CN104508135B - 用于在体内产生双重特异性免疫球蛋白或者仅高变重链免疫球蛋白的转基因非人脊椎动物 - Google Patents

用于在体内产生双重特异性免疫球蛋白或者仅高变重链免疫球蛋白的转基因非人脊椎动物 Download PDF

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Abstract

本发明一方面一般性涉及完全在体内指导选择抗体可变结构域、组合及表达。一项应用是产生多价多肽。本发明涉及多价(例如多特异性)抗体、抗体链和多肽，以及缺乏轻链的仅重链抗体(H2抗体)。本发明进一步涉及这些抗体在非人脊椎动物体内和非人脊椎动物细胞中的选择、成熟和产生。为此，本发明还涉及这种非人脊椎动物和细胞。本发明还涉及提供产生和选择仅重链抗体及包含已经经历亲和性成熟的可变结构域的重链的手段。

Description

用于在体内产生双重特异性免疫球蛋白或者仅高变重链免疫 球蛋白的转基因非人脊椎动物
本发明一方面一般性涉及体内指导选择抗体可变结构域、组合及完整表达的新概念。一项应用是产生多价多肽。
本发明还涉及多价(例如多特异性)抗体、抗体链和多肽，以及缺乏轻链的仅重链抗体(H2抗体)。本发明进一步涉及这些抗体在非人脊椎动物体内和非人脊椎动物细胞中的选择、成熟和生产。为此，本发明还涉及这种非人脊椎动物和细胞。本发明还涉及提供产生和选择仅重链的抗体及包含经历亲和性成熟的可变结构域的重链的手段。
发明背景
现有技术领域提供了在体外(例如使用噬菌体、核糖体或酵母展示)或体内(例如使用包含转基因免疫球蛋白基因座的非人脊椎动物(例如小鼠和大鼠)和细胞)产生抗体的方法。这种体内系统(例如XenomouseTM)完全使用人转基因重链基因座，其包含位于人恒定区上游的人可变区(人VH、D和JH基因区段)(例如位于人γ恒定区基因区段上游的人μ)。随后，揭示了完全人转基因基因座在这种体内系统中的应用是不利的，B细胞的发育被妨碍，导致相对小的B细胞区室及产生抗体的用途受限。已经产生了后世转基因动物(例如VelocimouseTM)，其具有嵌合重链基因座，其中人可变区位于内源(例如小鼠或大鼠)恒定区的上游(即在种系构型中，小鼠μ恒定区位于γ恒定区上游)。这样对B细胞和抗体开发的内源控制机制得以控制，由此完全人转基因基因座的问题程度不见了。构建转基因脊椎动物及使用这些动物在抗原免疫接种后产生抗体及其核酸的方法为本领域已知，例如见US7501552(Medarex)；US5939598&US6130364(Abgenix)；WO02066630、WO2011163311&WO2011163314(Regeneron)；WO2011004192&WO2011158009(Kymab Limited)；WO2009076464、WO2009143472、EP1414858、WO2009013620A2、WO2010070263A1&WO2010109165A2(Harbour Antibodies)；EP1399559(Crescendo Biologics)和WO2010039900(Ablexis)，所述文献并入本文作参考，包括但不限于提供给技术人员指导怎样产生携带转基因免疫球蛋白基因座的非人动物及失活内源性基因座表达。
本领域意识到产生表位或抗原结合位点和特异性的人工组合的需求。因此，本领域提议了结合多价抗原的抗体和多肽，其中多个结合位点是合成组合的，以提供与相同或不同靶上多个表位的结合。当所述靶不同时，多特异性构建体是可行的，它们可靶向并结合多个提供表位的不同抗原(例如中和所述抗原)。一种技术包括体外组合(融合)不同的杂交瘤以产生细胞杂交瘤，其中获得来自不同抗体的重链和轻链的配对(Milstein&Cuello,Nature,1983,305(5934):pp 537-40)。这种技术的缺点是导致抗体链的错配配对及多个不同组合，由此产生希望的特异性组合相对低。接下来的技术使用体外抗体工程化，以合成组合表位结合部分(例如抗体可变结构域、dAb或scFv)，以产生多价、多特异性构建体。所述表位结合部分是在体外技术如噬菌体展示、核糖体展示和酵母展示技术中单独选择的(通常基于表位结合亲和性)。一旦鉴别了希望的部分，则将这些部分在体外通过工程化组合，评定所得多价构建体的性能和特性。虽然提供了多价和多特异性，但是这些技术是不利的，因为这种体外工程化可降低所得抗体的希望的特性。例如，抗原结合亲和性、抗原特异性、可表达性(例如在细胞系如CHO或HEK293细胞中)、半衰期和/或生物物理学特性(例如解链温度、溶液状态(solution state)、聚集抗性等)可被降低，从而不利于抗体作为人用治疗或预防性应用药物的开发。希望具有解决本领域中这些缺点的产生、成熟和选择多价和多特异性抗体的手段。多价和多特异性形式在例如Trends Biotechnol.2010Jul；28(7):355-62.Epub 2010May 4；“Multivalent antibodies:when design surpasses evolution”；Cuesta AM et al.中揭示。
参考上文提及的Harbour Antibodies and Crescendo Biologics专利申请；这些专利申请涉及产生缺少CH1及缺失轻链的仅重链抗体(H2抗体)。在Proc Natl Acad SciUSA.2006Oct 10；103(41):15130-5.Epub 2006Oct 2；“Generation of heavy-chain-onlyantibodies in mice”；Janssens et al中，揭示了转基因小鼠(MGΔ小鼠)，其包含抗体重链基因座，所述基因座包含骆驼(llama)VHH外显子和位于Cγ2和Cγ3区上游的Cμ区，其中CH1已经缺失。所述小鼠具有μMT背景并表达轻链。所述重链MGΔ基因座通过将DNA注射进小鼠受精卵中及随后将基因座的1-5个拷贝随机整合进小鼠基因组中而导入。所述MGΔ基因座不拯救B细胞发育。MGΔ小鼠含有极少的表达细胞表面嵌合Ig的B细胞；30％的骨髓B220+细胞表达细胞内IgM，而非IgG。因此，需要改良的转基因重链基因座以及包含这些基因座以产生H2抗体(例如类别转换的H2抗体如γ型H2抗体)的脊椎动物和细胞。
发明概述
本发明解决了改良的多价和多特异性抗体、链和多肽以及产生和选择这些的手段的需求。在这方面，本发明提供了一种解决方案，完全在体内进行表位结合特异性组合的产生、成熟和选择。以这种方式，本发明使得技术人员可以选择已经通过体内系统在一或多个预定的其它结合位点或特异性背景下产生、成熟和表达的抗体可变结构域。
因此，使用本发明可以直接快速地获得多抗原特异性抗体、链和多肽，其包含已经在体内在一或多个预定的其它结合部分的背景下经历连接突变(junctional mutation)和亲和性成熟的抗原特异性可变结构域。这种抗体、链和多肽全部是在用作终产物的组合中在体内产生和选择的，因此本发明在希望的可变结构域和预定的表位结合部分配对的背景下控制了可表达性的体内过滤(及可能提供了计入体内选择中的亲和性和生物物理特征)。这避免了在现有技术中当单独选择及随后在体外组合表位结合部分时可见的降低生物物理和亲和性特征的问题。因此，本发明使得技术人员可以直接选择多价和多特异性抗体、链和多肽，以此形式其将用于随后的人体治疗和预防用途。
本发明还解决了仅重链抗体的改良的体内生产的需求。使用本发明可以产生和选择包含经历亲和性成熟的可变结构域的仅重链抗体和重链。本发明使得抗体和B细胞区室发育经过有利的4链内源性IgM阶段，之后是从由较早的4链IgM阶段提供的良好的重链VDJ重组集合中仅选择仅重链(H2)抗体的后续(例如γ)阶段，这个后续阶段基本上消除了4链抗体的可能性。这个后续阶段可以预定方式掺入另外的表位特异性，由此所述仅重链抗体和链可任选是多特异性的。本发明期望提供一或多个如下优势：良好的B细胞区室发育(例如处于野生型的或接近野生型的正常骨髓和/或脾或二级淋巴区室)；在骨髓和/或脾区室中的正常B细胞比率；正常血清抗体水平；正常血清γ-H2抗体水平；H2抗体的良好的抗原结合亲和性；仅产生同种型转换的H2抗体；及仅产生同种型转换的抗体，其可变结构域是抗体单一可变结构域(即dAb)。
因此，在第一个构型中，本发明提供了
第一方面：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组均包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二转换序列及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中在同种型转换之后，所述脊椎动物表达多价多肽链，所述多价多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
第二方面：
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞，如ES细胞或B细胞)，所述细胞基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二转换序列和非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，以表达多价多肽链，所述多价多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
在第二个构型中，本发明提供了：
第一方面：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ(例如γ)恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多价多肽链，所述多价多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
第二方面：
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或者杂交瘤，所述细胞基因组包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ(例如γ)恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述细胞表达多价多肽链，所述多价多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
在第三个构型中，本发明提供了
第一方面：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞的基因组包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排的或未重排的可变区及第二个区域；
其中
所述第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
第二方面：
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或者杂交瘤，其中所述细胞基因组包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排的或未重排的可变区和第二个区域；
其中
所述第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，以表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
在第四个构型中，本发明提供了：
第一方面：
一种产生多价多肽链的方法，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位，所述方法包括：
(a)在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在幼B细胞中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座表达的重链和轻链，任选所述重链包含CH1结构域；
(b)用携带所述第一表位的第一个预定抗原免疫所述脊椎动物，获得同种型转换以表达至少一些重链基因座中的非-μ(例如γ)恒定区及表达已经经历体细胞高变的可变区；及
