CN110248958A - 多聚体、四聚体和八聚体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽的多聚体，例如四聚体，和效应域(例如抗原结合位点(例如，特异性结合到抗原或pMHC的抗体或TCR结合位点或其可变域))或肽(例如肠促胰岛素、胰岛素或激素肽)的四聚体和八聚体。

Description

多聚体、四聚体和八聚体
技术领域
本发明涉及多肽的多聚体，例如四聚体，和效应域(例如抗原结合位点(例如，特异性结合到抗原或pMHC的抗体或TCR结合位点或其可变域))或肽(例如肠促胰岛素、胰岛素或激素肽)的四聚体和八聚体。
背景技术
效应域的多聚体具有在以下中的经辨识效用：用于组合并倍增效应域的活性和存在度例如以提供更高的抗原结合亲合力(对于作为例如抗体或TCR结合域的效应域)、或用于增强生物或结合活性如以用于提供双或多特异性标靶或与体内或体外靶标配体的相互作用的医学和非医学应用。
引起蛋白质单体自组装成多聚体的多聚化域是所属领域中已知的。实例包括转录因子如p53、p63和p73中所见的结构域，以及离子通道如TRP阳离子通道中所见的结构域。转录因子p53可分成不同功能性域：N端反式激活域、富脯氨酸域、DNA结合域、四聚域和C端调节区。人类p53的四聚域从残基325延伸到356，并且具有4螺旋束折叠(Jeffrey等人,《科学(Science)》(New York,N.Y.>纽约)1995,267(5203):1498-1502)。TRPM四聚域是瞬时受体电位(transient receptor potential)阳离子通道亚家族M成员蛋白质1-8的短反平行卷曲螺旋四聚域。其通过广泛的核心填充和链间极性相互作用保持在一起(Fujiwara等人,《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》2008,383(4):854-870)。瞬时受体电位(TRP)通道包含一大类对多样形式的感觉输入物起反应的四聚阳离子选择性离子通道。另一个实例是钾通道BTB域。这个结构域可在电压门控的钾通道蛋白质的N端处找到，在其中表示参与α-亚单元组装成功能性四聚通道的细胞质四聚域(Tl)(Bixby等人，《自然结构生物学(Nature Structural Biology)》1999,6(l):38-43)。这个结构域也可以在不为钾通道如KCTDl的蛋白质中找到(含有钾通道四聚域的蛋白质1；Ding等人，《DNA和细胞生物学(DNA and Cell Biology)》2008,27(5):257-265)。
已经使用各种多聚化技术包括生物素、dHLX、ZIP和BAD域以及p53生产多聚抗体片段(Thie等人，《自然生物技术(Nature Boitech.)》2009:26,314-321)。在生产中有效的生物素是诱发人类的免疫反应的细菌蛋白质。
人类p53(UniProtKB-P04637(P53人类))充当多个肿瘤类型中的肿瘤抑制剂，取决于生理环境和细胞类型而诱发生长遏止或细胞凋亡。其参与细胞周期调节作为用以通过控制为此过程所需的一组基因负调节细胞分裂的反式激活因子。人类p53在增加量的广泛多种的转化细胞中找到。其通常在约60％癌症中是突变的或失活的。人类p53缺陷在巴雷特化生(Barrett metaplasia)中找到，所述巴雷特化生是其中下食道的复层扁平上皮通常由化生性柱状上皮置换的病况。所述病况发展为约10％患有慢性胃食道逆流病的患者的并发症并且使其倾向于罹患食道腺癌。
p53的九种同工型天然地产生并且于大范围正常组织中但以组织依赖性方式进行表达。同工型2在大部分正常组织中表达但在脑部、肺脏、前列腺、肌肉、胎儿脑部、脊髓和胎儿肝脏中检测不到。同工型3在大部分正常组织中表达但在肺脏、脾脏、睾丸、胎儿脑部、脊髓和胎儿肝脏中检测不到。同工型7在大部分正常组织中表达但在前列腺、子宫、骨骼肌和乳房中检测不到。同工型8仅在结肠、骨髓、睾丸、胎儿脑部和肠道中检测到。同工型9在大部分正常组织中表达但在脑部、心脏、肺脏、胎儿肝脏、唾液腺、乳房或肠道中检测不到。
发明内容
本发明提供：-
在第一构型中
效应域(例如蛋白质域或肽)的至少第一、第二、第三和第四拷贝的蛋白质多聚体，其中多聚体是通过第一、第二、第三和第四自缔合四聚域(TD)缔合在一起而多聚化，其中包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝的对应工程化多肽包含每个四聚域。
在第二构型中
经分离的TCR结合位点、胰岛素肽、肠促胰岛素肽或肽激素四聚体或八聚体；或多个所述四聚体或八聚体。
经分离的抗体结合位点或抗体可变域(例如单可变域)四聚体或八聚体；或多个所述四聚体或八聚体。
在一个实例中，四聚体或八聚体可溶于水溶液(例如水性真核细胞培养基)中。在一个实例中，四聚体或八聚体可在真核细胞中表达。下文提供范例。
在第三构型中
以下各物的四聚体或八聚体：
(a)TCR V域或TCR结合位点，其中四聚体或八聚体可溶于水溶液(例如水性真核细胞生长培养基或缓冲液)中；
(b)抗体单可变域，其中四聚体或八聚体可溶于水溶液(例如水性真核细胞生长培养基或缓冲液)中；
(c)TCR V域或TCR结合位点，其中四聚体或八聚体能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达；或
(d)抗体可变域(例如抗体单可变域)，其中四聚体或八聚体能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达。
在第四构型中
本发明的多聚体、四聚体或八聚体的工程化多肽或单体。
在第五构型中
工程化(并且任选地经分离)工程化多肽(P1)，其包含(在N端到C端方向上)：-
(a)TCR V1-TCR C1-抗体CH1(例如IgG CH1)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα并且Cl是Cα；
(ii)V1是Vβ并且Cl是Cβ；
(iii)V1是Vγ并且Cl是Cγ；或
(iv)V1是Vδ并且Cl是Cδ；
或
(b)TCR V1-抗体CH1(例如IgG CH1)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα；
(ii)V1是Vβ；
(iii)V1是Vγ；或
(iv)V1是Vδ；
或
(c)抗体V1-抗体CH1(例如IgG CH1)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)V1是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(d)抗体V1-任选的抗体CH1(例如IgG CH1)-抗体Fc(例如IgG Fc)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)V1是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(e)抗体V1-抗体CL(例如Cλ或Cκ)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)V1是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(f)TCR V1-TCR C1-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα并且Cl是Cα；
(ii)V1是Vβ并且Cl是Cβ；
(iii)V1是Vγ并且Cl是Cγ；或
(iv)V1是Vδ并且Cl是Cδ。
在第六构型中
编码本发明的工程化多肽或单体的核酸，任选地，其中用于表达多肽的表达载体包含核酸。
在第七构型中
本发明的核酸或载体在制备蛋白质多聚体以用于产生经细胞内表达和/或经分泌多聚体的方法中的用途，其中所述方法包含在包含核酸或载体的真核细胞中表达多聚体和/或从包含核酸或载体的真核细胞中分泌多聚体。
在第八构型中
一种方法，其产生：
(a)TCR V域多聚体，所述方法包含真核细胞中所表达的TCR V-TD(例如NHR2 TD或TCR V-p53 TD)融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达，所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；
(b)抗体V域多聚体，所述方法包含真核细胞中所表达的抗体V(例如单可变域)-TD(例如V-NHR2 TD或V-p53 TD)融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达，所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；
(c)肠促胰岛素肽(例如GLP-1、GIP或胰岛素)多聚体，所述方法包含真核细胞如HEK293T细胞中所表达的肠促胰岛素肽-TD(例如肠促胰岛素肽-NHR2 TD或肠促胰岛素肽-p53 TD)融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达；所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；或
(d)肽激素多聚体，所述方法包含真核细胞如HEK293T细胞中所表达的肽激素-TD(例如肽激素-NHR2 TD或肽激素-p53 TD)融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达；所述方法任选地包含分离多个所述多聚体。
在第九构型中
本发明的核酸或载体在制备蛋白质多聚体以用于产生包含核酸或载体的真核细胞中的糖基化多聚体的方法中的用途。
在第十构型中
自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63 TD或p73 TD或其同源物或直系同源物)在制备多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途。
在第十一构型中
工程化多肽在制备包含蛋白质域或肽的多个拷贝的多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途，其中工程化多肽包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，并且进一步包含自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63 TD或p73 TD或同源物或直系同源物)。
在第十二构型中
自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63 TD或p73 TD或其同源物或直系同源物)在制备多肽四聚体以用于产生不与单体、二聚体或三聚体混合的多个四聚体的方法中的用途。
在第十三构型中
包含用于细胞内和/或分泌性表达本发明的多聚体、四聚体、八聚体、工程化多肽或单体的核酸或载体的真核宿主细胞。
在第十四构型中
工程化多肽在制备包含蛋白质域或肽的多个拷贝的多肽四聚体的方法中用于产生不与单体、二聚体或三聚体混合的多个四聚体的用途，其中工程化多肽包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，并且进一步包含自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63TD或p73 TD或同源物或直系同源物)。
在第十五构型中
能够结合pMHC复合物的多价异源二聚可溶性T细胞受体，其包含：
(i)TCR胞外域；
(ii)免疫球蛋白恒定域；和
(iii)ETO的NHR2多聚化域。
在第十六构型中
多聚免疫球蛋白，其包含
(i)免疫球蛋白可变域；和
(ii)ETO的NHR2多聚化域。
在第十七构型中
用于组装可溶性多聚多肽的方法，其包含：
(a)提供与ETO的NHR2域融合的所述多聚多肽的单体；
(b)使所述单体的多个拷贝缔合，由此获得多聚可溶性多肽。
在第十八构型中
包含(i)编码本发明的多肽的细胞系(例如真核哺乳动物细胞系，例如HEK293、CHO或Cos细胞系)和(ii)本发明的四聚体的混合物。
在第十九构型中
用于增强蛋白质效应域(例如抗体可变域或结合位点)的四聚体的产量的方法，所述方法包含由细胞系(例如哺乳动物细胞、CHO、HEK293或Cos细胞系)表达多肽的四聚体，其中多肽是本发明的多肽并且包含一种或多种效应域；和任选地分离所述经表达四聚体。
本发明还提供包含本发明的一种或多种多聚体、一种或多种四聚体或一种或多种八聚体的医药组合物、化妆品、食品、饮料、清洁产品、洗涤剂。
附图说明
图1.表示通过NHR2四聚域辅助的经由单体和同源二聚体进行的四价异源二聚可溶性TCR蛋白质复合物的逐步自组装的示意图。
图2.表示通过NHR2四聚域和免疫球蛋白铰链域辅助的经由单体2和同源二聚体2进行的八价异源二聚可溶性TCR蛋白质复合物的逐步自组装的示意图。
图3：用于表达和组装ts-NY-ESO-1 TCR的α和β链中的结构域配置的示意图。
图4：用于表达和组装os-NY-ESO-1 TCR的α和β链中的结构域配置的示意图。
图5：ts-NY-ESO-1 TCR蛋白质复合物的α和β链的氨基酸序列。替代结构域的氨基酸序列加有下划线。
图6：os-NY-ESO-1 TCR蛋白质复合物的α和β链的氨基酸序列。替代结构域的氨基酸序列加有下划线。
图7：用于表达和组装ts-NY-ESO-1 TCR-IL2融合蛋白复合物的α和β链中的结构域配置的示意图。
图8：用于表达和组装os-NY-ESO-1 TCR-IL2融合蛋白复合物的α和β链中的结构域配置的示意图。
图9：ts-NY-ESO-1 TCR-IL2融合蛋白复合物的α和β链的氨基酸序列。替代结构域的氨基酸序列加有下划线。
图10：os-NY-ESO-1 TCR-IL2融合蛋白复合物的α和β链的氨基酸序列。替代结构域的氨基酸序列加有下划线。
图11A：表示通过NHR2四聚域辅助的经由单体和同源二聚体进行的四价单域抗体(dAb)的逐步自组装的示意图。
图11B：用于组装四价dAb包括连接子和NHR2域的结构域配置的示意图。
图12A：表示通过NHR2四聚域辅助的经由单体和同源二聚体进行的四价Fab复合物的逐步自组装的示意图。
图12B：用于组装四价Fab包括重链中的连接子和NHR2域以及轻链可变域和恒定域的结构域配置的示意图。
图13A：表示通过NHR2四聚域和连接到CH1域的抗体铰链区辅助的经由单体和同源二聚体进行的八价Fab复合物的逐步自组装的示意图。
图13B：用于组装八价Fab包括重链中的铰链、连接子和NHR2域以及轻链可变域和恒定域的结构域配置的示意图。
图14是Quad 16和Quad 17的示意图。
图15显示(A)Quad 16和(B)Quad 17单体序列和构型。
图16显示使用抗Ig蛋白质印迹法进行的分泌蛋白的分析：(A)在SDS变性条件下的PAGE凝胶-16＝Quad16；17＝Quad17；和(B)在天然(即非变性)条件下的PAGE凝胶-16＝Quad16；17＝Quad17。
图17：由用来自Quad 3和4的抗人类IgG HRP检测抗体(A)蛋白质样品探测的变性SDS-PAGE凝胶制备的蛋白质印迹是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1和2中。针对Quad 3和4的预期Mw分别是46.1和46.4kDa。(B)来自Quad 12和13的蛋白质样品是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1和2中。针对Quad 12和13的预期Mw分别是47.8和48.1kDa。
图18：由用来自Quad 3和4的抗人类IgG HRP检测抗体(A)蛋白质样品探测的变性SDS-PAGE凝胶制备的蛋白质印迹是通过浓缩细胞上清液制备的并且分别负载于泳道1和2中。针对Quad 3和4的预期Mw分别是46.1和46.4kDa。(B)来自Quad 12和13的蛋白质样品是通过浓缩细胞上清液制备的并且分别负载于泳道1和2中。针对Quad 12和13的预期Mw分别是47.8和48.1kDa。
图19：由用来自Quad 14、15、18和19的抗HIS HRP检测抗体(A)蛋白质样品探测的变性SDS-PAGE凝胶制备的蛋白质印迹是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1-4中。针对Quad 14、15、18和19的预期Mw分别是22.0、22.3、37.4和37.7kDa。(B)来自Quad 23、24、26和27的蛋白质样品是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1-4中。针对Quad23、24、26和27的预期Mw分别是32.1、32.4、33.7和34.0kDa。(C)来自Quad 34和38的蛋白质样品是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1-2中。针对Quad 34和38的预期Mw分别是25.5和25.4kDa。(D)来自Quad 40、42、44和46的蛋白质样品是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1-4中。针对Quad 40、42、44和46的预期Mw分别是25.4、37.6、25.5和38.0kDa。泳道U含有由未转染HEK293T细胞(阴性对照)制备的浓缩血清并且C是用作用于抗His HRP检测抗体的阳性对照的His标记的蛋白质。血清抗His背景条带通过黑色箭头突出显示，可以在所有样品中针对印迹对其进行一致检测。
图20：由变性SDS-PAGE凝胶(A)制备并且用抗人类IgG HRP检测抗体探测的蛋白质印迹。来自Quad 14和15的蛋白质样品是由全细胞提取物制备的并且分别负载于泳道1和2中。针对Quad 14和15的预期Mw分别是22.0和22.3kDa。(B)由天然PAGE凝胶制备并且用抗人类IgG HRP检测抗体探测的蛋白质印迹。泳道1和2含有由全细胞提取物制备的来自Quad 14和15的蛋白质样品。
图21:与前导序列和标签序列融合的Quad多肽。其中存在连接子，连接子是G4S(仅1个G4S)。*指示具有允许TCRα与β链之间的S-S键形成的经引入半胱氨酸残基的TCR恒定域。使用人类IgG1铰链。所有C区均是人类C区。TCR V域对NY-ESO-1具有特异性。GFP＝绿色荧光蛋白质。
本文中的所有多肽示意图和氨基酸序列均从N端到C端书写。本文中的所有核苷酸序列均从5'到3'书写。
具体实施方式
本发明涉及多肽的多聚体，例如四聚体，和效应域(例如抗原结合位点(例如，特异性结合到抗原或pMHC的抗体或TCR结合位点或其可变域))或肽(例如肠促胰岛素、胰岛素或激素肽)的四聚体和八聚体。在实施例中，本发明的多聚体可有用地在真核系统中产生并且可以从呈可溶形式的真核细胞中分泌，该形式可用于各种工业应用，如生产医药、诊断、作为成像剂、洗涤剂等。高阶多聚体如效应域或肽的四聚体或八聚体可用于增强抗原或pMHC结合亲合力。此可用于生产有效药品或可用于增强包含所述多聚体、四聚体或八聚体的诊断试剂的敏感性。当将本发明的多聚体投予到人类或动物个体中例如以用于治疗或预防个体的疾病或病况时，额外的或替代的益处是增强的活体半衰期。有用地，本发明也可以提供多特异性(例如双或三特异性)多价结合蛋白。特异性可能与抗原或pMHC结合的特异性有关。在某些实例中，通过使用包含结合域或肽的单工程化多肽，本发明有用地提供用于产生在高纯度下的多价(例如双特异性)蛋白质的方式。单物种的工程化多肽单体的使用避免在2种或更多种不同多肽物种用于产生多(例如双)特异性或多价蛋白质时所见的混合产物的问题。
本发明提供以下条款、方面和概念。本文中的任何条款均可以与本文中的任何方面或概念组合。本文中的任何方面均可以与本文中的任何概念组合。
方面：
1.一种效应域(例如蛋白质域)或肽的至少第一、第二、第三和第四拷贝的蛋白质多聚体，其中多聚体是通过第一、第二、第三和第四自缔合四聚域(TD)缔合在一起而多聚化，其中包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝的对应工程化多肽包含每个四聚域。
在一个实例中，每个TD是表2中所列的蛋白质1到119中的任一种的TD。在一个实例中，每个TD是p53 TD或其同源物或直系同源物。在一个实例中，每个TD是NHR2 TD或其同源物或直系同源物。在一个实例中，每个TD是p63 TD或其同源物或直系同源物。在一个实例中，每个TD是p73 TD或其同源物或直系同源物。在一个实例中，每个TD不是NHR2 TD。在一个实例中，每个TD不是p53 TD。在一个实例中，每个TD不是p63 TD。在一个实例中，每个TD不是p73 TD。在一个实例中，每个TD不是p53、p63或p73 TD。在一个实例中，每个TD不是NHR2、p53、p63或p73 TD。
通过“缔合在一起”，方面1中的TD多聚化工程化多肽的第一、第二、第三和第四拷贝以提供多聚体蛋白质，例如可以在真核或哺乳动物细胞(例如HEK293细胞)中细胞内表达和/或可以从真核或哺乳动物细胞(例如HEK293细胞)中细胞外分泌和/或可溶于水性培养基(例如真核或哺乳动物细胞(例如HEK293细胞)培养基)中的多聚体。实例是NHR TD、p53TD、p63 TD和p73 TD(例如人类NHR TD、p53 TD、p63 TD和p73 TD)或其直系同源物或同源物。
在一个实例中，TD不是p53 TD(或其同源物或直系同源物)，例如，其不是人类p53TD(或其同源物或直系同源物)。在一个实例中，TD是NHR2 TD或其同源物或直系同源物，但不包括p53 TD或其同源物或直系同源物。在一个实例中，TD是人类NHR2 TD或其同源物或直系同源物，但不包括人类p53 TD或其同源物或直系同源物。在一个实例中，TD是人类NHR2。在一个实例中，TD的氨基酸序列与人类NHR2的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一个实例中，也包含NHR2 TD的多肽不天然地包含结构域或肽。
在一个实例中，多肽的所有结构域均是人类结构域。
工程化多肽可以包含所述结构域或肽N端的一个或多个拷贝到所述TD的一个拷贝。另外地或可替代地，工程化多肽可以包含所述结构域或肽C端的一个或多个拷贝到所述TD的一个拷贝。在一个实例中，工程化多肽包含第一所述结构域或肽和TD，其中第一结构域或肽与TD间隔至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个邻接氨基酸，其中第一结构域或肽与TD之间不存在另一个所述结构域或肽。
在一个实例中，多聚体(例如所述工程化多肽的四聚体)包含4个(但不超过4个)TD(例如相同TD)和4、8、12或16个(但分别不超过所述4、8、12或16个)所述结构域或肽的拷贝。在一个实例中，每个TD和每个所述结构域或肽均是人类TD和人类结构域或肽。
在一个实例中，多聚体、四聚体或八聚体包含工程化多肽的第一、第二、第三和第四相同拷贝，多肽包含TD和一个(但不超过一个)、两个(但不超过两个)或更多个所述蛋白质域或肽的拷贝。
在一些实施例中，通过仅需要一种类型的工程化多肽以形成本发明的多聚体、四聚体或八聚体，本发明有利地提供可以易于以纯(或高度纯，即>90％、95％、96％、97％、98％或99％纯度)格式分离的格式，以及用于以纯(或高度纯)形式产生这种格式的方法。纯度由不与任何其它多聚体或多肽单体以组合物形式混合的本发明的多聚体指示，或其中本发明的多聚体占包含本发明的多聚体和其它包含工程化多肽的多聚体和/或多肽单体的组合物中的物种的>90、95、96、97、98或99％。因此，在这些实施例中，避免不同类型的多肽的混合物或将其减到最少。因此，这有利地还提供仅包含一种(和不超过一种)类型的工程化多肽的多种多聚体(例如多种四聚体或八聚体)，其中多聚体是单特异性(但多价)的以用于抗原结合，或者双或多特异性的以用于抗原结合。因此，本发明提供多种多聚体(例如多种四聚体或八聚体，每个多肽是至少四价的以用于抗原结合和(i)双特异性的(即能够特异性结合到2种不同抗原)或(ii)单特异性的和至少四价的以用于抗原结合。在本文中，在提及抗原结合的情况下，当结构域是TCR V域时，这可替代地是pMHC结合。有利地，多者呈包含超过一种类型的多肽单体的纯形式(即不与多聚体(例如四聚体或八聚体混合)。在一个实例中，多聚体包含至少2种不同类型的抗原结合位点。在一个实例中，多聚体是双特异性、三特异性或四特异性多聚体。在一个实例中，多聚体具有抗原结合位点或pMHC结合位点4、6、8、10或12价，优选4或8价。
