proceso.
Al realizar la separación, la mezcla de muestra se pone en contacto con el material de HIC, por ejemplo, usando una técnica de purificación por lotes o usando una columna. Antes de purificación por HIC puede ser deseable eliminar cualquier agente caotrópico o sustancia muy hidrofóbica, por ejemplo, pasando la mezcla a través de una columna previa.
Por ejemplo, en el contexto de la purificación por lotes, el material de HIC se prepara en o equilibra de acuerdo con la solución amortiguadora de equilibrio deseada. Una suspensión del material de HIC se obtiene. La solución de anticuerpo se pone en contacto con la suspensión para absorber el anticuerpo que se separará en el material de HIC. La solución que comprende las HCPs que no se unen al material de HIC, es separada de la mezcla, por ejemplo, para permitir que la mezcla se asiente y se pueda retirar el sobrenadante. La suspensión se puede someter a uno o más etapas de lavado. Si se deseada, la mezcla se puede poner en contacto con una solución de conductividad más baja para desorber los anticuerpos que se han unido al material de HIC. Para eluir los anticuerpos unidos, la concentración de la sal se puede disminuir.
Aunque la cromatografía de intercambio iónico se basa en las cargas de los anticuerpos para aislarlos, la cromatografía de interacción hidrofóbica utiliza las propiedades hidrofóbicas de los anticuerpos. Los grupos hidrofóbicos en el anticuerpo interactúan con los grupos hidrofóbicos en la columna. Mientras más hidrofóbica sea una proteína más fuerte interactuará con la columna. Así la etapa de HIC elimina las impurezas derivadas de la célula hospedadora (por ejemplo, ADN y otras especies relacionadas al producto de alto y bajo peso molecular).
Las interacciones hidrofóbicas son las más fuertes a una alta resistencia iónica, por lo tanto, esta forma de separación se realiza convenientemente después de las precipitaciones de sal o procedimientos de intercambio iónico. La adsorción del anticuerpo en una columna de HIC es favorecida por las altas concentraciones de sal, pero las concentraciones reales pueden variar en un intervalo amplio dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y ligando de HIC particular elegido. Varios iones se pueden ordenar en una serie llamada serie solufóbica dependiendo de si promueven las interacciones hidrofóbicas (efectos de eliminación de sal) o alteran la estructura del agua t (efecto caotrópico) y conducen al debilitamiento de la interacción hidrofóbica. Los cationes se clasifican en términos de efecto creciente de eliminación de sal como: Ba+ + ; Ca++; Mg + + ; Li + ; Cs + ; Na + ; K+; Rb+; NH4 + , mientras que los aniones se pueden clasificar en términos de efecto creciente caotrópico como: PO-; S04-; CH3C03-; CI-; Br; N03-; CI04-; I; SCN-.
Generalmente los sulfatos Na, K o NH4 promueven eficazmente la interacción de ligando-proteína en HIC. Las sales pueden ser formuladas para que influencien la resistencia de la interacción según lo dado por la siguiente relación: (NH4)2S04 > Na2S04 > NaCI > NH4CI > NaBr > NaSCN. Generalmente son útiles las concentraciones de sal de entre aproximadamente 0.75 y sulfato de amonio de aproximadamente 2 M o entre NaCI de aproximadamente 1 y 4 M.
Las columnas de HIC comprenden normalmente una matriz base (por ejemplo, agarosa reticulada o material de copolímero sintético) a la cual se unen los ligandos hidrofóbicos (por ejemplo, grupos alquilo o arilo). Una columna de HIC conveniente comprende una resina de agarosa sustituida con grupos fenilo (por ejemplo, una columna Phenyl Sepharose™). Muchas columnas de HIC están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, columna Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow con sustitución baja o alta (Pharmacia LBCB Biotechnology, AB, Suecia); columna Phenyl Sepharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); columna Octyl Sepharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology , AB, Suecia); columnas Fractogel™ EMD Propyl o Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemania); soportes Macro-Prep™ Methyl o Macro-Prep™ t-Butyl (Bio-Rad, California); columna WP Hl-Propyl (C3)™ (J. T. Baker, New Jersey); y columnas de éter, fenilo o butilo Toyopearl™ (TosoHaas, PA). 4.6. Estrategias de purificación ejemplares En ciertas modalidades, la recuperación primaria puede proceder secuencialmente utilizando la reducción de pH, centrifugación, y etapas de filtración para eliminar las células y residuos celulares (incluyendo HCPs) de la cosecha del biorreactor de producción. Por ejemplo, pero sin limitación, un cultivo que comprende los anticuerpos, medios, y células se pueden someter a la reducción/desactivación viral mediada por pH usando un pH ácido de aproximadamente 3.5 durante aproximadamente 1 hora. La reducción de pH se puede facilitar usando preparaciones acidas conocidas tal como ácido cítrico, por ejemplo, 3M de ácido cítrico. La exposición al pH ácido reduce, si no es que elimina completamente, los contaminantes y precipitados virales sensibles al pH virales y algunos medios/contaminantes celulares. Después de esta etapa de reducción/desactivación viral, el pH se ajusta a aproximadamente 4.9 ó 5.0 usando una base tal como hidróxido de sodio, por ejemplo, 3M de hidróxido de sodio, durante aproximadamente veinte a aproximadamente cuarenta minutos. Este ajuste puede ocurrir a aproximadamente 20°C. En ciertas modalidades, el cultivo de ajuste de pH después es centrifugado a aproximadamente 7000 x g a aproximadamente 11,000 x g. En ciertas modalidades, el sobrenadante de muestra resultante entonces se pasa a través de un tren de filtros que comprende múltiples filtros profundos. En ciertas modalidades, el tren de filtros comprende aproximadamente doce filtros profundos de 40.64 cm (16 pulgadas) Cuno™ modelo 30/60ZA (3M Corp.) y aproximadamente tres alojamientos de filtro redondos ajustados con tres cartuchos de 2 filtros de 76.2 cm (30 pulgadas), 0.45/0.2 µ?? Sartopore™ (Sartorius). El sobrenadante clarificado se recolecta en un recipiente tal como un recipiente de cosecha esterilizado previamente y se mantiene a aproximadamente 8°C. Esta temperatura entonces se ajusta a aproximadamente 20°C antes de la etapa o etapas de cromatografía de captura descritas posteriormente. Se debe observar que el experto en la técnica puede variar las condiciones citadas anteriormente y aún estar dentro del alcance de la presente invención.
El sobrenadante clarificado se puede entonces purificar adicionalmente usando una columna de intercambio catiónico. En ciertas modalidades, la solución amortiguadora de equilibrio usada en la columna de intercambio catiónico es una solución amortiguadora que tiene un pH de aproximadamente 5.0. Un ejemplo de una solución amortiguadora conveniente es aproximadamente 210 mM de acetato de sodio, pH 5.0. Después del equilibrio, la columna se carga con la muestra preparada de la etapa de recuperación primaria anterior. La columna se llena con una resina de intercambio catiónico, tal como CM Sepharose™ Fast Flow de GE Healthcare. La columna entonces se lava usando la solución amortiguadora de equilibrio. La columna después se somete a una etapa de elución usando una solución amortiguadora que tiene una mayor resistencia iónica con respecto a la solución amortiguadora de equilibrio o lavado. Por ejemplo, una solución amortiguadora de elución conveniente puede ser de aproximadamente 790 mM de acetato de sodio, pH 5.0. Los anticuerpos IL-12 serán eluídos y se pueden supervisar usando un espectrofotómetro UV ajustado a OD2eonm- En un ejemplo particular, la recolección de elución puede ser de la parte superior 3 OD2aonm a la parte inferior 8 OD2sonm- Se debe entender que el experto en la técnica puede variar las condiciones pero aún estar dentro del alcance de la invención.
En ciertas modalidades, el sobrenadante clarificado obtenido de la recuperación primaria es, de hecho, purificado adicionalmente usando una columna de intercambio aniónico. Un ejemplo no limitante de una columna conveniente para esta etapa es una columna de 60 cm de diámetro x 30 cm de largo cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 85 I. La columna se llena con una resina de intercambio aniónico, tal como Q Sepharose™ Fast Flow de GE Healthcare. La columna se puede equilibrar usando aproximadamente siete volúmenes de columna de una solución amortiguadora apropiada tal como Tris/cloruro sódico. Un ejemplo de condiciones convenientes es 25 m Tris, 50 mM de cloruro sódico a pH 8.0. Nuevamente, un experto en la técnica puede variar las condiciones pero aún estar dentro del alcance de la presente invención. La columna se carga con la muestra recolectada de la etapa de recuperación primaria descrita anteriormente. En otro aspecto, la columna se carga del eluato recolectado durante el intercambio catiónico. Después de la carga de la columna, la columna se lava con la solución amortiguadora de equilibrio (por ejemplo, la solución amortiguadora de Tris/cloruro de sodio). El flujo directo que comprende los anticuerpos IL-12 se puede supervisar usando un espectrofotómetro UV a OD28onm- Esta etapa de intercambio aniónico reduce las impurezas relacionadas al proceso tal como ácidos nucleicos similares al ADN, y proteínas de célula hospedadora. La separación ocurre debido al hecho que los anticuerpos de interés no interactúan ni se unen a la fase sólida de la columna, por ejemplo, Q Sepharose™, pero muchas impurezas interactúan con y se unen a la fase sólida de la columna. El intercambio aniónico puede ser realizado a aproximadamente 12°C.
En ciertas modalidades, el eluato de intercambio catiónico o intercambio aniónico, dependiendo de cual etapa de intercambio iónico se utiliza primero, se filtra después usando, por ejemplo, un filtro deslipidizante Cuno™ de 40.64 cm (16 pulgadas). Esta filtración, usando el filtro deslipidizante, se puede continuar mediante, por ejemplo, un cartucho de filtro de doble capa de 76.2 cm (30 pulgadas) de 0.45/0.2 pm Sartopore™. La solución amortiguadora de intercambio de elución iónico se puede utilizar para enjuagar el volumen residual en los filtros y prepararse para la ultrafiltración/diafiltración .
Para lograr la etapa de ultratfiltración/diafiltración , los medios de filtración se preparan en una solución amortiguadora conveniente, por ejemplo, 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. Una sal tal como cloruro de sodio se puede agregar para aumentar la resistencia iónica, por ejemplo, 100 mM de cloruro de sodio. Esta etapa de ultrafiltración/diafiltración sirve para concentrar los anticuerpos anti-IL-12, eliminar el acetato de sodio y ajustar el pH. Los filtros comerciales están disponibles para efectuar esta etapa. Por ejemplo, Millipore fabrica un contenedor de membrana de ultrafiltro de celulosa de corte de peso molecular (MWCO, por su abreviatura en inglés) de 30 kD. Este procedimiento de filtración se puede conducir en o a aproximadamente temperatura ambiente.
En ciertas modalidades, la muestra de la etapa de filtración de captura anterior se somete a una segunda etapa de separación de intercambio iónico. Preferiblemente esta segunda separación de intercambio iónico implicará la separación basada en la carga opuesta de la primera separación de intercambio iónico. Por ejemplo, si una etapa de intercambio aniónico se utiliza después de la recuperación primaria, la segunda etapa cromatográfica de intercambio iónico puede ser una etapa de intercambio catiónico. Por el contrario, si la etapa de recuperación primaria fuera seguida por una etapa de intercambio catiónico, esa etapa sería seguida por una etapa de intercambio aniónico. En ciertas modalidades el primer eluato de intercambio iónico se puede someter directamente a la segunda etapa cromatográfica de intercambio iónico donde el primer eluato de intercambio iónico se ajusta a las condiciones apropiadas de la solución amortiguadora. Los materiales y condiciones de separación aniónica y catiónica convenientes se describieron anteriormente.
En ciertas modalidades de la presente invención la muestra que contiene los anticuerpos será procesada adicionalmente usando una etapa de separación de interacción hidrofóbica. Un ejemplo no limitante de una columna conveniente para tal etapa es una columna de 80 cm de diámetro x 15 cm de largo cuyo volumen de lecho es de aproximadamente 75 I, que se llena con una resina apropiada usada para MIC, tal como, pero sin limitarse a, Phenyl HP Sepharose™ de Amersham Biosciences, Upsala, Suecia. La preparación de flujo directo obtenida de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico anterior que comprende los anticuerpos de interés se puede diluir con un volumen igual de aproximadamente 1.7 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. Esta entonces se puede someter a la filtración usando un filtro de doble capa de 0.45/0.2 pm Sartopore™, o su equivalente. En ciertas modalidades, el procedimiento de cromatografía hidrofóbico implica dos o más ciclos.
En ciertas modalidades, la columna de HIC primero se equilibra usando una solución amortiguadora conveniente. Un ejemplo no limitante de una solución amortiguadora conveniente es 0.85 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. El experto en la técnica puede variar la solución amortiguadora de equilibrio y aún estar dentro del alcance de la presente invención alterando las concentraciones de los neutralizantes y/o sustituyendo las soluciones amortiguadoras equivalentes. En ciertas modalidades la columna entonces se carga con una muestra de flujo directo de intercambio aniónico y se lava múltiples veces, por ejemplo, tres veces, con un sistema amortiguador apropiado tal como sulfato de amonio/fosfato de sodio. Un ejemplo de un sistema amortiguador conveniente incluye 1.1 M de sulfato de amonio, 50 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio con un pH de aproximadamente 7.0. Opcionalmente, la columna puede experimentar ciclos de lavado adicionales. Por ejemplo, un segundo ciclo de lavado puede incluir múltiples lavados de columna, por ejemplo, una a siete veces, usando un sistema amortiguador apropiado. Un ejemplo no limitante de un sistema amortiguador conveniente incluye 0.85 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. En un aspecto, la columna cargada experimenta aún un tercer lavado usando un sistema amortiguador apropiado. La columna se puede lavar múltiples veces, por ejemplo, una a tres veces, usando un sistema amortiguador tal como 1.1 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio a un pH de aproximadamente 7.0. Nuevamente, el experto en la técnica puede variar las condiciones de amortiguamiento y aún estar dentro del alcance de la presente invención.