(c)从所述免疫的脊椎动物中通过选择结合所述第一表位的可变区而选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
其中所述方法进一步包括：
(d)提供所述脊椎动物基因组中重链基因座的非-μ恒定区中表位结合部分的核苷酸序列，其中在步骤(c)中选择的多肽链结合所述第一和第二表位。
第二方面：
一种在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中产生多价多肽链的方法，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位，所述方法包括：
(a)用携带所述第一表位的第一个预定抗原免疫所述脊椎动物，获得同种型转换以表达所述脊椎动物的至少一些重链基因座中的非-μ(例如γ)恒定区及表达已经经历体细胞高变的可变区；及
(b)通过选择结合所述第一表位的可变区而从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
其中所述方法进一步包括：
(d)提供所述脊椎动物基因组中重链基因座的非-μ恒定区中表位结合部分的核苷酸序列，其中在步骤(b)中选择的多肽链结合所述第一和第二表位。
在第五个构型中，本发明提供了：
第一方面：
多价(例如多特异性或双特异性)多肽链，其具有(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C，其中
(i)V是特异性结合第一表位的抗体可变结构域，
(ii)X是不存在、抗体铰链区或者包含恒定结构域的抗体恒定区，
(iii)每个L是任选的接头，
(iv)E是特异性结合第二表位的表位结合部分，及
(v)C是不存在或者包含恒定结构域的抗体恒定区(例如C是人γFc)，
其中V是重排的抗体可变结构域，其衍生自非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
第二方面：
多价(例如多特异性或双特异性)抗体，其包含与轻链结合的重链，其中：
每个重链是在第五个构型的第一方面中列举的多肽链，其中E是抗体可变结构域；
每个轻链是具有(N-至C-末端方向)结构V’-L’-E’-L’-C’的多肽链，其中
(i)V’是抗体可变结构域，
(ii)每个L’是任选的接头，
(iv)E’是表位结合部分，及
(v)C’是不存在或者是包含恒定结构域的抗体恒定区(例如C’是人CL)；
其中
V’是重排的抗体可变结构域，其衍生自非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码E’的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
V’包含内源性AID模式体细胞高变；
V和V’形成特异性结合第一表位的第一个结合位点；及
任选地，当E’是抗体可变结构域时，E和E’形成特异性结合第二表位的第二个结合位点(例如E是VH及E’是VL；或者E是VL及E’是VH)。
第三方面：
抗原结合多肽，其包含与一或多个表位结合部分连接的蛋白质支架，其中所述抗原结合多肽包含至少两个表位结合位点，其中至少一个是由表位结合部分提供的，及至少一个是由与第二个抗体可变结构域配对的第一个抗体可变结构域提供的，其中每个可变结构域均是重排的抗体可变结构域，其衍生自非人脊椎动物中的可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码一或多个表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID-模式体细胞高变。
第四方面：
根据第一、第二或第三方面的多特异性抗原结合多肽、二聚体或者抗体，其通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原(例如人CD3)而能拯救人免疫效应细胞的活性，所述多肽、二聚体或抗体的第一个表位结合位点能特异性结合所述效应抗原，所述多肽、二聚体或抗体的第二个表位结合位点能特异性结合除了效应抗原之外的靶抗原(例如人EpCAM或者人CD19)；任选其中所述靶抗原位于除了所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上。
在第六个构型中，本发明提供了：
第一方面：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中
(a)所述脊椎动物表达包含分别由抗体重链和轻链基因座编码的重链和轻链的IgM抗体，任选其中每个重链包含CH1结构域；
(b)所述脊椎动物能表达非-μ(例如IgG)抗体，每个非-μ抗体重链均缺少功能性CH1结构域；及
(c)所述IgM抗体由淋巴细胞表达，每个细胞包含功能性轻链基因座以表达由所述细胞表达的IgM抗体的轻链；及
其中
(d)所述非-μ抗体由淋巴细胞表达，每个细胞均缺少功能性轻链基因座，其中非-μ抗体在不存在轻链表达时由所述细胞表达。
第二方面：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二转换序列和缺少CH1基因区段的非-μ(例如γ)恒定区；
(ii)功能性抗体轻链基因座以表达轻链；
其中所述细胞可表达包含IgM型重链和轻链的IgM抗体；
其中每个细胞的重链基因座能经历同种型转换以产生非-μ(例如IgG)抗体，其在不存在轻链时包含一或多个非-μ-型(例如IgG-型)重链，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件(means)，其中在同种型转换为所述非-μ-型抗体后功能性轻链不表达。
第三方面：
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其中所述细胞基因组包含：
(i)功能性抗体轻链基因座以表达轻链；
(ii)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二转换序列和缺少CH1基因区段的非-μ(例如γ)恒定区，以表达包含IgM型重链和轻链的IgM抗体；及IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换以产生非-μ(例如IgG)抗体，其在不存在轻链时包含一或多个非-μ-型重链，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件，其中在同种型转换为所述非-μ-型抗体后功能性轻链不表达。
在第七个构型中，本发明提供了：
一种在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中产生包含体细胞高变的可变区的多肽链的方法，所述方法包括：
(a)在脊椎动物中在幼B细胞中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座表达的重链和轻链；
(b)用预定的表位免疫所述脊椎动物并获得在至少一些重链基因座中的同种型转换及已经经历体细胞高变的非-μ(例如IgG)抗体的表达，其中所述抗体包含缺少CH1结构域的重链及包含特异性结合所述抗原的可变区；及
(c)从所述免疫的脊椎动物中通过选择结合所述表位的可变区而选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
所述方法进一步包括在不存在轻链表达时在步骤(b)中表达非-μ抗体。
在第八个构型中，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，
(a)所述轻链基因座包含(5’至3’方向)轻链可变区和恒定区，以在表达IgM抗体的淋巴细胞中表达轻链；及
(b)在表达非-μ(例如IgG)抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或者杂交瘤，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，所述轻链基因座包含：
(a)轻链可变区和恒定区(5’至3’方向)，以在表达IgM抗体的淋巴细胞中表达轻链；及
(b)在表达非-μ(例如IgG)抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
本发明还提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其中所述脊椎动物或细胞的基因组的Ig重链或轻链基因座包含(5’至3’方向)：(i)未重排的人可变区以编码第一可变结构域，(ii)编码任选的接头的序列，及(iii)编码表位结合部分的序列。
多肽，其包含特异于靶表位的结合位点，所述结合位点具有结构V1-L-E，其中V1是抗体可变结构域，E是表位结合部分及L是任选的肽接头；及其中V1衍生自在非人脊椎动物中人可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码E的核苷酸序列中具有体细胞高变，其中V1包含内源性AID模式体细胞高变并且特异性结合所述靶表位。
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含抗体重链或轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头的核苷酸序列及编码第一可变结构域的重排的可变区，其中在同种型转换之后，所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，其包含分别衍生自重排的第二可变结构域核苷酸序列和第一可变结构域核苷酸序列的第二和第一抗体可变结构域，其中第二核苷酸序列已经在所述脊椎动物中重排。
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或者杂交瘤，所述细胞基因组包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头的核苷酸序列及编码第一可变结构域的重排的可变区，以表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，其包含分别衍生自重排的第二可变结构域核苷酸序列和第一可变结构域核苷酸序列的第二和第一抗体可变结构域，其中第二核苷酸序列在所述细胞中已经重排。
产生非人物种脊椎动物的方法，所述方法包括将所述物种的两个脊椎动物一起繁殖，其中这两个脊椎动物均如本发明任何方面所述。
通过关闭轻链表达，同种型转换的重链在不存在轻链表达时表达，因此在B细胞增殖期间及在抗原或表位免疫后重链的体细胞突变和选择期间不可能存在与重链相关的新表达的轻链。因此重链产生基本上只是产生H2抗体型重链，其中所述可变区在不存在轻链可变区配偶体时结合抗原。这种H2抗体可以是抗体单一可变结构域序列的良好来源(例如当重链基因座包含人可变区时的人VH单一可变结构域)。因此，本发明的非人脊椎动物或细胞的体内抗体产生机制在免疫之后可以提供H2抗体产生，而无妨碍H2抗体应答程度的任何明显的4链抗体(H2L2)产生，最终可获得希望水平的H2。这个优势使得可以从产生于内源IgM阶段保留的希望的重组VDJ库集(repertoire)和B细胞区室中产生这种同种型转换的抗原/表位特异性体内应答，如下文进一步论述。
通过保留内源性IgM阶段，本发明的各个构型和方面保留控制非人脊椎动物或细胞的内源性抗体和B细胞发育控制机制的能力。这包括控制内源性末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)活性和连接突变以及正确的B细胞发育(包括在当IgM表达时的发育早期阶段)以产生良好大小的B细胞区室和良好大小和品质的重组VDJ多样性库集的能力，从该库集随后选择和成熟从本发明的抗体重链或轻链基因座产生的同种型转换的重链。因此，例如本发明的脊椎动物可以用预定的治疗性靶抗原(例如人、病毒或细菌抗原)免疫，可以分离抗体(例如γ型)或重链(例如γ型重链)，其(i)已经经历连接和体细胞突变，及因此应答抗原攻击的体内亲和性成熟，(ii)具有人可变结构域，及(iii)根据表达及结合抗原或表位的能力通过全部体内系统选择。因此，本发明采用体内系统指导技术人员获得可行的人抗体(例如H2或4链双特异性抗体)并且可以在体内良好表达及特异于预定抗原的重链。
本发明的多价构型简单地通过避免在体内和体外产生的多个步骤组合而产生，并根据现有技术方法工程化以产生多价形式。