在一个实例中，肽MHC(pMHC)是I类或II类pMHC。
例如就结构域、抗体或结合位点而言，如本文所使用的术语“特异性结合”意思指辨识具有如通过SPR所测定的ImM或更小结合亲和力的特异性抗原(或pMHC)的结构域、抗体或结合位点。
靶结合能力、特异性和亲和力(KD(又称为Kd)、K0ff和/或Kon)可以通过所属领域中的任何常规方法，例如通过表面等离子体共振(SPR)来测定。如本文所使用的术语“KD”意欲指特别结合位点/配体、受体/配体或抗体/抗原相互作用的平衡解离常数。在一个实施例中，表面等离子体共振(SPR)是在25℃下进行的。在另一个实施例中，SPR是在37℃下进行的。在一个实施例中，SPR是在生理pH如约pH 7下或在pH 7.6下进行的(例如使用在pH 7.6下的Hepes缓冲盐水(又称为HBS-EP))。在一个实施例中，SPR是在生理盐量例如150mM NaCl下进行的。在一个实施例中，SPR是在不超过0.05体积％的洗涤剂量下，例如在存在0.05％P20(聚山梨醇酯20；例如Tween 20TM)和3mM EDTA的情况下进行。在一个实例中，SPR是在25℃或37℃下在pH 7.6缓冲液、150mM NaCl、0.05％洗涤剂(例如P20)和3mM EDTA中进行的。缓冲液可以含有10mM Hepes。在一个实例中，SPR是在25℃或37℃下在HBS-EP中进行的。HBS-EP可以从Teknova公司(Teknova Inc)(加利福尼亚；目录编号H8022)获得。在一个实例中，亲和力(例如VH/VL结合位点的亲和力)是使用通过使用任何标准SPR装置如通过BiacoreTM或使用ProteOn XPR36TM 进行的SPR来测定的。结合数据可以使用标准技术拟合成1:1固有模型，例如使用固有模型拟合到ProteOn XPR36TM分析软件。
在一个实例中，本发明的多聚体、四聚体或八聚体是经分离多聚体、四聚体或八聚体。在一个实例中，本发明的多聚体、四聚体或八聚体由所述工程化多肽的拷贝组成。任选地，本发明的多聚体、四聚体或八聚体分别包含4或8个但不超过4或8个工程化多肽的拷贝。
“工程化”意思指多肽不是天然产生的，举例来说，也包含所述TD的多肽不天然地包含蛋白质域或肽。
每个所述蛋白质域或肽可以是具有生物活性的结构域或肽(例如在人类或动物中具有生物活性)，如特异性结合到抗原或肽-MHC(pMHC)的结构域，或其中抗原或pMHC结合位点包含所述结构域。在替代方案中，结构域或肽是碳水化合物、葡萄糖或糖调节剂，如肠促胰岛素或胰岛素肽。在替代方案中，结构域或肽是抑制剂或酶或人类或动物中的生物功能或路径的抑制剂。在替代方案中，结构域或肽是铁调节剂。因此，在一个实例中，每种蛋白质域或肽选自抗原或pMHC结合域或肽；激素；碳水化合物、葡萄糖或糖调节剂；铁调节剂；和酶抑制剂。
2.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中多聚体是所述结构域或肽的四聚体或八聚体。
3.根据任一方面1或2所述的多聚体，其包含免疫球蛋白超家族结合位点(例如抗体或TCR结合位点，如scFv或scTCR)的四聚体或八聚体。
免疫球蛋白超家族(IgSF)是参与细胞的辨识、结合或粘着过程的大蛋白质超家族的细胞表面和可溶性蛋白质。基于与免疫球蛋白(又称为抗体)的共享结构特点，将分子分类为这个超家族的成员；其全部具有称为免疫球蛋白域或折叠的结构域。IgSF的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子，分子参与向淋巴细胞、细胞粘着分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白的抗原呈递。其通常与免疫系统中的作用相关联。
T细胞受体(TCR)域可以是Vα(例如与νβ配对)、νβ(例如与Vα配对)、Vγ(例如与Vδ配对)或Vδ(例如与Vγ配对)。
4.根据方面3所述的多聚体，其中结合位点包含与第二可变域配对的第一可变域。
在第一实例中，工程化多肽包含第一和第二可变域。在另一个实例中，工程化多肽包含第一域，并且另一个不同于工程化多肽(并且任选地包含TD或不含TD)的多肽包含第二域。
在替代方案中，结构域是恒定区结构域。在替代方案中，结构域是FcAb。在替代方案中，结构域是非Ig抗原结合位点或包含在非Ig抗原结合位点例如亲和抗体中。
抗原结合位点和效应域
在一个实例中，所述或每个抗原结合位点(或效应域)选自以下组成的组：抗体可变域(例如VL或VH、抗体单可变域(域抗体或dAb)、骆驼科VHH抗体单可变域、鲨鱼免疫球蛋白单可变域(NA V)、NanobodyTM或骆驼源化(camelised)VH单可变域)；T细胞受体结合域；免疫球蛋白超家族域；无颌总纲(agnathan)可变淋巴细胞受体(《免疫学杂志(J Immunol)》；2010年8月1日；185(3):1367-74；《无颚脊椎动物的替代性适应性免疫(Alternativeadaptive immunity in jawless vertebrates)》；Herrin BR和Cooper M D.)；纤连蛋白域(例如AdnectinTM)；scFv；(scFv)2；sc-双链抗体；scFab；来源于选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的centyrin和抗原结合位点；脂质运载蛋白域；蛋白A，如蛋白A的Z域(例如AffibodyTM或SpA)；A域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热休克蛋白(如和来源于GroEI和GroES的表位结合域)；转铁蛋白域(例如转移体)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C型凝集素域(例如TetranectinTM)；人类γ-晶状体蛋白或人类泛素(人泛素)；PDZ域；蝎毒素；和人类蛋白酶抑制剂的库尼兹型域(kunitz type domain)。
抗原结合位点的另外来源是WO2007024715在第40页第23行到第43页第23行中所公开的抗体的可变域和VH/VL对。这份具体公开如同明确地书写于本文中一样以引入的方式并入本文中以为用于本发明中和可能包括于本文权利要求书中的表位结合部分提供基础。
“结构域”是具有独立于蛋白质其余部分的三级结构的折叠蛋白质结构。一般来说，结构域负责蛋白质的离散功能特性并且在多数情况下可以将其添加、去除或转移到其它蛋白质中并且不损失蛋白质和/或结构域的剩余部分的功能。“单抗体可变域”是包含抗体可变域的序列特征的折叠多肽域。因此，其包括完全抗体可变域和经改性可变域，例如其中一个或多个环已经由不为抗体可变域的特征的序列置换，或经截短或包含N端或C端延伸的抗体可变域，以及至少保留全长域的结合活性和特异性的可变域的折叠片段。
短语“免疫球蛋白单可变域”或“抗体单可变域”是指特异性结合独立于不同V区或V域的抗原或表位的抗体可变域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单可变域可以存在于具有其它不同可变区或可变域的格式(例如同源多聚体或异源多聚体)中，其中通过单免疫球蛋白可变域进行的抗原结合(即，其中免疫球蛋白单可变域结合独立于额外可变域的抗原)不需要其它区域或结构域。“域抗体”或“dAb”与能够结合到抗原的“免疫球蛋白单可变域”(在本文使用所述术语时)相同。免疫球蛋白单可变域可以是人类抗体可变域，而且包括来自其它物种的单抗体可变域，如啮齿类动物(例如，如WO 00/29004中所公开)、铰口鲨和骆驼科VHH免疫球蛋白单可变域。来源于产生重链抗体的包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种的骆驼科VHH sre免疫球蛋白单可变域多肽天然地不含轻链。这类VHH域可以根据所属领域中可用的标准技术进行人类化，并且这类结构域仍然被视为本发明的“域抗体”。如本文所使用的“VH”包括骆驼科VHH域。NA V是在包括铰口鲨的软骨鱼中辨识的另一种类型的免疫球蛋白单可变域。这些结构域又称为新颖抗原受体可变区(通常缩写为V(NAR)或NARV)。对于另外的细节，参见《分子免疫学(Mol.Immunol.)》44,656-665(2006)和US20050043519A。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞缔合抗原4)是于主要CD4+ T细胞上表达的CD28家族受体。其胞外域具有可变域样Ig折叠。对应于抗体的CDR的环可以经异源序列取代以赋予不同结合特性。CTLA-4分子工程化成具有不同结合特异性又称为Evibodies。对于另外的细节，参见《免疫法杂志(Journal of Immunological Methods)》248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是运输小疏水性分子如类固醇、后胆色素、类视黄素和脂质的一类胞外蛋白。其具有在可以工程化成结合到不同靶抗原的圆锥形结构的开放端处具有许多环的刚性β层二级结构。抗运载蛋白具有在160-180个氨基酸之间的尺寸，并且来源于脂质运载蛋白。对于另外的细节，参见《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和抗体是来源于可以工程化成结合到抗原的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架。结构域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过随机化表面残基来生成文库。对于另外的细节，参见《蛋白质工程设计与选择(Protein Eng.Des.Sel.)》17,455-462(2004)和EP1641818A1。AvimersTM是来源于A域支架家族的多域蛋白质。具有约35个氨基酸的天然域采用经界定二硫键键结结构。通过改组由A域家族展现的自然变异来生成多样性。对于另外的细节，参见《自然生物技术》23(12),1556-1561(2005)和《调研药物专家评论(Expert Opinion on Investigational Drugs)》16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清运输糖蛋白。转铁蛋白可以工程化成通过将肽序列插入许可表面环中来结合不同靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括转移体。对于另外的细节，参见《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》274,24066-24073(1999)。经设计锚蛋白重复蛋白(DARPinsTM)来源于作为介导完整膜蛋白附着到细胞骨架的一类蛋白质的锚蛋白。单锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基基序。其可以工程化成通过随机化每个重复的第一α-螺旋和β-转角中的残基来结合不同靶抗原。可以通过增加模块数量(亲和力成熟方法)来增加其结合界面。对于另外的细节，参见《分子生物学杂志》332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和《分子生物学杂志》369,1015-1028(2007)以及US20040132028Al。纤连蛋白是可以工程化成结合到抗原的支架。AdnectinsTM由人类纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10域的天然氨基酸序列的主链组成。在β-夹层的一端处的三个环可以工程化成使得纤连蛋白能够特异性地辨识所关注的治疗靶标。对于另外的细节，参见《蛋白质工程设计与选择》18,435-444(2005)、US20080 139791、WO2005056764和US6818418Bl。肽适体为由含有插入在活性位点的限制可变肽环的恒定支架蛋白质(通常为硫氧还蛋白(TrxA))组成的组合辨识分子。对于另外的细节，参见《生物疗法专家评论(Expert Opin.Biol.Ther.)》5,783-797(2005)。微体来源于含有3-4个半胱氨酸桥的长度为25-50个氨基酸的天然产生的微生物蛋白-微生物蛋白的实例包括KalataBI和芋螺毒素以及打结素(knottin)。微生物蛋白具有可以工程化成包括高达25个氨基酸并且不影响微生物蛋白的总折叠的环。对于工程化打结素域的另外的细节，参见WO2008098796。其它表位结合部分和表位结合域包括已经用作工程化不同靶抗原结合特性的支架的蛋白质，所述蛋白质包括人类γ-晶状体蛋白和人类泛素(人泛素)、人类蛋白酶抑制剂的库尼兹型域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C型凝集素域(四连接素)，综述于《治疗抗体手册(Handbook of Therapeutic Antibodies)》的第7章-《非抗体支架(Non-Antibody Scaffolds)》(2007，由Stefan Dubel编辑)和《蛋白质科学(ProteinScience)》15:14-27(2006)中。
5.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中每个多肽包含所述蛋白质结构域或肽的第一和第二拷贝，其中多肽包含(在N端到C端方向上)：(i)所述拷贝中的第一拷贝-TD-所述拷贝中的第二拷贝；(ii)TD-和所述第一和第二拷贝；或(iii)所述第一和第二拷贝-TD。
6.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中TD是NHR2 TD并且结构域或肽不是NHR2域或肽；或其中TD是p53 TD并且结构域或肽不是p53域或肽。
7.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中工程化多肽包含第二类型的蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，其中第二类型的蛋白质域或肽不同于第一蛋白质域或肽。
举例来说，多肽在N端方向上包含：(i)P1-TD-P2；或(ii)TD-P1-P2，其中P1＝第一类型(即，根据方面1所述的多聚体的结构域或肽的类型)的结构域或肽的拷贝；并且P2＝所述第二类型的结构域或肽的拷贝。
8.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中结构域是免疫球蛋白超家族域。
9.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中结构域或肽是抗体可变域或恒定域(例如抗体单可变域)、TCR可变域或恒定域、肠促胰岛素、胰岛素肽或激素肽。
10.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中多聚体包含所述工程化多肽的第一、第二、第三和第四相同拷贝，多肽包含TD和所述蛋白质域或肽的一个(但不超过一个)、两个(但不超过两个)或更多个拷贝。
11.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中工程化多肽包含抗体或TCR可变域(V1)和NHR2 TD。
12.根据方面11所述的多聚体，其中多肽包含(在N端到C端方向上)：(i)V1-任选的连接子-NHR2 TD；(ii)V1-任选的连接子-NHR2 TD-任选的连接子-V2；或(iii)V1-任选的连接子-V2-任选的连接子-NHR2 TD，其中V1和V2是TCR可变域并且是相同的或不同的，或其中V1和V2是抗体可变域并且是相同的或不同的。
13.根据方面12所述的多聚体，其中V1和V2是抗体单可变域。
14.根据方面11所述的多聚体，其中每个工程化多肽包含(在N端到C端方向上)V1-任选的连接子-NHR2 TD，其中V1是抗体或TCR可变域并且每个工程化多肽与包含V2的对应第二工程化多肽配对，其中V2分别是与V1配对以形成抗原或pMHC结合位点的抗体或TCR可变域，并且任选地，一个多肽包含抗体Fc或包含抗体CH1，并且另一个多肽包含与CH1配对的抗体CL。
15.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中TD包含(i)与SEQ ID NO:10或126具有一致性或与其具有至少80％一致性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:120或123具有一致性或与其具有至少80％一致性的氨基酸序列。
16.根据前述方面中任一项所述的多聚体，其中多聚体包含选自以下组成的组的抗体的抗原结合位点的四聚体或八聚体：ReoProTM；阿昔单抗(Abciximab)；RituxanTM；利妥昔单抗(Rituximab)；ZenapaxTM；达利珠单抗(Daclizumab)；SimulectTM；巴利昔单抗(Basiliximab)；SynagisTM；帕利珠单抗(Palivizumab)；RemicadeTM；英利昔单抗(Infliximab)；HerceptinTM；MylotargTM；吉妥单抗(Gemtuzumab)；CampathTM；阿仑单抗(Alemtuzumab)；ZevalinTM；异贝莫单抗(Ibritumomab)；HumiraTM；阿达木单抗(Adalimumab)；XolairTM；奥马珠单抗(Omalizumab)；BexxarTM；托西莫单抗(Tositumomab)；RaptivaTM；依法利珠单抗(Efalizumab)；ErbituxTM；西妥昔单抗(Cetuximab)；AvastinTM；贝伐单抗(Bevacizumab)；TysabriTM；那他珠单抗(Natalizumab)；ActemraTM；托珠单抗(Tocilizumab)；VectibixTM；帕尼单抗(Panitumumab)；LucentisTM；雷珠单抗(Ranibizumab)；SolirisTM；依库珠单抗(Eculizumab)；CimziaTM；赛妥珠单抗(Certolizumab)；SimponiTM；戈利木单抗(Golimumab)；IlarisTM；卡那单抗(Canakinumab)；StelaraTM；优特克单抗(Ustekinumab)；ArzerraTM；奥法木单抗(Ofatumumab)；ProliaTM；地诺单抗(Denosumab)；NumaxTM；莫维珠单抗(Motavizumab)；ABThraxTM；瑞西巴库单抗(Raxibacumab)；BenlystaTM；贝利木单抗(Belimumab)；YervoyTM；伊匹单抗(Ipilimumab)；AdcetrisTM；本妥昔单抗(Brentuximab)；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗(Pertuzumab)；KadcylaTM；阿多-曲妥珠单抗(Ado-trastuzumab)；KeytrudaTM；OpdivoTM；GazyvaTM和奥必珠单抗(Obinutuzumab)。
举例来说，所述工程化多肽的蛋白质域是选自所述组的抗体的抗体结合位点的V域(VH或VL)，其中多聚体包含与工程化多肽的V域配对以形成所选抗体的抗原结合位点的另一个V域(对应地VL或VH)。因此，有利地，本发明提供所述所选抗体的结合位点的四聚体或八聚体，其有益地可以具有用于结合其同源抗原或用于治疗或预防人类或动物的疾病或病况的改善的亲和力、亲合力和/或功效，其中将多聚体投予到其上以结合体内同源抗原。
举例来说，多聚体、四聚体或八聚体包含抗体的抗原结合位点的4个拷贝，其中抗体是阿达木单抗、萨瑞鲁单抗(sarilumab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)、贝伐单抗(例如AVASTINTM)、西妥昔单抗(例如ERBITUXTM)、托珠单抗(例如ACTEMRATM)或曲妥珠单抗(HERCEPTINTM)。在替代方案中，抗体是抗CD38抗体、抗TNFa抗体、抗TNFR抗体、抗IL-4Ra抗体、抗IL-6R抗体、抗IL-6抗体、抗VEGF抗体、抗EGFR抗体、抗PD-1抗体、抗PD-Ll抗体、抗CTLA4抗体、抗PCSK9抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD 138抗体、抗IL-1抗体。在替代方案中，抗体选自WO2007024715在第40页第23行到第43页第23行中所公开的抗体，所述案的公开内容以引入的方式并入本文中。
本文中的结合位点可以例如是受体(例如KDR或Fit)的配体(例如细胞因子或生长因子，例如VEGF或EGFR)结合位点。本文中的结合位点可以例如是例如用于人类或动物中的眼部或肿瘤医学用途的EyeleaTM、AvastinTM或LucentisTM的结合位点。当配体或抗原是VEGF时，多聚体、四聚体或八聚体可以用于治疗或预防癌症或眼部病况(例如湿性或干性AMD或糖尿病性视网膜病变)或作为人类或动物个体的新血管形成的抑制剂。
17.一种经分离的TCR结合位点、胰岛素肽、肠促胰岛素肽或肽激素四聚体或八聚体；或多个所述四聚体或八聚体。
几种重要的肽激素是从脑下垂体中分泌的。垂体前叶分泌三种激素：催乳素，其作用于乳腺；促肾上腺皮质激素(ACTH)，其作用于肾上腺皮质以调节糖皮质激素的分泌；和生长激素，其作用于骨骼、肌肉和肝脏。脑下垂体后叶分泌抗利尿激素(又称为血管加压素)和催产素。然而，肽激素是通过多个不同器官和组织产生的，包括心脏(心房利尿钠肽(ANP)或心房利尿钠因子(ANF))和胰脏(胰高血糖素、胰岛素和生长抑素)、胃肠道(胆囊收缩素、胃泌素)以及脂肪组织储存物(瘦素)。在一个实例中，本发明的肽激素选自催乳素、ACTH、生长激素(促生长素)、血管加压素、催产素、胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦素(例如选自人类催乳素、ACTH、生长激素、血管加压素、催产素、胰高血糖素、胰岛素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦素)。
在一个实例中，肠促胰岛素是GLP-1、GIP或肠促胰岛素类似物-4肽。
在实施例中，本发明提供以下工程化四聚体和八聚体：-
经分离的肠促胰岛素四聚体或八聚体。
经分离的胰岛素肽四聚体或八聚体。
经分离的GLP-1(胰高血糖素样肽-1(GLP-1)肽四聚体或八聚体。
经分离的GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)肽四聚体或八聚体。
经分离的肠促胰岛素类似物(例如肠促胰岛素类似物-4)肽四聚体或八聚体。
经分离的肽激素四聚体或八聚体。
经分离的催乳素或催乳素肽四聚体或八聚体。
经分离的ACTH或ACTH肽四聚体或八聚体。
经分离的生长激素或生长激素肽四聚体或八聚体。
经分离的血管加压素或血管加压素肽四聚体或八聚体。
经分离的催产素或催产素肽四聚体或八聚体。
经分离的胰高血糖素或胰高血糖素肽四聚体或八聚体。
经分离的胰岛素或胰岛素肽四聚体或八聚体。
经分离的生长抑素或生长抑素肽四聚体或八聚体。
经分离的胆囊收缩素或胆囊收缩素肽四聚体或八聚体。
经分离的胃泌素或胃泌素肽四聚体或八聚体。
经分离的瘦素或瘦素肽四聚体或八聚体。
经分离的抗体结合位点(例如scFv或Fab)四聚体或八聚体。
经分离的TCR结合位点(例如scTCR)四聚体或八聚体。
经分离的TCR Vα/vβ结合位点四聚体或八聚体。
经分离的TCR Vγ/Vδ结合位点四聚体或八聚体。
经分离的抗体单可变域结合位点四聚体或八聚体。
经分离的FcAb结合位点四聚体或八聚体。