La columna se eluye usando una solución amortiguadora de elución apropiada. Un ejemplo conveniente de tal solución de elución amortiguadora es 0.5 M de sulfato de amonio, 15 mM de fosfato de sodio a un pH de aproximadamente 7.0. Los anticuerpos de interés se pueden detectar y recolectar usando un espectrofotómetro convencional de la parte superior a 3 OD28onm a la parte inferior a 3 OD280nm- En ciertos aspectos de la invención, el eluato de la etapa de cromatografía hidrofóbica se somete a la filtración para la eliminación de partículas virales, incluyendo virus intactos, si están presentes. Un ejemplo no limitante de un filtro conveniente es el filtro de Ultipor DV50™ de Pall Corporation. Otros filtros virales se pueden utilizar en esta etapa de filtración y son bien conocidos por los expertos en la técnica. El eluato de HIC se pasa a través de un filtro humedecido previamente de aproximadamente 0.1 µ?t? y un tren de filtros de 5.08 x 76.2 cm (2 x 30 pulgadas) Ultipor DV50™ a aproximadamente 2.34 bar (34 psig). En ciertas modalidades, después del proceso de filtración, el filtro se lava usando, por ejemplo, la solución amortiguadora de elución de HIC para eliminar cualquier anticuerpo conservado en el alojamiento de filtro. El filtrado se puede almacenar en un envase esterilizado previamente a aproximadamente 12°C.
En ciertas modalidades, el filtrado anterior se somete nuevamente a la ultrafiltración/diafiltración. Esta etapa es importante si una conclusión de un experto es utilizar el anticuerpo en, por ejemplo, una formulación farmacéutica. Este proceso, si se utiliza, puede facilitar la concentración de anticuerpo, eliminación de sales de amortiguamiento utilizadas previamente y las sustituye por una solución amortiguadora de formulación particular. En ciertas modalidades, se realiza la diafiltración continua con múltiples volúmenes, por ejemplo, dos volúmenes, de una solución amortiguadora de formulación. Un ejemplo no limitante de una solución amortiguadora de formulación conveniente es 5 mM de metionina, 2% de manitol, 0.5% de sucrosa, solución amortiguadora a pH 5.9 (ningún Tween). Al completar este intercambio de doble volumen se concentran los anticuerpos. Una vez que se haya logrado una concentración predeterminada de anticuerpo, entonces un experto puede calcular la cantidad de 10% de Tween que se debe agregar para lograr una concentración final de Tween de aproximadamente 0.005% (v/v).
Ciertas modalidades de la presente invención incluirán etapas de purificación adicionales. Los ejemplos de los procedimientos de purificación adicional que se pueden realizar antes, durante, o después del método de cromatografía de intercambio iónico incluyen la precipitación de etanol, concentración isoeléctrica, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina Sepharose™, cromatografía de intercambio aniónico adicional y/o cromatografía de intercambio catiónico adicional, cromato-concentración, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando la proteína G, un anticuerpo, un sustrato específico, ligando o antígeno como reactivo de captura).
En ciertas modalidades de la presente invención, el anticuerpo anti-IL-12 es un anticuerpo del isotipo IgAi, lgA2, IgD, IgE, Igd, lgG2, lgG3, lgG4, o IgM que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera presentada en la figura 1. 5. Métodos para analizar la pureza de muestra La presente invención también proporciona los métodos para determinar los niveles residuales de la concentración de proteína de célula hospedadora (HCP) en la composición de anticuerpo aislada/purificada. Según lo descrito anteriormente, las HCPs se excluyen deseablemente del producto de sustancia objeto final, el anticuerpo anti-IL-12. Las HCPs ejemplares incluyen las proteínas que se originan de la fuente de la producción de anticuerpo. La incapacidad de identificar y eliminar de manera suficiente las HCPs del anticuerpo objeto puede conducir a la eficacia reducida y/o reacciones objeto adversas.
Según lo utilizado en la presente, el término "ELISA HCP" se refiere a un ELISA donde el segundo anticuerpo usado en el análisis es específico para las HCPs producidas de las células, por ejemplo, células CHO, usadas para generar el anticuerpo, anticuerpo anti-IL-12. El segundo anticuerpo se puede producir de acuerdo con lós métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el segundo anticuerpo se puede producir usando las HCPs obtenidas por los mismos análisis de producción y purificación, es decir, la misma línea celular usada para producir el anticuerpo de interés se utiliza, pero la línea celular no es transfectada con el ADN de anticuerpo. En una modalidad ejemplar, el segundo anticuerpo se produce usando las HPCs similares a las expresadas en el sistema de expresión celular de elección, es decir, el sistema de expresión celular usado para producir el anticuerpo objeto.
Generalmente, ELISA HCP comprende la inserción de una muestra líquida que comprende HCPs entre dos capas de anticuerpos, es decir, un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo. La muestra se incuba mientras las HCPs en la muestra se capturan por el primer anticuerpo, por ejemplo, pero sin limitarse a anti-CHO de cabra, purificado por afinidad (Cygnus). Un segundo anticuerpo etiquetado, o mezcla de anticuerpos, específico para las HCPs producidas de las células usadas para generar el anticuerpo, por ejemplo, HCP anti-CHO biotinilada, se agrega, y une a las HCPs dentro de la muestra. En ciertas modalidades el primer y segundo anticuerpos son anticuerpos policlonales. En ciertos aspectos el primer y segundo anticuerpos son mezclas de anticuerpos policlonales producidos contra HCPs, por ejemplo, pero sin limitarse a la mezcla de anti-proteína de célula hospedadora de cabra biotinilada 599/626/748. La cantidad de HCP contenida en la muestra es determinada usando la prueba apropiada basada en la etiqueta del segundo anticuerpo.
HCP ELISA se puede utilizar para determinar el nivel de HCPs en una composición de anticuerpo, tal como un eluato o flujo directo obtenido usando el proceso descrito anteriormente. La presente invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo, en donde la composición no tiene ningún nivel detectable de HCPs según lo determinado por un ensayo ¡nmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA", por su abreviatura en inglés) de HCP. 6. Otras modificaciones Los anticuerpos IL-12 de la presente invención se pueden modificar. En algunas modalidades, los anticuerpos IL-12 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se modifican químicamente para proporcionar un efecto deseado. Por ejemplo, la pegilación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se puede realizar por cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, según lo descrito, por ejemplo, en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; y EP 0 401 384, que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. En un aspecto, la pegilacion se realiza vía una reacción de acilación o una reacción de alquilizacion con una molécula de poiietiiengiicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Un polímero soluble en agua conveniente para la pegilacion de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención es poiietiiengiicol (PEG). Según lo utilizado en la presente, se entiende que el "poiietiiengiicol" comprende cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tal como mono(CI- CIO)alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol. v Los métodos para preparar los anticuerpos y fragmentos anticuerpo pegilados de la invención comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con poiietiiengiicol, tal como un derivado de éster o aldehido reactivo de PEG, bajo las condiciones convenientes por las cuales el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. Será evidente para un experto en la técnica seleccionar las condiciones de reacción óptimas o las reacciones de acilación con base en los parámetros conocidos y resultado deseado.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados se pueden utilizar generalmente para tratar los trastornos relacionados con IL-12 de la invención por la administración de los anticuerpos anti-IL-12 y fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. Generalmente los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados han aumentado la vida útil, con respecto a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo no pegilados. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados se pueden utilizar solos, juntos, o en combinación con otras composiciones farmacéuticas.
Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede derivar o unir a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se piensan para incluir las formas derivadas y de otra manera modificadas de los anticuerpos humanos anti-hlL-12 descritos en la presente, incluyendo las moléculas de inmunoadhesión . Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede unir funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra manera) a una o más de otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puedan mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).
Un tipo de anticuerpo derivado es producido reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o diferentes tipos, por ejemplo, para crear los anticuerpos biespecíficos) . Los reticuladores convenientes incluyen los que son heterobifuncionales, que tiene dos grupos distintamente reactivos separados por un separador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Tales enlaces están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Los agentes detectables útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede derivar incluyen los compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen la fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -naftalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también se puede derivar con las enzimas detectables, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, oxidasa de glucosa y similares. Cuando un anticuerpo se deriva con una enzima detectable, es detectado agregando los reactivos adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando la peroxidasa de rábano picante de agente detectable está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de coloración, que es detectable. Un anticuerpo también se puede derivar con biotina, y detectar a través de la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. 7. Composiciones farmacéuticas Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas convenientes para la administración a un sujeto. Comúnmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Según lo utilizado en la presente, el "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, es deseable incluir los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de las sustancias auxiliares tal como agentes de humectación o los emulsificación , conservadores o soluciones amortiguadoras, que aumentan la vida útil o eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica conveniente para la administración parenteral. El anticuerpo o porciones de anticuerpo se pueden preparar como una solución inyectable que contiene, por ejemplo, 0.1-250 mg/ml dé anticuerpos. La solución inyectable se puede componer de una forma de dosificación líquida o liofilizada en un frasco de pedernal o ámbar, ampolla o jeringuilla llenada previamente. La solución amortiguadora puede ser L-histidina de aproximadamente 1-50 mM, (óptimamente 5-10 mM), a pH 5.0 a 7.0 (óptimamente pH 6.0). Otras soluciones amortiguadoras convenientes incluyen pero no se limitan a succcinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio se puede utilizar para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Los crioprotectores se pueden incluir para una forma de dosificación liofilizada, principalmente 0-10% de sucrosa (óptimamente 0.5-1.0%). Otros crioprotectores convenientes incluyen trehalosa y lactosa. Los agentes espesantes se pueden incluir para una forma de dosificación liofilizada, principalmente de 1-10% de manitol (óptimamente 24%). Los estabilizadores se pueden utilizar en las formas de dosificación líquidas y liofilizadas, principalmente 1-50 mM de L-metionina (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes espesantes convenientes incluyen glicina, arginina, se pueden incluir como 0-0.05% de polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01%). Los tensioactivos adicionales incluyen pero no se limitan a polisorbato 20 y tensioactivos de BRIJ.
En un aspecto, la composición farmacéutica incluye el anticuerpo a una dosificación de aproximadamente 0.01 mg/kg-10 mg/kg. En otro aspecto, las dosificaciones de anticuerpo incluyen aproximadamente 1 mg/kg administradas cada semana intermedia, o aproximadamente 0.3 mg/kg administradas cada semana. Un médico experto puede determinar la dosificación y régimen apropiados para administrar a un sujeto.
Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma depende de, por ejemplo, el modo de administración previsto y el uso terapéutico. Las composiciones comunes están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tal como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. Un modo de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En un aspecto, el anticuerpo es administrado por infusión o inyección intravenosa. En otro aspecto, el anticuerpo es administrado por inyección intramuscular o subcutánea.
Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estériles y estables bajo condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como la solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura particular conveniente a alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles liofilizados para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por aspersión que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención se pueden administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica, una ruta/modo de administración son inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como será apreciado por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que proteja el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microcapsulados. Los polímeros biodegradables biocompatibles se pueden utilizar, por ejemplo etilen-vinil-acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o se conocen generalmente por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia.
En ciertos aspectos, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se pueden incluir en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimir en tabletas, o incorporar directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con los excipientes y utilizar en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención de una manera distinta a la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su desactivación.
Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar a las composiciones. En ciertos aspectos, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se co-formula con y/o co-administra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los cuales la actividad de IL-12 es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-12 o porción de anticuerpo de la invención se puede co-formular y/o co-administrar con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que unen otras citocinas o que unen las moléculas de superficie celular). Además, uno o más anticuerpos de la invención se pueden utilizar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así las toxicidades o complicaciones posibles asociadas a varias monoterapias. Será apreciado por el médico experto que cuando los anticuerpos de la invención se utilizan como parte de una terapia de combinación, una dosificación inferior del anticuerpo puede ser deseable que cuando el anticuerpo solo se administra a un sujeto (por ejemplo, un efecto terapéutico sinérgico se puede alcanzar a través del uso de la terapia de combinación que, a su vez, permite el uso de una dosis inferior del anticuerpo para alcanzar el efecto terapéutico deseado).
Se debe entender que los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos se pueden utilizar solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, agente terapéutico, el agente adicional es seleccionado por el experto en la técnica para su propósito previsto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que es tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparte una cualidad beneficiosa a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecte la viscosidad de la composición.
Se debe entender adicionalmente que las combinaciones que se incluirán dentro de esta invención son las combinaciones útiles para su propósito previsto. Los agentes mencionados posteriormente son ilustrativos y no propuestos como limitantes. Las combinaciones que son parte de esta invención pueden ser los anticuerpos de la presente invención y por lo menos un agente adicional seleccionado de las listas posteriores. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar su función prevista.
Algunas combinaciones son fármacos antiinflamatorios no esteroideos también referidos como NSAIDS que incluyen fármacos tal como ibuprofeno. Otras combinaciones son corticosteroides que incluyen prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esteroides pueden ser reducidos o incluso ser eliminados disminuyendo la dosis de esteroides requerida al tratar a pacientes en combinación con los anticuerpos de esta invención. Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la artritis reumatoide con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede combinar incluyen los siguientes: fármacos antiinflamatorios supresores de citocina (CSAID); anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los anticuerpos en las moléculas de superficie celular tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos que incluyen CD 154 (gp39 o CD40L).