此外，在脊椎动物或细胞中经历亲和性成熟，选择的抗体具有的抗原结合亲和性自然而不是人工调整。因此，本发明的脊椎动物和细胞提供了完全人抗原特异性抗体和重链的良好来源，其具有顺应治疗的亲和性而不需要进行费力的体外亲和性成熟(或者由于体外操纵所致降低希望的特性的危险)。
此外，本发明使得技术人员可以可预测方式设计脊椎动物和细胞以产生特异的希望的同种型的多价抗体、链和多肽。例如，技术人员能设计在本发明的脊椎动物中的重链基因座，以便所有γ恒定区基因区段均包含上述多价设计。以此方式，技术人员将获知从所述脊椎动物中选择的所有IgG-型抗体或重链在其H链均是多价的且已经进行内源性抗体开发(例如亲和性成熟)及在结合位点组合的背景中体内表达和选择。进一步地，技术人员可以设计脊椎动物，其中仅IgG1同种型基因区段具有多价设计。因此，技术人员从一开始获知所有IgG1同种型抗体是多价的(例如双特异性的)及在体内成熟、表达和选择。这可用于在体内调整抗体亚型如IgG1或IgG4，使其以可预测方式适应特定的靶表位或抗原组合。
附图简述
图1示出在小鼠重链基因座中AID的体细胞高变模式。
图2示出在骨髓和脾区室中B细胞发育和标记。
图3示出在本发明非人脊椎动物中体内产生仅重链抗体的改良途径。
图4和5示出怎样工程化非人脊椎动物的基因组以提供有条件的轻链表达的实例。
图6示出产生双特异性重链和抗体的示意方法。
图7示出在野生型脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中膜结合的或分泌的抗体的剪接和聚腺苷酸化之间的竞争。
图8和9示出产生本发明的多价产物的可变剪接。
图10A和10B示出构建本发明的相关二价重链基因座的方法的详细示意图。
图11A和11B示出构建表达共同轻链的基因座的方法的详细示意图。
图12和13示出构建在体内表达多价多肽的基因座的方法以及举例的产物的详细示意图。
图14A和14B示出用于构建包含表达多价多肽的转基因基因座的非人脊椎动物的详细方法。
图15示出举例的得自本发明转基因脊椎动物的脾和淋巴结，以及从这种脊椎动物中提取的mRNA的PCR分析结果。(A)从转基因小鼠KMBS2.1d和KMBS3.1a的脾和淋巴结中提取的总RNA在1％TAE琼脂糖凝胶上分离。(B)第一轮PCR使用内部半嵌套引物1在从脾和淋巴结中提取的RNA合成的cDNA上进行。相应于双特异性转录物的预期的DNA片段为～1.7kb，以白色框高亮表示。切下在预期的转录物大小周围的琼脂糖凝胶，进行凝胶提取，并用于使用相同的半嵌套反向引物1或者内部半嵌套反向引物2进行第二轮PCR(C)。检测从小鼠KMBS2的淋巴结中提取的RNA样品中相应于预期的双特异性抗体大小的转录物。从琼脂糖凝胶中切下～1.7kb DNA片段，进行凝胶提取，并将一小部分用于使用进一步的内部反向引物3进行的第三轮PCR(D)。第三轮PCR产生显著量的产物，相应于新的双特异性转录物预期的大小。缩写：S，脾；L，淋巴结。
图16示出PCR凝胶：通过SalI限制消化的第三轮PC产物A和B的分析。从相应于双特异性抗体的转录物的SalI消化中预期的DNA片段大小为～400bp和1300bp。相应于预期的双特异性抗体转录物的条带在SalI消化后可见。将SalI消化的DNA(D)在未消化(U)的PCR产物旁边运行。
发明详述
如下定义用于本发明的任何构型、方面、条项、条款、属性、实例或实施方案。
“衍生自”以该术语的常用含义应用。举例的同义词包括“产生自”、“得自”、“…的产物”、“…的结果”及“修饰自”。例如，人重链可变区可衍生自人VH、D和JH基因区段的重组，这反映了这些基因区段在例如本发明的具有任何伴随突变(例如连接突变)的重链基因座中的体内重组。
从中可获得B细胞的样品包括但不限于血液、血清、脾、脾组织、骨髓、淋巴、淋巴结、胸腺和阑尾。抗体和免疫球蛋白链可得自每个先前提及的样品，也可以得自如下非限制性的B细胞、腹水、杂交瘤和细胞培养物。
“多个”以该术语的常用含义应用，是指“至少一个”或“一个以上”。
术语“种系构型”是指种系基因组构型。例如，转基因免疫球蛋白基因座的人免疫球蛋白基因区段，当所述基因区段的相对顺序与人种系基因组中相应基因区段的顺序相同时，其是种系构型。例如，当转基因基因座是本发明的重链基因座，其包含假设人免疫球蛋白基因区段A、B和C，当人种系基因组的相应基因区段包含5’-A-B-C-3’排列时，这些区段以此顺序提供(基因座中5’至3’方向)。在一个实例中，当人免疫球蛋白基因座的元件(例如基因区段、增强子或其它调节元件)在本发明的转基因免疫球蛋白基因座中提供时，当基因区段的相对顺序与人种系基因组中相应基因区段的顺序相同并且包括元件之间的人序列(这些序列相应于人种系基因组中相应元件之间的这种序列)时，所述人Ig基因座元件是种系构型。因此，在一个假设实例中，转基因基因座包含5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’排列的人元件，其中A、B和C是人免疫球蛋白基因区段，S1-S3是人基因区段间序列，其中相应的排列5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’存在于人种系基因组中。例如，这可以通过在本发明的转基因免疫球蛋白基因座中提供一个DNA插入体而实现，所述DNA插入体相应于人种系基因组中A-C的DNA序列(或者插入体包含A-C的DNA序列)。人种系基因组和免疫球蛋白基因座的排列为本领域已知(例如见World Wide Web的IMGT(见上述)，Kabat及本文参考的其它抗体来源)。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体、二抗体，及单链分子，以及抗体片段(例如dAb、Fab、F(ab’)2和Fv)。术语“抗体”还包括H2抗体，其包含重链(5’-VH-(任选铰链区)-CH2-CH3-3’)的二聚体及缺失轻链(类似于天然发生的H2抗体；见例如Nature.1993Jun3；363(6428):446-8；Naturally occurring antibodies devoid of light chains；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R)。因此，在本发明的一个实施方案中，从转基因重链基因座中产生的RNA编码没有CH1基因区段及不包含功能性抗体轻链的重链。在一个实例中，从转基因重链基因座中产生的RNA编码VH单一可变结构域(dAb；结构域抗体)。这些可任选包含恒定区。
术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文与“抗体”可互换使用。
举例的抗体是传统的4链抗体，其包含两个重链与两个轻链配对(如5’-VH-CH1-铰链区-CH2-CH3-3’与5’-VL-CL-3’配对的二聚体)，或者H2抗体，其包含重链(5’-VH-(任选铰链区)-CH2-CH3-3’)的二聚体而缺失轻链。因此，在本发明的一个实施方案中，重链序列库集编码没有CH1基因区段及不包含功能性抗体轻链的重链。在一个实例中，由所述脊椎动物产生的重链序列库集编码具有一或多个人恒定结构域的VH单一可变结构域(dAb；结构域抗体)库集。
在本发明任何构型的实例中，库集包含多个不同成员(因此，例如重链库集包含多个不同的重链序列，如其可变区和/或人非-μ恒定区中不同的序列)。在本发明任何构型的实例中，库集包含或由2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013或者至少1014个成员组成。例如，抗体重链或抗体的库集分别包含或由至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013或至少1014个抗体链序列或抗体组成。例如，库集包含或由2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013或者至少1014个不同成员组成。例如，基因区段的库集包含或由2、3、4、5、6、7、8、9、10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50个基因区段组成。
“分离的”抗体是已经从其产生环境(例如天然或重组产生)的成分中鉴别、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽与其产生环境的所有其它成分不相关，例如由此所述抗体已经分离为FDA可批准或已经批准的标准。其产生环境的污染成分如得自重组转染的细胞的成分是典型干扰所述抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其它蛋白质样或非蛋白质样溶质。在优选的实施方案中，多肽将被纯化为：(1)通过例如Lowry方法确定高于95％抗体重量，在一些实施方案中高于99％重量；(2)通过使用转杯测序仪(spinning cup sequenator)足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(3)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下均质，使用考马斯蓝或者优选银染色。由于不存在抗体的天然环境的至少一种成分，因此分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体。然而，通常分离的多肽或抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。举例的抗体片段包括dAb、Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二抗体；线性抗体；从抗体片段中形成的单链抗体分子和多特异性抗体。
“特异性结合”或者“特异于”特定多肽、抗原或表位的抗体是结合特定多肽、抗原或表位而基本上不结合其它多肽、抗原或表位的抗体。例如，当抗体以KD为100μM或更低、10μM或更低、1μM或更低、100nM或更低例如10nM或更低、1nM或更低、500pM或更低、100pM或更低、或者10pM或更低结合时，与所述抗原或表位的结合是特异性的。结合亲和性(KD)可以使用本领域技术人员已知的标准方法确定，例如在ELISA中的结合和/或使用表面等离子体共振(例如BiacoreTM、ProteonTM或者KinExATM溶液相亲和性测定，其可以检测低至fM的亲和性(Sapidyne Instruments,Idaho))的亲和性确定。
在一个实施方案中，所述表面等离子体共振(SPR)在25℃进行。在另一实施方案中，SPR在37℃进行。
在一个实施方案中，SPR在生理pH进行，如大约pH7或pH7.6(例如使用Hepes缓冲盐水pH7.6(也称作HBS-EP))。
在一个实施方案中，SPR在生理盐水水平进行，如150mM NaCl。
在一个实施方案中，SPR在不超过0.05％体积的洗涤剂水平进行，例如存在0.05％的P20(聚山梨醇酯20；例如Tween-20TM)和3mM的EDTA。
在一个实施例中，SPR在25℃或37℃在pH7.6缓冲液-150mM NaCl、0.05％洗涤剂(例如P20)和3mM EDTA中进行。所述缓冲液可含有10mM Hepes。在一个实例中，SPR在25℃或37℃在HBS-EP中进行。HBS-EP可得自Teknova Inc(California；目录号H8022)。
在一个实例中，亲和性是使用SPR通过如下步骤确定：
1.通过伯胺结合法将抗小鼠(或者其它相关非人脊椎动物)IgG(例如Biacore BR-1008-38)与生物传感器芯片(例如GLM芯片)结合；
2.将所述抗小鼠IgG(非人脊椎动物抗体)暴露于检测IgG抗体或重链，以捕获芯片上的检测抗体；
3.使检测抗原经过芯片的捕获表面，浓度为1024nM、256nM、64nM、16nM、4nM及0nM(即仅缓冲液)；及
4.例如在上述SPR条件下(例如在25℃在生理缓冲液中)，使用表面等离子体共振确定检测抗体/链与检测抗原的结合亲和性。可以使用任何标准SPR仪器进行SPR，例如通过BiacoreTM或者使用ProteOn XPR36TM