在这些四聚体或八聚体中的任一种的实例中，结构域或肽是人类结构域或肽。在这些四聚体或八聚体中的任一种的实例中，四聚体或八聚体包含NHR2 TD(例如人类NHR2)。在这些四聚体或八聚体中的任一种的实例中，四聚体或八聚体包含p53 TD(例如人类p53TD)。在这些四聚体或八聚体中的任一种的实例中，四聚体或八聚体包含p63 TD(例如人类p63 TD)。在这些四聚体或八聚体中的任一种的实例中，四聚体或八聚体包含p73 TD(例如人类p73 TD)。在这些四聚体或八聚体中的任一种的实例中，四聚体或八聚体包含TD(例如人类NHR2 TD)的四聚体，由此结构域或肽形成4或8种结构域或肽的多聚体。
在一个实例中，多者是纯的，例如不与所述结合位点或肽的多聚体混合，其中多聚体包含超过一种类型的多肽单体。
18.根据前述方面中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中多聚体、四聚体或八聚体
(a)可溶于水溶液(例如水性真核细胞生长培养基或缓冲液)中；
(b)可从真核细胞中分泌；和/或
(c)是真核细胞的表达产物。
在一个实例中，如使用来自这类细胞的上清液样品由在预期用于PAGE凝胶上的所述多聚体、四聚体或八聚体的分子量下的单条带所指示和使用蛋白质印迹法所检测，多聚体、四聚体或八聚体可从呈稳定形式的HEK293T(或其它真核、哺乳动物、CHO或Cos)细胞中分泌。
19.一种以下各物的四聚体或八聚体：
(a)TCR V域或TCR结合位点，其中四聚体或八聚体可溶于水溶液(例如水性真核细胞生长培养基或缓冲液)中；
(b)抗体单可变域，其中四聚体或八聚体可溶于水溶液(例如水性真核细胞生长培养基或缓冲液)中；
(c)TCR V域或TCR结合位点，其中四聚体或八聚体能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达；或
(d)抗体可变域(例如抗体单可变域)，其中四聚体或八聚体能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达。
培养基的实例是补充有L-谷氨酰胺的SFMII生长培养基(例如补充有4mM L-谷氨酰胺的完全SFMII生长培养基)。在一个实例中，培养基是无血清HEK293细胞培养基。在一个实例中，培养基是无血清CHO细胞培养基。
举例来说，本文中的细胞是人类细胞，例如HEK293细胞(如HEK293T细胞)。
20.根据前述方面中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中四聚体或八聚体对于抗原或pMHC结合具有双特异性。
21.根据前述方面中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中结构域是相同的。
22.根据前述方面中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中多聚体、四聚体或八聚体包含真核细胞糖基化。
举例来说，糖基化是CHO细胞糖基化。举例来说，糖基化是HEK(例如HEK293，如HEK293T)细胞糖基化。举例来说，糖基化是Cos细胞糖基化。举例来说，糖基化是毕赤酵母(Picchia)细胞糖基化。举例来说，糖基化是酵母(Sacchaaromyces)细胞糖基化。
23.根据方面22所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中所述细胞是HEK293细胞。
24.多个根据前述方面中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体。
25.一种医药组合物，其包含根据前述方面中任一项所述的一种或多种多聚体、一种或多种四聚体或一种或多种八聚体和医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
26.一种化妆品、食品、饮料、清洁产品、洗涤剂，其包含根据方面1到24中任一项所述的一种或多种多聚体、一种或多种四聚体或一种或多种八聚体。
27.一种根据前述方面中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体的所述工程化(并且任选地经分离)多肽或(任选地经分离)单体。
单体是如本文所公开的工程化多肽，其包含所述蛋白质域或肽并且进一步包含TD。
任选地，工程化多肽包含(在N端到C端方向上)：可变域(V1)-恒定域(C)(例如CH1或Fc)-任选的连接子-TD。
28.一种工程化(并且任选地经分离)工程化多肽(P1)，其包含(在N端到C端方向上)：-
(a)TCR V1-TCR C1-抗体C(例如CH、CH1(如IgG CH1)或CL(如Ck或CK))-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα并且C1是Cα；
(ii)V1是Vβ并且C1是Vβ；
(iii)V1是Vγ并且C1是Cγ；或
(iv)V1是Vδ并且C1是Cδ；
或
(b)TCR V1-抗体C(例如CH、CH1(如IgG CH1)或CL(如Cλ或Cκ))-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα；
(ii)V1是Vβ；
(iii)V1是Vγ；或
(iv)V1是Vδ；
或
(c)抗体V1-抗体C(例如CH、CH1(如IgG CH1)或CL(如Ck或CK))-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)V1是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(d)抗体V1-任选的抗体C(例如CH、CH1(如IgG CH1)或CL(如Ck或CK))-抗体Fc(例如IgG Fc)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)V1是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(e)抗体V1-抗体CL(例如Ck或CK)-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)V1是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(f)TCR V1-TCR C1-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα并且C1是Cα；
(ii)V1是Vβ并且C1是Cβ；
(iii)V1是Vγ并且C1是Cγ；或
(iv)V1是Vδ并且C1是Cδ。
在一个实例中，在(a)或(b)中，特异性结合到pMHC的单链TCR结合位点(scTCR)包含TCR V，其中结合位点包含TCR V-连接子-TCRV。在一个实例中，工程化多肽包含(在N到C端方向上)：(i)V1-连接子-V-任选的C-任选的连接子-TD，或(ii)Vα-连接子-V1-任选的C-任选的连接子-TD，其中Vα是TCR V域并且C是抗体C域(例如CH1或CL)或TCR C。
优选地，抗体C是CH1(例如IgG CH1)。
在一个实例中，多聚体、四聚体或八聚体的尺寸不超过155kDa，例如，其中所述蛋白质域是包含具有至少16、17、18、19、20、21或22个氨基酸的CDR3的抗体可变域，如骆驼科CDR3或牛CDR3。
在一个实例中，多聚体、四聚体或八聚体包含TCR结合位点和抗体结合位点。举例来说，每个多肽包含TCR V(例如包含在特异性结合pMHC的scTCR中)和抗体V(例如包含在scFv中或与包含在所述第二多肽中的第二V域配对以形成特异性结合到抗原的V/V配对结合位点)。在一个实例中，pMHC包含RAS肽。在一个实例中，抗原选自以下组成的组：PD-1、PD-Ll或本文所公开的任何其它抗原。举例来说，抗原是PD-1并且pMHC包含RAS肽。
29.根据方面28所述的多肽，其中工程化多肽P1与另一个多肽(P2)配对，其中P2包含(在N端到C端方向上)：-
(g)TCR V2-TCR C2-抗体CL(例如cλ或Cκ)，其中P1符合方面28中所叙述的(a)，并且
(i)当P1符合(a)(ii)时V2是Vα并且C2是Cα；
(ii)当P1符合(a)(i)时V2是Vβ并且C2是Cβ；
(iii)当P1符合(a)(iv)时V2是Vγ并且C2是Cγ；或
(iv)当P1符合(a)(iii)时V2是Vδ并且C2是Cδ；
或
(h)TCR V2-抗体CL(例如Ck或CK)，其中P1符合方面28中所叙述的(b)，并且
(i)当P1符合(b)(ii)时V2是Vα；
(ii)当P1符合(b)(i)时V2是Vβ；
(iii)当P1符合(b)(iv)时V2是Vγ；或
(iv)当P1符合(b)(iiii)时V2是Vδ；
或
(i)抗体V2-CL(例如Ck或CK)，其中P1符合方面28中所叙述的(c)，并且
(i)当P1符合(c)(ii)时V2是VH；或
(ii)当P1符合(c)(i)时V2是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(j)抗体V2-任选的CL(例如Ck或CK)，其中P1符合方面28中所叙述的(d)，并且
(i)当P1符合(d)(ii)时V2是VH；或
(ii)当P1符合(d)(i)时V2是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(k)抗体V2-CH1(例如IgG CH1)，其中P1符合方面28中所叙述的(e)，并且
(i)当P1符合(e)(ii)时V2是VH；或
(ii)当P1符合(e)(i)时V2是VL(例如Vλ或Vκ)；
或
(1)TCR V2-TCR C2，其中P1符合方面28中所叙述的(f)，并且
(i)当P1符合(f)(ii)时V2是Vα并且C2是Cα；
(ii)当P1符合(f)(i)时V2是Vβ并且C2是Cβ；
(iii)当P1符合(f)(iii)时V2是Vγ并且C2是Cγ；或
(iv)当P1符合(f)(iv)时V2是Vδ并且C2是Cδ。
任选地，V1和V2形成能够特异性结合到抗原或pMHC的配对可变域结合位点。在一个实例中，V1和V2是例如选自以下组成的组的抗体的可变域：ReoProTM；阿昔单抗；RituxanTM；利妥昔单抗；ZenapaxTM；达利珠单抗；SimulectTM；巴利昔单抗；SynagisTM；帕利珠单抗；RemicadeTM；英利昔单抗；HerceptinTM；MylotargTM；吉妥单抗；CampathTM；阿仑单抗；ZevalinTM；异贝莫单抗；HumiraTM；阿达木单抗；XolairTM；奥马珠单抗；BexxarTM；托西莫单抗；RaptivaTM；依法利珠单抗；ErbituxTM；西妥昔单抗；AvastinTM；贝伐单抗；TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；雷珠单抗；SolirisTM；依库珠单抗；CimziaTM；赛妥珠单抗；SimponiTM；戈利木单抗；IlarisTM；卡那单抗；StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；ABThraxTM；瑞西巴库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；阿多-曲妥珠单抗；KeytrudaTM；OpdivoTM；GazyvaTM和奥必珠单抗。
在一个实施例中，抗体是阿瓦斯汀(Avastin)。
在一个实施例中，抗体是安挺乐(Actemra)。
在一个实施例中，抗体是爱必妥(Erbitux)。
在一个实施例中，抗体是乐舒晴(Lucentis)。
在一个实施例中，抗体是萨瑞鲁单抗。
在一个实施例中，抗体是杜匹鲁单抗。
在一个实施例中，抗体是阿里罗单抗(alirocumab)。
在一个实施例中，抗体是依伏库单抗(evolocumab)。
在一个实施例中，抗体是派姆单抗(pembrolizumab)。
在一个实施例中，抗体是纳武单抗(nivolumab)。
在一个实施例中，抗体是伊匹单抗。
在一个实施例中，抗体是类克(remicade)。
在一个实施例中，抗体是戈利木单抗。
在一个实施例中，抗体是奥法木单抗。
在一个实施例中，抗体是本利斯塔(Benlysta)。
在一个实施例中，抗体是坎帕斯(Campath)。
在一个实施例中，抗体是利妥昔单抗。
在一个实施例中，抗体是赫赛汀(Herceptin)。
在一个实施例中，抗体是杜伐鲁单抗(durvalumab)。
在一个实施例中，抗体是达雷木单抗(daratumumab)。
在一个实例中，V1能够(当单可变域时或当与V2配对时自身)特异性结合到选自以下组成的组的抗原：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AWI；AIG1；AKAPl；AKAP2；AIYIH；AMHR2；ANGPTl；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRl(MDR15)；BlyS；BM PI；BMP2；BMP3B(GDFIO)；BMP4；BMP6；BM P8；BMPRIA；BMPRIB；BM PR2；BPAGl(网蛋白)；BRCAl；C19orflO(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANTl；CASPl；CASP4；CAVl；CCBP2(D6/JAB61)；CCLl(1-309)；CCLl 1(嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCLl 3(MCP-4)；CCL15(MIP-id)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(M IP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MIP-2)；SLC；次级非淋巴组织趋化因子-2(exodus-2)；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(M PIF-1)；CCL24(MPIF-2I嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MIP-la)；CCL4(M IP-lb)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CM KBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙黏蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p2IWapl/Cipl)；CDKN1B(p27Kipl)；CDKNIC；CDKN2A(pl6INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(紧密连接蛋白-7)；CLN3；CLU(丛生蛋白)；CMKLR1；CMK0R1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDi)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GROl)；CXCLIO(IP-10)；CXCL1 1(1-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GR02)；CXCL3(GR03)；CXCL5(ENA-78ILIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR ISTRL33IBonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J01 18；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGFl；EDGl；EFNAI；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENOl；EN02；EN03；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF1 1；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF 8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FIL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FU12584；FU25530；FLRT1(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-I)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-65T；GAT A3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCRIO)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC1O(C1O)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；EDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOXl；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNAl；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNBl；IFNγ；TFNWl；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL1 1RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；1L13；IL13RA1；IL13RA2；1L14；1L15；IL15RA；IL16；1L17；IL17B；IL17C；IL17R；1L18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；1L19；ILIA；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2ILIRN；1L2；1L20；IL20RA；IL21R；1L22；1L22R；1L22RA2；1L23；1L24；1L25；1L26；1L27；1L28A；1L28B；1L29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；1L3；1L30；IL3RA；1L4；IL4R；1L5；IL5RA；1L6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；1L7；TL7R；1L8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；1L9；IL9R；ILK；TNHA；TNHBA；INSL3；INSL4；IRAKI；IRAK2；ITGA1；ITGA2；1TGA3；ITGA6(a6整联蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b 4整联蛋白)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；MTLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KRTHB6(头发特异性II型角蛋白)；LAMA5；LEP(瘦素)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；M IB1；中期因子；M IF；M IP-2；MK167(Ki-67)；MMP2；M MP9；MS4A1；MSMB；MT3(金属硫蛋白-ifi)；MTSS 1；M UC 1(粘蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB 1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NM El(NM23A)；NOX5；NPPB；NROB1；NROB2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；P2RX7；PAP；PARTI；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸蛋白聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDCl；PPBP(CXCL7)；PPID；PRl；PRKCQ；PRKDl；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p2IRac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF1 10(ZNF144)；ROB02；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYE1(内皮细胞单核细胞活化细胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINIA3；SERPINB5(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂)；SERPTNEl(PAT-i)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPP1；SPRRIB(Spri)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCPIO；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBSl(血小板反应蛋白-l)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-i)；T]MP3；组织因子；TLRIO；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAIP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSF1 1A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF2 1；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSFIO(TRAIL)；TNFSF1 1(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF1 5(VEGI)；TNFSF1 8；TNFSF4(0X40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSF8(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶lia)；TP53；TPM 1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM 1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-lb)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；和ZFPM2。