Algunas combinaciones de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada inflamatoria autoinmune y subsecuente; los ejemplos incluyen antagonistas de TNF similares a los anticuerpos de TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7, (Solicitud Estadounidense Número de Serie 08/599,226 presentada el 9 de febrero de 1996, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870), y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados de los mismos, (p75TNFRIgG (Enbrel™) o p55TN FRIgG (Lenercept), receptor de IL-13 soluble (slL-13), y también inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE); similarmente los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, inhibidores de enzima de conversión de lnterleucina-1 , tal como Vx740, o IL-1RA, etc.) pueden ser eficaces por la misma razón. Otras combinaciones incluyen Interleucina 11, anti-P7s y ligando de glicoproteína de selectina P. Aún otras combinaciones implican otros protagonistas esenciales de la respuesta autoinmune que pueden actuar de manera paralela, dependiente o en combinación con la función de IL-12; son especialmente incluidos los antagonistas de IL-18 que incluyen los anticuerpos de IL-18 o receptores solubles de IL-18, o proteínas de unión de IL-18. Se ha demostrado que IL-12 e IL-18 están traslapados pero las funciones distintas y una combinación de antagonistas a ambos pueden ser las más eficaces. Aún otra combinación incluye los inhibidores anti-CD4 no agotables. Aún otras combinaciones incluyen antagonistas de la trayectoria co-estimulante CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) que incluyen los anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagónicos.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con los agentes, tal como metotrexato, 6-MP, sulfasalazina de azatioprina, mesalazina, cloroquinina/hidroxicloroquinina de olsalazina, penicilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, coquicina, corticoesteroides (orales, inhalados e inyección local), agonistas de adrenorreceptores ß-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromilo, ketotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NDC, IKK, p38 o MAP), inhibidores de enzima de conversión de I L- 1 ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P, inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE), inhibidores de la señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o de p75 solubles y derivados p75TNFRIgG (Enbrel.TM.) y p55TNFRIgG (Lenercept), slL-1 Rl, sIL-IRII, SIL-6R, receptor de IL-13 soluble (slL-13)) y citocinas antiinflamatorios (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF ). Algunas combinaciones incluyen metotrexato o leflunomida y en los casos moderados o severos de artritis reumatoide, ciclosporina.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la enfermedad intestinal inflamatoria con la cual un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede combinar incluyen los siguiente: budesónida, factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipooxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas de receptor IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1a, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los anticuerpos en las moléculas de superficie celular tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes, tal como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP), inhibidores de enzima de conversión de 1ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P, inhibidores de enzima de conversión de TNFa, inhibidores de señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa , sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, slL-1RI, slL-1RII, slL-6R, receptor de IL-13 (sll_-13) soluble) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF3).
Los ejemplos de los agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn en los cuales un anticuerpo o porción de unión a antígeno se puede ser combinar incluyen los siguientes, antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (Solicitud Estadounidense Número de Serie 08/599,226, presentada el 9 de febrero de 1996, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia), cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870), constructos de TNFR-lg (p75TN FRIgG (Enbrel™) y p55TNFRIgG (Lenercept)), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P (PSGL), receptor soluble de IL-13 (slL-13), e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antigeno de los mismos, se pueden combinar con los corticosteroides, por ejemplo, budesónida y dexametasona. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con agentes tal como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicí lico y olsalazina, y los agentes que interfieren con la síntesis o acción de citocinas proinflamatorias tal como IL-1, por ejemplo, inhibidores de enzima de conversión de IL-1 (por ejemplo, Vx740) e I L- 1 ra . Los anticuerpos de la invención o porción de unión a antígeno de los mismos también se pueden utilizar con los inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo, inhibidores de la tirosina cinasa tal como 6-mercaptopurinas. Los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con IL-11.
Los ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los cuales un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se pueden combinar incluyen los siguientes: corticosteroides, prednisolona, metilprednisolona, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, 4-aminopiridina, tizanidina, IFN ia (Avonex; Biogen), IFNpib (Betaseron; Chiron/Berlex), copolímero 1 (Cop-1, Copaxone, Teva Pharmaceutical Industries, Inc.), oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, cladribina, anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humano, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden combinar con los anticuerpos en las moléculas de superficie celular tal como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, también se pueden combinar con los agentes, tal como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, NSAIDs, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NIK, IKK, p38 o MAPA), inhibidores de enzima de conversión de l L- 1 ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P, inhibidores de TACE, inhibidores de señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, sIL-1RI, sIL-IRII, SIL-6R, receptor de IL-13 (slL-13) soluble) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF ).
Los ejemplos de los agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple en los cuales el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se puede combinar, incluyen IFN , por ejemplo, IFNpia e IFN31b, copaxona, corticosteroides, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para el ligando CD40 y CD80.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tal como estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y de la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Comúnmente, puesto que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, un solo bolo se puede administrar, varias dosis divididas se pueden administrar en un cierto periodo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. En ciertas modalidades es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación según lo utilizado en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para que los sujetos mamíferos sean tratados; cada unidad comprende una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención se dicta por y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y efecto terapéutico o profiláctico particular que se alcanzará, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Un intervalo ejemplar no limitante para la cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0.01-20 mg/kg, ó 1-10 mg/kg, ó 0.3-1 mg/kg. Se debe observar que los valores de la dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición que se aliviará. Se debe entender adicionalmente que cualquier régimen de dosificación específico objeto particular se debe ajustar en un cierto periodo de tiempo de acuerdo con la necesidad individual y juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en la presente son ejemplares solamente y no están pensados como limitantes del alcance o práctica de la composición reivindicada. 8. Usos de los anticuerpos de la invención 8.1. Usos generales Debido a su capacidad de unirse a IL-12, los anticuerpos anti-IL-12, o porciones de los mismos, de la invención se pueden utilizar para detectar IL-12, en un aspecto, lL-12 (por ejemplo, en una matriz de muestra, en un aspecto, una muestra biológica, tal como suero o plasma), usando un inmunoensayo convencional, tal como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) o inmunohistoqu ímica de tejido. La invención proporciona un método para detectar IL-12 en una muestra biológica que comprende el contacto de una muestra con un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención y la detección del anticuerpo (o porción de anticuerpo) unido a IL-12 o anticuerpo no unido (o porción de anticuerpo), para de tal modo detectar IL-12 en la muestra. El anticuerpo se etiqueta directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables convenientes incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas convenientes incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos convenientes incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes convenientes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales radioactivos convenientes incluyen 25l, 13 l, 35S, ó 3H. La detección de IL-12 en una muestra puede ser útil en un contexto de diagnóstico, por ejemplo en la diagnosis de una condición asociada a IL-12 creciente, y/o puéde ser útil en la identificación de un sujeto que pueda beneficiarse del tratamiento con un anticuerpo anti-IL-12.
Alternativamente para etiquetar el anticuerpo, IL-12 se puede probar en una muestra por un ¡nmunoensayo de competencia que utiliza, por ejemplo, los estándares de rh IL-12 etiquetados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-12 sin etiqueta, tal como un anticuerpo anti-hlL-12. En este análisis, se combina la muestra, los estándares rhlL-12 etiquetados, y el anticuerpo a nti-h I L- 2 y se determina la cantidad del estándar de rhlL-12 etiquetado unido al anticuerpo sin etiqueta. La cantidad de hlL-12 en la muestra es proporcionalmente inversa a la cantidad del estándar de rhlL-12 etiquetado unido al anticuerpo anti-h I L- 12.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención son capaces de neutralizar la actividad de IL-12 in vitro e in vivo, en un aspecto, una actividad de hlL-12. Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para inhibir la actividad de IL-12, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene IL-12, en temas humanos o en otros temas mamíferos que tienen IL-12 con el cual un anticuerpo de la invención reacciona de manera cruzada (por ejemplo, primates tal como babuino, mono Cynomolgus y Rhesus). En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la actividad de IL-12 de humano, y por lo menos una IL-12 de primate adicional seleccionado del grupo que consiste de IL-12 de babuino, IL-12 de mono tití, IL-12 de chimpancé, IL-12 de cynomolgus y IL-12 de rhesus, pero que no neutraliza la actividad de IL-12 de ratón. En un aspecto, IL-12 es IL-12 de humano. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o se sospecha que contiene hlL-12, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se puede agregar al medio de cultivo para inhibir la actividad de hlL-12 en el cultivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de IL-12 en un sujeto que sufre de un trastorno en el cual la actividad de IL-12 es perjudicial. IL-12 se ha implicado en la patofisiolog ía de una gran variedad de trastornos (Windhagen y colaboradores, (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996; Morita y colaboradores (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314; Bucht y colaboradores, (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais y colaboradores (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Pyrronchi y colaboradores, (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone y colaboradores, (1997) Gastroenterology. 112:1169-1178, y Berrebi y colaboradores, (1998) Am. J. Path 152:667-672; Pyrronchi y colaboradores (1997) Am. J. Path. 150:823-832, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). La invención proporciona los métodos para inhibir la actividad de IL-12 en un sujeto que sufre de tal trastorno, en donde el método comprende la administración al sujeto de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención tal que la actividad de IL-12 en el sujeto sea inhibida. En un aspecto, IL-12 es IL-12 de humano y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa IL-12 con el cual un anticuerpo de la invención reacciona de manera cruzada. Incluso el sujeto puede ser un mamífero en el cual se ha introducido hlL-12 (por ejemplo, por administración de hlL-12 o por expresión de un transgén de hlL-12). Un anticuerpo de la invención se puede administrar a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Por otra parte, un anticuerpo de la invención se puede administrar a un mamífero no humano que expresa un IL-12 con el cual el anticuerpo reacciona de manera cruzada para propósitos veterinarios o como modelo animal de la enfermedad humana. Con respecto a esté último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de las dosificaciones y evolución de la administración).
Según lo utilizado en la presente, la frase "un trastorno en donde la actividad de IL-12 es perjudicial" se piensa para que incluya las enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de IL-12 en un sujeto que sufre del trastorno ha mostrado ser o se sospecha que sea responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye a un agravamiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de IL-12 es perjudicial es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad de IL-12 alivie los síntomas y/o progreso del trastorno. Tales trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento de la concentración de IL-12 en un líquido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento de la concentración de IL-12 en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto), que puede ser detectada, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-12 según lo descrito anteriormente. Existen numerosos ejemplos de los trastornos en los cuales la actividad de IL-12 es perjudicial. En un aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden utilizar en la terapia para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente. En otro aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden utilizar para la fabricación de una medicina para tratar las enfermedades o trastornos descritos en la presente. El uso de los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención en el tratamiento de algunos trastornos específicos no limitantes se discute más detalladamente a continuación.
La interleucina-12 desempeña una función esencial en la patología asociada a una variedad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, dermatitis atópica, enfermedad de anfitrión contra injerto, rechazo a trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con el trasplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítís, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, afecciones malignas, paro cardíaco, infarto del miocardio, enfermedad de Addison, caso esporádico, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) en adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reíter, artropatía psoriásica, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, yersinia y artropatía relacionada con salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, Enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerótica primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas a la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria , neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de tejido conectivo mezclada, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada al lupus sistémico eritematoso, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjodgren, enfermedad pulmonar asociada la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis por radiación, bronquitis obliterante, pulmonía eosinófila crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfección, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a la insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada al trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada al trasplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerótica primaria, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS en enfermedad renal, glomerulonefritides, vasulitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), diabetes mellitus dependiente de insulina, oftalmía simpatética, hipertensión pulmonar después de enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocítopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad de tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria y vitíligo. Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar las enfermedades autoinmunes, particularmente las asociadas a la inflamación, que incluyen, espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, y uveítis autoinmune.
En ciertos aspectos, los anticuerpos de la invención o porciones de unión a antígeno de los mismos, se utilizan para tratar la artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina y psoriasis. 8.2. Uso en artritis reumatoide La interleucina-12 se ha implicado en el desempeño de una función en enfermedades inflamatorias tal como artritis reumatoide. El mensaje de IL-12p40 inducible se ha detectado en fluido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide y IL-12 ha mostrado estar presente en los fluidos sinoviales de los pacientes con artritis reumatoide (ver, Morita y colaboradores, (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). Las células positivas a IL-12 se han encontrado presentes en la capa subíntima del sinovio de artritis reumatoide. Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar, por ejemplo, la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis de Lyme, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa. Comúnmente, el anticuerpo, o porción de anticuerpo, se administra sistémicamente, aunque para ciertos trastornos, la administración local del anticuerpo o porción de anticuerpo puede ser beneficiosa. Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención también se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
En el modelo murino de artritis inducida por colágeno (CIA) para la artritis reumatoide, el tratamiento de ratones con un mAb anti-IL-12 (anticuerpo monoclonal IL-12 anti-ratón de rata, C17.15) antes de la artritis suprimió profundamente el inicio, y redujo la incidencia y gravedad de la enfermedad. El tratamiento con mAb anti-IL-12 temprano después del inicio de la artritis redujo la gravedad, pero el tratamiento tardío de los ratones con mAb anti-IL-12 después del inicio de la enfermedad tuvo un efecto mínimo sobre la gravedad de la enfermedad. 8.3. Uso en la enfermedad de Crohn la interleucina-12 también desempeña una función en la enfermedad intestinal inflamatoria, y enfermedad de Crohn. La expresión creciente de IFN-? y IL-12 ocurre en la mucosa intestinal de los pacientes con enfermedad de Crohn (ver, por ejemplo, Fais y colaboradores, (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Pyrronchi y colaboradores, (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; onteleone y colaboradores, (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi y colaboradores, (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Los anticuerpos anti-IL-12 han mostrado para suprimir la enfermedad en modelos ratón con colitis, por ejemplo, ratones transgénicos para IL-12 con colitis inducida con TNBS, y recientemente en ratones transgénicos para IL-10. Por consiguiente, los anticuerpos, y porciones de anticuerpo, de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento de las enfermedades intestinales inflamatorias. 8.4. Uso en la esclerosis múltiple La interleucina-12 se ha implicado como mediador esencial de la esclerosis múltiple. La expresión del mensaje inducible en p40 de IL-12 o IL-12 por si misma se puede mostrar en las lesiones de pacientes con esclerosis múltiple (Windhagen y colaboradores, (1995) J. Exp. Med 182: 1985-1996, Drulovic y colaboradores, (1997) J. Neurol. Sci. 147.145-150, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Los pacientes con esclerosis múltiple progresiva crónica tienen niveles elevados en circulación de IL-12. Las investigaciones con las células T y las células que presentan el antígeno (APCs) de los pacientes con esclerosis múltiple, revelaron una serie de interacciones inmunes autoperpetuables como la base de la esclerosis múltiple progresiva que conduce a una inmunorespuesta de tipo Th1. La secreción creciente de IFN-? de las células T condujo a la producción creciente de IL-12 por las APCs, que perpetuaron el ciclo que condujo a un estado crónico de una activación y enfermedad inmune de tipo Th1 (Balashov y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 599-603, cuya enseñanza completa es incorporada en la presente por referencia). La función de IL-12 en la esclerosis múltiple se ha investigado usando modelos experimentales ratón y rata con encefalomielitis alérgica (EAE) de la esclerosis múltiple. En un modelo de EAE en reincidencia-remisión de la esclerosis múltiple en ratones, el tratamiento previo con mAb anti-IL-12 retrasó la parálisis y redujo los conteos clínicos. El tratamiento con mAb anti-IL-12 en el pico de la parálisis o durante el período de remisión subsecuente redujo los conteos clínicos. Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los síntomas asociados a la esclerosis múltiple en seres humanos. 8.5. Uso en la diabetes mellitus dependiente de insulina La interleucina-12 se ha implicado como mediador importante de la diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM, por su abreviatura en inglés). La IDDM fue inducida en ratones NOD por la administración de IL-12, y los anticuerpos anti-IL-12 fueron protectores en un modelo de transferencia adoptiva de IDDM. Los pacientes con inicio temprano de IDDM experimentan frecuentemente un llamado "período de luna de miel" durante el cuál se mantiene una cierta función residual de la célula del islote. Estas células residuales del islote producen la insulina y regulan los niveles de glucosa en sangre de una mejora manera que la insulina administrada. El tratamiento de estos pacientes de inicio temprano con un anticuerpo anti-IL-12 puede prevenir la destrucción adicional de las células del islote, para de tal modo mantener una fuente endógena de insulina. 8.6. Uso en la psoriasis La interleucina-12 se ha implicado como mediador esencial en la psoriasis. El psoriasis implica las lesiones de piel agudas y crónicas que se asocian a un perfil de expresión de citocina tipo TH1. (Hamid y colaboradores (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225-231; Turka y colaboradores (1995) Mol. Med. 1: 690-699, cuyas enseñanzas completas son incorporadas en la presente por referencia). Los ARNms p35 y p40 de IL-12 fueron detectados en muestras de piel humana enfermas. Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los trastornos crónicos de la piel tal psoriasis.