捕获表面的再生可以使用pH1.7的10mM甘氨酸进行。这除去了捕获的抗体并使得该表面可用于另一次相互作用。可使用标准技术将结合数据拟合为1:1内部模型(modelinherent)，例如使用ProteOn XPR36TM分析软件的内部模型。
“药物可接受的”是指由美国联邦或州政府管理机构已经批准或者可以批准的或者美国药典或者其它普遍公认的药典中列出的可用于动物包括人。“药物可接受的载体、赋形剂或佐剂”是指可以与药物如本文所述抗体或抗体链一起施用给对象并且当以足以输送治疗量所述药物的剂量施用时不破坏其药理学活性及是无毒性的载体、赋形剂或佐剂。
如本文使用，术语“Fc”是指包含(N-至C-末端方向)免疫球蛋白CH2和CH3结构域的蛋白质。CH2和CH3结构域可以形成抗体或重链的至少一部分恒定区。
如本文使用，“恒定区”当针对本发明的抗体基因座(例如基因组的重链基因座)时是指一段DNA序列，其包含在基因座中与重组的VDJ序列体内组合的基因区段(恒定区基因区段)。所述VDJ与恒定区基因区段一起在从中可以产生抗体链(例如在RNA剪接后)的脊椎动物或细胞中产生(任选在高变后)RNA转录物，每个链包含一个可变结构域及一或多个恒定结构域。当“恒定区”用于描述抗体或抗体重链时，是指在可变结构域C末端及包含一或多个恒定结构域的区域。
如本文使用，“内源”是指所述恒定区等是在所述脊椎动物或细胞中正常发现的恒定区类型等(与外源恒定区相反，其序列在这种脊椎动物或细胞中通常未发现，如人序列)。例如，内源恒定区可以是由所述非人脊椎动物或细胞的野生型基因组编码的那些。因此，在其中所述脊椎动物是小鼠的一个实例中，内源恒定区是小鼠恒定区。进一步地，在一个实例中，内源区是与所述脊椎动物或细胞品系匹配的。因此，在一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞是小鼠129ES细胞，所述内源恒定区是小鼠129恒定区。在另一实施方案中，所述脊椎动物或细胞是JM8品系小鼠或小鼠细胞，内源恒定区是小鼠JM8恒定区。在另一实施方案中，所述脊椎动物或细胞是Black 6小鼠或小鼠细胞，内源恒定区是小鼠Black 6恒定区。
体内指导选择(Guided Selection in vivo)
参考Biotechnology,1994Sep；12(9):899-903,“Guiding the selection ofhuman antibodies from phage display repertoires to a single epitope of anantigen”；Jespers LSet al.。这篇文章揭示了体外指导选择可变结构域对的途径，其中可以将小鼠抗体结合位点(VH/VL配对)转变为保留抗原特异性的人VH/VL配对。这个技术未评定所得产物可变结构域配对是否良好适合体内系统和表达。本发明的如下方面解决了这个问题，通过提供体内指导选择实现可变结构域与另一可变结构域(或其它表位结合部分)的组合、成熟和表达。
在本发明各个方面中，提供了非人脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物或细胞的基因组的Ig重链或轻链基因座包含(5’至3’方向)：(i)未重排的人可变区，以编码第一可变结构域，(ii)编码任选的接头的序列，及(iii)表位结合部分(任选第二可变结构域的重排的序列)。所述表位结合部分或第二可变结构域核苷酸序列是预定的序列，例如编码已知抗体的结合位点的VH或VL结构域的序列，或者模拟的(种系)VH或VL序列。序列(i)和(iii)在Ig基因座中紧密在一起(例如直接相邻或仅由肽接头编码序列相隔，例如在蛋白质产物中不超过20、15、10或5个氨基酸的接头)，从而使得可以配对以在体内组合和选择。因此，例如在蛋白质产物中，在衍生自(i)和(iii)的产物之间无蛋白质结构域。相似地，在Ig基因座中，例如没有编码这种蛋白质结构域的序列。
在一个实施方案中，对于(iii)，希望使用已知抗体的结合位点的VH结构域序列，因为VH/VL配对中VH引起的结合通常是最强的，从而可用于在体内重排后指导由(i)编码的配偶体可变结构域的选择。在这个实施方案的一个实例中，(i)是未重排的人轻链可变区(κ或λ人可变区)以与衍生自(iii)的VH结构域配对。在另一实例中，(i)是未重排的人重链可变区或包含重链和轻链可变区基因区段的可变区(例如在WO2012018764中揭示)。
(i)的人可变区可以在体内重排及在用靶抗原表位免疫所述脊椎动物之后，发生亲和性成熟和选择。成功重排、成熟和表达可变结构域的可变区可以与由序列(iii)编码的产物组合，以提供V-任选的接头-E的组合(例如V-任选的接头-V)。技术人员能发现由这种组合提供的抗原结合位点，其可特异性结合希望的抗原(例如靶抗原或相关抗原)。这是有用的，因为本发明的这个方面使得已知序列(iii)及其产物可以指导由重排和成熟的序列(i)编码的合适的配偶体V结构域的选择。因此，所述脊椎动物用于提供潜在成熟的重排的序列的库集，其在体内的选择由衍生自序列(iii)的相邻的表位结合部分(例如V结构域)指导。组合的成功表达提供了对于潜在有用的药物和药物候选物的基于表达的V和E的配对的进一步选择标准。
对于(iii)使用已知抗体的V结构域序列是产生生物改良的药物所希望的，所述药物与已知抗体结合相同的靶，但是基于使用已知V结构域作为起始点的指导选择具有修饰的抗原结合位点。所述产物结合位点可具有一或多种特性，其优于由已知的原始抗体的结合位点展示的那些特性。例如，所述指导选择方法可用于发现V配对，其具有对靶抗原的一或多种更高的结合亲和性(例如在通过表面等离子体共振如BiacoreTM确定的结合率、解离率和/或KD方面更好)、新的靶特异性(例如另外的特异性，从而提供双特异性结合位点)、更好的药动学、更好的药效学、特异性结合靶抗原上的新表位的能力(即不是由原始结合位点特异性结合的表位)、更好的体内抗体清除、更好的体内抗体分布及对生物体(例如人患者或小鼠)更低的毒性。通过发现更高的亲和性结合位点，可以克隆通过所述指导选择方法选择的成对的V结构域并将所述V结构域序列插入标准重链和轻链载体中以表达联合形成结合位点的抗体重链和轻链。以此方式，可以重建特异性结合靶抗原的生物改良的抗体。
在一个实施方案中，用于免疫的靶抗原与已知抗体结合位点结合的抗原不同。这使用本发明提供了产生双特异性的V-任选的接头-V配对的可能性，其中所述配对能特异性结合靶抗原及其它抗原。在一个实施方案中，这两个抗原是结构相关的抗原(见例如WO2002/002773)。
在另一实施方案中，序列(iii)是种系人可变结构域序列，其编码模拟的V结构域。在这种情况中，所述模拟可以是完成支架功能，由此由重排的序列(i)编码的可变结构域在免疫后是抗体单一可变结构域(dAb)，即在不存在另一可变结构域时其能特异性结合靶抗原。这样提供了人抗体单一可变结构域(任选在Fc或由序列(iii)的Ig基因座3’编码的其它恒定区的背景中结合及选择)的有用来源。
在上述实例中，本发明的这个方面在Ig基因座用于基于进一步的表位结合部分(aka，结合分子，例如置换CH1的已知scFv)产生多特异性产物的背景中提供。在此方式中，本发明提供了N-末端V-任选的接头-E(例如V-任选的接头-V)与scFv或其它结合分子的组合。
在本发明该方面的其它实例中，在Ig基因座中不提供这种另外的表位结合部分序列，由此所述基因座的产物是N-末端V-任选的接头-E(例如V-任选的接头-V)，与恒定区(例如Fc)连接或者不与恒定区连接(例如其中IgM阶段后的裂解是使用如本文别处所述的基因座构建实现)。
在实施方案中，所述非人脊椎动物或细胞基因组包含Ig重链恒定区5’的序列(ii)和(iii)，例如小鼠或人恒定区，例如是所述脊椎动物或细胞内源的重链恒定区。在一个实例中，所述恒定区是γ(例如γ-1)恒定区。
在一个实例中，所述基因组包含在S-μ(3’)下游的序列(ii)和(iii)，例如μ恒定区下游。如上所述，序列(iii)被保护免于AID的作用。因此，这可用于提供基于已知序列(iii)产物的指导选择。在一个实例中，基因组包含序列(iii)代替γCH1基因(例如γ-1CH1)。以这种方式，所述恒定区没有CH1，可以产生仅重链的产物。在另一实施方案中，序列(i)-(ii)-(iii)提供在S-μ(5’)的上游，由此在IgM阶段产生V-任选的接头-E配对，然后在免疫之后获得类别转换为γ(或其它非-μ)同种型。这样可以通过AID使V/E配对成熟，从而提供成熟结合位点的有用的库集，其与输入序列(iii)部分相关。
在本发明的任何指导选择方面的实例中，第二个可变结构域是Vκ1-39/Jκ或Vκ3-20/JκVL结构域。这些结构域与VH结构域杂乱配对，因此是在指导选择方法中有用的配对配偶体用以产生V-V配对的库集，从中选择希望的抗原结合链。通过选择与共同的VL如这些之一的VL单独配对的两或更多个VH结构域，可以通过表达具有单一VL的不同VH而更简便地产生VH/VL结合位点的混合物。例如，一旦已经选择合适的VH结构域与共同VL配对，则可以将所述VH和VL结构域克隆进分别含有重链和轻链恒定区的标准重链和轻链载体中(例如重链CH1-CH3；或者分别Cκ或Cλ)，以产生表达不同VH结构域的两或更多个重链及产生含有所述VL结构域的单一轻链。通过混合或共表达这些链，可以产生均基于共同轻链的抗体混合物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含多个不同抗体的抗体组合物，其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链均包含由在本发明任何指导选择方法中选择的VH-VL配对编码的VH，任选其中在所述方法中第二个可变结构域是Vκ1-39/Jκ或Vκ3-20/JκVL结构域。在一个实例中，所述组合物的每个抗体均包含单一类型的VH/VL配对。这可以通过常规纯化技术分解希望的混合物而获得。见例如EP1523496、WO2004061104、WO2008145133、WO2011097603和WO2010151792。
在一个实施方案中，本发明的指导选择脊椎动物、细胞或方法的产物是表达的重链，其包含V-任选的接头-E(例如V-任选的接头-V)结合位点及没有CH1结构域的重链恒定区(例如Fc，例如CH2-CH3)(的3’)。在这个实施方案中，重链能二聚体化产生H2抗体(无轻链的仅重链抗体)，在其N末端携带配对的V-任选的接头-V结合位点。因此，在一个实施方案中，本发明提供了这种重链和这种H2抗体，其包含特异性结合靶抗原的V-任选的接头-V结合位点。根据本发明的进一步实施方案，这个方面可以在同种型转换为非-μ同种型之后组合关闭轻链表达，如本文进一步描述。
所述指导选择方面的应用在下文进一步描述以用于产生多价产物。
多价产物
本发明涉及多价(例如多特异性)抗体、抗体链和多肽，以及缺失轻链的仅重链抗体(H2抗体)。本发明进一步涉及在非人脊椎动物和非人脊椎动物细胞中在体内这些的选择、成熟和产生。为此，本发明还涉及这种非人脊椎动物和细胞。
因此，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列(例如S-μ，例如人或内源性S-μ)、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二转换序列(例如S-γ，例如人或内源性S-γ)及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；并且任选所述非-μ恒定区缺少CH1基因区段和/或铰链区核苷酸序列；及
其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座的可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分分别特异性结合第一和第二表位。
所述可变结构域衍生自重链基因座的可变区。因此，当所述基因座的可变区是重排的可变区时，所述可变结构域由任选具有体细胞高变的可变区(例如VHDJH或VLJL区)序列编码。当所述可变区是未重排的可变区时，这个区域包含一或多个V基因区段、一或多个J基因区段及任选包含一或多个D基因区段(例如其中所有这些区段均是人区段)。在重链基因座中基因区段重排之后，形成重排的VDJ或VJ，其编码任选在体细胞高变之后的可变结构域。
任选地，所述非-μ恒定区包含编码多个表位结合部分、例如通过任选的接头连接的两或三个表位结合部分的核苷酸序列。