举例来说，在本发明的任何构型中，多聚体、四聚体或八聚体特异性结合到第一和第二表位或抗原，其中的每一个选自以下组成的组：EpCAM和CD3；CD 19和CD3；VEGF和VEGFR2；VEGF和EGFR；CD 138和CD20；CD138和CD40；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD19和CD20；CD-8和IL-6；PDL-1和CTLA-4；CTLA-4和BTN02；CSPGs和RGM A；IGF1和IGF2；IGF1和/或2和Erb2B；IL-12和IL-18；IL-12和TWEAK；IL-13和ADAM8；IL-13和CL25；IL-13和IL-lβ；IL-13和IL-25；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-9；IL-13和LHR激动剂；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和PED2；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和TARC；IL-13和TGF-β；IL-1α和IL-1β；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；RGM A和RGM B；Te38和TNFα；TNFα和IL-12；TNFα和IL-12p40；TNFα和IL-13；TNFα和IL-15；TNFα和IL-17；TNFα和IL-18；TNFα和IL-1β；TNFα和IL-23；TNFα和M IF；TNFα和PEG2；TNFα和PGE4；TNFα和VEGF；和VEGFR和EGFR；TNFα和RANK配体；TNFα和Blys；TNFα和GP130；TNFα和CD-22；和TNFα和CTLA-4。
举例来说，第一表位或抗原选自以下组成的组：CD3；CD 16；CD32；CD64；和CD89；并且第二表位或抗原选自以下组成的组：EGFR；VEGF；IGF-1R；Her2；c-Met(aka HGF)；HER3；CEA；CD33；CD79a；CD19；PSA；EpCAM；CD66；CD30；HAS；PSMA；GD2；ANG2；IL-4；IL-13；VEGFR2；和VEGFR3。
在一个实例中，V1能够(当单可变域时或当与V2配对时自身)特异性结合到选自以下组成的组的抗原：人类IL-1A、IL-Ib、IL-1RN、IL-6、BLys、APRIL、活化素A、TNFα、BMP、BMP2、BMP7、BMP9、BMP 10、GDF8、GDF1 1、RANKL、TRAIL、VEGFA、VEGFB或PGF；任选地，多聚体包含细胞因子氨基酸序列(例如C端到TD)，如IL-2或IL2-肽；并且多聚体、四聚体或八聚体用于治疗或预防人类个体的癌症。在一个实例中，所述效应或蛋白质域能够结合到这种抗原；任选地，多聚体包含细胞因子氨基酸序列(例如C端到TD)，如IL-2或IL2-肽；并且多聚体、四聚体或八聚体用于治疗或预防人类个体的癌症。
30.一种如方面28中所定义的P1或与如方面29中所定义的P2配对的P1的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体或八聚体)；或多个所述多聚体，任选地，其中多聚体符合方面1到24中的任一项。
优选地，多聚体是工程化多肽和/或效应域的四聚体。在一个实例中，多个四聚体不与多肽的单体、二聚体或三聚体混合。
在一个实例中，多聚体例如四聚体能够特异性结合到两种不同的pMHC。
31.一种核酸，其编码根据方面27到29中任一项所述的工程化多肽或单体，任选地，其中用于表达多肽的表达载体包含核酸。
在一个实例中，核酸是任选地与用于表达多肽或单体的启动子可操作地连接或包含其的DNA。在另一个实例中，核酸是RNA(例如mRNA)。
32.一种真核宿主细胞，其包含根据方面3所述的核酸或载体，用于细胞内和/或分泌性表达根据方面1到24中任一项所述的多聚体、四聚体、八聚体、工程化多肽或单体。
33.一种根据方面31所述的核酸或载体在制备蛋白质多聚体的方法中用于产生细胞内表达和/或分泌的多聚体的的用途，其中所述方法包含在包含核酸或载体的真核细胞中表达多聚体和/或由包含核酸或载体的真核细胞分泌多聚体。
34.一种根据方面31所述的核酸或载体在制备蛋白质多聚体的方法中、在包含核酸或载体的真核细胞中用于产生糖基化多聚体的的用途。
本发明的哺乳动物糖基化可用于产生包含或其组成为本发明的多聚体、四聚体或八聚体的药品以用于医学治疗或预防哺乳动物例如人类的疾病或病况。因此，出于此目的，本发明提供这种使用方法以及本发明的多聚体、四聚体或八聚体。类似地，一种或多种作为本发明哺乳动物的宿主细胞(或其细胞系)中的细胞内和/或分泌性表达可用于产生这类药品。当HEK293、CHO或Cos细胞常用于生产药剂时，在其中的这种表达是特别适用的。
在一个实施例中，本发明包含有包含本发明的多聚体、四聚体或八聚体的洗涤剂或个人保健产品。在一个实施例中，本发明包含有包含本发明的多聚体、四聚体或八聚体的食品或饮料。
在一个实例中，本发明的多聚体、单体、二聚体、三聚体、四聚体、八聚体、多肽、组合物、混合物、用途或方法供用于工业或家用用途，或用于供用于这种用途的方法。举例来说，其供用于或用于农业、石油(oil/petroleum)工业、食品或饮品工业、服装工业、包装工业、电子行业、计算机行业、环境工业、化学工业、航天工业、汽车工业、生物技术工业、医学工业、保健工业、牙科行业、能量工业、消费品工业、制药工业、采矿行业、清洁工业、林业工业、渔业、休闲行业、回收利用工业、化妆品工业、塑料工业、纸浆或造纸工业、纺织工业、服装工业、皮革或麂皮或动物兽皮工业、烟草工业或钢铁工业。
35.一种混合物，其包含(i)编码根据方面27到29中任一项所述的工程化多肽的真核细胞系；和(ii)如方面1到24中任一项中所定义的多聚体、四聚体或八聚体。
36.根据方面35所述的混合物，其中细胞系处于包含细胞的分泌产物的培养基中，其中分泌产物包含所述多聚体、四聚体或八聚体。
37.根据方面1到24中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其用于医学用途。
38.一种方法，其产生：
(a)TCR V域多聚体，所述方法包含真核细胞中所表达的TCR V-NHR2 TD或TCR V-p53 TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达，所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；
(b)抗体V域多聚体，所述方法包含真核细胞中所表达的抗体V(例如单可变域)-NHR2 TD或V-p53 TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达，所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；
(c)肠促胰岛素肽(例如GLP-1、GIP或胰岛素)多聚体，所述方法包含真核细胞如HEK293T细胞中所表达的肠促胰岛素肽-NHR2 TD或肠促胰岛素肽-p53 TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达；所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；或
(d)肽激素多聚体，所述方法包含真核细胞如HEK293T细胞中所表达的肽激素-NHR2 TD或肽激素-p53 TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达；所述方法任选地包含分离多个所述多聚体。
39.一种自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63 TD或p73 TD或其同源物或直系同源物)在制备多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途。
40.一种工程化多肽在制备包含蛋白质域或肽的多个拷贝的多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途，其中工程化多肽包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，并且进一步包含自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63 TD或p73 TD或同源物或直系同源物)。
41.一种自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53 TD、p63 TD或p73 TD或其同源物或直系同源物)在制备多肽的四聚体以用于产生不与单体、二聚体或三聚体混合的多个四聚体的方法中的用途。
42.一种工程化多肽在制备包含蛋白质域或肽的多个拷贝的多肽四聚体的方法中用于产生不与单体、二聚体或三聚体混合的多个四聚体的用途，其中工程化多肽包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，并且进一步包含自缔合四聚域(TD)(例如NHR2 TD、p53TD、p63 TD或p73 TD或同源物或直系同源物)。
43.根据方面39到42中任一项所述的用途，其中四聚体产量是单体和/或二聚体产量的至少10、20、30、40或50倍。
44.根据方面39到43中任一项所述的用途，其中所述方法所产生的四聚体:所产生的单体和/或二聚体的比率是至少90:10(例如至少95:5或98:2或99:1)。
45.根据方面39到44中任一项所述的用途，其中每个单体的尺寸不超过40、35、30、25或20kDa。
46.根据方面39到45中任一项所述的用途，其中每个四聚体的尺寸不超过200、160、155或150kDa。
47.根据方面39到46中任一项所述的用途，其中所述方法包含由真核细胞系表达四聚体。
48.一种能够结合pMHC复合物的多价异源二聚可溶性T细胞受体，其包含：
(i)TCR胞外域；
(ii)免疫球蛋白恒定域；和
(iii)ETO的NHR2多聚化域。
49.一种多聚免疫球蛋白，其包含
(i)免疫球蛋白可变域；和
(ii)ETO的NHR2多聚化域。
50.一种用于组装可溶性多聚多肽的方法，其包含：
(a)提供与ETO的NHR2域融合的所述多聚多肽的单体；
(b)使所述单体的多个拷贝缔合，由此获得多聚可溶性多肽。
本发明进一步提供
(i)如图1中所示的单体；
(ii)如图1中所示的同源二聚体；
(iii)如图1中所示的同源四聚体；
(iv)如图2中所示的单体2；
(v)如图2中所示的同源二聚体2；
(vi)如图2中所示的同源四聚体2；
(vii)如图11a中所示的单体；
(viii)如图11a中所示的同源二聚体；
(ix)如图11a中所示的同源四聚体；
(x)如图12a中所示的单体；
(xi)如图12a中所示的同源二聚体；
(xii)如图12a中所示的同源四聚体；
(xiii)如图13a中所示的单体2；
(xiv)如图13a中所示的同源二聚体2；
(xv)如图13a中所示的同源四聚体2；或
(xvi)包含(i)到(xv)中的任一种(例如Quad 3、4、12、13、14、15、16和17中的任一种)或图21中所示(不包括任何前导或标签)的任何蛋白质的多聚体的多聚蛋白质
(xvii)多个(xvi)的多聚体；或
(xviii)包含(i)到(xvii)中的任一种和医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的医药组合物。
本发明还提供
(i)四价或八价抗体V分子；
(ii)四价或八价抗体Fab分子；
(iii)四价或八价抗体dAb分子；
(iv)四价或八价抗体scFv分子；
(v)四价或八价抗体TCR V分子；或
(vi)四价或八价抗体scFv分子；
其中所述分子
(a)可溶于水溶液(例如本文所公开的溶液或细胞培养基)中；和/或
(b)能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达。
本发明提供在其N端和/或C端处与不为NHR2序列的氨基酸序列(例如肽、蛋白质域或蛋白质)融合的NHR2或p53(或本文所公开的另一种TD)的权利要求多聚体(例如四聚体)。举例来说，序列选自TCR(例如TCRα、TCRβ、Cα或Oβ)、细胞因子(例如白细胞介素，例如IL-2、IL-12、IL-12和IFN)、抗体片段(例如scFv、dAb或Fab)和抗体域(例如V或C域，例如VH、VL、Vκ、Vλ、CH、CH1、CH2、CH3、铰链、Cκ或Cλ域)。任选地，所述多聚体所述分子
(i)可溶于水溶液(例如本文所公开的溶液或细胞培养基)中；和/或
(ii)能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达。
本发明提供：-
(i)NHR2或p53(或本文所公开的另一种TD)用于制备用于由细胞例如真核细胞(例如哺乳动物、HEK293、CHO或Cos细胞)可溶性表达多肽的多聚体的多肽的用途。
(ii)NHR2或p53(或本文所公开的另一种TD)用于制备用于在细胞例如真核细胞(例如哺乳动物、HEK293、CHO或Cos细胞)中细胞内表达多肽的多聚体的多肽的用途。
(iii)包含细胞内表达产物的细胞，其中所述产物包含有包含在其N端和/或C端处与不为NHR2序列的氨基酸序列(例如肽、蛋白质域或蛋白质)融合的NHR2或p53(或本文所公开的另一种TD)的多肽的多聚体。
(iv)NHR2作为用于四聚化肽、蛋白质域、多肽或蛋白质的混杂四聚域在制备由宿主细胞细胞内和/或可溶性表达的多聚体中的用途。
任选地，氨基酸是人类肽、蛋白质域或蛋白质的氨基酸序列，例如TCR(例如TCRα、TCRβ、Cα或νβ)、细胞因子(例如白细胞介素，例如IL-2、IL-12、IL-12和IFN)、抗体片段(例如scFv、dAb或Fab)或抗体域(例如V或C域，例如VH、VL、Vκ、Vλ、CH、CH1、CH2、CH3、铰链、Cκ或Cλ域)。
任选地，所述或每个多肽包含选自Quad 1-46组成的组的多肽(即如图21中所示但不包括任何前导序列或标签序列的多肽)。任选地，本发明提供选自这种Quad 1-46组成的组的多肽的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体，优选四聚体或八聚体)以例如用于医学或诊断用途，例如用于治疗或预防人类或动物(例如人类)的疾病或病况的医学用途。
任选地，所述或每个多肽包含由选自SEQ ID NO:13-50组成的组的核苷酸序列编码的多肽(不包括任何前导序列或标签序列)。任选地，所述或每个多肽包含有包含选自SEQID NO:83-115组成的组的氨基酸序列的多肽(不包括任何前导序列或标签序列)。任选地，本发明提供这种多肽的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体或八聚体，优选四聚体或八聚体)以例如用于医学或诊断用途，例如用于治疗或预防人类或动物(例如人类)的疾病或病况的医学用途。
在一个实例中，TD是包含在SEQ ID NO:1-9中的任一个中的TD。在一个实例中，TD是包含SEQ ID NO:10或126的TD。在一个实例中，TD由SEQ ID NO:124或125编码。在一个实例中，每个TD的氨基酸序列是SEQ ID NO:10或126或与SEQ ID NO:10或126具有至少80％、85％、90％、95％、96％m、97％、98％或99％一致性。
在一个实例中，TD是包含SEQ ID NO:120或123的TD。在一个实例中，TD由SEQ IDNO:116或119编码。在一个实例中，每个TD的氨基酸序列是SEQ ID NO:120或123或与SEQ IDNO:120或123具有至少80％、85％、90％、95％、96％m、97％、98％或99％一致性。
任选地，包含在工程化多肽或单体中的结构域或肽包含选自SEQ ID NO:51-82的氨基酸。
高纯度四聚体
如本文中所示例，在一个构型中，本发明是基于以下的意外实现：四聚域(TD)例如p53四聚域(p53 TD)可用于优先于产生低级结构如二聚体和单体而产生效应域的四聚体。这对于四聚体的分泌是特别适用的，所述分泌是哺乳动物表达细胞系如CHO、HEK293和Cos细胞系的所需产量。本发明也特别适用于产生尺寸不超过200、160、155或150kDa的四聚体。
因此，本发明提供以下概念：-
概念
1.一种四聚域(TD)(例如p53四聚域(p53 TD)或NHR2 TD)或其同源物或直系同源物在制备多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途。
单体和二聚体包含TD的一个或两个拷贝，分别为同源物或直系同源物。
在一个实例中，TD、直系同源物或同源物是人类域。
在一个实例中，四聚体的产量高于单体的产量；在一个实例中，四聚体的产量高于二聚体的产量；在一个实例中，四聚体的产量高于三聚体的产量；在一个实例中，四聚体的产量高于单体和二聚体的产量；在一个实例中，四聚体的产量高于单体和三聚体的产量；在一个实例中，四聚体的产量高于单体、二聚体和三聚体的产量。
举例来说，TD是p53同工型1的TD。在一个实例中，TD包含或其组成为与人类p53(例如同工型1)的位置325到356(或319-360；或321-359)具有一致性的氨基酸序列。任选地，TD、直系同源物或同源物包含或其组成为与SEQ ID NO:10、126、11或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。举例来说，所述序列与所述所选序列具有一致性。任选地，TD、直系同源物或同源物包含或其组成为与SEQ ID NO:120、121、122或123具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。举例来说，所述序列与所述所选序列具有一致性。
2.根据概念1所述的用途，其中使用相同TD或其同源物或直系同源物的第一、第二、第三和第四拷贝。
3.根据前述概念中任一项所述的用途，其中TD是NHR2、p53、p63或p73四聚域。
举例来说，TD是p53 TD。在一个实例中，TD是p53 TD例如人类p53 TD的直系同源物或同源物。
4.根据前述概念中任一项所述的用途，其中四聚体产量是单体和/或二聚体产量的至少10倍。
任选地，产量是单体和/或二聚体产量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。任选地，所生成四聚体:单体和/或二聚体的比率是至少90:10，例如至少95:5；或96:4；或97:3；或98:2；或99:1。任选地，仅产生四聚体。
在一个实施例中，包含在每个单体、二聚体或四聚体中的每个域是人类域；并且任选地，单体、二聚体或四聚体不包含非人类氨基酸序列或连接子。
5.根据前述概念中任一项所述的用途，其中所述方法所产生的四聚体:所产生的单体和/或二聚体的比率是至少90:10(即单体的量的9×；二聚体的量的9×；或单体与二聚体组合的量的9×)。
6.根据概念4或5所述的用途，其中产量或比率通过以下可测定或测定：获得四聚体制备方法的产物的样品，对样品使用蛋白质分离技术以解析四聚体、单体和二聚体，并且比较四聚体的量与单体和二聚体的量。
可例如使用本文所描述的凝胶例如天然凝胶(即不在变性条件下如在不存在SDS的情况下的凝胶)的蛋白质印迹分析测定四聚体、单体、二聚体和三聚体的量。
7.根据概念4或5所述的用途，其中产量或比率通过以下可测定或测定：
(a)获得四聚体制备方法的产物的样品；
(b)在非还原条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以将样品解析到对应于所述四聚体的条带和对应于所述单体的条带和/或对应于所述二聚体的条带中；和
(c)比较四聚体条带与一个或多个单体和/或二聚体条带以例如通过比较相对条带强度和/或条带尺寸测定所述产量或比率。
8.根据概念4或5所述的用途，其中产量或比率通过以下可测定或测定：
(d)获得四聚体制备方法的产物的样品；
(e)在非还原条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以将样品解析到对应于所述四聚体的条带中，例如，其中凝胶处于非变性条件下(例如在不存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下)；
(f)确定不存在对应于所述单体的条带和/或无条带对应于所述二聚体。
9.根据概念7或8所述的用途，其包含
(g)获得四聚体制备方法的产物的第二样品；
(h)在还原条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以将第二样品解析到对应于所述单体的条带和/或对应于所述二聚体的条带中，例如，其中凝胶处于非变性条件下(例如在不存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下)；和
(i)比较通过步骤(h)产生的凝胶与步骤(b)或(e)的凝胶以确定步骤(b)的凝胶或其中预期在步骤(e)的凝胶中的这类凝胶中的一个或多个单体和/或二聚体条带的位置。
10.根据前述概念中任一项所述的用途，其中每个单体的尺寸不超过40kDa。
举例来说，单体的尺寸不超过35、30、25、24、23、22、21或20kDa。
11.根据前述概念中任一项所述的用途，其中每个四聚体的尺寸不超过150kDa。
举例来说，四聚体的尺寸不超过80、90、100、110、120、130或140kDa。
12.根据前述概念中任一项所述的用途，其中所述方法包含由哺乳动物细胞系例如HEK293、CHO或Cos细胞系表达四聚体。
举例来说，细胞系是HEK293(例如HEK293T)细胞系。在替代方案中，细胞系是酵母(例如酵母或毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Ppastoris))或细菌细胞系。
13.根据前述概念中任一项所述的用途，其中所述方法包含由哺乳动物细胞系例如HEK293、CHO或Cos细胞系分泌四聚体。
在一个实例中，因此，有利地，四聚体用途是用于由哺乳动物细胞系(例如HEK293、CHO或Cos细胞系)或真核细胞系表达。这可用于大规模制备本发明的产物，例如四聚体。
举例来说，细胞系是HEK293(例如HEK293T)细胞系。在替代方案中，细胞系是酵母(例如酵母或毕赤酵母，例如巴斯德毕赤酵母)或细菌细胞系。
14.根据前述概念中任一项所述的用途，其中每个多肽或单体包含所述TD、同源物或直系同源物和一个或多个蛋白质效应域，如一个或多个抗体域，例如一个或多个形成抗原结合位点的抗体域。
15.根据概念14所述的用途，其中多肽包含以下中的一种或多种：
(i)能够特异性结合抗原的抗体单可变域(dAb或VHH或NanobodyTM)；
(ii)能够结合抗原的scFv或能够结合pMHC的scTCR；
(iii)能够结合抗原的Fab；或
(iv)TCR可变域或pMHC结合位点。
16.根据前述概念中任一项所述的用途，其中每个多肽或单体包含所述TD、同源物或直系同源物和一个或多个肠促胰岛素、胰岛素、GLP-1或肠促胰岛素类似物-4域。
17.根据前述概念中任一项所述的用途，其中每个多肽或单体包含所述TD、同源物或直系同源物；和第一和第二抗原结合位点。
18.根据概念17所述的用途，其中每个结合位点由以下提供：
(i)能够特异性结合抗原的抗体单可变域(dAb或VHH或NanobodyTM)；
(ii)能够结合抗原的scFv或能够结合pMHC的scTCR；
(iii)能够结合抗原的Fab；或
(iv)TCR可变域或pMHC结合位点。
19.根据概念18所述的用途，其中每个结合位点由抗体单可变域提供。
20.根据概念14到18中任一项所述的用途，其中TD、同源物或直系同源物与所述另外一种或多种结构域直接融合。
21.根据概念20所述的用途，其中每个单体或多肽包含直接或经由肽连接子与所述另一种结构域的C端融合的TD、同源物或直系同源物。
22.一种多肽的四聚体，其中每个多肽包含
(i)四聚域(TD)(例如p53 TD或NHR2 TD)或其同源物或直系同源物；
(ii)一种或多种蛋白质效应域；和
(iii)任选的连接(i)与(ii)的连接子(例如连接(ii)的C端与(i)的N端)；
其中任选地，每个四聚体的尺寸不超过150或200kDa。
举例来说，四聚体的尺寸不超过80、90、100、110、120、130或140kDa。在一个实例中，本文中的任何多聚体、二聚体、三聚体、四聚体或八聚体的尺寸是至少60或80kDa；这可以用于实例中以延长投予有多聚体、二聚体、三聚体、四聚体或八聚体的人类或动物个体的半衰期(例如以治疗或预防个体的疾病或病况)。这些范围内的尺寸可以超过肾脏过滤尺寸。