Ejemplos 1. Aislamiento y purificación del anticuerpo anti-IL-12 Este ejemplo proporciona un esquema para purificar los anticuerpos anti-IL-12 de las proteínas de célula hospedadora asi como de otras impurezas.
Recuperación primaria La recuperación primaria por reducción de pH, centrifugación y filtración fue utilizada para eliminar las células y residuos celulares de una cosecha de biorreactor de producción. El cultivo que comprende los anticuerpos, medios, y células de interés fue desactivado por pH a 3.5 durante 1 hora para eliminar los posibles contaminantes virales sensibles a pH y precipitar el medio/contaminantes celulares en el biorreactor de producción de 300 I. El cultivo entonces fue ajustado hasta pH 4.9. La reducción de pH fue alcanzada con 3 M de ácido cítrico durante un periodo de 20 a 40 minutos. El aumento de pH fue realizado usando 3 M de hidróxido de sodio durante un periodo de 20 a 40 minutos. Estas operaciones ocurrieron a una temperatura de 20°C. Después de la desactivación por pH, el cultivo fue centrifugado en otro biorreactor usado como tanque de depósito. La centrifuga fue operada a 11,000 x g a un nivel de entrada de 28 l/min. El volumen de intervalo de descarga fue ajustado a 300 segundos para lograr un nivel bajo de turbiedad de 150. El filtrado de centrifugadora fue pasado a través de un tren de filtros que comprende doce filtros profundos de 40.64 cm (16 pulgadas) Cuno™ modelo 30/60ZA y un alojamiento de filtro con tres módulos ajustado con tres cartuchos de filtro de 76.2 cm (30 pulgadas) 0.45/0.2 µ?t? Sartopore™. El sobrenadante clarificado fue recolectado en un tanque de cosecha fijado de 3000 I esterilizado previamente y mantenido a 8°C. La temperatura fue ajustada hasta 20°C antes de la cromatografía de intercambio iónico.
Los títulos de ABT-874 en la cosecha, para varias muestras referidas como 28085BI, 28204BI, 28206BI, 28207BI, y 34142BI, oscilaron de 3.76 a 4.05 mg/ml con un promedio de 3.91 mg/ml. La reducción de pH prolongada del caldo de cultivo celular y el aumento de pH y centrifugación subsecuentes de la cosecha dio lugar a producciones de recuperación totales que se oscilaron de 77% a 84% con un promedio de 82% y una desviación estándar de 2.11 (ver las tablas 2 y 3). La cuantificación de anticuerpo fue determinada usando un análisis de cuantificación Poros A™ (bien conocido por los expertos en la técnica) a través de esta etapa. Tabla 2. Datos de recuperación primaria para varios lotes de muestras Recuperación primaria Lote de fermentación # 28085BI 28204BI 28206BI 28207BI 34142BI Etapa de proceso Concentración de Ab 3.9 4.05 3.84 3.99 3.76 (producto) en cosecha (g/l) Peso de cultivo final 2439 2387 2467 2494 2464 (kg) Producto total en cosecha 9512 9667 9473 9951 9265 (g) 3 M de ácido cítrico 78 62 79 95 81 agregado (g) pH durante 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 reducción Recuperación primaria Lote de fermentación # 28085BI 28204BI 28206BI 28207BI 34142BI Etapa de proceso Duración de pH bajo 63 70 60 69 64 (minutos) 3 M de hidróxido de 111 89 117 142 116 sodio agregado (g) pH después de la 4.89 4.9 4.9 4.9 4.85 reducción de PH Peso final de cosecha 2478 2402 2531 2447 2449 clarificada (kg) Concentración de cosecha 3.23 3.33 3.09 3.15 3.11 clarificada de producto (g/l) Recuperación primaria Lote de fermentación # 28085BI 28204BI 28206BI 28207BI 34142BI Etapa de proceso Cosecha clarificada de 8004 7997 7821 7708 7616 producto total (g) Producción de etapa de producto de 84 83 83 77 82 cosecha total (%) Tabla 3. Análisis de la etapa de recuperación primaria Promedios de recuperación Cinco lotes de muestras primaria Etapa de proceso *PROM *SD *% CV Peso de cosecha clarificada 2461 47.6 1.93 final (kg) Concentración de cosecha 3.18 0.1 3.14 clarificada de producto (g/l) Cosecha clarificada de producto 7829 172.4 2.2 total (g) Producción de etapa de producto 82 2.77 3.38 de cosecha total (%) *PROM = promedio; SD = desviación estándar; % CV = coeficiente porcentual de variación Intercambio catiónico El objetivo de la etapa de cromatografía de captura de intercambio catiónico es la captura del anticuerpo del filtrado profundo y la reducción de las impurezas relacionadas al proceso (por ejemplo, proteínas de célula hospedadora, especie de bajo peso molecular de anticuerpo relacionado y componentes medios). La resina CM HyperDF™ (Pall Corporation) fue utilizada para esta etapa de proceso. La etapa de captura de CM HyperDF™ fue realizada a temperatura ambiente.
Una columna de 80 cm de diámetro x 23 cm de largo (volumen de lecho de 116 I) fue utilizada para esta operación. Las etapas de columna de equilibrio previo, equilibrio, carga, lavado, y regeneración fueron realizadas a 16.0 l/min (velocidad lineal = 191 cm/hr). Las etapas de columna de elución, separación, lavado, neutralización, esterilización, y almacenamiento fueron realizadas a 9.2 l/min (velocidad lineal = 110 cm/hr). La columna fue equilibrada con 210 mM de acetato de sodio, pH 5.0. Después del equilibrio, la columna fue cargada con la cosecha clarificada que se diluye en línea con agua purificada USP. La columna fue cargada a un máximo de 80 g de proteína por litro de resina (=9248 g por ciclo). La columna entonces fue lavada a la línea base con la solución amortiguadora de equilibrio. El producto fue eluído con 790 mM de acetato de sodio, pH 5.0. La recolección de elución fue de la parte superior a 3 OD28onm a la parte inferior 8 OD28onm del pico de elución de anticuerpo .
La columna fue regenerada con 1 M de cloruro de sodio, lavada con 1 M de ácido acético deslipidizante/20% de alcohol de isopropilo, lavada con 790 mM de acetato de sodio, pH 5.0, esterilizada con 0.5 M de hidróxido de sodio, seguido con 790 mM de acetato de sodio, pH 5.0, y almacenada con 25 mM de fosfato de sodio, 20% alcohol de isopropilo (I PA) .
Un ciclo de la etapa de cromatografía de CM HyperDF™ fue realizado para cada lote de muestras examinado. La carga promedio para los lotes de muestras fue de 67.38 g anticuerpo/1 de resina CM HyperDF™ con la desviación estándar de 1.37; que oscila de 65.27 a 68.62 g/l (ver las tablas 4 y 5). Las producciones de recuperación de producto oscilaron de 83% a el 96% con un promedio de el88% para los lotes 29001 BF, 29008BF, 30005BF, 30006BF, y 35036BF y desviación estándar de 5.17. Para la cosecha clarificada, la cuantificación de anticuerpo fue determinada usando un análisis de cuantificación Poros A™ y para el eluato de CM HyperDF™, la cuantificación de A2sonm fue utilizada. Los criterios de corte para el mínimo del pico de producto de elución de CM HyperDF™ fueron altos para cortar la especie de anticuerpo relacionada con el producto de doble cadena ligera para alcanzar la pureza del producto. Esto hizo que las producciones totales de la etapa de cromatografía de CM HyperDF™ oscilaran de 95% a aproximadamente 80%.
No se observó ninguna diferencia significativa de pureza de CLAR de exclusión de tamaño (SE) para los cinco ciclos. La tabla 16 muestra el promedio de 94.76% para IgG monomérico con una desviación estándar de 0.67.
Tabla 4. Datos de cromatografía de CM HyperDF™ Cromatografía de CM HyperDF™ Lote de muestras # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Volumen de carga de cosecha 2464 2380 2512 2418 2434 clarificada (kg = 1) Concentración de carga de producto en CM HyperDF™ 3.23 3.33 3.09 3.15 3.11 (cosecha clarificada) (g/i) Producto total de carga en 7959 7926 7761 7615 7571 CM HyperDF™ (g) Cromatografía de CM HyperDF™ Lote de muestras # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Capacidad de carga de producto por 68.62 68.33 66.90 65.65 65.27 resina de CM HyperDF™ (g/i) Volumen de inicio de pico 89.8 88.5 64.9 72.9 58.6 de eluato (1) del programa Volumen final de pico de 288.1 286 306.1 295.0 329.6 eluato (1) del programa Cromatografía de CM HyperDF™ Lote de muestras # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Volumen de eluato de CM 200.8 199.1 245.2 227.7 275.8 HyperDF™ (kg = 1) Concentración de eluato de 33.05 35.6 26.72 31.97 24.39 CM HyperDF™ (g/i) Producto total de eluato de 6636 7088 6552 7280 6727 CM HyperDF™ (g) Producción de producto total 83 89 84 96 89 por etapa (%) Tabla 5. Análisis de la etapa de croma tografía de CM HyperDF™ Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de CM HyperDF™ Etapa de proceso PROM SD % C Producto total de eluato de 6857 312.6 4.56 CM HyperDF™ (g) Producción de producto total 88 5.17 5.88 por etapa (%) Ultrafiltración/dia filtración (UF/DF) de captura El eluato de CM HyperDF™ fue filtrado vía el filtro profundo deslipidizante (2.54 cm x 40.64 cm (1 x 16 pulgadas), Cuno™ Corporation) seguido con cartucho de filtro de doble capa de 0.45/0.2 µ?t? Sartopore™ (2.54 cm x 76.2 cm (1 x 30 pulgadas)). La solución amortiguadora de eluído de C HyperDF™, 790 mM de acetato de sodio, pH 5.0, fue utilizada para enjuagar el volumen residual restante en los filtros. La ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) del eluato deslipidizante de CM HyperDF™ fue realizada para concentrar los anticuerpos de interés, eliminar el acetato de sodio y amortiguar el intercambio del producto en 100 mM de cloruro de sodio, 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. Los módulos de membrana de tipo ultrafiltro de celulosa regenerada Millipore Corporation con un atajo de peso molecular (MWCO) de 30 kD, fueron utilizados para esta etapa a temperatura ambiente.
La membrana regenerada de celulosa de 30 kD fue enjuagada con 790 mi de acetato de sodio, pH 5.0 antes del comienzo de la adición de producto. El eluato deslipidizante de CM HyperDF™ fue concentrado a 40 g/l de proteína con presiones de entrada de 1.37-2.06 bar (20-30 psig) y presiones de salida de 0.68-1.03 bar (10-15 psig) y un caudal de retenido de 52 l/min a 104 l/min. Fue realizada la diafiltración continua con un mínimo de seis volúmenes de 100 mM de cloruro de sodio, 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. El sistema de UF entonces fue drenado del producto a una concentración objeto de 42.5 g/l de proteína. El sistema fue enjuagado con solución amortiguadora de diafiltración para recuperar el producto soportado en el sistema. El concentrado y lavado fueron combinados para producir el ABT-874 diafiltrado. Esta etapa fue realizado a temperatura ambiente. La matriz de muestra fue filtrada con un filtro de 2.0/1.2 µ?t? de cápsula OpticapXUBO™ seguido con un cartuchos de filtro de doble capa de 0.45/0.2 µ?t? Sartopore™ (2.54 x 76.2 cm (1 x 30 pulgadas)).
La filtración deslipidizante y UF/DF de la etapa de eluato de CM HyperDF™ dieron lugar a una producción de recuperación de producto promedio de 5.92 kg para varios lotes de muestras (es decir, 29001BF, 29008BF, 30005BF, 30006BF, y 35036BF); que oscilaron de 80%-94% (ver las tablas 6 y 7).
La pureza por SE-HPLC fue aceptable para los cinco ciclos. La tabla 16 muestra el promedio de 95.79% para IgG con una desviación estándar de 0.57.