任选地，所述非-μ恒定区包含编码一或多个(任选通过接头连接)表位结合部分代替CH1基因区段的核苷酸序列。
有利地，鉴于本发明，技术人员能选择希望的预定的表位结合部分，及有目的地在基因座中包括相应核苷酸序列以随后在体内与由脊椎动物产生的可变结构域的库集混合和匹配。成功的配对是例如在用靶抗原或表位免疫后可以表达和选择的那些。在这个意义上，选择首先是通过脊椎动物体内系统进行，因为表达同种型转换的重链(例如作为非-μ抗体的一部分)及其中所述链(或抗体)可特异性识别及结合靶的B细胞是由脊椎动物的免疫系统依照典型的免疫应答针对增殖和B细胞扩增而选择的。因此，是抗原特异性的及可以以多价形式表达的那些产物是天然选择的。此外，提供配对的结合特异性和效价的库集，其中一或多个特异性和效价是由预定的表位结合部分提供，及一或多个其它特异性或效价由在表位结合部分背景中已经在体内选择和成熟的可变结构域提供。以此方式，可以很好进行针对组合的天然选择(例如可表达为可检测水平及具有体内相容的生物物理学特性，这可用于随后的药物开发应用中)。技术人员根据希望的抗体特性如靶结合亲和性能进行从所述库集(例如从血清或脾细胞)中选择一或多个多价重链(或抗体)(例如使用熟知的表面等离子体共振技术)。因此，本发明使用全部体内组合方法在预定的进一步效价和特异性背景及因此在随后用于人或动物治疗或预防的最终药物形式的背景中选择和成熟可变结构域。这相对于产生多价产物的现有技术领域是具有明显进步的，现有技术依赖体外操纵、选择及随后需要进一步体外亲和性成熟。
此外，本发明人意识到在S-μ或μ恒定区下游提供已知表位结合部分核苷酸序列是有利的。本发明人考虑到在靶抗原或表位暴露后，在亲和性成熟期间所述表位结合部分序列的最小突变的需求。这样可有利地保留希望的表位结合特性(例如亲和性)及也可能保留所述部分的希望的生物物理特性。本发明人考虑到激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)的典型活性模式，这种酶负责在体细胞高变期间导入序列突变。参见图1，其是对并入本文参考的Mauel,R.W.&Gearhart,P.J.；“AID and somatic hypermutation”Advances inImmunology2010.105:159-191”加以调整的方案。本发明人认识到AID在S-μ转换中诱导体细胞高变及位于所述重链基因座(5’)上游。因此，本发明人决定在S-μ(3’)下游例如μ恒定区下游引用编码表位结合部分的核苷酸序列。本发明人认识到这样将有益于使保留表位结合部分完整序列的机会最大化，并因此提供结合特异性及这些元件在终产物中的性能的更好的可预测性。因此，技术人员能相对可预测地使用在现有体内或体外产生和选择方法中单独产生的任何表位结合部分(包含氨基酸序列)，并将此部分-已知其特性如表位结合特异性和/或亲和性-掺入根据本发明在体内产生的最终多价产物中。因此，本发明扩展了已知的希望的表位结合部分在产生多价和多特异性产物(抗体、链和多肽)中的应用。
此外，有利地，本发明人认识到可以将预定的表位结合部分的编码序列选择性定位，由此可以产生、成熟和选择同种型(类别)转换的产物(例如γ型抗体或重链)，而不连累IgM阶段的正常功能，这在早期B细胞区室和最初的可变区库集发育期间是非常重要的。为此，本发明人在某些构型中决定提供位于μ恒定区(3’)下游的表位结合部分编码序列。因此，根据一个实施方案，本发明人提供了在μ恒定区3’的一或多个非-μ恒定区中的这些编码序列。例如，一个(例如γ-1)或所有γ恒定区可包含一或多个表位结合部分核苷酸序列。以此方式，所有γ重链(及提供这些链的抗体)将携带可变结构域及一或多个表位结合部分。由于所述部分的编码序列是在这个位置，因此所得部分的蛋白质序列是未突变的(或者基本未突变的)且可以选择与上游可变结构域一起组合和表达。
在另一个实施方案中，在μ恒定区中提供编码一或多个表位结合部分的核苷酸序列。因此，这些序列在S-μ(其是AID活性的范围)的下游。在这个实施方案中，脊椎动物产生μ-同种型的多价(例如多特异性)重链(例如由抗体如H2抗体提供)，其包含一或多个表位结合部分，位于N-末端抗体可变结构域的下游。例如，在免疫之后，所述可变结构域在表位结合部分的背景中成熟。因此本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组均包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区及包含编码任选的接头及预订的表位结合部分的核苷酸序列的μ恒定区，其中脊椎动物表达多价多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座的可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分分别特异性结合第一和第二表位。任选地，所述μ恒定区没有CH1基因区段；这个实例可用于产生结合第一和第二表位的多价H2抗体。在另一实例中，所述μ恒定区包含CH1；这可用于产生结合第一和第二表位的4链(H2L2)多价抗体。任选地，所述μ恒定区没有铰链区核苷酸序列。
B细胞是淋巴细胞的一个实例。从中可以获得B细胞的样品包括但不限于血液、血清、脾、脾组织、骨髓、淋巴、淋巴结、胸腺和阑尾。例如，B细胞是幼B细胞和/或成熟B细胞。
在一个实施方案中，所述非-μ恒定区是γ恒定区(例如γ-1)。或者，所述非-μ恒定区是δ、α或ε恒定区。在一个实施方案中，基因组的重链基因座(或者全部重链基因座)的每个非-μ恒定区均是如上文(ii)所示。在一个实施方案中，基因组的重链基因座(或者全部重链基因座)的每个γ恒定区均是如上文(ii)所示。例如，基因组的重链基因座包含γ-1、γ-2a、γ-2b及任选地包含γ-4恒定区，其中每个这些恒定区均如上文(ii)所示。
在一个实施方案中，所述基因组对于所述重链基因座是纯合的。
任选地，或者所述μ恒定区不包含CH1基因区段。然而，在μ恒定区中包含CH1基因区段，可以在抗体库集和B细胞区室发育期间表达重链，其是4链(H2L2)IgM抗体。这种构建体的表面表达在早期B细胞发育期间可以是有利的，以提供良好的脾和骨髓B细胞区室。因此，可以提供有用的一抗库集，从中随后选择应答抗原的同种型转换的链(有或无CH1)。
在非-μ恒定区中省略CH1基因区段对于产生和选择无轻链配对的重链是有用的，例如当产生H2抗体时所见。在缺失轻链配对的条件下，选择由上述基因座表达的非-μ型重链的可变结构域并使其无可变结构域配偶体成熟(例如在重链的可变结构域是VH的情况中，这些是在无VH/VL对的条件下产生、亲和性成熟和选择的，因此所述VH是抗体单一可变结构域(也已知为dAb或者结构域抗体)。H2抗体和dAb的用途和优势为本领域熟知，如在例如本文提及的Harbour Antibodies and Crescendo Biologics专利申请及以DomantisLimited and Ablynx名称提请的专利申请中描述。任选地，当非-μ型链表达时，不发生轻链表达。这样提供了产生H2抗体和重链的上述优势。
所述可变区可以是未重排的，即重链基因座的可变区包含一或多个VH基因区段、一或多个D基因区段及一或多个JH基因区段(例如多个人VH基因区段，一或多个人D基因区段及一或多个人JH基因区段)。所述基因区段能重排形成重排的可变区(VDJ，例如人VDJ)，其可以与恒定区序列组合。因此，在可变区重排后，重链可编码包含编码抗体重链可变结构域和恒定区的核苷酸序列的RNA。
或者，重链基因座的可变区是重排的(即VDJ核苷酸序列)。
为了获得从μ转换为非-μ同种型，所述基因座包含μ恒定区5’的一个转换序列(例如保留内源性S-μ)及非-μ恒定区5’(或每端)的第二个转换序列。第二个转换序列可以是通常与恒定区存在的转换序列(例如当所述恒定区是γ-1恒定区时，保留γ-1转换序列)。转换序列为本领域已知，例如见Nikaido et al,Nature 292:845-848(1981)及也见于WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009/076464和US6586251所述，例如在US7501552中揭示的SEQ ID NO:9-24。商业的人和小鼠BAC文库(例如RPC-11及CaltechA、B、C和D文库)是合适的免疫球蛋白基因座序列例如转换序列或恒定区序列的来源。或者，人DNA样品可以从自愿供者中重新获得(例如使用面颊拭子)，从所述样品获得DNA序列。
在本发明的任何构型中，提供了多价抗体、抗体链或多肽。在抗体链的背景中的“多价”是指所述链包含两或更多个效价(即表位或抗原结合位点)。例如，本发明的重链可包含第一和第二表位结合位点(无其它表位结合位点)，由此所述链是二价的。这与在现有技术领域中在体内产生的抗体链不同，现有抗体链由于N-末端可变结构域(例如其与配偶体轻链上的V结构域配对形成VH/VL表位结合位点)而是单价的。在抗体背景中的“多价”是指当所述抗体是H2抗体时，其包含两或更多个效价(即表位或抗原结合位点)，或者当所述抗体是4链(H2L2)抗体时包含三或更多个效价。这种抗体的相应表位结合片段(例如Fab)与现有技术领域中的等价抗体片段相比包含更多的表位结合位点。例如，本发明的Fab样结构可具有两个表位结合位点，而常规的Fab具有一个结合位点(由VH/VL对提供)。当本发明的多肽包含两或更多个表位或抗原结合位点时，其是多价的。
除了是多价的之外，本发明的抗体、链或多肽是任选多特异性的(例如双特异性)。这是指所述抗体、链或多肽特异性结合两或更多个不同表位或抗原(同时或非同时结合)。所述表位可例如由不同抗原或者由相同抗原物种提供(这有利于提供与靶抗原结合的亲合力)。结合可以使用标准体外技术评定，例如竞争表面等离子体共振(例如BiacoreTM或Proteon)或者竞争ELISA。与给予了药物(例如本发明的抗体、链或多肽或其衍生物)的患者中的不同表位结合可用于在人和动物中处理许多疾病或病症。
或者，所述抗体、链或多肽是多价和多特异性的，即包含特异性结合相同表位物种的多个表位结合位点(例如同时结合相同表位的拷贝，例如在一个抗原上，这可用于提供结合亲合力)。
所述抗原是例如在EP1697421(Micromet AG)、WO2007024715(AbbottLaboratories)或WO2010136485(Glaxo Group Limited)中揭示的任何抗原，所述文献并入本文作参考。例如，本发明可涉及具体在如下文献中论述的一或多种抗原和抗原类别：WO2007024715第6页第14行至第8页第23行；第16页第15行至第18页第26行；第24页第9-26行；第52页第5-22行；以及第55页第10行至第66页第23行，用于或不用于引用的一或多个医学指征中。这些抗原实例特别并入本文，就如作为本发明可能的抗原而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。例如，本发明可涉及在WO2010136485中具体论述的一或多种抗原和抗原类别，包括但不限于VEGF、TNFα、EGFR、VEGFR2、IL-13和HER2，用于或不用于引用的一或多个医学指征中。这些抗原实例特别并入本文，就如作为本发明可能的抗原而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。用于本发明中的合适表位的例子是由一或多个这些抗原提供的表位。