在替代方案中，本发明提供单体、二聚体、四聚体或八聚体代替四聚体。
23.根据概念22所述的四聚体，其中每个多肽包含以下中的一种或多种：
(i)能够特异性结合抗原的抗体单可变域(dAb或VHH或NanobodyTM)；
(ii)能够结合抗原的scFv或能够结合pMHC的scTCR；
(iii)能够结合抗原的Fab；或
(iv)TCR可变域或pMHC结合位点。
24.根据概念22或23所述的四聚体，其中每个多肽包含所述TD、同源物或直系同源物和一个或多个肠促胰岛素、胰岛素、GLP-1或肠促胰岛素类似物-4域。
25.根据概念22或23所述的四聚体，其中每个多肽包含所述TD、同源物或直系同源物；和第一和第二抗原结合位点。
26.根据概念25所述的四聚体，其中每个结合位点由以下提供：
(i)能够特异性结合抗原的抗体单可变域(dAb或VHH或NanobodyTM)；
(ii)能够结合抗原的scFv或能够结合pMHC的scTCR；
(iii)能够结合抗原的Fab；或
(iv)TCR可变域或pMHC结合位点。
27.根据概念26所述的四聚体，其中每个结合位点由抗体单可变域提供。
28.根据概念22到27中任一项所述的四聚体，其中TD、同源物或直系同源物与所述一种或多种效应域直接融合。
29.根据概念22到27中任一项所述的四聚体，其中每个多肽包含直接或经由肽连接子与所述效应域的C端融合的TD、同源物或直系同源物。
在一个实施例中，每个多肽包含仅2个(即仅第一和第二但不是第三)效应域或仅2个dAb、VHH、scFv、scTCR、Fab或抗原结合位点。
30.一种医药组合物，其包含根据概念22到29中任一项所述的四聚体和医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
任选地，无菌医学容器或装置例如注射器、小瓶、吸入器或注射装置包含所述组合物。
31.一种化妆品、食品、饮料、清洁产品、洗涤剂，其包含根据概念22到29中任一项所述的四聚体。
32.一种混合物，其包含编码如前述概念中的任一项所叙述的多肽的细胞系(例如哺乳动物细胞系，例如HEK293、CHO或Cos细胞系)；和如前述概念中任一项中所定义的四聚体。
任选地，无菌容器包含所述混合物。
33.根据概念32所述的混合物，其中细胞系处于包含所述细胞的分泌产物的培养基中，其中分泌产物包含所述四聚体。
34.根据概念33所述的混合物，其中分泌产物不包含如概念1到31中任一项所定义的单体和/或二聚体。
35.根据概念33所述的混合物，其中分泌产物包含呈单体和/或二聚体的量的至少10×的量的所述四聚体。
36.根据概念33所述的混合物，其中分泌产物包含呈至少90:10四聚体:单体和/或二聚体的比率的所述四聚体。
37.一种用于增强蛋白质效应域(例如抗体可变域或结合位点)的四聚体的产量的方法，所述方法包含由细胞系(例如哺乳动物细胞、CHO、HEK293或Cos细胞系)表达多肽的四聚体，其中多肽如前述概念中的任一项所定义并且包含一种或多种效应域；和任选地分离所述经表达四聚体。
同源物、直系同源物或等效物具有四聚功能。
同源物：通过从共同的祖先DNA或蛋白质序列下降的与第二基因、核苷酸或蛋白质序列相关的基因、核苷酸或蛋白质序列。术语同源物可应用于通过事件分离的基因之间的关系或应用于通过基因复制事件分离的基因之间的关系。
直系同源物：直系同源物是通过物种形成从共同的祖先基因、核苷酸或蛋白质序列中演化的不同物种中的基因、核苷酸或蛋白质序列。通常，在演化过程中直系同源物保留相同功能。
在一个实例中，TD、直系同源物或同源物是表2中所列的蛋白质1到119中的任一种的TD。在一个实例中，直系同源物或同源物是表2中所列的蛋白质1到119中的任一种的TD的直系同源物或同源物。在一个实施例中，并非使用p53四聚域(p53-TD)或其同源物或直系同源物，取而代之地，可以读取本文中的本发明的所有方面以涉及在多肽中使用或包括表2中所列的蛋白质1到119中的任一种的TD或其同源物或直系同源物的单体、二聚体、三聚体或四聚体。TD可以是NHR2(例如人类NHR2)TD或其直系同源物或同源物。TD可以是p63(例如人类p63)TD或其直系同源物或同源物。TD可以是p73(例如人类p73)TD或其直系同源物或同源物。此可以具有如下的一种或多种优势：-
-从哺乳动物或其它真核细胞例如本文所公开的哺乳动物细胞(如CHO、HEK293或Cos)中分泌四聚体；
-增强相对于单体而言的经分泌四聚体的产量；
-增强相对于二聚体而言的经分泌四聚体的产量；
-增强相对于三聚体而言的经分泌四聚体的产量；
-增强相对于组合单体与二聚体而言的经分泌四聚体的产量；
-增强相对于组合单体、二聚体和三聚体而言的经分泌四聚体的产量；
-增强包含抗原结合位点的四聚体中的抗原结合的亲和力或亲合力；
-增强四聚体产生和/或表达，其中四聚体的尺寸不超过200或不超过160或150kDa。
在一个实施例中，每个多肽或单体包含一个或多个选自以下的抗体的VH、VL或VH/VL结合位点：ReoProTM；阿昔单抗；RituxanTM；利妥昔单抗；ZenapaxTM；达利珠单抗；SimulectTM；巴利昔单抗；SynagisTM；帕利珠单抗；RemicadeTM；英利昔单抗；HerceptinTM；曲妥珠单抗；MylotargTM；吉妥单抗；CampathTM；阿仑单抗；ZevalinTM；异贝莫单抗；HumiraTM；阿达木单抗；XolairTM；奥马珠单抗；BexxarTM；托西莫单抗；RaptivaTM；依法利珠单抗；ErbituxTM；西妥昔单抗；AvastinTM；贝伐单抗；TysabriTM；那他珠单抗；ActemraTM；托珠单抗；VectibixTM；帕尼单抗；LucentisTM；雷珠单抗；SolirisTM；依库珠单抗；CimziaTM；赛妥珠单抗；SimponiTM；戈利木单抗；IlarisTM；卡那单抗；StelaraTM；优特克单抗；ArzerraTM；奥法木单抗；ProliaTM；地诺单抗；NumaxTM；莫维珠单抗；ABThraxTM；瑞西巴库单抗；BenlystaTM；贝利木单抗；YervoyTM；伊匹单抗；AdcetrisTM；本妥昔单抗；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗；KadcylaTM；阿多-曲妥珠单抗；GazyvaTM和奥必珠单抗。在替代方案中(例如用于治疗或预防人类的癌症)，每个多肽或单体包含一个或多个选自以下的抗体的VH、VL或VH/VL结合位点：伊匹单抗(或YERVOYTM)、曲利木单抗(tremelimumab)、纳武单抗(或OPDIVOTM)、派姆单抗(或KEYTRUDATM)、匹立珠单抗(pidilizumab)、BMS-936559、杜伐鲁单抗和阿特珠单抗(atezolizumab)。
在一个实例中，四聚体包含选自伊匹单抗(或YERVOYTM)、曲利木单抗、纳武单抗(或OPDIVOTM)、派姆单抗(或KEYTRUDATM)、匹立珠单抗、BMS-936559、杜伐鲁单抗和阿特珠单抗组成的组的第一抗体的抗原结合位点的4个拷贝；和任选的选自所述组的第二抗体的抗原结合位点的4个拷贝，其中第一和第二抗体是不同的。举例来说，第一抗体是伊匹单抗(或YERVOYTM)，并且任选地，第二抗体是纳武单抗(或OPDIVOTM)或派姆单抗(或KEYTRUDATM)。这可用于治疗或预防人类的癌症。
在一个实例中，四聚体包含阿瓦斯汀的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含修美乐(Humira)的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含爱必妥的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含ActemraTM的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含萨瑞鲁单抗的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含杜匹鲁单抗的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含阿里罗单抗或依伏库单抗的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含的抗原结合位点的4个拷贝，在一个实例中，四聚体包含类克的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含乐舒晴的抗原结合位点的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含EyleaTM的抗原结合位点的4个拷贝。这类四聚体可用于投予到人类以治疗或预防癌症。这类四聚体可用于投予到人类以治疗或预防眼部病况(例如湿性AMD或糖尿病性视网膜病变，例如当结合位点是阿瓦斯汀、乐舒晴或艾力雅(Eylea)位点时如此)。这类四聚体可用于投予到人类以治疗或预防血管生成。
在一个实例中，四聚体包含胰岛素的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含GLP-1的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含GIP的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含肠促胰岛素类似物-4的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含胰岛素的4个拷贝和GLP-1的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含胰岛素的4个拷贝和GIP的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含胰岛素的4个拷贝和肠促胰岛素类似物-4的4个拷贝。在一个实例中，四聚体包含GLP-1的4个拷贝和肠促胰岛素类似物-4的4个拷贝。这类四聚体可用于投予到人类以治疗或预防糖尿病(例如II型糖尿病)或肥胖症。
疾病和病况
本发明的单体或多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体或八聚体)可用于用于投与到人类或动物个体以治疗或预防个体的疾病或病况的方法中。
任选地，疾病或病况选自
(a)神经退行性疾病或病况；
(b)脑部疾病或病况；
(c)CNS疾病或病况；
(d)记忆力丧失或损伤；
(e)心脏或心血管疾病或病况，例如心脏病发作、中风或心房颤动；
(f)肝脏疾病或病况；
(g)肾脏疾病或病况，例如慢性肾脏疾病(CKD)；
(h)胰腺疾病或病况；
(i)肺脏疾病或病况，例如囊肿性纤维化或COPD；
(j)胃肠道疾病或病况；
(k)咽喉或口腔疾病或病况；
(1)眼部疾病或病况；
(m)生殖器疾病或病况，例如阴道、阴唇、阴茎或阴囊疾病或病况；
(n)性传播疾病或病况，例如淋病、HIV感染、梅毒或衣原体感染；
(o)耳部疾病或病况；
(p)皮肤疾病或病况；
(q)心脏疾病或病况；
(r)鼻部疾病或病况
(s)血液疾病或病况，例如贫血，例如慢性疾病或癌症的贫血；
(t)病毒感染；
(u)病原性细菌感染；
(v)癌症；
(w)自身免疫疾病或病况，例如SLE；
(x)发炎疾病或病况，例如类风湿性关节炎、牛皮癣、湿疹、哮喘、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)或IBD；
(y)自闭症；
(z)ADHD；
(aa)躁郁症；
(bb)ALS[肌萎缩性侧索硬化]；
(cc)骨关节炎；
(dd)先天性或发育缺陷或病况；
(ee)流产；
(ff)凝血病况；
(gg)支气管炎；
(hh)干性或湿性AMD；
(ii)新血管形成(例如肿瘤的新血管形成或眼睛中的新血管形成)；
(jj)感冒；
(kk)癫痫症；
(11)纤维化，例如肝脏或肺脏纤维化；
(mm)真菌疾病或病况，例如鹅口疮；
(nn)代谢疾病或病况，例如肥胖症、厌食症、糖尿病、I型或II型糖尿病。
(oo)一种或多种溃疡，例如胃溃疡或皮肤溃疡；
(pp)皮肤干燥；
(qq)休格连氏综合征(Sjogren's syndrome)；
(rr)细胞因子风暴；
(ss)失聪、听力丧失或损伤；
(tt)缓慢或快速代谢(即对于个体的体重、性别和年龄，比平均代谢慢或快)；
(uu)怀孕病症，例如不育症或低生育力；
(vv)黄疸；
(ww)皮疹；
(xx)川崎氏病(Kawasaki Disease)；
(yy)莱姆病(Lyme Disease)；
(zz)过敏，例如胡桃、草、花粉、尘螨、猫或狗毛皮或皮屑过敏；
(aaa)疟疾、伤寒、结核或霍乱；
(bbb)抑郁；
(ccc)智力迟钝；
(ddd)小头畸形；
(eee)营养不良；
(fff)结膜炎；
(ggg)肺炎；
(hhh)肺栓塞；
(iii)肺高血压；
(jjj)骨骼病症；
(kkk)败血症或败血性休克；
(111)窦炎；
(mmm)压力(例如职业压力)；
(nnn)地中海贫血、贫血、范威勒布朗氏病(von Willebrand Disease)或血友病；
(ooo)带状疱疹或唇疱疹；
(ppp)月经；
(qqq)低精子计数。
待治疗或预防的神经退行性或CNS疾病或病况
在一个实例中，神经退行性或CNS疾病或病况选自以下组成的组：阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、老年期精神病、唐氏综合症(Down syndrome)、帕金森病(Parkinson's disease)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-jakob disease)、糖尿病性神经病变、帕金森综合征(Parkinson syndrome)、亨廷顿氏病(Huntington'sdisease)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、肌萎缩性侧索硬化、糖尿病性神经病变和克罗伊茨费尔特克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt Creutzfeldt-Jakobdisease)。举例来说，所述疾病是阿尔茨海默病。举例来说，所述疾病是帕金森综合征。
在一个实例中，其中本发明的方法实施到人类或动物个体上以用于治疗CNS或神经退行性疾病或病况，所述方法引起个体中的Treg细胞的下调，由此促进跨脉络丛的全身性单核细胞衍生的巨噬细胞和/或Treg细胞进入个体脑部中，从而所述疾病或病况(例如阿尔茨海默病)得到治疗、预防，或其进展得到减少。在一个实施例中，所述方法引起个体的CNS系统中的(例如脑部和/或CSF中的)IFN-γ的增加。在一个实例中，所述方法恢复神经纤维和//或减少神经纤维损坏的进展。在一个实例中，所述方法恢复神经髓鞘和//或减少神经髓鞘损坏的进展。在一个实例中，本发明的方法治疗或预防WO20 15 136541中所公开的疾病或病况，和/或所述方法可以与WO2015 136541(本文件的公开内容以全文引用的方式并入本文中，例如用于提供这类方法、疾病、病况和潜能治疗剂的公开内容，所述潜能治疗剂可以向个体投予以用于实行CNS和神经退行性疾病和病况的治疗和/或预防，例如如免疫检查点抑制剂的药剂，例如抗PD-1、抗PD-Ll、抗TIM3或其中所公开的其它抗体)中所公开的任何方法一起使用。
待治疗或预防的癌症
可以经治疗的癌症包括未血管化或未实质上血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可以包含非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包含实体肿瘤。待用本发明治疗的癌症的类型包括但不限于癌瘤、母细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤，和恶性肿瘤例如肉瘤、癌瘤和黑色素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症。
缺血性癌症是血液或骨髓癌症。血液(或血原)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红细胞白血病)、慢性白血病(如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、骨髓发育不良综合症、毛状细胞白血病和骨髓异常增生。
实体肿瘤是异常大量的通常不含有胞囊或液体区域的组织。实体肿瘤可以是良性或恶性的。针对形成其的细胞的类型命名不同类型的实体肿瘤(如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体肿瘤如肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumour)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳房癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、髓质甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌瘤、乳头状癌、乳头状腺癌、髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒膜癌、威耳姆氏肿瘤(Wilms'tumour)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合型神经胶质瘤)、神经胶母细胞瘤(又称为多形性胶质母细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、胚细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
待治疗或预防的自身免疫疾病
·急性播散性脑脊髓炎(ADEM)
·急性坏死出血性白质脑炎
·阿狄森病(Addison's disease)
·无丙种球蛋白血症
·斑秃
·淀粉样变性病
·强直性脊柱炎
·抗GBM/抗TBM肾炎
·抗磷脂综合征(APS)
·自身免疫性血管性水肿
·自身免疫性再生障碍性贫血
·自身免疫性自主神经失调
·自身免疫性肝炎
·自身免疫性高脂质血症
·自身免疫性免疫缺陷
·自身免疫性内耳病(AIED)
·自身免疫性心肌炎
·自身免疫性卵巢炎
·自身免疫性胰腺炎
·自身免疫性视网膜病
·自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)
·自身免疫性甲状腺疾病
·自身免疫性荨麻疹
·轴突和神经元神经病变
·巴洛病(Balo disease)
·白塞病(Behcet's disease)
·大疱性类天疱疮
·心肌病
·卡斯尔曼病(Castleman disease)
·乳糜泻
·查加斯病(Chagas disease)
·慢性疲劳综合症
·慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病变(CIDP)
·慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)
·丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)
·瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮
·克罗恩病
·柯根氏综合症(Cogans syndrome)
·冷凝集素病
·先天性心脏阻滞
·柯沙奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)
·CREST疾病
·原发性混合型冷球蛋白血症
·脱髓鞘神经病变
·疱疹样皮炎
·皮肌炎
·德维克氏疾病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)
·盘状狼疮
·卓斯勒氏综合征(Dressier's syndrome)
·子宫内膜异位症
·嗜酸性粒细胞食道炎
·嗜酸性粒细胞筋膜炎
·结节性红斑
·实验性变应性脑脊髓炎
·伊凡氏综合征(Evans syndrome)
·肌肉纤维疼痛
·纤维性肺泡炎
·巨细胞动脉炎(颞动脉炎)
·巨细胞心肌炎
·丝球体肾炎
·古德帕斯丘综合征(Goodpasture's syndrome)
·肉芽肿性多血管炎(GPA)(以前称为韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sGranulomatosis))
·格雷夫斯氏病(Graves'disease)
·吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)
·桥本氏脑炎(Hashimoto's encephalitis)
·桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)
·溶血性贫血
·亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)
·妊娠疱疹
·低丙种球蛋白血症
·特发性血小板减少性紫癜(ITP)
·IgA肾病
·IgG4相关硬化性疾病
·免疫调节脂蛋白
·包涵体肌炎
·间质性膀胱炎
·幼年型关节炎
·幼年型糖尿病(1型糖尿病)
·幼年型肌炎
·川崎氏综合征(Kawasaki syndrome)
·兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)
·白细胞破碎性血管炎
·扁平苔癣
·硬化性苔癣
·木样结膜炎
·线性IgA疾病(LAD)
·狼疮(SLE)
·莱姆病，慢性
·梅尼尔氏病(Meniere's disease)
·显微镜下多血管炎
·混合型结缔组织疾病(MCTD)
·莫伦氏溃疡(Mooren's ulcer)
·穆哈-哈伯曼疾病(Mucha-Habermann disease)
·多发性硬化症
·重症肌无力
·肌炎
·发作性睡病
·视神经脊髓炎(德维克氏)
·嗜中性白细胞减少症
·眼部瘢痕性类天疱疮
·视神经炎
·复发性风湿病
·PANDAS(链球菌相关小儿自身免疫性神经精神病症)
·副肿瘤性小脑变性
·阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)
·帕-罗二氏综合征(Parry Romberg syndrome)
·帕-特二氏综合征(Parsonnage-Tumer syndrome)
·睫状体扁平部炎(周边性葡萄膜炎)
·天疱疮
·周边神经病变
·静脉周脑脊髓炎
·恶性贫血
·POEMS综合征
·结节性多动脉炎
·I、II和III型自身免疫性多内分泌腺综合征
·风湿性多肌痛
·多发性肌炎
·心肌梗塞后综合征
·心包切开术后综合征
·孕酮性皮炎
·原发性胆汁性肝硬化
·原发性硬化性胆管炎
·牛皮癣
·牛皮癣性关节炎
·特发性肺纤维化
·坏疽性脓皮病
·纯红细胞发育不全
·雷诺现象(Raynauds phenomenon)
·反应性关节炎
·反射性交感神经失养症
·莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)
·复发性多软骨炎
·不安腿综合征
·腹膜后纤维化
·风湿热
·类风湿性关节炎
·结节病
·施密特综合征(Schmidt syndrome)
·巩膜炎
·硬皮病
·休格连氏综合征
·精子和睾丸自身免疫
·僵人综合征
·亚急性细菌性心内膜炎(SBE)
·苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)
·交感性眼炎
·高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)
·颞动脉炎/巨细胞动脉炎
·血小板减少性紫癜(TTP)
·托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)
·横贯性脊髓炎
·I型糖尿病
·溃疡性结肠炎
·未分化型结缔组织疾病(UCTD)
·葡萄膜炎
·血管炎
·大疱性皮肤病