Tabla 6. Filtración deslipidizante y UF/DF de los datos de eluído de CM HyperDF™ de los lotes de muestras Filtración deslipidizante y UF/DF de eluato de CM HyperDF™ Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso Volumen de inicio de CM 200.8 199.1 245.2 227.7 275.8 HyperDF™ (kg =1) Concentración de eluato de CM 33.05 35.6 26.72 31.97 24.39 HyperDF™ (g/i) Producto total de eluato de 6636 7088 6552 7280 6727 CM HyperDF™ (g) Filtración deslipidizante y UF/DF de eluato de CM HyperDF™ Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso Volumen de solución amortiguadora de eluato de CM para 70 71 135 143 141 enjuagar el filtro deslipidizante (1) Volumen de solución amortiguadora 1003 1106 913 1034 1051 de diafiltración (l) Volumen de 136.8 163.6 149.9 189.8 163.6 retenido de UF/DF (kg = 1) Filtración deslipidizante y UF/DF de eluato de CM HyperDF™ Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso Concentración de retenido 38.93 36.47 40.36 31.18 38.72 de UF/DF (kg = 1) Producto total de retenido 5326 5966 6050 5918 6334 de UF/DF (g) Producción de producto total 80 84 92 81 94 por etapa (%) Tabla 7. Análisis de filtración deslipidizante y UF/DF de I datos de eluato de CM HyperDF™ Promedios de filtración Cinco lotes de muestras deslipidizante y UF/DF Etapa de proceso PROM SD % CV Volumen de inicio de CM 229.72 32.175 14.01 HyperDF™ (kg = I) Promedios de filtración Cinco lotes de muestras deslipidizante y UF/DF Etapa de proceso PROM SD % CV Concentración de eluato de 30.35 4.642 15.29 CM HyperDF™ (g/l) Producto total de eluato de 6857 312.6 4.56 CM HyperDF™ (g) Volumen de solución amortiguadora de eluato de 112 38 33.93 CM para enjuagar el filtro deslipidizante (1) Volumen de solución amortiguadora de diafiitración 1021 71.1 6.96 (l) Volumen de retenido de 160.7 19.694 12.26 UF/DF (kg = 1) Concentración de retenido de 37.13 3.607 9.71 UF/DF (kg = 1) Producto total de retenido de 5919 368.9 6.23 UF/DF (g) Producción de producto total 86 6.42 7.47 por etapa (%) Cromatografía de intercambio aniónico La cromatografía de intercambio aniónico reduce impurezas relacionadas al proceso tal como ADN y proteínas de célula hospedadora. Esta etapa de proceso es una cromatografía de modo flujo directo donde el producto de anticuerpo principal no une a Q Sepharose™, pero sí a las impurezas. Esta etapa y las etapas subsecuentes fueron realizadas en un conjunto de purificación Class 10,000 a 12 ± 2°C después de que el producto intermedio de UF/DF de captura fuera transferido al conjunto de purificación detallada en un tanque móvil cerrado.
Fue utilizada una columna de 60 cm de diámetro x 30 cm largo (volumen de lecho de 85 I). La columna fue llenada con resina de cromatografía de intercambio aniónico Q Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Todos las etapas de columna fueron realizadas a 7.0 l/min (velocidad lineal = 150 cm/hr), a excepción del almacenamiento de la columna que se realiza a 3.5 l/min.
La columna fue equilibrada usando siete volúmenes de columna (CV) de 50 mM de cloruro de sodio, 25 mM de Tris, pH 8.0. La carga de proteína máxima para esta etapa fue 50 g de proteína por litro de resina (=4250 g por ciclo). Esta columna completado dos veces un ciclo con solamente una regeneración de 1 M de cloruro de sodio entre los ciclos. El material de UF/DF de captura fue diluido aproximadamente dos veces con 25 mM de Tris, pH 8.0. Éste se convirtió en la carga Q a aproximadamente 7.0 mS/cm, pH 7.5 a 8.1. Después de la carga del material UF/DF de captura diluido, la columna fue lavada con solución amortiguadora de equilibrio. El flujo directo que comprende los anticuerpos de interés fue recolectado de la parte superior a 3 OD28onm a la parte inferior del pico a 3 OD28onm que incluye el lavado después de la carga. Éste fue el flujo directo Q más el lavado (Q FTW).
Después del segundo ciclo, la columna fue regenerada con 1 M de cloruro de sodio, lavada con agua para inyección (WFI), esterilizada durante 1 hora con 1 M de hidróxido de sodio, lavada con 1 M cloruro de sodio, 25 mM de fosfato de sodio, pH 7.0, para disminuir el pH y después almacenarse con 25 mM de fosfato de sodio, 20% IPA.
Dos ciclos de la columna de Q Sepharose™ fueron realizados para cada uno de los lotes de muestras producidos. La carga promedio por ciclo fue de 34.8 y 31 g/l de resina (ciclo A y ciclo B, respectivamente); que oscila de 29.01 a 37.13 g/l (ver las tablas 8 y 9). La producción de etapa total incluyendo ambos ciclos fue de 92% con una desviación estándar de 17.8. Esta etapa produce comúnmente de 99 a 101% (lotes de muestras 29001BF, 29008BF, 30005BF, y 30006BF). La producción total de Q Sepharose™ FTW fue de 25.81 kg para los cinco lotes. El pH de carga de Q fue de pH 7.5 con conductividades de aproximadamente 6.0 a 6.7 mS/cm para el lote 30006BF.
Las pureza por SE-HPLC para los cinco ciclos mostró un promedio de 96.75% para IgG con una desviación estándar de 0.53 (tabla 16).
Tabla 8. Datos de la cromatografía de Q Sepharose™ FF de los lotes de muestras Cromatografía de Q Spharose™ FF Lote de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Volumen de retenido de UF/DF (kg = 1) 136.8 163.6 149.9 189.8 163.6 carga no diluida de Q Concentración de retenido de 38.93 36.47 40.36 31.18 38.72 UF/DF (g/l) Producto total de retenido de 5326 5966 6050 5918 6335 UF/DF (g) 25 mM de Tris, pH 8 agregado para 186.8 223.6 190 285.7 204 diluir el retenido de UF/DF (kg = 1) Cromatografía de Q Spharose™ FF Lote de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Volumen total de carga de Q 323.6 387.2 339.9 475.5 367.6 ( pH de carga 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 de Q Conductividad de carga de Q 6.3 6.3 6.0 6.7 6.2 (mS/cm) Concentración de carga de Q 16.46 15.4 17.8 12.4 17.2 (g/i) Ciclo A Producto cargado en la 2667 2978 3028 2945 3156 columna, ciclo A (g) Carga de 162 193.4 170.1 237.5 183.5 volumen, ciclo A (1) Cromatografía de Q Spharose,M FF Lote de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Capacidad de carga actual de producto/1 de resina Q, 31.4 35.04 35.62 34.65 37.13 ciclo A (g de producto/1 de resina Q) Volumen de flujo directo 117.6 151.7 129.9 192 136.8 recolectado, ciclo A (1) Volumen de lavado 76 78.9 79.3 76.9 73.6 recolectado, ciclo A (1) Volumen de flujo directo + 193.6 230.6 209.2 268.9 210.4 lavado, ciclo A (kg =1) Cromatografía de Q SpharoserM FF Lote de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Ciclo B Producto cargado en la 2647 2894 2569 2754 2466 columna, ciclo B (g) Carga de volumen, ciclo 113 187.9 100 222.1 143.4 B (1) Capacidad de carga actual de producto/1 de resina Q, 31.06 34.05 30.22 32.40 29.01 ciclo B (g de producto/1 de resina Q) Volumen de flujo directo 115.7 146.4 109.7 179.7 94.8 recolectado, ciclo B (1) Cromatografía de Q SpharoserM FF Lote de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Volumen de lavado 75.7 81 78.3 76.1 72.2 recolectado, ciclo B (1) Volumen de flujo directo + 191.4 227.4 188 255.8 167 lavado, ciclo B (kg = 1) Ciclo A + Ciclo B Carga de ciclo 5314 5872 5597 5699 5622 A + ciclo B (g) Volumen de flujo directo 385 458 397.2 524.7 377.4 de Q + lavado (kg = 1) Concentración 13.81 12.74 13.92 10.95 8.97 Cromatografía de Q SpharoserM FF Lote de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso de flujo directo de Q + lavado (g/l) Producto total de flujo 5317 5835 5529 5745 3385 directo de Q + lavado (g) Producción de producto total 100 99 99 101 60 por etapa (%) Tabla 9. Análisis de datos de cromatografía de Q Sepharose™ FF Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Q Sepharose™ FF Etapa de proceso PROM SD % C Volumen de retenido de UF/DF 160.74 19.7 12.26 (kg = I) carga no diluida de Q Concentración de retenido de 37.13 3.607 9.71 Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Q Sepharose™ FF Etapa de proceso PROM SD % CV UF/DF (g/l) Producto total de retenido de 5919 368.9 6.23 UF/DF (g) 25 mM de Tris, pH 8 agregado para diluir el retenido de 218 40.52 18.59 UF/DF (kg = 1) Volumen total de carga de Q (1) 379 59.39 15.67 pH de carga de Q 7.5 0 0 Concentración de carga de Q 15.9 2.13 13.4 (g/i) Ciclo A Producto cargado en la 2955 179.8 6.08 columna, ciclo A (g) Carga de volumen, ciclo A (1) 189 29.53 15.62 Capacidad de carga actual de producto/1 de resina Q, ciclo A 34.80 2.11 6.1 (g de producto/1 de resina Q) Volumen de flujo directo 146 28.71 19.66 recolectado, ciclo A (1) Volumen de lavado 77 2.32 3.01 recolectado, ciclo A (1) Volumen de flujo directo + 223 29.06 13.03 Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Q Sepharose™ FF Etapa de proceso PROM SD % CV lavado, ciclo A (kg =1) Ciclo B Producto cargado en la 2666 165.5 6.21 columna, ciclo B (g) Carga de volumen, ciclo B (1) 153 51.22 33.48 Capacidad de carga actual de producto/1 de resina Q, ciclo B 31.00 1.95 6.29 (g de producto/1 de resina Q) Volumen de flujo directo 129 33.8 26.26 recolectado, ciclo B (1) Volumen de lavado 77 3.27 4.25 recolectado, ciclo B (1) Volumen de flujo directo + 206 35.34 17.16 lavado, ciclo B (kg = 1) Ciclo A + Ciclo B Carga de ciclo A + ciclo B (g) 5621 202.4 3.6 Volumen de flujo directo de Q 428 62.47 14.6 + lavado (kg = 1) Concentración de flujo directo 12.10 2.11 17.4 de Q + lavado (g/l) Producto total de flujo directo 5162 1014 19.63 Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Q Sepharose™ FF Etapa de proceso PROM SD % CV de Q + lavado (g) Producción de producto total 92 17.8 19.35 por etapa (%) Cromatografía de HIC La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) se utiliza para la eliminación de agregados de anticuerpo y impurezas relacionadas al proceso a las especificaciones de producto final. Esta etapa es un modo de unión y eluato de cromatografía. El producto de intercambio anióníco (muestra) fue colocado en una solución amortiguadora con alto contenido de sal (sulfato de amonio), unido a la columna, y eluído de la columna después de tres lavados.
Una columna de 80 cm de diámetro x 15 cm de largo (volumen de lecho de 75 I) fue utilizada para este procedimiento. La columna fue llenada con resina de interacción hidrofóbica Phenyl Sepharose™ HP (Amersham Biosciences, Upsala, Suecia). El Q FTW (que posiblemente comprende los anticuerpos de interés) fue diluido con un volumen igual de 1.7 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0, después fue filtrado a través de un filtro de doble capa Sartopore™ de 0.45/0.2 µ?? (2.54 cm x 76.2 cm (1 x 30 pulgadas)). Phenyl Sepharose™ HP fue realizada en dos ciclos con una carga máxima de 40 g de ABT-874 por I de resina de Phenyl Sepharose™ HP (<3000 g por ciclo).
La carga de fenilo fue cargada en la columna y equilibrada con cinco CVs de 0.85 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. Después de cargar el producto, la columna fue lavada con tres CVs de lavado 1 (1.1 de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0), uno a siete CVs de lavado 2 (85 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0), después tres CVs de lavado 3 (1.1 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.0).
La columna fue eluída con solución amortiguadora de elución, 0.5 M de sulfato de amonio, 15 mM de fosfato de sodio, pH 7.0. El producto de muestra fue recolectado de la parte superior a 3 OD280nm a la parte inferior del pico a 3 OD28onm- El equilibrio, carga, lavado 1, lavado 2, y lavado 3 fue realizado a 6.2 l/min (velocidad lineal = 74 cm/hr). Las etapas de columna de elución, regeneración, lavado con WFI, esterilización, y almacenamiento fueron realizadas a 3.1 l/min (velocidad lineal = 37 cm/hr).
La columna fue regenerada entre ciclos con cuatro CVs de agua para inyección (WFI), tres CVs de 1 M de NaOH, y cuatro CVs de WFI entre ciclos. Después del último ciclo, la columna fue sometida a cinco CVs de solución amortiguadora de almacenamiento, 25 mM de fosfato de sodio, 20% IPA.
Dos ciclos de HIC fueron realizados para cada lote de muestra. La carga promedio por ciclo fue de 32.54 y 34.00 g/l de resina (ciclo A y ciclo B, respectivamente); que oscila de 21.77 a 37.79 g/l (ver las tablas 10 y 11). Las producciones de recuperación de producto totales para el ciclo A y B combinados oscilaron de 81% a 86% con un promedio de 84% con una desviación estándar de 1.87 para los lotes de muestras 29001BF, 29008BF, 30005BF, 30006BF, y 35036BF. Un total de 20.94 kg de ABT-874 fueron producidos a través de todas las etapas de cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP agregadas.
La pureza por SEC-HPLC para los lotes de Phenyl tuvo un promedio de 99.63% para IgG con una desviación estándar de 0.11 (tabla 16). La pureza porcentual aumentó durante el procedimiento de cromatografía hidrofóbica con la purificación de los anticuerpos de interés que redujo el IgG agregado relacionado la anticuerpo y la doble cadena ligera (especie de bajo peso molecular). Esto fue logrado con una solución amortiguadora de lavado 2 (SR-342:25 mM de fosfato de sodio, 0.85 M de sulfato de amonio, pH 7). Esta solución amortiguadora eluyó la especie de bajo peso molecular de anticuerpo de doble cadena ligera y se implemento después de que A280 nm aumentará ligeramente y se nivelará a aproximadamente un volumen de columna con un caudal que es la mitad de la carga y un caudal de lavado 1 (reducción de caudal de 6.2 a 3.1 I por minuto). Los agregados fueron eliminados por unión a la resina de Phenyl de la columna y sin eluir a los criterios de 0.5 M de solución amortiguadora de sulfato de amonio cuando el anticuerpo fue eluído.