例如，在本发明的任何构型中，所述或每个抗原选自如下一组：ABCF1；ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、聚集蛋白聚糖、AGR2、AICDA、AWl、AIG1、AKAP1、AKAP2、AIYIH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、AZGP1(锌-α-糖蛋白)、B7.1、B7.2、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、B1yS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDF1O)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、Cl9orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(I-309)、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin))、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL2O(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2I嗜酸细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CD1C、CD2O、CD200、CD-22、CD24、CD28、CD3、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD4O、CD4OL、CD44、CD45RB、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD8O、CD81、CD83、CD86、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p2lWap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKNIC、CDKN2A(p16lNK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、壳多糖酶、CHST10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(claudin-7)、CLN3、CLU(凝集素)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL18A1、COL1A1、COL4A3、COL6A1、CR2、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYDi)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78I LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTRISTRL33I Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNAI、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、ENO1、ENO2、ENO3、EPHB4、EPO、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF1O、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF2O、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FOS、FOSL1(FRA-l)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-65T、GATA3、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR1O)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG8O)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(钙结合微丝蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、EDAC5、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIF1A、HIP1、组胺及组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、1D2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNγ、TFNW1、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL-12、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、1L13、IL13RA1、IL13RA2、1L14、1L15、IL15RA、IL16、1L17、IL17B、IL17C、IL17R、1L18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、1L19、IL1A、IL1B、IL1F1O、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1HY1、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1；IL1RL2IL1RN、1L2、1L20、IL2ORA、IL21R、1L22、1L22R、1L22RA2、1L23、1L24、1L25、1L26、1L27、1L28A、1L28B、1L29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、1L3、1L30、IL3RA、1L4、IL4R、1L5、IL5RA、1L6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、1L7、TL7R、1L8、IL8RA、IL8RB、IL8RB、1L9、IL9R、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、1TGA3、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b 4整联蛋白)、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAI1、KDR、MTLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦素)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIB1、midkine、MIF、MIP-2、MK167(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(metallothionectin-ifi)、MTSS 1、MUC 1(粘蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经蛋白聚糖、NFKB 1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOX5、NPPB、NROB1、NROB2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZ1、OPRD1、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PDGFA、PDGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸聚糖、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(p2lRac2)、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNF11O(ZNF144)、ROBO2、S100A2、SCGB1D2(lipophilin B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞激活细胞因子)、SDF2、SERPINA1、SERPINIA3、SERPINB5(maspin)、SERPINE1(PAT-i)、SERPINF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spri)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-i)、T]MP3、组织因子、TLR1O、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(0X40配体)、TNFSF5(CD4O配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD3O配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶lia)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、XCL1(淋巴细胞趋化蛋白)、XCL2(SCM-lb)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、YY1及ZFPM2。用于本发明中的合适表位的例子是由一或多种这些抗原提供的表位。
例如，在本发明的任何构型中，第一和第二表位或抗原选自如下一组：EpCAM和CD3、CD19和CD3、VEGF和VEGFR2、VEGF和EGFR、CD138和CD2O、CD138和CD4O、CD2O和CD3、CD38和CD138、CD38和CD2O、CD38和CD4O、CD4O和CD2O、CD19和CD2O、CD-8和IL-6、PDL-1和CTLA-4、CTLA-4和BTNO2、CSPG和RGM A、IGF1和IGF2、IGF1和/或2和Erb2B、IL-12和IL-18、IL-12和TWEAK、IL-13和ADAM8、IL-13和CL25、IL-13和IL-1β、IL-13和IL-25、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-9、IL-13和LHR激动剂、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-13和PED2、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和TARC、IL-13和TGF-β、IL-1α和IL-1β、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和IL-12、TNFα和IL-12p40、TNFα和IL-13、TNFα和IL-15、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-1beta、TNFα和IL-23、TNFα和MIF、TNFα和PEG2、TNFα和PGE4、TNFα和VEGF、及VEGFR和EGFR、TNFα和RANK配体、TNFα和Blys、TNFα和GP130、TNFα和CD-22、及TNFα和CTLA-4。
例如，在本发明的任何构型中，第一表位或抗原选自如下一组：CD3、CD16、CD32、CD64及CD89；第二表位或抗原选自如下一组：EGFR、VEGF、IGF-1R、Her2、c-Met(也已知为HGF)、HER3、CEA、CD33、CD79a、CD19、PSA、EpCAM、CD66、CD30、HAS、PSMA、GD2、ANG2、IL-4、IL-13、VEGFR2和VEGFR3。
预期本发明的抗体、链或多肽的应用是在EP1697421(Micromet AG)、WO2007024715(Abbott Laboratories)或WO2010136485(Glaxo Group Limited)中揭示的任何应用，所述文献并入本文作参考。例如，本发明可涉及一或多项应用，具体在WO2007024715的第11页第24行至第15页第14行、第51页第6行至第66页第23行、第76页第1行至第79页第29行及第84页第1行至第90页第2行中论述。这些应用实例特别并入本文，就如作为本发明可能的应用而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。例如，本发明可涉及在WO2010136485中具体论述的一或多项应用，包括但不限于在第12页第33行至第13页第7行和第15页第16-32行中揭示的那些应用。这些应用实例特别并入本文，就如作为本发明可能的抗原而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。例如，本发明可涉及在EP1697421中特别论述的一或多项应用，包括但不限于在第6页第31-33行揭示的那些应用。这些应用实例特别并入本文，就如作为本发明可能的抗原而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。