·白斑病
·韦格纳氏肉芽肿病(现在称为肉芽肿性多血管炎(GPA)。
待治疗或预防的发炎疾病
·阿尔茨海默
·强直性脊柱炎
·关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣性关节炎)
·哮喘
·动脉粥样硬化
·克罗恩病
·结肠炎
·皮炎
·憩室炎
·肌肉纤维疼痛
·肝炎
·肠易激综合征(IBS)
·全身性红斑狼疮(SLE)
·肾炎
·帕金森病
·溃疡性结肠炎。
多价可溶性TCR
本发明的构型涉及多价可溶性TCR蛋白质。在一个方面中，本发明涉及四价和八价可溶性TCR类似物。本发明的TCR蛋白质能够由单体自组装并且全部具有人类来源。蛋白质是包含ETO NHR2多聚化域的多聚体。本发明还涉及构建多聚可溶性TCR的方法和使用这类蛋白质的方法。
与抗体格式过多相比，采用替代性可溶性TCR格式作为治疗性分子的尝试已经远远滞后。这很大程度上是由于TCR，一旦细胞外TCRα/β链从其跨膜域和细胞质域中分离，异源二聚跨膜蛋白就具有内部溶解度问题。其次，这些分子对于其靶位点处的同源配体的内部低亲和力和亲合力很大程度上妨碍其发展作为治疗性分子。
为了克服这些缺点，本发明的本发明构型提供具有多价性和可溶性的TCR蛋白质。多价性增加TCR对于同源pMHC的亲合力，并且溶解度允许待使用的TCR超出跨膜环境。因此，在第一方面中，提供能够结合pMHC复合物的多价异源二聚可溶性T细胞受体，其包含：
(i)TCR胞外域；
(ii)(ii)免疫球蛋白恒定域；和
(iii)(iii)ETO的NHR2多聚化域。
Ig恒定域的使用提供具有稳定性和溶解度的TCR胞外域；经由NHR2域进行的多聚化提供多价性和增加的亲合力。有利地，所有结构域具有人类来源或符合人类蛋白质序列。
使用Ig恒定域以稳定化TCR并且赋予TCR可溶性避免使用非天然二硫键。因此，有利地，本发明的TCR不包含非天然二硫键。
在一个实施例中，所述复合物包含重链和轻链，并且每个轻链包含TCR Vα域和免疫球蛋白Cα域，并且每个重链包含TCRνβ域和免疫球蛋白CH1域。
在一个实施例中，每个轻链另外包含TCR Cα域，并且每个重链另外包含TCRνβ域。
在实施例中，TCR和免疫球蛋白域可以通过柔性连接子分离。
将NHR2多聚化域有利地连接至免疫球蛋白域的C端。因此，每个具有重链和轻链的二聚体应连接至一个多聚化域以使得重链-轻链二聚体缔合成多价低聚物。
在实施例中，多聚化域和免疫球蛋白域通过柔性连接子分离。在某些实施例中，这允许多聚化域多聚化并且不受一种或多种免疫球蛋白域妨碍。
在实施例中，TCR蛋白质可以进一步包含免疫球蛋白铰链域。铰链域允许二聚化重链-轻链二聚体；这允许进一步多聚化TCR蛋白质。举例来说，形成四聚体的多聚化域可以使用免疫球蛋白铰链域将多聚体最高形成为八聚体。同样，二聚化多聚化域可以在存在铰链域的情况下形成四聚体。
在实施例中，本发明的TCR蛋白质是四价的。
在实施例中，本发明的TCR蛋白质是八价的。
本发明提供可溶性TCR，其中使用在人类的ETO家族蛋白质中找到的神经同源区2(NHR2)域将其稳定地组装成四价异源二聚格式(Liu等人，2006)。天然地找到NHR2域以形成同源四聚体，其由使两个NHR2同源二聚体配对而形成。可操作地连接到细胞外TCRα或TCRβ链的NHR2应优先形成四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子，所述分子依序由单体随后由同源二聚体自组装(图1)。
组装成八聚体的TCR蛋白质可以使用NHR2域通过采用免疫球蛋白铰链域来产生。
在另一个方面中，本发明的TCR蛋白质可以偶合到具有生物活性的多肽/效应分子。这类多肽的实例可以包括具有免疫活性的部分如细胞因子、结合蛋白如抗体或目标多肽等等。
本发明另外涉及用于制备四价和八价异源二聚可溶性TCR、编码用于转染所关注的宿主细胞的蛋白质的DNA载体的方法和这些新颖高度敏感性多价可溶性TCR蛋白质分子的用途。供用应用可以包括但不限于治疗、诊断和药物研发。
在另一个方面中，本发明提供用于在不采用非人类构建体组分的情况下以有效方式构建多价免疫球蛋白分子的方法。
因此，提供多聚免疫球蛋白，其包含
(i)免疫球蛋白可变域；和
(ii)ETO的NHR2多聚化域。
免疫球蛋白可变域优选是抗体可变域。这类结构域与ETO NHR2多聚化域融合，这提供用于形成免疫球蛋白可变域的四聚体的方式。
在免疫球蛋白多聚体生产中，ETO NHR2域比p53和类似多聚化域更高效，并且在不使用构建体中的非人类组分的情况下准许多聚免疫球蛋白分子生产。
还提供用于产生多聚免疫球蛋白的方法，其包含表达与ETO的NHR2域融合的免疫球蛋白可变域，和允许可变域组装成多聚体。
优选地，将免疫球蛋白可变域连接到一种或多种免疫球蛋白恒定域。
有利地，免疫球蛋白域是抗体域。举例来说，可变域可以是VH和VL抗体域。举例来说，恒定域是抗体CH1域。
在一个实施例中，产生本发明的多聚免疫球蛋白分子即TCR和非TCR免疫球蛋白以用于通过噬菌体呈现或另一种呈现技术进行筛检。因此，举例来说，产生多价免疫球蛋白作为与噬菌体鞘蛋白的融合体。对于与鞘蛋白融合的所生成的每个免疫球蛋白，在无鞘蛋白的情况下产生其它免疫球蛋白分子以使得其由于NHR2多聚化而可以在噬菌体表面上进行组装。
如上文所详述的本发明的本发明构型涉及核酸序列和用于产生新颖多价(例如四价和八价)可溶性蛋白质的方法。在一个方面中，特定来说，可溶性蛋白质是组装成可以结合四个具有高敏感性、亲和力和特异性的pMHC的四价异源二聚格式的TCR。可溶性四价异源二聚TCR是由全部或部分细胞外TCRα/β链构成的独特蛋白质分子。将细胞外TCRα/β链连接到免疫球蛋白CH1和CL(Cκ或Cλ)域。这个连接允许稳定地形成异源二聚TCRα/β。在可溶性四价TCR的情形下，独特特点是ETO蛋白质家族的NHR2同源四聚体域，其可操作地连接到CH1的C端或CL的C端。以此方式进行的NHR2域与异源二聚α/βTCR的连接允许其在细胞内部自组装成四价格式并且随后分泌到上清液中作为可溶性蛋白质。
TCR胞外域
TCR胞外域由可变区和恒定区构成。这些结构域以与其存在于抗体和其它免疫球蛋白域中的方式相同的方式存在于T细胞受体中。TCR受体库具有由用于抗体重链和轻链基因中的相同基因重排机制产生的广泛多样性(Tonegawa,S.(1988)《生物科学报告(Biosci.Rep.)》8:3-26)。大部分多样性是在编码α和β链的互补决定区3(CDR3)的可变(V)和接合(J)(或多样性，D)区的接合点处产生的(Davis和Bjorkman(1988)《自然(Nature)》334:395-402)。TCR基因的数据库是可用的，如IMGT LIGM资料库，并且用于克隆TCR的方法是所属领域中已知的-例如参见Bentley和Mariuzza(1996)《免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)》14:563-590；Moysey等人,《分析生物化学(Anal Biochem.)》2004年3月15日；326(2):284-6；Walchli等人(2011)《T细胞受体克隆和表达的实用方法(APractical Approach to T-Cell Receptor Cloning and Expression)》.《公共科学图书馆：综合(PLoS ONE)》6(1 1):e27930。
免疫球蛋白可变域
抗体可变域是所属领域中已知的并且可从广泛多种的来源获得。存在抗体可变域的序列的数据库，如IMGT和Kabat，并且可变域可以通过克隆和表达天然序列或根据现有技术合成人造核酸来产生。
用于构建噬菌体抗体呈现文库和λ噬菌体表达文库的方法在所属领域中是众所周知的(McCafferty等人(1990)《自然》,348:552；Kang etal.(1991)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》,88:4363；Clackson等人(1991)《自然》,352:624；Lowman等人(1991)《生物化学(Biochemistry)》,30:10832；Burton等人(1991)《美国国家科学院院刊》,88:10134；Hoogenboom等人(1991)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,19:4133；Chang等人(1991)《免疫学杂志》,147:3610；Breitling等人(1991)《基因(Gene)》,104:147；Marks等人(1991)同上；Barbas等人(1992)同上；Hawkins和Winter(1992)《免疫学杂志》,22:867；Marks等人,1992,《生物化学杂志》,267:16007；Lerner等人(1992)《科学》,258:13 13，以引入的方式并入本文中)。
一种特别有利的方法已经使用scFv噬菌体文库(Huston等人,1988,《美国国家科学院院刊》,85:5879-5883；Chaudhary等人(1990)《美国国家科学院院刊》,87:1066-1070；McCafferty等人(1990)同上；Clackson等人(1991)《自然》,352:624；Marks等人(1991)《分子生物学杂志》,222:581；Chiswell等人(1992)《生物技术趋势(Trends Biotech.)》,10:80；Marks等人(1992)《生物化学杂志》,267)。已经描述呈现于噬菌体外壳蛋白质上的scFv文库的各种实施例。噬菌体呈现方法的优化也是已知的，例如如W096/062 13和W092/01047(医学研究委员会(Medical Research Council)等人)和W097/08320(Morphosys)中所描述，所述文献以引入的方式并入本文中。
这类技术可以适于通过融合NHR2多聚化域与抗体可变域来产生多聚免疫球蛋白。
免疫球蛋白恒定域
如本文中所提到的免疫球蛋白恒定域优选是抗体恒定域。恒定域在抗体亚型之间的序列方面不同；优选地，恒定域是IgG恒定域。优选地，恒定域是CH1恒定域。抗体恒定域在所属领域中是众所周知的并且可从多种来源和数据库包括IMGT和Kabat数据库获得。
例如构建工程化Fab抗体片段中的抗体恒定域与免疫球蛋白可变域的融合也是所属领域中已知的。
连接子
柔性连接子可用于连接TCR可变域-Ig恒定域与NHR2多聚化域。这允许TCR域和多聚化域在无来自彼此或多聚复合物中的其它分子的位阻的情况下起作用。合适的连接子包含例如甘氨酸重复、甘氨酸-丙氨酸重复、Gly(4)Ser连接子或柔性多肽连接子，如ReddyChichili等人,2012《蛋白质科学(Protein Science)》22:153-167中所阐述。
免疫球蛋白铰链域
Ig铰链域(在本文中优选为抗体铰链域)是连接天然抗体中的抗体恒定区的结构域。因此，这个结构域提供包括抗体恒定域的分子的天然二聚化。其存在于例如F(ab)2抗体片段以及全抗体如IgG中。这个区包含两个将两个CH1恒定域连接在一起的天然链间二硫键。
在一个实施例中，多聚化域可以连接到Ig恒定域或连接到铰链域。如果存在铰链域，则多聚化域将形成TRC八聚体，包含四个在铰链区接合的TCR可变域-Ig恒定域的二聚体。在无铰链区的情况下，多聚化域将引起四聚体的形成。优选地，将多聚化域连接到恒定域或铰链区的C末端。
具有生物活性的分子
一种或多种具有生物活性的分子或效应分子(EM)可以连接到本发明的多聚体，例如多聚TCR蛋白质。这类分子可以是例如抗体，尤其可以辅助TCR的免疫辨识和运行的抗体，如抗CD3抗体或抗体片段。
在一些方面中，具有生物活性的分子可以是细胞毒性药物、毒素或如细胞因子的具有生物活性的分子，如下文所更详细地描述。具有生物活性的分子的实例包括趋化因子如MIP-lb、细胞因子如IL-2、生长因子如GM-CSF或G-CSF、毒素如蓖麻毒素、细胞毒性剂如小红莓或紫杉烷、包括放射性和荧光标记物的标记物等等。对于可缀合到TCR的具有生物活性的分子的实例，参见US20110071919。
在其它方面中，具有生物活性的分子例如选自以下组成的组：能够结合到延长体内多肽配体的半衰期的分子和延长体内多肽配体的半衰期的分子的基团。这种分子可以例如是HSA或细胞基质蛋白，并且能够结合到延长体内TCR分子的半衰期的分子的基团是对HSA或细胞基质蛋白具有特异性的抗体或抗体片段。
在一个实施例中，具有生物活性的分子是结合分子，例如抗体片段。2、3、4、5或更多个抗体片段可以使用合适的连接子接合在一起。这些抗体片段中的任何两个或更多个的特异性可以是相同的或不同的；如果其是相同的，则将形成多价结合结构，其具有相较于单价抗体片段而言的用于靶标的经增加亲合力。
此外，具有生物活性的分子可以是效应基团，例如抗体Fc区。
可以在将TCR分子或工程化多肽组装成多聚体之前或之后进行与N或C端的连接。因此，可以在适当位置具备具有生物活性的分子的N或C端的情况下(合成地，或通过表达核酸)产生具有Ig恒定域的TCR融合物。然而，在某些方面中，在已经产生TCR融合物之后，进行向N或C端的添加。举例来说，芴基甲氧羰基氯可用于在TCR融合物的N端引入Fmoc保护基。Fmoc结合到包括具有高亲和力的HSA的血清白蛋白，并且Fmoc-Trp或FMOC-Lys在经增加亲和力的情况下结合。可以合成肽并且在其上保留有Fmoc保护基，且随后通过半胱氨酸将所述肽与支架偶合。替代物是也结合HSA并且例如用于利拉鲁肽(Liraglutide)中以延长这个GLP-1类似物的半衰期的棕榈酰基部分。
或者，可以在N端处例如用胺-和巯基-反应性连接子N-e-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)改性TCR融合物。TCR可以经由这个连接子连接到其它多肽，例如抗体Fc片段。
NHR2域
AMLl/ETO是由于M2亚型的急性骨髓白血病(AML)中找到的t(8；21)产生的融合蛋白。AMLl/ETO含有与大部分(575aa)ETO框内融合的RUNXl的N端177个氨基酸。ETO的神经同源性域2负责与AMLl/ETO相关联的多种生物活性，包括低聚反应和蛋白质-蛋白质相互作用。这个结构域详细地表征于Liu等人(2006)中。参见基因库寄存编号NG_023272.2。
在本发明的一个方面中，组装成可溶性多价格式的蛋白质是由部分或全部TCRα和β链的胞外域构成的TCR。TCRα和β链通过免疫球蛋白CH1和CL域稳定并且可以布置于以下构型中：
1.Vα-CL和VβCHl
2.Vα-CH1和Vβ-CL
3.VαCα-CL和VβCβ-CH1
4.VαCαCHl和VβCβCL
在本发明的一个方面中，细胞外TCR域经由任选的肽连接子(L)连接到免疫球蛋白CH1和CL域以提高蛋白质柔性并且促进理想的蛋白质折叠。
1.Vα-(L)-CL和Vβ-(L)-CH1
2.Vα-(L)-CH1和Vβ-(L)-CL
3.VαCα-(L)-CL和VβCβ-(L)-CH1
4.VαCα-(L)-CHl和VβCβ-(L)-CL
在本发明的另一个方面中，将四聚域(TD)如NHR2同源四聚体域连接到与细胞外TCRα和β链连接的免疫球蛋白CH1或CL域的C端。NHR2域可以经由肽连接子任选地连接到CH1或CL域。所得四价异源二聚TCR蛋白质可以布置于以下构型中，其中(L)是任选的肽连接子：
1.Vα-(L)-CL和Vβ-(L)-CH1-(L)-TD
2.Vα-(L)-CH1-(L)-TD和Vβ-(L)-CL
3.VαCα-(L)-CL和VβCβ-(L)-CH1-(L)-TD
4.VαCα-(L)-CH1-(L)-TD和VβCβ-(L)-CL
5.Vα-(L)-CL-(L)-TD和Vβ-(L)-CH1
6.Vα-(L)-CH1和Vβ-(L)-CL-(L)-TD
7.VαCα-(L)-CL-(L)-TD和VβCβ-(L)-CH1
8.VαCα-(L)-CHl和VβCβ-(L)-CL-(L)-TD
可溶性TCR对于其同源pMHC的敏感性可以通过增加亲合力作用来增强。这通过增加抗原结合位点的数量来实现，通过四聚域来促进。反过来，这也增加相较于单价可溶性TCR而言的蛋白质分子的分子量并且因此延长循环中的血清滞溜。增长血清半衰期也增强这些分子与其同源靶抗原相互作用的可能性。
四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子能够同时结合到一个、两个、三个或四个呈现于单细胞上的pMHC，或同时结合到一个、两个、三个或四个不同的呈现其同源pMHC的细胞。
用于本发明中的TCRα和β链序列可以来自对特别pMHC具有特异性或通过使用所属领域中已知的技术如噬菌体呈现进行的筛检从头识别的已知TCR。此外，在本发明中，TCR序列不限于α和β链但也可以合并TCR8和γ或ε链和其从人类T细胞直接克隆或通过使用重组DNA技术进行的定向演化识别的序列变异体。
在本发明的另一个方面中，在哺乳动物细胞中优先产生四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子以用于理想地产生可溶性、稳定和恰当折叠的蛋白质分子。
本发明的多聚体(例如四聚体或八聚体)或多价TCR可以在细胞如哺乳动物细胞中使用任何合适的载体系统来表达。pTT5表达载体是用于表达多价可溶性TCR的表达系统的一个实例。pTT5表达系统允许在悬浮液适应的HEK293EBNA细胞中高水平瞬时产生重组蛋白(Zhang等人2009)。其含有通过病毒蛋白质EB核抗原1(Epstein-Barr Nuclear Antigen 1，EBNA-1)辨识的复制起点(oriP)，其与宿主细胞复制因子一起调节DNA质粒的游离型复制，允许增强重组蛋白的表达。所属领域中已知和市售的用于哺乳动物细胞表达的其它合适的载体系统可以与本发明一起使用。
四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子或其它多聚体可以通过由表达载体瞬时表达基因来产生。
在另一个实施例中，四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子或其它多聚体可以由工程化稳定细胞系产生。可以使用所属领域中已知的基因组工程化技术使细胞系工程化以产生蛋白质分子，其中一种或多种编码蛋白质分子的基因整合到宿主细胞的基因组中作为单个拷贝或多个拷贝。DNA整合的位点可以是宿主基因组内的经界定位置或任意地整合以得到所需蛋白质分子的最大表达。基因组工程化技术可以包括但不限于同源重组、转座子介导的基因转移如PiggyBac转座子系统、包括重组酶介导的盒交换的位点特异性重组酶、核酸内切酶介导的基因标靶如CRISPR/Cas9、TALENs、锌指核酸酶、大范围核酸酶和病毒介导的基因转移如慢病毒。
此外，在本发明的另一个方面中，四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子或其它多聚体是通过作为包涵体的大肠杆菌(E.coli)的细胞质中的过度表达产生的，并且在通过亲和力色谱法进行纯化之后在体外再折叠以产生能够恰当地结合到其同源pMHC或抗原的功能蛋白分子。
在本发明的另一个方面中，四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子或其它多聚体的表达不限于哺乳动物或细菌细胞但也可以在昆虫细胞、植物细胞和低级真核细胞如酵母细胞中表达和产生。
在本发明的另一个方面中，产生异源二聚可溶性TCR分子或其它多聚体作为例如具有最多八个用于其同源pMHC的结合位点的八价蛋白质复合物(图2)。多个抗原结合位点允许这个分子结合最多八个呈现于一个细胞上的pMHC或结合呈现于最多八个不同细胞上的pMHC，因此产生高度敏感性可溶性TCR。
通过融合免疫球蛋白铰链域与自身连接到TCRα或β链的CH1或CL域的C端来将所述分子的异源二聚可溶性TCR部分制成二价分子。铰链域允许给予类似于IgG的结构的两个重链的连接。经由任选的肽连接子将四聚域如NHR2连接到铰链域的C端。通过将免疫球蛋白铰链分别接合到Ig CH1或CL域和NHR2域的C端和N端，这允许组装称为单体2的两个NHR2单体。在这个构型中，我们预测除非在铰链与NHR2域之间设置长柔性连接子，否则两个NHR2域将由于结构性限制而最不可能通过反平行缔合来形成同源二聚体。经由免疫球蛋白CH1或CL域进行的四聚和铰链域与异源二聚可溶性TCR的连接允许通过NHR2同源四聚体2形成的八价可溶性TCR的逐步自组装。八价可溶性TCR的自组装是经由NHR2单体2和同源二聚体2中间蛋白质复合物进行的(图2)。所得八价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子将具有用于其同源pMHC的优良敏感性，因此给予其独特的识别未知抗原或pMHC并且不必须以大大超过天然所见的亲和力使TCR亲和力成熟以用于其pMHC配体的优势。特定来说，其适用于识别通过未表征的肿瘤特异性T细胞和涉及其它疾病如自身免疫疾病的T细胞辨识的pMHC。可以产生多种不同构型的八价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子。下文显示一些实例。
1.Vα-(L)-CL和Vβ-(L)-CHl-铰链-(L)-TD
2.Vα-(L)-CH1-铰链-(L)-TD和Vβ-(L)-CL
3.Vα-Cα-(L)-CL和Vβ-Cβ-(L)-CH1-铰链-(L)-TD
4.VαCα(L)-CHl-铰链-(L)-TD和VβCβ-(L)-CL
5.Vα-(L)-CL-(L)-TD和Vβ-(L)-CH1-铰链
6.Vα-(L)-CH1-铰链和Vβ-(L)-CL-(L)-TD
7.Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD和Vβ-Cβ(L)-CH1-铰链
8.Vα-Cα-(L)-CH1-铰链和Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD
在本发明的另一个方面中，将自组装的多价蛋白质(优先为四价和八价异源二聚可溶性TCR)融合或缀合到生物活性剂/效应分子，因此允许引导这些分子到所需细胞群体如癌症细胞并且特异地发挥其治疗效果。充分建立单克隆抗体引导效应分子如细胞毒性药物、毒素或具有生物活性的分子如细胞因子的肿瘤标靶能力(Perez等人2014；Young等人2014)。概述于本发明中的多价可溶性TCR分子也可以以类似方式与效应蛋白和多肽融合或缀合到细胞毒性剂。适用作具有概述于本发明中的多价蛋白质复合物的融合蛋白的效应蛋白质分子的实例包括不限于IFNa、IPNP、IFNy、IL-2、IL-1 1、IL-13、粒细胞集落刺激因子[G-CSF]、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[GM-CSF]和肿瘤坏死因子[TNF]a、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、CD40L和TRAIL，共刺激配体是B7.1或B7.2、趋化因子DC-CKl、SDF-1、弗拉塔凯(fractalkine)、淋巴细胞趋化因子、IP-10、Mig、MCAF、MlP-la、MIP-1/3、IL-8、NAP-2、PF-4和RANTES或其活性片段。适用作融合蛋白或缀合到本发明中所描述的多价蛋白质复合物的毒性剂的实例包括但不限于毒素如白喉毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、细胞毒性药物如奥瑞他汀(auristatin)、美登素(maytansine)、卡奇霉素(calicheamicin)、蒽环霉素(anthracycline)、倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯并二氮呯。细胞毒性药物可以通过不可或可通过蛋白酶裂解或具有酸不稳定性的选择连接子来缀合。
为消除异源性并改善缀合物稳定性，可以以位点特异性方式缀合细胞毒性药物。这种情况可以通过使特异性半胱氨酸残基工程化或使用通过糖基转移酶和谷氨酰胺转氨酶进行的酶共轭来实现(Panowski等人2014)。
在本发明的另一个方面中，将多价蛋白质复合物共价连接到允许检测的分子，如荧光、放射性或电子转移剂。
在本发明的另一个方面中，经由四聚域如NHR2的C端经由任选的肽连接子将效应分子(EM)与多价蛋白质复合物融合。经由NHR2域进行的融合可以布置成产生呈多种不同构型的多价蛋白质复合物。下文显示可以使用四价异源二聚可溶性TCR产生的蛋白质构型中的一些的实例：