Tabla 10. Datos de cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP de los lotes de muestras Cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso *Volumen de Q FTW (1) = carga de 369.2 441.9 380.2 507.90 365.5 Phenyl no diluida Concentración de Q FTW 13.81 12.74 13.92 10.95 8.97 (g/i) Producto total 5099 5630 5292 5562 3279 cargado (g) 1.7 de sulfato de 385 458.21 397.14 524.64 377.68 amonio, 50 mM de fosfato Cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso de sodio agregado para diluir Q FTW (kg = i) Carga de Phenyl de 770 916.21 794.34 1049.34 755.08 volumen total (1) Ciclo A Producto cargado en 2801 2796 2641 2775 1633 columna, ciclo A (g) Carga de volumen, ciclo 405.7 438.9 379.5 506.9 364.2 A (1) # de plataforma de cromo Carga actual 37.35 37.28 35.35 37.00 21.77 Cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso de producto/1 de resina Phenyl, ciclo A (g de producto/1 de resina Phenyl) Volumen de eluato de 139 138 141 129 134 Phenyl, ciclo A (1) Ciclo B Producto cargado en la 2801 2796 2641 2775 1633 columna, ciclo B (g) Carga de 405.7 438.9 379.5 506.9 364.2 volumen, ciclo Cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso B (1) Carga actual de producto/1 de resina Phenyl, ciclo 37.35 37.28 35.35 37.00 21.77 B (g de producto/1 de resina Phenyl) Volumen de elutato de Phenyl, ciclo 139 138 141 129 134 B (1) # de la plataforma de cromo Ciclo A + ciclo B Producto de 5099 5630 5292 5562 3279 I Cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP Lote de muestras de purificación 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso carga, ciclo A + ciclo B (g) Volumen de eluato 275 274 280.8 259 268 agrupado de Phenyl (1) Concentración de elutato 15.58 17.19 16.02 18.56 9.86 agrupado de Phenyl (g/l) Producto total del eluato de 4285 4710 4498 4807 2642 Phenyl agrupado (g) Producción de producto total 84 84 85 86 81 para la etapa Cromatografía de Phenyl Sepharose™ HP Lote de muestras de purificación 29001 BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF # Etapa de proceso (%) *EI volumen usado es de la lectura actual de volumen de cromatografía OIT durante el final del ciclo A y ciclo B de la carga para Phenyl Sepharose™ HP.
Tabla 11. Análisis de datos de cromatografía de Phenyl j Sepharose™ HP Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Phenyl Sepharose™ HP Etapa de proceso PROM SD % CV "Volumen de Q FTW (I) = carga 413 61.42 14.87 de Phenyl no diluida 12.10 2.11 17.4 Concentración de Q FTW (g/l) 4972 970.4 19.52 Producto total cargado (g) 1.7 M de sulfato de amonio, 50 429 62.42 14.55 mM de fosfato de sodio agregado para diluir Q FTW Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Phenyl Sepharose™ HP Etapa de proceso PROM SD % CV (kg = 1) Carga de Phenyl de volumen 857 124.88 14.57 total (1) Ciclo A Producto cargado en columna, 2441 491.9 20.15 ciclo A (g) 407 70.07 17.22 Carga de volumen, ciclo A (1) # Carga actual de producto/1 de 32.54 6.563 20.17 resina Phenyl, ciclo A (g de producto/1 de resina Phenyl) Volumen de eluato de Phenyl, 135 3.57 2.64 ciclo A (1) Ciclo B Producto cargado en la 2531 505.9 19.99 columna, ciclo B (g) Carga de volumen, ciclo B (1) 419 56.71 13.53 Carga actual de producto/1 de resina Phenyl, ciclo B (g de 34.00 6.75 19.85 producto/1 de resina Phenyl) Volumen de elutato de Phenyl, 136.2 4.764 3.5 Promedios de cromatografía Cinco lotes de muestras de Phenyl Sepharose™ HP Etapa de proceso PROM SD % CV ciclo B (1) # Ciclo A + ciclo B Producto de carga, ciclo A + 4972 970.6 19.52 ciclo B (g) Volumen de eluato agrupado 271 8.27 3.05 de Phenyl (1) Concentración de elutato 15.40 3.33 21.6 agrupado de Phenyl (g/l) Producto total del eluato de 4189 887.4 21.18 Phenyl agrupado (g) Producción de producto total 84 1.87 2.23 para la etapa (%) Filtración de virus El eluato de Phenyl de la etapa de HIC fue filtrado usando una etapa de filtración de retiro eliminación viral de Ultipor DV50™. La etapa de Ultipor DV50™ proporciona la eliminación física de los virus inesperados de=50 nm de diámetro que pueden estar presentes en el eluato de columna de Phenyl Sepharose™ HP.
El eluato de columna de interacción hidrofóbica fue pasado a través de un filtro de 0.1 pm humedecido previamente y un tren de filtros Ultipor DV50™ de 5.08 cm x 76.2 cm (2 x 30 pulgadas) (Pall Corporation) a =2.34 bar (<34 psig). Después de la filtración, el filtro fue enjuagado con solución amortiguadora de elución de HIC para eliminar cualquier ABT-874 conservado en el alojamiento de filtro. El filtrado de Ultipor DV50™ fue almacenado en un tanque esterilizado previamente a 12°C ± 2°C antes de la etapa final de formulación de UF/DF.
La producción de recuperación de producto de la etapa de filtración de DV50™ osciló de 97% a 102% con una producción promedio de 100% para varios análisis de muestra (ver las tablas 12 y 13). Un total de 20.99 kg del producto de anticuerpo fue procesado para los cinco lotes de muestras.
Tabla 12. Datos de filtración viral los lotes de muestras Filtración viral Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Volumen de eluato agrupado de Phenyl antes 275 274 280.8 259 268 de la filtración de DV50™ (kg = I) Concentración de eluato 15.58 17.19 16.02 18.56 9.86 agrupado de Phenyl (g/l) 4285 4710 4498 4807 2642 Producto total Filtración viral Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso de eluato agrupado de Phenyl (g) 0.5 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato 45.3 41.7 43.7 46.5 43.3 de sodio agregado a filtros de enjuague (kg) filtrado viral total + enjuague con 337.2 324.2 336.2 313.4 324.4 solución amortiguadora (kg) Filtrado viral 324.23 311.73 323.27 301.35 311.92 total (1)* Concentración de filtrado 13.27 15.20 14.22 15.45 8.6.6 viral (g/l) Filtración viral Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Producto total de filtrado 4303 4738 4597 4656 2701 viral (g) Producción de producto total 100 101 102 97 102 por etapa (%) *Corrección para la densidad de 0.5 M de sulfato de amonio, 50 mM de fosfato de sodio - dividir el peso en kg por la densidad de 1.04 g/ml = volumen en L. I Tabla 13. Análisis de datos de filtración de virus Promedios de filtración de Cinco lotes de muestras virus final Etapa de proceso PROM SD % CV mM de fosfato de sodio agregado a filtros de enjuague (kg) filtrado viral total + enjuague 327.1 9.85 3.01 con solución amortiguadora (kg) Filtrado viral total (1)* 314.5 9.47 3.01 Concentración de filtrado viral 13.40 2.77 20.7 (g/i) Producto total de filtrado viral 4199 853.2 20.32 (g) Producción de producto total 100 2.07 2.07 por etapa (%) Ultrafiltración/Diafiltración (UF/DF) final La etapa de UF/DF final fue la concentración de anticuerpo, eliminación de sulfato de amonio y formulación del producto de anticuerpo en 5 mM de histidina, 5 mM de metionina, 2% de manitol, 0.5% de sucrosa, 0.005% de Tween 80, pH 5.9. Los módulos de membrana de tipo ultrafiltración de celulosa regenerada de Millipore Corporation con un corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD fueron utilizados para esta etapa.
El filtrado de Ultipor DV50™ fue concentrado a 30 g/l de proteína. Fue realizada la diafiltracion continua con dos volúmenes de 5 mM de metionina, 2% de manitol, 0.5% de sucrosa, solución amortiguadora a pH 5.9 (ningún Tween). El producto entonces fue concentrado a 40 g/l ahora que la mayor parte del sulfato de amonio fue eliminado. Fue realizada la diafiltracion continua con seis volúmenes de 5 mM de metionina, 2% de manitol, 0.5% de sucrosa, solución amortiguadora a pH 5.9 (ningún Tween). Al completar este intercambio de seis diavolúmenes, el anticuerpo fue concentrado a 75 g/l. El sistema de UF entonces fue drenado del producto y enjuagado con solución amortiguadora de diafiltracion para recuperar el producto mantenido en el sistema. El concentrado y lavado fueron combinados para producir el ABT-874 diafiltrado y fue ajustado posteriormente a =65 g/l con solución amortiguadora adicional de formulación. Una vez que la concentración objeto había sido confirmada, un cálculo fue realizado para determinar la cantidad de solución amortiguadora de formulación que contuvo 10% de Tween 80 que se debe agregar al retenido concentrado de UF para llevar la concentración final de Tween 80 en sustancia de fármaco a 0.005% (v/v). La concentración final de la sustancia de fármaco formulada fue de =65 g/l. La muestra de anticuerpo fue filtrada a través de un filtro de 2.0/1.2 µ?? de cápsula de OpticapXLT30™ seguido con un filtro de doble capa de 0.45/0.2 pm de Sartopore™ en un envase estéril, después fue transferida a una áreas Class 100 en la preparación para el embotellamiento final.
La producción de recuperación de producto de la etapa de UF/DF osciló de 94% a 100% con una producción promedio de 97.0% con una desviación estándar de 2.22 para cinco análisis, (ver las tablas 14 y 15.) Hubo un total de 20.51 kg de producto de anticuerpo al final de esta UF/DF final. En conclusión, la etapa de filtración de UF/DF fue muy constante de ejecución a ejecución. El uso de la membrana de corte de 30 kD en lugar de una membrana de corte de 10 kD permitió un tiempo de procesamiento más rápido sin sacrificar la producción.
Tabla 14. Datos de UF/DF final de los lotes de muestras UF/DF final Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso Filtrado viral 324.23 311.73 323.27 301.35 311.92 (1) Concentración de filtrado 13.27 15.20 14.22 15.45 8.66 viral (g/l) Producto total 4303 4738 4597 4656 2701 de filtrado UF/DF final Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso viral (g/l) Primer volumen de trabajo de 135 150 145 147 82 diafiltración de TK-2575 (l) Primer volumen de solución 291 318 315 311 216 amortiguadora de diafiltración (1) Segundo volumen de 107.3 118.4 107.1 120 60.1 trabajo de diafiltración de TK-2575 UF/DF final Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso (1) Segundo volumen de solución 694 730 663 770 450 amortiguadora de diafiltración (1) Transferencia previa de pH 5.8 5.8 5.9 5.8 6.0 medido del sistema de UF Transferencia previa de 0 3 0 0 0 conductividad medida del sistema de UF i UF/DF final Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso (mS/cm) Filtrado de UF/DF 67.3 71.2 71.2 68 44.8 después de la transferencia (kg) 1 % de Tween, solución amortiguadora 0.337 0.356 0.356 0.340 0.822 de formulación agregada (I) Retenido de UF/DF filtrado 65.1 71.2 68.4 66 42.4 final en " (kg) 65.70 66.48 63.90 69.70 59.66 Concentración UF/DF final Lote de muestras de purificación # 29001BF 29008BF 30005BF 30006BF 35036BF Etapa de proceso de retenido de UF/DF final (g/l) Producto total de retenido 4277 4733 4371 4600 2530 de UF/DF final (g) Producción de producto 99 100 95 99 94 total por etapa (%) Tabla 15. Análisis de datos de UF/DF final Promedios de filtración de Cinco lotes de muestras virus final Etapa de proceso PROM SD % CV Filtrado viral (I) 314.5 9.47 3.01 Promedios de filtración de Cinco lotes de muestras virus final Etapa de proceso PROM SD % CV Concentración de filtrado viral 13.4 2.77 20.7 (g/i) Producto total de filtrado viral 4199 853.2 20.32 (g/i) Primer volumen de trabajo de 131.8 28.4 2 .55 diaf iltración de TK-2575 (1) Primer volumen de solución 290.2 42.8 14.75 amortiguadora de diafiltración (1) Segundo volumen de trabajo de 102.6 24.5 23.88 diafiltración de TK-2575 (1) Segundo volumen de solución 661.4 124.75 18.86 amortiguadora de diafiltración (1) Transferencia previa de pH 5.86 0.089 1.52 medido del sistema de UF Transferencia previa de 0.6 1.342 223.67 conductividad medida del sistema de UF (mS/cm) Filtrado de UF/DF después de 64.5 11.16 17.3 la transferencia (kg) Promedios de filtración de Cinco lotes de muestras virus final Etapa de proceso PROM SD % CV 1% de Tween, solución 0.44 0.212 48.18 amortiguadora de formulación agregada (I) Retenido de UF/DF filtrado 62.6 11.55 18.45 final en I (kg) Concentración de retenido de 65.1 3.69 5.7 UF/DF final (g/l) Producto total de retenido de 4102 208.8 5.09 UF/DF final (g) Producción de producto total 97 2.22 2.29 por etapa (%) Tabla 16. Análisis de muestras analíticas de QC en proceso de cinco lotes de muestras Cultivo celular/etapas Prueba Método Especificación PROM SD % CV de proceso Muestra de Poros QCA- Valor de cosecha de 3.91 0.12 3.07 A reactor de 228 reporte g/l producción HPLC Después de Poros QCA- Valor de 3.46 0.13 3.76 desactivación A 228 reporte g/l Cultivo celular/etapas Prueba Método Especificación PROM SD % c de proceso de filtración HPLC de pH profundo Poros Cosecha QCA- Valor de A 3.18 0.1 3.14 clarificada 228 reporte g/l HPLC Poros QCA- Poros A A 30.9 5.18 16.76 228 HPLC g/l HPLC Eluato de CM Pureza HyperDF™ SE- QCA- porcentual 94.76 0.67 0.71 HPLC 232 Valor de reporte QCA- Valor de A280 37.13 3.61 9.72 227-01 reporte g/l Eluato de CM HyperDF™ Pureza SE- QCA- concentrado porcentual 95.79 0.57 0.6 HPLC 232 Valor de reporte Lavado de QCA- Valor de A280 12.08 2.11 17.47 flujo directo 227-01 reporte g/l Cultivo celular/etapas Prueba Método Especificación PROM SD % cv de proceso de Q Pureza Sepharose™ SE- QCA- porcentual 96.75 0.53 0.55 HPLC 232 Valor de reporte QCA- Valor de A280 15.44 3.33 21.57 Eluato de 227-01 reporte g/l Phenyl Pureza Sepharose™ SE- QCA- porcentual 99.63 0.11 0.11 HP HPLC 232 Valor de reporte QCA- Valor de A280 13.36 2.77 20.73 227-01 reporte g/l Filtrado de Pureza Ultipor™ VF SE- QCA- porcentual 99.63 0.09 0.09 HPLC 232 Valor de reporte Retenido de QCA- Valor de 65.09 3.69 5.67 A280 UF/DF final 227-01 reporte g/l SE- QCA- Pureza formulado 99.45 0.13 0.13 HPLC 232 porcentual 2. Determinación de la concentración de proteína de célula hospedadora en composiciones de anticuerpo anti-IL-12 Este procedimiento describe la metodología de ensayo para la determinación de la concentración de proteína de célula hospedadora residual en las muestras de anticuerpo anti-IL-12. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se utiliza para insertar la proteína de célula hospedadora (antígenos) entre dos capas de anticuerpos específicos. Esto es seguido por el bloqueo de sitios no específicos con caseína. Las proteínas de célula hospedadora entonces se incuban durante cuyo tiempo las moléculas de antigeno son capturadas por el primer anticuerpo (anticuerpo de recubrimiento). Un segundo anticuerpo (anticuerpo anti-proteína de célula hospedadora biotinilado) entonces se agrega el cuál se fija al antígeno (proteínas de célula hospedadora). Se agrega el conjugado de neutravidina-HRP que une al anticuerpo anti-proteína de célula hospedadora biotinilado. Esto es seguido por la adición de sustrato azul de K. El sustrato cromogénico es hidrolizado por el anticuerpo conjugado con enzima unido, que produce un color azul. La reacción se detiene con 2 M de H3P04, que cambia el color a amarillo. La intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de unión a antígeno en el pozo.