预期本发明的抗体、链或多肽的应用或者包含其的组合物是与如在EP1697421(Micromet AG)、WO2007024715(Abbott Laboratories)或WO2010136485(Glaxo GroupLimited)中揭示的第二种物质组合的任何应用或组合物，所述文献并入本文作参考。例如，本发明可涉及本发明的抗体、链或多肽与在WO2007024715中第11页第7-23行、第15页第15-32行及第79页第30行至第90页第2行中具体论述的一或多种另外的药物可接受的物质的组合。这些应用、组合和组合物的实例特别并入本文，就如作为本发明可能的应用、组合和组合物而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中，除了本发明的抗体、链或多肽代替这些现有技术领域揭示的抗体、链或多肽而使用。
期望包含本发明抗体、链或多肽的组合物具有在EP1697421(Micromet AG)、WO2007024715(Abbott Laboratories)或WO2010136485(Glaxo Group Limited)中揭示的任何组合物成分的一般混合物，所述文献并入本文作参考，除了本发明的抗体、链或多肽代替现有技术领域文献中揭示的抗体、链或多肽而使用。例如，本发明可涉及在WO2007024715在第66页第25行至第75页第23行及第90页第2-26行中具体论述的药物组合物中的发明的抗体、链或多肽。这些组合实例特别并入本文，就如作为本发明可能的组合物而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中，除了本发明的抗体、链或多肽代替现有技术领域文献中揭示的抗体、链或多肽而使用。
预期本发明的组合物、抗体、链或多肽如EP1697421(Micromet AG)、WO2007024715(Abbott Laboratories)或WO2010136485(Glaxo Group Limited)中所述施用或可施用，所述文献并入本文作参考，除了本发明的抗体、链或多肽代替现有技术领域文献中揭示的抗体、链或多肽而使用。例如，本发明可涉及施用本发明的抗体、链或多肽(或者为此目的的药物组合物)按照在WO2007024715在第69页第29行至第75页第23行及第90页第3-33行中具体论述的施用方式施用。这些组合物实例特别并入本文，就如作为本发明可能的组合物及施用途径和方案而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中，除了本发明的抗体、链或多肽代替现有技术领域文献中揭示的抗体、链或多肽而使用。
每个接头(当存在时)均是本发明的抗体、链或多肽中的氨基酸序列。在基因组的基因座中，所述基因座包含编码每个接头的相应核苷酸序列。
对于用于本发明中，期望一个、多个或每个接头均如EP1697421(Micromet AG)、WO2007024715(Abbott Laboratories)或WO2010136485(Glaxo Group Limited)中所揭示，所述文献并入本文作参考。例如，本发明可使用在WO2007024715第4页第25行至第6页第13行、第24页第27行至第25页第2行、第44页第11行至第45页第3行中具体论述的接头。这些接头实例特别并入本文，就如作为本发明可能的接头应用而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。例如，本发明可使用在WO2010136485第10页第27行至第12页第28行及第14页第6-14行中具体论述的接头，或者WO2010136485的SEQ ID NO:10-38所示接头。这些接头实例特别并入本文，就如作为本发明可能的接头应用而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中。
例如在本发明的任何构型中，一或多个或者每个接头是(GGGGS)n接头，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
例如在本发明的任何构型中，一个、多个或每个接头是选自如下的接头：AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLBEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、AKTTPKLEEGEFSEARV、SAKTTP、SAKTTPKLGG、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、RADAAAA(G4S)4、SAKTTP、SAKTTPKLGG、SAKTTPKLEBGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GGGGSGGGGSGGGGS、GBNKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKEAKVS及GHEAAAVMQVQYPAS。
例如在本发明的任何构型中，一个、多个或每个接头是一个氨基酸序列，长度为1-150个氨基酸，或者1-140个氨基酸，例如1-130个氨基酸，或者1-120个氨基酸，活着1-80个氨基酸，或者1-50个氨基酸，活着1-20个氨基酸，或者1-10个氨基酸，或者5-18个氨基酸。这种序列可具有其自己的三级结构，例如本发明的接头可以是或包含一个结构域，例如抗体单一可变结构域。在一个实施方案中，接头的大小等于单一可变结构域。合适的接头的大小可以是1-20埃，例如小于15埃或者小于10埃，或者小于5埃。
在本发明的一个实施方案中，接头包含1-150个氨基酸，例如1-50个氨基酸，例如1-20个氨基酸，例如1-10个氨基酸。这种接头可以选自WO2010136485中SEQ ID NO:10-38或SEQ ID NO:42-44所示任一序列(所述文献特别并入本文作参考，就如作为本发明可能的接头应用而特别及明确地揭示及可能包含于本文的一或多项权利要求中)，或者是多个这样的接头。
接头可单独或者在其它接头之外包含一或多组GS残基，例如GSTVAAPS或TVAAPSGS或GSTVAAPSGS。
一个举例的接头是(PAS)n(GS)m。在另一实施方案中，接头是(GGGGS)n(GS)m。在另一实施方案中，接头是(TVAAPS)n(GS)m。在另一实施方案中，接头是(GS)m(TVAAPSGS)n。在另一实施方案中，接头是(PAVPPP)n(GS)m。在另一实施方案中，接头是(TVSDVP)n(GS)m。在另一实施方案中，接头是(TGLDSP)n(GS)m。在所有这种实施方案中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，及m＝0、1、2、3或4。
这种接头例如包括(PAS)n(GS)m，其中n＝1及m＝1；(PAS)n(GS)m，其中n＝2及m＝1；(PAS)n(GS)m，其中n＝3及m＝1；(PAS)n(GS)m，其中n＝4及m＝1；(PAS)n(GS)m，其中n＝2及m＝0；(PAS)n(GS)m，其中n＝3及m＝0；(PAS)n(GS)m，其中n＝4及m＝0。
这种接头例如包括(GGGGS)n(GS)m，其中n＝1及m＝1；(GGGGS)n(GS)m，其中n＝2及m＝1；(GGGGS)n(GS)m其中n＝3及m＝1；(GGGGS)n(GS)m，其中n＝4及m＝1；(GGGGS)n(GS)m，其中n＝2及m＝0；(GGGGS)n(GS)m，其中n＝3及m＝0；(GGGGS)n(GS)m其中n＝4及m＝0。
这种接头例如包括(TVAAPS)n(GS)m，其中n＝1及m＝1；(TVAAPS)n(GS)m，其中n＝2及m＝1；(TVAAPS)n(GS)m，其中n＝3及m＝1；(TVAAPS)n(GS)m，其中n＝4及m＝1；(TVAAPS)n(GS)m，其中n＝2及m＝0；(TVAAPS)n(GS)m，其中n＝3及m＝0；(TVAAPS)n(GS)m其中n＝4及m＝0。
这种接头例如包括(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝1及m＝1；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝2及m＝1；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝3及m＝1；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝4及m＝1；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝5及m＝1；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝6及m＝1；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝1及m＝0；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝2及m＝10；(GS)m(TVAAPSGS)n，其中n＝3及m＝0或者(GS)m其中m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
这种接头例如包括(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝1及m＝1；(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝2及m＝1；(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝3及m＝1；(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝4及m＝1；(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝2及m＝0；(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝3及m＝0或者(PAVPPP)n(GS)m，其中n＝4及m＝0。
这种接头例如包括(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝1及m＝1；(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝2及m＝1；(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝3及m＝1；(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝4及m＝1；(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝2及m＝0；(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝3及m＝0；(TVSDVP)n(GS)m，其中n＝4及m＝0。
这种接头例如包括(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝1及m＝1；(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝2及m＝1；(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝3及m＝1；(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝4及m＝1；(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝2及m＝0；(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝3及m＝0；或(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝4及m＝0。