1.Vα-(L)-CL和Vβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
2.Vα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-(L)-CL
3.Vα-Cα-(L)-CL和Vβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
4.Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-Cβ-(L)-CL
5.Vα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-(L)-CH1
6.Vα-(L)-CH1和Vβ-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM
7.Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-Cβ-(L)-CH1
8.Vα-Cα-(L)-CH1和Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM
在本发明的另一个方面中，在免疫球蛋白CH1或CL1域的C端经由任选的肽连接子将效应分子(EM)与多价蛋白质复合物融合。经由免疫球蛋白域进行的EM的融合可以布置成产生呈多种不同构型的多价蛋白质复合物。下文显示可以使用四价异源二聚可溶性TCR产生的蛋白质构型中的一些的实例：
9.Vα-(L)-CL-(L)-EM和Vβ-(L)-CH1-(L)-TD
10.Vα-(L)-CH1-(L)-TD和Vβ-(L)-CL-(L)-EM
11.Vα-Cα-(L)-CL-(L)-EM和Vαβ-Cβ-(L)-CHl-(L)-TD
12.Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-TD和Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-EM
13.Vα-(L)-CL-(L)-TD和Vβ-(L)-CH1-(L)-EM
14.Vα-(L)-CH1-(L)-EM和Vβ-(L)-CL-(L)-TD
15.Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD和Vβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-EM
16.Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-EM和Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD
在本发明的另一个方面中，在免疫球蛋白CH1或CL1域的C端以及四聚域(例如NHR2)的C端经由任选的肽连接子将效应分子(EM)与多价蛋白质复合物融合。这个方法允许每个TCR异源二聚体复合物的待融合的两个效应分子的融合。经由免疫球蛋白域和四聚域进行的EM的融合可以布置成产生呈多种不同构型的多价蛋白质复合物。下文显示可以使用四价异源二聚可溶性TCR产生的蛋白质构型中的一些的实例：
17.Vα-(L)-CL-(L)-EM和Vβ-(L)-CHl-(L)-TD-(L)-EM
18.Vα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-(L)-CL-(L)-EM
19.Vα-Cα-(L)-CL-(L)-EM和VβCβ-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM
20.Vα-Cα-(L)-CH1-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-EM
21.Vα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-(L)-CH1-(L)-EM
22.Vα-(L)-CH1-(L)-EM和Vβ-(L)-CL-(L-)TD-(L)-EM
23.Vα-Cα-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM和Vβ-Cβ-(L)-CH1-(L)-EM
24.Vα-(L)-CH1-(L)-EM和Vβ-Cβ-(L)-CL-(L)-TD-(L)-EM
在本发明的另一个方面中，将多价蛋白质复合物与蛋白标签融合以促进纯化。纯化标签是所属领域中已知的并且其包括、不限于以下标签：His、GST、TEV、MBP、Strep、FLAG。
非TCR多聚体
本发明提供用于组装呈可溶性多价格式的蛋白质并且潜在地结合多个相互作用域或抗原的独特方法。所述蛋白质可以是优先直接或间接参与免疫系统或具有调节免疫反应的潜能的单体、同源二聚体、异源二聚体或低聚物。实例包括但不限于TCR、肽MHC I类和II类、抗体或其抗原结合部分以及具有替代性非抗体蛋白质支架的结合蛋白。
在本发明的另一个方面中，相互作用域或抗原可以是任何细胞表面表达或分泌蛋白、MHC I或II类相关肽或任何病原体相关蛋白质(包括病毒和细菌蛋白质)。
非TCR多聚体可以是抗体或抗体片段的多聚体，如Fab的dAb。本发明的dAb和Fab的实例包括以下：
多价Dab的实例
25.VH-(L)-NHR2
26.VL(λ或κ)-(L)-NHR2
27.VH-(L)-NHR2-(L)-EM
28.VL(λ或κ)-(L)-NHR2-(L)-EM
29.VH-CH1-(L)-NHR2
30.VL(λ或κ)-CL-(L)-NHR2
31.VH-CH1-(L)-NHR2-(L)-EM
32.VL(λ或κ)-CL-(L)-NHR2-(L)-EM
多价Fab的实例
33.VH-CH1-(L)-NHR2和VL(λ或κ)-CL
34.VL(λ或κ)-CL-(L)-NHR2和VH-CH1
35.VH-CH1-铰链-(L)-NHR2和VL(λ或κ)-CL
36.VL(λ或κ)-CL-铰链-(L)-NHR2和VH-CH1
37.VH-CH1-(L)-NHR2-(L)-EM和VL(λ或κ)-CL
38.VL(λ或κ)-CL-(L)-NHR2-(L)-EM和VH-CH1
39.VH-CH1-铰链-(L)-NHR2-(L)-EM和VL(λ或κ)-CL
40.VL(λ或κ)-CL-铰链-(L)-NHR2-(L)-EM和VH-CH1
41.VH-CH1-(L)-NHR2和VL(λ或κ)-CL-(L)-EM
42.VL(λ或κ)-CL-(L)-NHR2和VH-CH1-(L)-EM
43.VH-CH1-铰链-(L)-NHR2和VL(λ或κ)-CL-(L)-EM
44.VL(λ或κ)-CL-铰链-(L)-NHR2和VH-CH1-(L)-EM
在上文实例中，(L)指示任选的肽连接子，而EM指示生物活性剂或效应分子如毒素、药物或细胞因子，并且包括结合分子如抗体、Fab和ScFv。
可变轻链可以是νλ或vK。
在本发明的一个方面中，在一个实例中，经组装四聚化蛋白质分子可以是人类pMHC以用于使用动物药物研发平台(例如小鼠、大鼠、兔子、鸡)进行的药物研发应用。在这种情形下，优先表达四聚域并且其由源自所期望的动物物种的基因产生。这类药物研发应用的一个实例是使用四聚化人类pMHC作为抗原以用于例如大鼠的免疫接种。一旦使大鼠免疫接种有pMHC，就将免疫反应特异地导向人类pMHC并且不导向蛋白质复合物的四聚域。
可以例如使用单域抗体序列产生与NHR2多聚化域融合的多价抗体。
在本发明的一个相关方面中，四价蛋白质可以是用作用于肿瘤抗原的分子成像的探针的肽。这种探针的多价结合将具有优于单价分子探针的独特优势，因为其将具有增强的亲和力、亲合力和体内滞留时间，并且此反过来将增强体内肿瘤标靶。
多聚化域是上文所阐述的NHR2域。优选地，通过使用与多肽融合的Ig恒定域使多肽稳定和/或呈现可溶性以使得融合提供多肽的四聚体。Ig铰链域可用于提供八聚体。
多聚体的用途
本发明的多聚TCR蛋白质适用于其中指示可溶性TCR蛋白质的任何应用。本发明的TCR蛋白质的特别优势包括用于所选靶标的增加的亲合力和/或结合多个靶标的能力。
因此，在一个方面中，本发明的多价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子可用于选择性抑制免疫反应，例如遏制自身免疫反应。这些可溶性蛋白质分子的多价(例如四价)性质给予其精致的敏感性和结合亲和力以竞争T细胞与抗原呈递细胞之间的抗原特异性相互作用。这种中和作用可以在自身免疫疾病如类风湿性关节炎、全身性红斑性狼疮症、牛皮癣、发炎性肠病、格雷夫斯病(graves disease)、血管炎和1型糖尿病中具有治疗益处。
类似地，四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子可用于通过选择性遏制特异性移植抗原和结合到靶分子的自身抗原的T细胞辨识并且因此抑制细胞与细胞相互作用来预防组织移植体排斥反应。
在本发明的另一个方面中，四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子可用于临床研究中，如毒性、传染病研究、神经研究、行为和认知研究、生殖、遗传和异种移植研究。
具有用于同源pMHC的增强敏感性的四价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子可用于使用从人类患者中直接获得的生物样品进行的诊断目的。四价异源二聚可溶性TCR的增强敏感性允许检测天然地发现在低密度下表达的潜在的呈现于MHC上的疾病相关肽。这些分子也可以用于患者分层以用于登记相关临床试验中的患者。
在本发明的另一个方面中，八价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子可用于医药制剂中以用于治疗各种疾病。
在本发明的另一个相关方面中，八价异源二聚可溶性TCR蛋白质分子可用作用于肿瘤分子成像或制备为治疗蛋白的探针。
实例
实例1：四价和八价可溶性异源二聚NY-ESO-1 TCR分子的产生
此实例证实用于产生分别称为ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR的四价和八价可溶性异源二聚TCR分子的方法。这些格式克服与用于靶位点处的同源配体的溶解度和亲合力相关联的问题。
为例证ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR作为稳定和可溶性分子，具有用于NY-ESO-1的高亲和力的TCRαβ可变序列以及免疫球蛋白恒定域和NHR2四聚域用于此实例中。
对用于此实例中的SLLMWITQC-HLA-A*0201具有特异性的高亲和力NY-ESO TCRαβ链(分别由TCR Vα-Cα和νβ-Cβ构成)如WO 2005/1 13595 A2中所报告并且包括信号肽序列(MGWSC1ILFLVATATGVHS)。为辅助蛋白质纯化，将组氨酸标签合并到NHR2域的C端中。
将编码ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR的组分的DNA构建体以合成方式构建为双载体系统以容许其在哺乳动物细胞中的可溶性表达和功能性组装。其DNA序列经合成以用于克隆成表达载体的两个经组装TCR链(α和β链)的示意图显示于图3和4中，并且其氨基酸序列显示于图5和6中。
pTT5载体系统允许在悬浮液适应的HEK293 EBNA细胞中高水平瞬时产生重组蛋白(Zhang等人2009)。其含有通过病毒蛋白质EB核抗原1(EBNA-1)辨识的复制起点(oriP)，其与宿主细胞复制因子一起调节DNA质粒的游离型复制，允许增强重组蛋白的表达。因此，选择pTT5表达载体以用于克隆ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR分子的组分。
在限制位点(RS)(FastDigest，Fermantas)用限制酶消化含有TCRαβ链的合成DNA片段并且在1％琼脂糖凝胶上将DNA分离出。将正确尺寸DNA片段切除并且使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行DNA纯化。也用相同限制酶消化pTT5载体并且由所切除琼脂糖凝胶纯化线性化质粒DNA。将经消化TCRαβ链克隆成经消化pTT5载体以得到四个表达载体(pTT5-ts-NY-ESO-1-TCRα、pTT5-ts-ESO-I-TCRβ、pTT5-os-NY-ESO-1-TCRα和pTT5-os-ESO-l-TCRβ)。
四价和八价可溶性NY-ESO TCR的表达
ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR的功能性表达是在悬浮液适应的HEK293EBNA细胞中进行的。在37℃、5％CO2和95％湿度下在无血清杜尔贝科氏经改性伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，高葡萄糖(4.5g/L)和2mM L-谷氨酰胺)中培养HEK293-EBNA细胞。
对于每个转染，将来自-60％汇合细胞的HEK293-EBNA细胞(3×107细胞)新接种到250mL爱伦美氏摇瓶(Erlenmeyer shaker Flask)(康宁(Corning))中。根据供应商指南，使用FreeStyle MAX阳离子脂质碱试剂(生命科技(Life Technologies))进行转染。对于ts-NY-ESO-1 TCR的表达，每个转染使用37.5μg总质粒DNA(使用各18.75μg pTT5-ts-NY-ESO-1-TCRα和pTT5-ts-ESO-l-TCRβ载体的质粒DNA或改变两个表达质粒的量)。类似地，对于os-NY-ESO-1 TCR的表达，使用各18.75μg pTT5-os-NY-ESO-1-TCRα和pTT5-os-ESO-l-TCRβ的质粒DNA以用于转染。在转染之后，在新制培养基中回收细胞并且在37℃和5％CO2下在定轨振荡器中以110rpm培育4-8天。类似地，在6孔或24孔板中进行较小规模的转染。
经表达可溶性eTCR2-BiTE的分析
通过十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或在蛋白质纯化之后直接分析分泌到上清液中的ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR蛋白质分子。在还原和非还原条件下制备蛋白质样品和标准品。在微型PROTEAN四细胞电泳系统(Bio-Rad)中使用用于蛋白质电泳的浇铸微型凝胶执行SDS-PAGE。考马斯蓝染料(Coomassie blue dye)用于染色SDS-PAGE凝胶中的蛋白质。
ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR蛋白质分子的纯化
在两个步骤中纯化来自细胞上清液的可溶性ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1TCR。在第一步中，将固定化金属亲和色谱法(IMAC)与负载有镍的氮基三乙酸(NTA)琼脂糖树脂(HisPur Ni-NTA Superflow琼脂糖-赛默飞世尔(Thermo fisher))一起使用。结合和洗涤缓冲液由含有低浓度咪唑(10-25mM)的pH7.2的Tris缓冲液盐水(TBS)组成。来自IMAC管柱的His标记的ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR的溶析和回收是通过用高浓度咪唑(>200mM)洗涤来实现的。通过SDS-PAGE分析经溶析蛋白质溶离份，并且混合含有所关注蛋白质的溶离份。将混合蛋白质溶离份直接用于结合分析中或在涉及尺寸排阻色谱法(SEC)的第二步中进一步纯化。Superdex 200经增加预包装管柱(GE生命科学(Gelifesciences))用于分离出单体、低聚物和任何聚集形式的靶蛋白。
表面等离子体共振
使用BIAcore执行ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR对其pMHC的特异性结合和亲和力分析。简单来说，在传感器表面上经由氮基三乙酸(NTA)的Ni2+螯合来捕获纯化的组氨酸标记的ts-NY-ESO-1 TCR和os-NY-ESO-1 TCR蛋白质。注射不同浓度的含有NY-ESO pep(SLLMwiTQv)-MHC(Prolmmune)的分析物溶液并且监测结合信号。
实例2：四价和八价可溶性NY-ESO TCR-IL2融合分子的产生
将编码表达ts-NY-ESO-1 TCR-IL2和os-NY-ESO-1 TCR-IL2蛋白质复合物所需的结构域的DNA合成并且克隆成如上文所描述的表达载体pTT5。用于ts-NY-ESO-1 TCR-IL2和os-NY-ESO-1 TCR-IL2的TCRαβ链内的结构域的示意图显示于图7和8中，并且氨基酸序列显示于图9和10中。
如上文所描述进行ts-NY-ESO-1 TCR-IL2和os-NY-ESO-1 TCR-IL2的表达、纯化和表征。
实例3：高产量四聚体分泌
简单来说，使用常规的基因工程化技术，制得编码Quad 16的HEK293-T细胞系(图14和15)，并且制得另一种编码Quad 17的HEK293-T细胞系(图14和15)。
进行蛋白质表达并且从细胞系中分泌蛋白质。使其中培育细胞的培养基样品在变性条件下(SDS-PAGE)或在天然条件下(无SDS)进行PAGE。使前者进一步在还原条件下(使用巯基乙醇)进行，然而后者不在还原条件下(使用巯基乙醇)进行。
还原凝胶显示在预期单体尺寸下的独特条带化(图16)。出乎意料地，未还原天然凝胶不显示在单体、二聚体或三聚体尺寸下的可检测条带化，但替代地见到在四聚体尺寸下的重条带化，这表明已经获得极高产量的四聚体，并且此得到高纯度SEC的确认。
对于Quad 16，在SDS-PAGE上运作来自SEC的四聚体峰并且切出所获得条带以用于质谱法。用胰蛋白酶消化物获得数据并且在100％蛋白质中检测p53。这结论性地证明，经分泌Quad 16是多聚化的。
实例4：与NHR2 TP融合的TCR的胞外部分的细胞内蛋白质表达
表达载体
Twist Bioscience(加利福尼亚(California))将所有DNA片段合成并且克隆成表达载体pEF/myc/cyto(英杰(Invitrogen))。合成DNA片段和Quad多肽的示意图和序列显示于本文中的图21和序列表中。
DNA制备
将由Twist Bioscience合成的冻干质粒DNA用MQ水再悬浮到浓度。使用常规的热休克方法将50ng DNA转化成50μ1感受态DH5a细胞。将细胞涂覆在含有100μg/mL氨苄青霉素(ampicillin)的LB琼脂板上并且在37℃下隔夜生长。选取单独的集落并且在37℃、220rpm下隔夜生长。根据制造商说明书(凯杰(Qiagen))，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒从细胞中纯化DNA。
HEK293T细胞中的转染
简单来说，将HEK293T细胞维持在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM中。将细胞以6×105个细胞/6孔板的孔接种在2ml培养基中并且允许在37℃、5％CO2下隔夜粘着。将脂染胺2000稀释在OptiMem中并且在室温下培育5分钟。将质粒DNA(2.5μg)稀释在OptiMem中。将经稀释DNA与经稀释脂染胺2000组合，平缓地混合并且在R.T.下培育20分钟。将复合物添加到6孔板的一个孔中。当分析需要培养基不含血清时，抽出培养基并且在转染后6小时置换成CD293培养基。在分析之前将细胞在37℃、5％CO2下培育48小时。
因此，不同格式的TCR连接的NHR2四聚域(TD)构建体(Quad)转染成HEK293T细胞。将类似于TCR四价格式(示意性表示于图1和3中的结构)的Quad 3和4和类似于TCR八价格式(示意性表示于图2和4中的结构)的Quad 12和13转染以用于蛋白质表达分析。如下由经转染HEK293T细胞制备蛋白质样品以检查细胞内表达的蛋白质。简单来说，细胞一旦经2mlPBS洗涤，随后就将其抽出。将胰蛋白酶-EDTA(0.05％)添加到每个孔中，并且将细胞在R.T.下培育～1分钟。轻敲所述板以剥离任何强烈粘着的细胞。将培养基添加到每个孔中以使胰蛋白酶失活。将细胞转移到1.5ml埃彭道夫(eppendorf)中并且以1,000rpm自旋5分钟。抽出上清液并且将丸粒储存在冰上。将细胞再悬浮于含有细胞溶解缓冲液(10mM Tris，pH 7.5，1％SDS)的蛋白酶抑制剂混合液组III(Calbiochem)中，稀释1/200。将样品剧烈涡旋并且在冰上培育20分钟。使用Branson Ultrasonics SonifierTM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))超声处理细胞。将振幅设定为30％并且将细胞超声处理总计24秒(6秒启动，3秒停用×4)。根据制造商说明书，使用Pierce BCA Protein AssayKitTM定量总蛋白质浓度。使100μg经MQ水稀释，得到80μl体积。随后，添加20μl 5×SDS负载缓冲液，得到1mg/ml样品。在SDS-PAGE和蛋白质印迹分析之前，将样品在95℃下培育5分钟。
在变性条件下在SDS-PAGE上分离蛋白质样品。通常，将25μg全细胞溶解物(25μl)负载于凝胶上以用于蛋白质印迹分析。将PageRule预染色10-180kDa蛋白质序列梯载入凝胶以及蛋白质样品中。在含有0.1％SDS的Tris甘氨酸缓冲液中运作凝胶。使用150伏恒定电压，并且将凝胶运作～70分钟直至染料前沿完全迁移。
使用以下解析和堆叠凝胶制备SDS-PAGE(15％Bis-Tris)凝胶。
解析凝胶：
·5ml 30％双丙烯酰胺
·2.6ml 1.5M Tris(pH 8.8)
·20％SDS
·10％APS
·TEMED
·2.2ml MQ水
堆叠凝胶：
·0.75ml 30％双丙烯酰胺
·1.25ml 1.5M Tris(pH 8.8)
·20％SDS
·10％APS
·TEMED
·2.9ml MQ水
执行蛋白质印迹法以用于由Quad 3、4、12和13特异性和敏感性检测TCR-NHR2 TD融合蛋白的蛋白质表达。如下将在SDS-PAGE上分离出的蛋白质转移到AmershamHybondTM0.45μM PVDF膜上。简单来说，在使用之前，将Amersham Hybond 0.45μMPVDF膜用MeOH活化～1分钟，并且用转移缓冲液(25mM Tris，190mM甘氨酸，20％MeOH)冲洗。制备海绵体、过滤纸、凝胶、膜、过滤纸、海绵堆叠体并且放置在盒中以用于转移。在280mA下在冰上进行转移75分钟。在阻断缓冲液(TBST，5％奶粉)中培育膜～2小时。将膜在4℃下用1/2500稀释于TBST、1％奶粉中的抗人类IgG HRP(赛默，31410)培育隔夜之前简单地用TBST洗涤。将膜在使用Pierce ECL蛋白质印迹受质发展之前彻底洗涤(三次TBST洗涤，各15分钟)。
使用抗人类IgG检测抗体以探测蛋白质印迹，可以从由Quad 3(46.1kDa)、4(46.4kDa)、12(47.8kDa)和13(48.1kDa)制备的样品中检测在预期分子量下的特异性蛋白质条带(图17A和17B)。这些数据确认HEK293T细胞中的TCR-NHR2 TD融合蛋白的细胞内蛋白质表达。
对于所有经分析Quad，可以检测清晰单条带，表明具有NHR2 TD的TRVβ-TRνβ-IgGl-CHl(+/-IgG铰链域)融合体是稳定的。这些表达数据也确认组装如此实例中所示例的四价(Quad 3和4)和八价(Quad 12和13)分子的可能性。
Quad 3和4之间的差异是位于IgG1CH1域与NHR2 TD之间的小肽连接子(G4S)的存在。这对于其中Q13含有IgG1CH1域与NHR2 TD之间的肽连接子的Quad 12和13也是成立的。从表达数据中可见肽连接子不实行蛋白质表达。然而，可能需要包括肽连接子以辅助抗原结合和或稳定呈这些TCR-NHR2 TD格式的多聚化复合物。