Preparación de 50 mM de bicarbonato de sodio (solución amortiguadora de recubrimiento) capa, pH 9.4. A un recipiente de 1 I se agrega: 900 mi de agua Milli-Q; 4.20 g ± 0.01 g de bicarbonato de sodio. Agitar hasta que se haya disuelto completamente. Ajusfar el pH a 9.4 con NaOH 1 N. Transferir a un matraz volumétrico de 1 I y llevar a un volumen con agua Miili-Q. Mezclar por inversión hasta que sea homogénea. Filtrar a través de una unidad de filtrado estéril de 0.22 pm. Almacenar a 4°C nominal durante hasta 7 días a partir de la fecha de preparación.
Preparación de 0.104 M de Na2HP04*7H20, 1.37 M de NaCI, 0.027 M de KCI, 0.0176 M de KH2P04, pH = 6.8-6.9 (10X PBS). Agregar aproximadamente 400 mi de agua Milli-Q a un recipiente de cristal. Agregar 13.94 g ± 0.01 g de Na2HP0 x 7H20. Agregar 40.0 g ± 0.1 g de NaCI. Agregar 0.01 g ± 1.00 g de KCI. Agregar 0.01 g ± 1.20 g de KH2P04. Agitar hasta que sea homogéneo. Transferir a un matraz volumétrico de 500 mi. C.s. a un volumen de 500 mi con agua Milli-Q. Mezclar por inversión. Filtrar a través de una unidad de filtrado estéril de 0.2 pm. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 7 días.
Preparación de 1X PBS + 0.1% Tritones X-100, pH 7.40: (solución amortiguadora de lavado de placa). En un cilindro graduado de 4 I, mezclar 400 mi de 10X PBS (etapa 5.2) con 3500 mi de agua Milli-Q. Comprobar el pH, y ajustar en caso de ser necesario a 7.40 ± 0.05 con ácido clorhídrico 1 N o NaOH 1 N. Llevar a un volumen con agua Milli-Q. Colocar firmemente Parafilm en el cilindro y mezclar por inversión hasta que sea homogéneo. Transferir a una botella de 4 I. eliminar 4 mi de 1X PBS y descartar. Agregar 4 mi de Tritón X-100 a 3996 mi de 1X PBS. Colocar en la placa de agitación y agitar hasta disolver completamente. Filtrar la cantidad de solución amortiguadora de lavado de placa necesaria para la preparación de solución amortiguadora de dilución a través de una unidad de filtrado estéril de 0.22 µ??. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 7 días.
Preparación de la mezcla de anticuerpo de recubrimiento: anti-CHO de cabra 599/626/748 (lote # G11201 a 1.534 mg/ml), la purificado por afinidad: OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -80°C nominal en frascos. Preparar las alícuotas. Tomar una alícuota por placa al momento de uso. Inmediatamente antes del uso: Diluir la mezcla de anticuerpo para tener una concentración final de 4 Mg/ml en 50 mM de bicarbonato de sodio frío como sigue. Por ejemplo: agregar 31 µ? de mezcla de anticuerpo de recubrimiento a 11969 µ? de solución amortiguadora de recubrimiento fría. Mezclar suavemente por inversión.
Preparación de la mezcla de anticuerpo anti-proteína de célula hospedadora de cabra biotinilado, 599/626/748 (lote # G11202 a 0.822 mg/ml): OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -80°C nominal en frascos. Preparar las alícuotas. Tomar una alícuota por placa al momento de uso. Inmediatamente antes del uso: Diluir la mezcla de anticuerpo biotinilado para tener una concentración final de 1 pg/ml de caseína a 37°C ± 2°C como sigue. Por ejemplo: agregar 14.6 µ? de mezcla de anticuerpo biotinilado a 11985 µ? de caseína a 37°C ± 20C. Mezclar suavemente por inversión.
Preparación de neutravidina-HRP. Reconstituir nuevos lotes (2 mg/frasco) a 1 mg/ml como sigue: Agregar 400 µ? de agua Milli-Q al frasco, después agregar 1600 µ? de 1X PBS, para un total de 2 mi. Agitar suavemente hasta mezclarse. Almacenar a -20°C nominal. Preparar las alícuotas con un volumen deseado para utilizar 1 alícuota por placa. Preparar en un tubo de polipropileno. Calificar los nuevos lotes para determinar la concentración de trabajo. Asignar un vencimiento de 6 meses a partir de la fecha de preparación. Por ejemplo, si la concentración de trabajo fue determinada como 0.2 pg/ml entonces se preparan como sigue. Inmediatamente antes del uso: Descongelar una alícuota de neutravidina-HRP a temperatura ambiente. Diluir 1 mg/ml de solución de neutravidina a 0.1 mg/ml (100 pg/ml) con caseína a 37°C ± 2°C. Por ejemplo: Diluir X10, agregar 50 µ? de neutravidina a 450 µ? de caseína. Agitar suavemente hasta mezclarse. Diluir adicionalmente 100 µg/ml de solución a 0.2 Mg/ml con caseína a 37°C ± 2°C. Por ejemplo: Diluir X500, agregar 24 µ? de neutravidina (100 pg/ml) a 11976 µ? de caseína. Agitar suavemente hasta mezclarse.
Preparación de 5.72 M de ácido fosfórico (solución de parada). Preparar una solución de 2 M de ácido fosfórica a partir de ácido fosfórico concentrado como sigue. A partir del % de ácido fosfórico indicado en la etiqueta, densidad (1.685 g/ml) y peso de fórmula (98 g/mole), calcular el volumen de ácido fosfórico concentrado necesario para preparar 500 mi de 2 M de ácido fosfórico. Agregar el volumen de ácido fosfórico concentrado calculado anteriormente al frasco. Llevar a un volumen con agua Milli-Q y mezclar por la inversión hasta que sea homogéneo. Almacenar a temperatura ambiente por hasta 6 meses a partir de la fecha de preparación.
Preparación de la solución amortiguadora de dilución (caseína diluida X100 en 1X PBS + 0.1% Tritón X100, pH 7.4). Diluir caseína X100 a 37°C ± 2°C en 0.22 pm de 1X PBS filtrado estéril + 0.1% Tritón X100, pH 7.4 (anterior). Por ejemplo: Agregar 1 mi de caseína a 37°C ± 2°C a 99 mi de 0.22 µ?t? de 1X PBS filtrado estéril + 0.1% Tritón X100, pH 7.4. Mezclar bien. Preparar nuevamente para cada uso.
Preparación de estándares. Estándares de proteína de célula hospedadora (estándares de antígeno) (lote # G11203 a 1.218 mg/ml): OBSERVACION: Almacenar las soluciones madre a -80°C nominal en 70 µ? de alícuotas. Descongelar una alícuota a temperatura ambiente. Realizar las diluciones seriales en tubos de polipropileno usando solución amortiguadora de dilución.
Preparación de muestras. En tubos de polipropileno, diluir muestras a granel finales a 24 mg/ml en solución amortiguadora de dilución. Concentración de registro. OBSERVACION: Utilizar las siguientés soluciones para preparar las muestras adicionadas y preparar 12 mg/ml de las soluciones referidas a continuación. En microtubos de polipropileno, diluir adicionalmente 24 mg/ml de soluciones a 12 mg/ml en solución amortiguadora de dilución. Cargar los pozos por triplicado para cada uno de los 12 mg/ml de soluciones en la placa para un total de 6 pozos.
Preparación de aditivo. En un microtubo de polipropileno, preparar 10 ng/ml de aditivo de proteína de célula hospedadora estándar a partir de 20 ng/ml de estándar preparado anteriormente diluyéndolo 2X con la solución amortiguadora de dilución. Cargar tres pozos con 10 ng/ml de solución de aditivo sobre la placa. Utilizar 20 ng/ml de solución estándar de la etapa 6.1 para las muestras adicionadas.
Preparación de las muestras adicionadas. En microtubos de polipropileno, adicionar 300 µ? de cada 24 mg/ml de solución a granel final con 300 µ? de 20 ng/ml de solución de aditivo (6.1). Cargar los pozos por triplicado con cada solución de muestra adicionada para un total de 6 pozos.
Preparación del control. Un intervalo de control se debe ajustar para cada nueva solución madre de control, antes de usarse en la prueba rutinaria. Solución madre de control: Preparar 150 µ? de alícuotas de un lote de concentrado de sustancia de fármaco ABT-874 y almacenar congelado a -80°C nominal por hasta tres años.
Preparación del control de trabajo. Descongelar una alícuota de control a temperatura ambiente. En los tubos de polipropileno, diluir el control a 24 mg/ml con la solución amortiguadora de dilución. En los microtubos de polipropileno, diluir adicionalmente 24 mg/ml de solución de control con la solución amortiguadora de dilución a 12 mg/ml. Preparar una sola dilución y carga el control en 3 pozos de la placa.
Procedimientos de ELISA. Llenar la botella de lavado de placa con solución amortiguadora de lavado de placa (referirse a la etapa 5.3, 1X PBS + 0.1% Tritón X-100). Preparar la lavadora de placas. Comprobar los siguientes parámetros: Los parámetros se deben ajustar a: Tipo de placa: 1 para cada ciclo (un total de 5 ciclos): Volumen: 400 µ?; Tiempo de impregnación: 10 segundos; Tiempo de asp.: 4 segundos.
Procedimiento de análisis. Recubrir las placas con 100 µ?/???? de 4 g/ml de mezcla de anticuerpo de recubrimiento de cabra en 50 mM de bicarbonato de sodio frío. Golpear ligeramente el lado de la placa hasta que la solución de recubrimiento cubra la parte inferior de los pozos uniformemente, cubrir con cinta de sellado e incubar a 4°C nominal con agitación en la mezcladora de placa (o equivalente) a la velocidad 3 por durante 18 horas ± 1 hora. Después de la incubación durante la noche, retirar la placa del refrigerador y permitir equilibrarse a temperatura ambiente. Agitar el recubrimiento. Absorber la placa con toallas de papel. Bloquear con 300 µ?/???? de caseína a 37°C ± 2°C, cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Preparar el estándar, muestra, control, aditivo, y muestras adicionadas durante la incubación de bloqueo. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Usar una pipeta de 8 canales, colocar con una pipeta 100 µ?/???? de estándares, muestras, aditivos, muestras adicionadas, y control por triplicado en los pozos de la placa. Colocar con una pipeta 100 µ?/???? de solución amortiguadora de dilución en todos los pozos vacíos de la placa para servir como espacios vacíos. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Llenar una plantilla para utilizar como guía al cargar la placa.
Ajuste de lector de placa. Ajustar la plantilla, incorporar las concentraciones para los estándares. No incorporar los factores de dilución para las muestras, control, aditivo, o muestras adicionadas. Asignar los pozos que contienen diluyente como vacíos que se restarán de todos los pozos. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de anticuerpo de cabra biotinilado. Cubrir con cinta de sellado e incubar a 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado. Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de solución de conjugado de neutravidina-HRP. Cubrir con cinta de sellado e incubar en 37°C ± 2°C con agitación en una mezcladora de placa Lab-Line Environ (o equivalente) a 80 rpm ± 5 rpm durante 1 hora. Lavar la placa 5 veces con solución amortiguadora de lavado.
Absorber la placa con toallas de papel. Agregar 100 µ?/???? de sustrato K-Blue frío, cubrir con cinta de sellado e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos (iniciar cronometro tan pronto como el sustrato se agregue a la primera fila), con agitación a velocidad 3 en la mezcladora de placa de titulación Lab-Line (o equivalente). Detener la reacción agregando 100 µ?/???? 2M de ácido fosfórico (etapa 5.7). Colocar la placa en una mezcladora de placa a velocidad 3 durante 3-5 minutos. Leer la placa a 450 nm.