实例5：与NHR2 TP融合的TCR的胞外部分的可溶性蛋白质表达
TCR-NHR2 TD融合蛋白显示于待于HEK293T细胞中细胞内表达的实例4中。此外，在此处，Quad 3、4、12和13用于证实这些融合蛋白的可溶性表达。如上文所描述，将Quad 3、4、12和13转染成HEK293T细胞，并且浓缩来自细胞上清液的可溶性蛋白质。简单来说，在转染后48小时收获培养基并且在2,000rpm下离心5分钟以移除任何细胞或碎片。通常，使用AmiconTM超0.5离心单元和10kDa MWCO将培养基浓缩到将负载缓冲液添加到样品中，随后在凝胶/蛋白质印迹分析之前将其在95℃下培育5分钟。将浓缩蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上分离出并且转移到Amersham Hybond 0.45pM PVDF膜上。使用抗人类IgG HRP使用上文所描述的方法进行蛋白质印迹法和蛋白质检测。
经浓缩并且由细胞上清液制备的蛋白质样品显示在对应于Quad 3(46.1kDa)、4(46.4kDa)、12(47.8kDa)和13(48.1kDa)的蛋白质印迹上的在预期分子量下的特异性蛋白质条带(图18A和18B)。蛋白质印迹表达数据明确地显示HEK293T中的TCR-NHR2 TD融合蛋白的可溶性表达。这些数据是证明于真核细胞如HEK293T细胞中表达的TCR-NHR2 TD融合蛋白的可溶性表达的第一报告。
四聚(Quad 3和4)和八聚(Quad 12和13)TCR-NHR2 TD格式的可溶性蛋白质表达的检测突出显示宽装置中的NHR2 TD的潜在可应用性。使用NHR2 TD融合分子可用于制备治疗性分子和蛋白质分子以用于诊断和成像。
实例6：与NHR2 TD融合的抗体片段的细胞内蛋白质表达
为进一步例证NHR2 TD的多功能性，构建几种不同的与NHR2 TD融合的抗体片段格式以用于测试其在HEK293T细胞中的表达。
如图11和21中所示意性地描绘，Quad 14和15含有具有或不具有位于VH与NHR2 TD之间的肽连接子的与NHR2 TD融合的抗体VH域。Quad 14和15中的VH域对GFP(绿色荧光蛋白)具有特异性。也构建几种其它型式的这种格式并且用对治疗上有用的药物靶标具有特异性的VH测试。结合域的序列列于表4中。这些序列中的一些包括Quad 34(对TNFα具有特异性)、Quad 38(对VEGF具有特异性)、Quad 40(对EGFR具有特异性)和Quad 44(对CD38具有特异性)。
进一步发展Quad 38和44以包括额外的结合臂并且包括对EGFR和CD 138具有特异性的第二VH域，分别得到Quad 42和46。Quad 42和46表示具有经由NHR2 TD域进行多聚化以形成双特异性四聚体的能力的双特异性分子。
在另一个实例中，将效应分子(人类IL2)连接到Quad 14和15的C端，产生Quad 18和19，从而VH-NHR2-IL2分子是四价和双功能的。
在另一个实例中，将抗体Fab片段(VH-CH1)连接到NHR2 TD(Quad 23和24)并且如图12中所示意性地描绘。Quad 23和24在与含有免疫球蛋白轻链的第二链(例如Quad 25)体外共表达或混合和组装时表示四价Fab分子。
在又另一个实例中，将称为Quad 26和27并且如图13中所示意性地描绘的人类IgG1铰链域包括在Quad 23和24中。Quad 26和27在与含有免疫球蛋白轻链域的第二链(例如Quad 25)体外共表达或混合和组装时表示八价Fab分子。
将以下Quad载体即全部为组氨酸标记的Quad 14、15、18、19、23、24、26、27、34、38、40、42、44和46在HEK293T细胞中转染。由如上文所描述的全细胞提取物制备蛋白质样品，在SDS-PAGE上分离出，并且转移到Amersham Hybond 0.45μM PVDF膜上。使用于TBST、1％奶粉中1/2500稀释的抗His HRP(西格玛(Sigma)，A7058)探测特异性蛋白质表达。
对于全部使用Quad 14、15、18、19、23、24、26、27、34、38、40、42、44和46测试的不同抗体-NHR2 TD融合蛋白，可以检测全细胞提取物中的特异性蛋白质表达(图19A-D)。引起关注地，含有除了与NHR2 TD的N端融合的VH结合域之外的与NHR2 TD域的C端融合的效应域(IL2)的Quad 18和19显示优良的蛋白质表达。
Quad 23和24多肽的表达突出显示当与配偶体可溶性Quad分子(例如方形25)体外共表达或混合时使用NHR2 TD以形成四价抗体Fab分子的潜能。类似地，包括人类IgG1铰链域的Quad 26和27的表达突出显示当与配偶体可溶性第二配偶体链(例如Quad 25)体外共表达或混合时使用NHR2 TD以形成八价抗体Fab分子的潜能。
含有与NHR2 TD域的C端融合的额外VH域的Quad 42和46双特异性分子也显示优良的蛋白质表达。这些数据突出显示NHR2 TD域的多功能性和其与不同结合和效应分子融合以发展大量蛋白质格式的能力。数据也表明有可能将蛋白质分子与NHR2 TD的N端和C端融合，这允许发展双特异性多价蛋白质分子。
实例7：与NHR2 TD融合的抗体片段的多价组装
NHR2 TD负责ETO成为四聚复合物的低聚反应。如实例4-6中所示，使用NHR2 TD域，有可能将结合域和效应分子与N端或C端或N端和C端融合并且不实行表达。结合域可以是TCR可变域和恒定域、抗体和抗体片段或效应分子如IL2。也有可能在与NHR2 TD(图18)融合时表达呈可溶性格式的蛋白质，尽管NHR2 TD与其中在本质上其仅表达于细胞内部的细胞内表达的蛋白质相隔。
为证实NHR2 TD是否在与结合域融合后保留其低聚的潜能，在HEK293T细胞中表达Quad 14和15，并且由如上文所描述的全细胞提取物制备蛋白质样品。在变性和非变性(天然)条件下在PAGE凝胶上分离出蛋白质样品。使用上文所描述的方案但不具有SDS来制备天然凝胶。将来自PAGE凝胶的蛋白质转移到Amersham Hybond 0.45μM PVDF膜上。用抗人类IgG HRP检测抗体探测特异性蛋白质表达。
如所预期，在变性条件下，来自Quad 14和15的VH-NHR2 TD的表达可以视为其中可以在预期分子量(22和22.3kDa)下检测特异性蛋白质条带的单体(图20A)。在非变性并且因此天然条件下，引起关注地，可能未检测到来自Quad 14和15的VH-NHR2 TD的单体或二聚体(图20B)。仅可以检测高分子量蛋白质条带，其认为是来自Quad 14和15的VH-NHR2 TD的四聚体。四聚体的组装似乎为高效的并且纯粹通过蛋白质强度和Quad 14和15的任何可检测单体和二聚体的不存在来判定。
与实例4-7中的数据一起，结论性地证明NHR2 TD是高度多功能的，允许各种蛋白质结合域和效应分子的融合。NHR2 TD允许由真核细胞如HEK293T细胞进行的蛋白质的可溶性表达并且其形成高度稳定并且纯的四聚分子。
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表1：序列表
表2：示例性包含四聚域的人类蛋白质
以引用的方式将这些蛋白质和其TD中的每一个的氨基酸序列和核苷酸序列并入本文中以用于本发明中并且用于潜在地包括于本文中的一个或多个权利要求中。
表4.结合部分、域和肽的氨基酸序列
*指示包含所述结构域的产品。

Claims (50)

1.一种效应域(例如蛋白质域)或肽的至少第一、第二、第三和第四拷贝的蛋白质多聚体，其中所述多聚体是通过第一、第二、第三和第四自缔合四聚域(TD)缔合在一起而多聚化，其中包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝的对应工程化多肽包含每个四聚域。
2.根据权利要求1所述的多聚体，其中所述多聚体是所述结构域或肽的四聚体或八聚体。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的多聚体，其包含免疫球蛋白超家族结合位点的四聚体或八聚体。
4.根据权利要求3所述的多聚体，其中所述结合位点包含与第二可变域配对的第一可变域。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中每个多肽包含所述蛋白质域或肽的第一和第二拷贝，其中所述多肽包含(在N端到C端方向上)：(i)所述拷贝中的第一拷贝-TD-所述拷贝中的第二拷贝；(ii)TD-和所述第一和第二拷贝；或(iii)所述第一和第二拷贝-TD。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述TD是NHR2TD并且所述结构域或肽不是NHR2域或肽；或其中所述TD是p53TD并且所述结构域或肽不是p53域或肽。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述工程化多肽包含第二类型的蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，其中所述第二类型的蛋白质域或肽不同于所述第一蛋白质域或肽。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述结构域是免疫球蛋白超家族域。
9.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述结构域或肽是抗体可变域或恒定域、TCR可变域或恒定域、肠促胰岛素、胰岛素肽或激素肽。
10.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述多聚体包含所述工程化多肽的第一、第二、第三和第四相同拷贝，所述多肽包含TD和所述蛋白质域或肽的一个(但不超过一个)、两个(但不超过两个)或更多个拷贝。
11.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述工程化多肽包含抗体或TCR可变域(V1)和NHR2TD。
12.根据权利要求11所述的多聚体，其中所述多肽包含(在N端到C端方向上)：(i)V1-任选的连接子-NHR2TD；(ii)V1-任选的连接子-NHR2TD-任选的连接子-V2；或(iii)V1-任选的连接子-V2-任选的连接子-NHR2TD，其中V1和V2是TCR可变域并且是相同的或不同的，或其中V1和V2是抗体可变域并且是相同的或不同的。
13.根据权利要求12所述的多聚体，其中V1和V2是抗体单可变域。
14.根据权利要求11所述的多聚体，其中每个工程化多肽包含(在N端到C端方向上)V1-任选的连接子-TD，其中V1是抗体或TCR可变域并且每个工程化多肽与包含V2的对应第二工程化多肽配对，其中V2分别是与V1配对以形成抗原或pMHC结合位点的抗体或TCR可变域，并且任选地，一个多肽包含抗体Fc或包含抗体CH1，并且另一个多肽包含与所述CH1配对的抗体CL。
15.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述TD包含(i)与SEQIDNO:10或126具有一致性或与其具有至少80％一致性的氨基酸序列；或(ii)与SEQIDNO:120或123具有一致性或与其具有至少80％一致性的氨基酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体，其中所述多聚体包含选自以下组成的组的抗体的抗原结合位点的四聚体或八聚体：ReoProTM；阿昔单抗(Abciximab)；RituxanTM；利妥昔单抗(Rituximab)；ZenapaxTM；达利珠单抗(Daclizumab)；SimulectTM；巴利昔单抗(Basiliximab)；SynagisTM；帕利珠单抗(Palivizumab)；RemicadeTM；英利昔单抗(Infliximab)；HerceptinTM；MylotargTM；吉妥单抗(Gemtuzumab)；CampathTM；阿仑单抗(Alemtuzumab)；ZevalinTM；异贝莫单抗(Ibritumomab)；HumiraTM；阿达木单抗(Adalimumab)；XolairTM；奥马珠单抗(Omalizumab)；BexxarTM；托西莫单抗(Tositumomab)；RaptivaTM；依法利珠单抗(Efalizumab)；ErbituxTM；西妥昔单抗(Cetuximab)；AvastinTM；贝伐单抗(Bevacizumab)；TysabriTM；那他珠单抗(Natalizumab)；ActemraTM；托珠单抗(Tocilizumab)；VectibixTM；帕尼单抗(Panitumumab)；LucentisTM；雷珠单抗(Ranibizumab)；SolirisTM；依库珠单抗(Eculizumab)；CimziaTM；赛妥珠单抗(Certolizumab)；SimponiTM；戈利木单抗(Golimumab)；IlarisTM；卡那单抗(Canakinumab)；StelaraTM；优特克单抗(Ustekinumab)；ArzerraTM；奥法木单抗(Ofatumumab)；ProliaTM；地诺单抗(Denosumab)；NumaxTM；莫维珠单抗(Motavizumab)；ABThraxTM；瑞西巴库单抗(Raxibacumab)；BenlystaTM；贝利木单抗(Belimumab)；YervoyTM；伊匹单抗(Ipilimumab)；AdcetrisTM；本妥昔单抗(Brentuximab)；VedotinTM；PerjetaTM；帕妥珠单抗(Pertuzumab)；KadcylaTM；阿多-曲妥珠单抗(Ado-trastuzumab)；KeytrudaTM；OpdivoTM；GazyvaTM和奥必珠单抗(Obinutuzumab)。
17.一种经分离的TCR结合位点、胰岛素肽、肠促胰岛素肽或肽激素四聚体或八聚体；或多个所述四聚体或八聚体。
18.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中所述多聚体、四聚体或八聚体
(a)可溶于水溶液中；
(b)可从真核细胞中分泌；和/或
(c)是真核细胞的表达产物。
19.一种以下各物的四聚体或八聚体：
(a)TCRV域或TCR结合位点，其中所述四聚体或八聚体可溶于水溶液中；
(b)抗体单可变域，其中所述四聚体或八聚体可溶于水溶液中；
(c)TCRV域或TCR结合位点，其中所述四聚体或八聚体能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达；或
(d)抗体可变域，其中所述四聚体或八聚体能够在细胞内和/或细胞外由HEK293细胞表达。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中所述四聚体或八聚体对于抗原或pMHC结合具有双特异性。
21.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中所述结构域是相同的。
22.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中所述多聚体、四聚体或八聚体包含真核细胞糖基化。
23.根据权利要求22所述的多聚体、四聚体或八聚体，其中所述细胞是HEK293细胞。
24.多个根据前述权利要求中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体。
25.一种医药组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的一种或多种多聚体、一种或多种四聚体或一种或多种八聚体和医药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
26.一种化妆品、食品、饮料、清洁产品、洗涤剂，其包含根据权利要求1到24中任一项所述的一种或多种多聚体、一种或多种四聚体或一种或多种八聚体。
27.一种根据前述权利要求中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体的所述工程化(并且任选地经分离)多肽或(任选地经分离)单体。
28.一种工程化(并且任选地经分离)多肽(P1)，其包含(在N端到C端方向上)：-
(a)TCRV1-TCRC1-抗体CH1-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα并且Cl是Cα；
(ii)V1是Vβ并且Cl是Cβ；
(iii)V1是Vγ并且C1是Cγ；或
(iv)V1是Vδ并且Cl是Cδ；
或
(b)TCRV1-抗体CH1-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα；
(ii)V1是Vβ；
(iii)V1是Vγ；或
(iv)V1是Vδ；
或
(c)抗体V1-抗体CH1-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)Vl是VL；
或
(d)抗体V1-任选的抗体CH1-抗体Fc-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)Vl是VL；
或
(e)抗体V1-抗体CL-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是VH；或
(ii)Vl是VL；
或
(f)TCRV1-TCRC1-任选的连接子-TD，其中
(i)V1是Vα并且Cl是Cα；
(ii)V1是Vβ并且Cl是Cβ；
(iii)V1是Vγ并且C1是Cγ；或
(iv)V1是Vδ并且Cl是Cδ。
29.根据权利要求28所述的多肽，其中所述工程化多肽P1与另一个多肽(P2)配对，其中P2包含(在N端到C端方向上)：-
(g)TCRV2-TCRC2-抗体CL，其中P1符合权利要求28中所述的(a)，并且
(i)当P1符合(a)(ii)时，V2是Vα并且C2是Cα；
(ii)当P1符合(a)(i)时，V2是Vβ并且C2是Cβ；
(iii)当P1符合(a)(iv)时，V2是Vγ并且C2是Cγ；或
(iv)当P1符合(a)(iii)时，V2是Vδ并且C2是Cδ；
或
(h)TCRV2-抗体CL，其中P1符合权利要求28中所述的(b)，并且
(i)当P1符合(b)(ii)时，V2是Vα；
(ii)当P1符合(b)(i)时，V2是Vβ；
(iii)当P1符合(b)(iv)时，V2是Vγ；或
(iv)当P1符合(b)(iii)时，V2是Vδ；
或
(i)抗体V2-CL，其中P1符合权利要求28中所述的(c)，并且
(i)当P1符合(c)(ii)时，V2是VH；或
(ii)当P1符合(c)(i)时，V2是VL；
或
(j)抗体V2-任选的CL，其中P1符合权利要求28中所叙述的(d)，并且
(i)当P1符合(d)(ii)时，V2是VH；或
(ii)当P1符合(d)(i)时，V2是VL；
或
(k)抗体V2-CH1，其中P1符合权利要求28中所述的(e)，并且
(i)当P1符合(e)(ii)时，V2是VH；或
(ii)当P1符合(e)(i)时，V2是VL；
或
(1)TCRV2-TCRC2，其中P1符合权利要求28中所叙述的(f)，并且
(i)当P1符合(f)(ii)时，V2是Vα并且C2是Cα；
(ii)当P1符合(f)(i)时，V2是Vβ并且C2是Cβ；
(iii)当P1符合(f)(iii)时，V2是Vγ并且C2是Cγ；或
(iv)当P1符合(f)(iv)时，V2是Vδ并且C2是Cδ。
30.一种如权利要求28中所定义的P1或与如权利要求29中所定义的P2配对的P1的多聚体；或多个所述多聚体，任选地，其中所述多聚体符合权利要求1到24中的任一项。
31.一种核酸，其编码根据权利要求27到29中任一项所述的工程化多肽或单体，任选地，其中所述核酸包含在用于表达所述多肽的表达载体中。
32.一种真核宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的核酸或载体，用于细胞内和/或分泌性表达根据权利要求1到24中任一项所述的多聚体、四聚体、八聚体、工程化多肽或单体。
33.一种根据权利要求31所述的核酸或载体在制备蛋白质多聚体的方法中用于产生细胞内表达和/或分泌的多聚体的用途，其中所述方法包含在包含所述核酸或载体的真核细胞中表达所述多聚体和/或由包含所述核酸或载体的真核细胞分泌所述多聚体。
34.一种根据权利要求31所述的核酸或载体在制备蛋白质多聚体的方法中、在包含所述核酸或载体的真核细胞中用于产生糖基化多聚体的用途。
35.一种混合物，其包含(i)编码根据权利要求27到29中任一项所述的工程化多肽的真核细胞系；和(ii)如权利要求1到24中任一项中所定义的多聚体、四聚体或八聚体。
36.根据权利要求35所述的混合物，其中所述细胞系处于包含所述细胞的分泌产物的培养基中，其中所述分泌产物包含所述多聚体、四聚体或八聚体。
37.根据权利要求1到24中任一项所述的多聚体、四聚体或八聚体，其用于医学用途。
38.一种方法，其产生：
(a)TCRV域多聚体，所述方法包含真核细胞中所表达的TCRV-NHR2TD或TCRV-p53TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达，所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；
(b)抗体V域多聚体，所述方法包含真核细胞中所表达的抗体V-NHR2TD或V-p53TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达，所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；
(c)肠促胰岛素肽多聚体，所述方法包含真核细胞如HEK293T细胞中所表达的肠促胰岛素肽-NHR2TD或肠促胰岛素肽-p53TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达；所述方法任选地包含分离多个所述多聚体；或
(d)肽激素多聚体，所述方法包含真核细胞如HEK293T细胞中所表达的肽激素-NHR2TD或肽激素-p53TD融合蛋白的可溶性和/或细胞内表达；所述方法任选地包含分离多个所述多聚体。
39.一种自缔合四聚域(TD)在制备多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途。
40.一种工程化多肽在制备包含蛋白质域或肽的多个拷贝的多肽四聚体的方法中用于产生比单体和/或二聚体多肽产量更高的四聚体的用途，其中所述工程化多肽包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，并且进一步包含自缔合四聚域(TD)。
41.一种自缔合四聚域(TD)在制备多肽四聚体的方法中用于产生不与单体、二聚体或三聚体混合的多个四聚体的用途。
42.一种工程化多肽在制备包含蛋白质域或肽的多个拷贝的多肽四聚体的方法中用于产生不与单体、二聚体或三聚体混合的多个四聚体的用途，其中所述工程化多肽包含所述蛋白质域或肽的一个或多个拷贝，并且进一步包含自缔合四聚域(TD)。
43.根据权利要求39到42中任一项所述的用途，其中所述四聚体产量是单体和/或二聚体产量的至少10倍。
44.根据权利要求39到43中任一项所述的用途，其中所述方法所产生的四聚体:所产生的单体和/或二聚体的比率是至少90:10。
45.根据权利要求39到44中任一项所述的用途，其中每个单体的尺寸不超过40kDa。
46.根据权利要求39到45中任一项所述的用途，其中每个四聚体的尺寸不超过150kDa。
47.根据权利要求39到46中任一项所述的用途，其中所述方法包含由真核细胞系表达所述四聚体。
48.一种能够结合pMHC复合物的多价异源二聚可溶性T细胞受体，其包含：
(a)TCR胞外域；
(b)免疫球蛋白恒定域；和
(c)ETO的NHR2多聚域。
49.一种多聚免疫球蛋白，其包含
(i)免疫球蛋白可变域；和
(ii)ETO的NHR2多聚域。
50.一种用于组装可溶性多聚多肽的方法，其包含：
(a)提供与ETO的NHR2域融合的所述多聚多肽的单体；和
(b)使所述单体的多个拷贝缔合，由此获得多聚可溶性多肽。
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