Análisis y cálculos de datos. OBSERVACION: solamente se aceptan las muestras, aditivos, muestras adicionadas, y control, con las densidades ópticas que se encuentren dentro del límite de cuantificación práctico (2.5 ng/ml de estándar) de la curva estándar y que cumplan con el % de CV o % de criterios de diferencia indicados posteriormente. Si la OD de muestra se encuentra por debajo de 2.5 ng/ml de estándar, el resultado deberá reportarse como menos de 2.5 ng/ml. Este valor se debe entonces dividir por la concentración de muestra diluida (12 mg/ml) para reportar el valor en ng/mg. Si la muestra es alta en concentración de célula hospedadora que hace que la muestra no adicionada y/o adicionada estar por encima de la curva estándar, se debe reportar el valor como >100 ng/ml. Este valor se debe entonces dividir por la concentración de muestra diluida (12 mg/ml) para reportar el valor en ng/mg. Considerar el valor de muestra como cero para los cálculos de recuperación de aditivo cuando la muestra está por debajo de 2.5 ng/ml de estándar.
Curva estándar. Las concentraciones estándar se deben incorporar a la plantilla de protocolo. Se utiliza un ajuste de curva cuadrático. El coeficiente de determinación debe ser = 0.99 y el % de CV entre los pozos triplicados debe ser = 20%. Si este criterio no se cumple: Un estándar (1 nivel, 3 pozos) se puede descartar. Si se descarta 1.25 ng/ml, sólo las muestras y muestras adicionadas con densidades ópticas que se encuentran dentro de 2.5 ng/ml y las densidades ópticas de 100 ng/ml (los puntos de curva estándar restantes) son aceptables. Además, para los triplicados de cada nivel estándar, si un solo pozo se contamina claramente o muestra una unión baja, se puede descartar. Si un pozo se descarta de un nivel estándar, las réplicas restantes deben tener un % de diferencia = 20%. El % de CV para el estándar más bajo, que muestra valores de OD cercanos a los antecedentes (vacíos) de la placa, debe ser = 30%. Si se descarta un pozo, el % de diferencia para las réplicas restantes debe ser = 35%. Si se descarta el estándar más bajo, sólo son aceptables las muestras y muestras adicionadas con densidades ópticas que se encuentran dentro de las densidades ópticas de nivel de curva estándar restante.
Muestras. El % de CV deben ser = 20% entre los pozos triplicados. Reportar el % de CV entre los pozos triplicados. Un pozo de cada dilución de muestra se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%.
OBSERVACION: Si la OD de muestra no adicionada está debajo de 2.5 ng/ml de OD estándar, el % de criterios de diferencia no se aplica a los resultados de muestra no adicionada. Referirse al cálculo anterior.
Calcular la concentración actual de la célula hospedadora en ng/mg del valor promedio (ng/ml) como sigue: Proteína de célula hospedadora CHO (ng/mg) = "resultado promedio de muestra no adicionada (ng/ml)"_Concentración de muestra diluida (12 mg/ml).
Aditivos. El % de CV debe se = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV. Un pozo de aditivo se puede descartar. Los puntos restantes deben tener un % de diferencia = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar la concentración de célula hospedadora en ng/ml. Este resultado será utilizado en los cálculos de recuperación de aditivo. La concentración resultante para el aditivo (ng/ml) debe ser ± 20% de la concentración teórica de aditivo. Registrar el resultado e indicar si se aprobó o falló. Si el resultado de aditivo no está dentro del 20% teórico, el análisis debe ser repetido. La concentración de aditivo promedio (ng/ml) x 100 = debe ser 20% ± 100% de 10 ng/ml.
Muestras adicionadas. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV entre los pozos triplicados. Un pozo de cada dilución de muestra adicionada se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar el "resultado de muestra adicionada" para cada dilución en ng/ml. Registrar el % de diferencia entre las diluciones duplicadas. El % de diferencia entre las diluciones debe ser = 25%. Estos resultados serán utilizados en los cálculos de recuperación de aditivo.
Calcular el % de recuperación de aditivo para cada dilución ajustada usando la siguiente fórmula: % de recuperación de aditivo = valor de muestra adicionada - valor de muestra no adicionada X 100 el valor de aditivo. OBSERVACION: (1) si la OD del valor de muestra no adicionada se encuentra debajo de 2.5 ng/ml de estándar se considera el valor como cero en el % de cálculo de recuperación de aditivo. El % de recuperación de aditivo debe ser 50% ± 100% (50%-150%) para cada dilución para cada muestra. Registrar los resultados y si aprobaron o fallaron.
Control. El % de CV debe ser = 20% entre los pozos triplicados. Registrar el % de CV resultante. Un pozo del control se puede descartar. Las réplicas restantes deben tener un % de diferencia de = 20%. Referirse al cálculo anterior. Reportar la concentración de célula hospedadora en el control en ng/ml. Calcular la concentración de célula hospedadora en ng/mg como sigue: Proteína de célula hospedadora (ng/mg) = resultado de proteína de célula hospedadora de control en ng/ml.
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Claims (43)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir una preparación de anticuerpo reducida en proteína de célula hospedadora (HCP) a partir de una mezcla de muestra que incluye un anticuerpo y por lo menos una HCP, que comprende: (a) someter la matriz de muestra a una reducción de pH que forma así una muestra de recuperación primaria, en donde la reducción del pH es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4; (b) ajustar la muestra de recuperación primaria a un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 6 seguido por la aplicación de la muestra de recuperación primaria a una resina de intercambio iónico y recolectar una muestra de intercambio iónico; (c) aplicar la muestra de intercambio iónico a una resina de cromatografía interactiva hidrofóbica (HIC) y recolectar una muestra de HIC, en donde la muestra de HIC comprende la preparación de anticuerpo reducida en HCP.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la reducción de pH es lograda mezclando un ácido conveniente con la mezcla de muestra, y en donde el ácido conveniente se selecciona del grupo que consiste de ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico, y similares.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio aniónico o una resina de intercambio catiónico.
4. El método de la reivindicación 3, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la resina dé intercambio catiónico se selecciona del grupo que consiste de Fractogel, carboximetilo, sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonatos (S).
6. El método de la reivindicación 5, en donde la resina de intercambio catiónico es carboximetilo.
7. El método de la reivindicación 3, en donde la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio aniónico.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la resina de intercambio aniónico se selecciona del grupo que consiste de Q Sepharose, dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE), y grupos amina cuaternaria (Q).
9. El método de la reivindicación 8, en donde la resina de intercambio aniónico es Q Sepharose.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de intercambio iónico comprende una primera etapa de intercambio iónico y una segunda etapa de intercambio iónico.
11. El método de la reivindicación 10, en donde la etapa de intercambio iónico es una etapa de intercambio catiónico seguida por una segunda etapa de intercambio aniónico.
12. El método de la reivindicación 10, que adicionalmente comprende una etapa intermedia, en donde la etapa intermedia es una etapa de filtración que ocurre entre la primera y segunda etapa de intercambio iónico.
13. El método de la reivindicación 12, en donde la etapa de filtración es lograda por ultrafiltración/diafiltración de captura.
14. El método de la reivindicación 1, en donde HIC se realiza usando una columna que comprende uno o más grupos hidrofóbicos.
15. El método de la reivindicación 14, en donde uno o más grupos hidrofóbicos se seleccionan del grupo que consiste de grupos alquilo, arilo, y una combinación de los mismos.
16. El método de la reivindicación 14, en donde la columna se selecciona del grupo que consiste de sefarosa de fenilo (tal como la columna Phenyl Sefarose™ 6 Fast Flow, columna Phenyl Sepharose™ High Performance), columna Octyl Sepharose™ High Performance, Fractogel™ EMD Propyl, columnas Fractogel™ EMD Phenyl, Macro-Prep™ Methyl, Macro-Prep™ t-Butyl Supports, columna WP Hl-Propyl (C3)™, y columnas de éter, fenilo o butilo Toyopearl™.
17. El método de la reivindicación 16, en donde la columna comprende sefarosa de fenilo.
18. El método de la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una etapa de filtración, en donde la muestra de HIC se somete a filtración para eliminar las partículas virales y para facilitar el intercambio de solución amortiguadora.
19. El método de la reivindicación 1, en donde la preparación de anticuerpo reducida en HCP comprende un anticuerpo anti-IL-12 o una porción de unión a antígeno del mismo.
20. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, o anticuerpo multivalente.
21. El método de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado.
22. El método de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humano aislado que se disocia de IL-12 humano con una Kd de aproximadamente 1 x 10"8 M o menos y una constante de K0ff de aproximadamente 1 x 10"3 s"1 o menos, ambas determinadas por resonancia de plasmón superficial.
23. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-IL-12 o porción de unión a antígeno del mismo neutraliza IL-12 in vivo e in vitro.
24. El método de la reivindicación 1, en donde la preparación está sustancialmente libre de HCPs.
25. Un método para producir una preparación de anticuerpo reducida en proteína de célula hospedadora (HCP) a partir de una mezcla de muestra que incluye un anticuerpo y por lo menos una HCP, que comprende: (a) someter la matriz de muestra a una reducción de pH que forma así una muestra de recuperación primaria, en donde la reducción de pH es a aproximadamente 3.5; (b) ajustar la muestra de recuperación primaria a un pH de aproximadamente 4.9, después aplicar la muestra de recuperación primaria a una resina de intercambio catiónico y recolectar una muestra de intercambio catiónico; (c) aplicar la muestra de intercambio catiónico a una resina y recolectar la muestra de intercambio aniónico; y (d) aplicar la muestra de intercambio aniónico a una resina de cromatografía interactiva hidrofobica (HIC) y recolectar una muestra de HIC, en donde la muestra de HIC comprende la preparación de anticuerpo reducida en HCP.
26. Un método para producir una preparación de anticuerpo reducida en proteína de célula hospedadora (HCP) a partir de una mezcla de muestra que incluye un anticuerpo y por lo menos una HCP, que comprende: (a) someter la matriz de muestra a una reducción de pH que forma así una muestra de recuperación primaria, en donde la reducción de pH está a aproximadamente 3.5; (b) ajustar la muestra de recuperación primaria a un pH de aproximadamente 4.9, después aplicar la muestra de recuperación primaria a una resina de intercambio catiónico y recolectar una muestra de intercambio catiónico; (c) someter la muestra de intercambio catiónico a la filtración y recolectar un filtrado; (d) aplicar el filtrado de (c) a una resina de intercambio aniónico y recolectar una muestra de intercambio aniónico; y (e) aplicar la muestra de intercambio aniónico a una resina de cromatografía interactiva hidrofóbica (HIC) y recolectar una muestra de HIC, en donde la muestra de HIC comprende la preparación de anticuerpo reducida en HCP.
27. Una composición farmacéutica que comprende una preparación de anticuerpo reducida en HCP producida por el método de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL-12 o una porción de unión a antígeno del mismo.
29. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde la composición está sustancialmente libre de HCPs.
30. La composición farmacéutica de la reivindicación 27 usada para neutralizar trastornos mediados por IL-12.
31. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en donde los trastornos se seleccionan del grupo que consiste de artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, dermatitis atópica, enfermedad de anfitrión contra injerto, rechazo a trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con el trasplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parásitas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, afecciones malignas, paro cardíaco, infarto del miocardio, enfermedad de Addison, caso esporádico, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) en adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, yersinia y artropatía relacionada con salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, Enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerótica primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de enfermedad de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas a la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria , neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de tejido conectivo mezclada, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada al lupus sistémico eritematoso, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjodgren, enfermedad pulmonar asociada la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis por radiación, bronquitis obliterante, pulmonía eosinofila crónica, enfermedad pulmonar i nf i Itrati va linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfección, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis de anticuerpo anti-LK ), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a la insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada al trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada al trasplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerótica primaria, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, NOS en enfermedad renal, glomerulonefritides, vasulitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), diabetes mellitus dependiente de insulina, oftalmía simpatética, hipertensión pulmonar después de enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad de tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria y vitíligo. Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar las enfermedades autoinmunes, particularmente las asociadas a la inflamación, que incluyen, espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, y uveítis autoinmune.
32. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, que adicionalmente comprende un fármaco antiinflamatorio no esteroideo o esteroideo.
33. La composición farmacéutica de la reivindicación 32, que comprende un fármaco antiinflamatorio no esteroideo.
34. La composición farmacéutica de la reivindicación 33, en donde el fármaco antiinflamatorio no esteroideo se selecciona del grupo que consiste de ibuprofeno, corticoesteroides, y prednisolona.
35. La composición farmacéutica de la reivindicación 32, que comprende un fármaco antiinflamatorio esteroideo.
36. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, que adicionalmente comprende uno o más otros anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos.
37. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, que adicionalmente comprende un agente farmacéutico.
38. La composición farmacéutica de la reivindicación 37, en donde el agente farmacéutico se selecciona del grupo que consiste de metotrexato, 6-MP, sulfasalazina de azatioprina, mesalazina, cloroquinina/hidroxicloroquinina de olsalazina, penicilamina, aurotiomalato, azatioprina, coquicina, corticoesteroides, agonistas de adrenorreceptores ß-2 (salbutamol, terbutalina, salmeterol), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromilo, ketotifeno, ¡pratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetilo de micofenolato, leflunomida, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tal como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de cinasa IRAK, NDC, IKK, p38 o MAP), inhibidores de enzima de conversión de I L- 1 ß (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteína de selectina P (PSGL), inhibidores de enzima de conversión de TNFa (TACE), inhibidores de la señalización de células T tal como inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima de conversión de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores de TNF p55 o de p75 solubles y derivados p75TNFRIgG (Enbrel™) y p55TNFRIgG (Lenercept), SIL-1RI, SIL-1RII, slL-6R, receptor de IL-13 soluble (slL-13)) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF ).
39. Los métodos de las reivindicaciones 1, 25 y 26, en donde la preparación de anticuerpo reducida en HCP comprende uno o más anticuerpos anti-IL-12 o porciones de unión a antígeno de los mismos y son etiquetados.
40. Los métodos de la reivindicación 39, en donde la etiqueta es radiactiva.
41. Los métodos de la reivindicación 40, en donde la etiqueta radiactiva se selecciona del grupo que consiste de 25l, 131 , 35S y 3H
42. Los métodos de la reivindicación 39, en donde la etiqueta no es radiactiva.
43. Los métodos de las reivindicaciones 1, 25 y 26, en donde la preparación de anticuerpo reducida en HCP comprende uno o más anticuerpos anti-IL-12 o porciones de unión a antígeno de los mismos y son pegilados.
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