在另一实施方案中，在表位结合部分与可变结构域之间无接头(因此所述基因座不包含相应的编码接头的核苷酸序列)。在另一实施方案中，所述表位结合部分与可变结构域通过接头TVAAPS连接。在另一实施方案中，所述表位结合部分通过接头TVAAPSGS与可变结构域连接。在另一实施方案中，所述表位结合部分通过接头GS与可变结构域连接。在另一实施方案中，所述表位结合部分通过接头ASTKGPT与可变结构域连接。
在一个实施方案中，本发明的脊椎动物或细胞包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列(例如S-μ转换序列，例如内源性S-μ)、内源性μ恒定区、第二转换序列(S-γ转换序列；例如内源性S-γ)及所述非-μ同种型的人恒定区；其中所述重链基因座能经历从IgM转换为非-μ同种型。因此，例如这可以通过在非人脊椎动物或细胞(例如ES细胞)基因组的内源性μ区域(3’)下游插入一或多个人非-μ恒定区序列而提供。以此方式，人序列被提供在内源重链基因座的位置，及从所述人序列中表达可以使用内源性抗体和B细胞机制而有效控制。
在本发明中，所述或每个基因座的可变区任选是人可变区。例如，所述可变区是人重排的VDJ或VJ。例如，所述可变区是未重排的，包含多个人V基因区段、一或多个人J基因区段及任选包含一或多个人D基因区段(例如多个人VH基因区段、一或多个人JH基因区段及一或多个人D基因区段)。期望所述可变区可编码重链或轻链可变结构域(VH、VHH或VL)。所述可变区可以是在本文引用的Kymab Limited、Regeneron、Harbour Antibodies、CrescendoBiologics或Ablexis专利申请中揭示的任何可变区，这些可变区组合物的揭示(如包含其中的基因区段的库集)并入本文作参考，就如在本文明确写出及可能包含于本发明的一或多项权利要求中。
在本发明中，所述或每个基因座的μ恒定区任选是非人脊椎动物μ恒定区，例如如所述脊椎动物本身相同的物种或品系的。例如，所述μ恒定区是小鼠恒定区。
在本发明中，所述或每个基因座的μ恒定区任选是内源的宿主μ恒定区。以此方式，所述恒定区(及IgM阶段)对于良好的B细胞区室和最初的库集发育是宿主匹配的。
在本发明中，所述或每个基因座的所述或每个非-μ恒定区任选是非人脊椎动物恒定区，例如与所述脊椎动物本身相同的物种或品系的恒定区。例如，所述或每个非-μ恒定区是小鼠恒定区。
在本发明中，所述或每个基因座的所述或每个非-μ恒定区任选是内源宿主恒定区。以此方式，所述恒定区对于良好的B细胞区室和抗体/链发生是宿主匹配的。
在一个实施方案中，所述脊椎动物物种选自人、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、鸡、鱼、鸟、爬行动物、骆驼、牛、黑猩猩、非人灵长目动物和灵长目动物。
在一个实施方案中，所述脊椎动物是小鼠。在一个实施方案中，所述脊椎动物是大鼠。
本发明还提供了非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，所述细胞包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列(例如S-μ转换序列，例如内源S-μ)、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二转换序列(例如S-γ转换序列，例如内源S-γ)及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及
其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，以表达多价(例如多特异性，如双特异性)多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分分别特异性结合第一和第二表位(例如其中所述表位是不同的)。
任选地，所述γ恒定区缺少CH1基因区段，如上文所述。
本文关于脊椎动物所述任选的特性也适用于本发明的细胞。
在一个实例中，所述细胞是B细胞、杂交瘤、ES细胞或iPS细胞。ES细胞和iPS细胞(诱导的多能干细胞)可用于产生相应的非人脊椎动物(本发明的脊椎动物)。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述基因组包含功能性抗体轻链基因座以表达轻链；其中所述细胞可表达包含IgM型重链和轻链的IgM抗体，每个重链均包含CH1结构域。任选地，所述轻链基因座包含人重排或未重排的可变区。
任选地，所述轻链基因座包含关闭轻链表达的构件，其中功能性轻链在IgM至非-μ同种型转换后不表达。举例的合适构件在下文描述。任选地，所述非-μγ恒定区也不包含CH1基因区段。因此，没有CH1结构域的非-μ重链可由所述脊椎动物或细胞在不存在轻链时表达；这可用于产生H2多价抗体。
在一个实施方案中，所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)：(a)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域(任选在体细胞高变之后)、任选的接头、表位结合部分及非-μ(例如γ)恒定区(例如γFc)，或者(b)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域(任选在体细胞高变之后)、非-μ(例如γ)恒定结构域(例如γFc)、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。在一个实例中，所述多肽链具有结构V-L-E或V-L-E-L，其中V是衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域(VH、VHH或VL)，L是任选的接头及E是表位结合结构域。可能的结构是V-L-E-Fc或V-L-E-L-Fc，其中Fc是抗体Fc区(例如γFc)。
在一个实施方案中，所述或每个表位结合部分是表位结合结构域。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述非-μ恒定区是γ恒定区，所述重链基因座能经历同种型转换以产生IgG抗体，所述抗体在不存在轻链时包含一或多个IgG重链，每个重链均没有CH1结构域。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，提供了一种非人(例如大鼠或小鼠)脊椎动物或细胞，其表达包含结构V-L-E或V-L-E-L(例如V-L-E-Fc或V-L-E-L-Fc)的多价重链(或其二聚体)，其中V是抗体可变结构域(VH、VHH或VL)，L是任选的接头及E是表位结合部分，其中V和E特异性结合各自的第一和第二抗原，其中所述抗原是不同的。
重排的非-MU(例如γ)基因座
本发明还涉及非人脊椎动物和细胞，其具有非-μ同种型如γ同种型恒定区，无μ恒定区，以产生非-μ重链(任选由非-μ抗体提供)。本发明还涉及经历同种型转换为非-μ同种型如γ同种型的非人脊椎动物和细胞，以产生非-μ重链(任选有非-μ抗体提供)。为此，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含抗体重链基因座，所述重链基因座包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ(例如γ)恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多价(例如二价，如双特异性)多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(例如其中所述表位是不同的)。
本发明还提供了非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或者杂交瘤，所述细胞基因组包含抗体重链基因座，所述重链基因座包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ(例如γ)恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述细胞表达多价多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
在包含μ恒定区的脊椎动物和细胞背景下上述的任选特征也适用于这些脊椎动物和细胞的同种型转换的实施方案。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，重链基因座经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，提供所述接头和/或表位结合部分核苷酸序列代替非-μ(例如γ)恒定区中CH1结构域基因区段。因此，产物包含或者由结构V-L-E(例如V-L-E-CH2-CH3，其中恒定结构域是γ型恒定结构域)组成。
多价产物的L链基因座
本发明相似地提供了轻链基因座以表达多价(例如多特异性，如双特异性)轻链。为此，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞的基因组包含抗体轻链基因座(例如κ或λ基因座)，所述轻链基因座包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区和第二个区域：
其中
所述第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域(任选在突变之后，例如体细胞高变之后)、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(例如其中所述表位是不同的)。
所述可变结构域衍生自轻链基因座可变区。因此，当所述基因座的可变区是重排的可变区时，所述可变结构域由任选具有体细胞高变的可变区(例如VHDJH或VLJL区)序列编码。当所述可变区是未重排的可变区时，这个区域包含一或多个V基因区段、一或多个J基因区段及任选包含一或多个D基因区段(例如其中所有这些阶段均是人基因区段)。在轻链基因座中的基因区段重排之后，形成重排的VDJ或VJ，其编码任选在体细胞高变之后的可变结构域。
任选地，第二个区域包含编码多个表位结合部分、例如通过任选的接头连接的两或三个表位结合部分的核苷酸序列。
任选地，第二个区域包含编码一或多个表位结合部分(任选通过接头连接)的核苷酸序列，代替CL基因区段或者另外添加。例如，第二个区域包含(5’至3’方向)的核苷酸序列编码任选的接头、预定的表位结合部分和CL；或者CL、任选的接头和预定的表位结合部分；或者任选的接头和预定的表位结合部分(不存在CL)。
例如，所述多肽链均包含衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分和CL结构域；或者衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、CL结构域、任选的接头和表位结合部分；或者衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分。
本文关于包含本发明轻链基因座的非人脊椎动物描述的特征也适用于包含本发明轻链基因座的细胞。本发明因此提供了：
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或杂交瘤，其中所述细胞基因组包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排的或未重排的可变区和第二个区域；
其中
第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，以表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
在一个实例中，提供了包含如本文所述本发明的重链和轻链的非人脊椎动物和细胞。因此，所述脊椎动物能表达多价重链及多价轻链，例如由多价抗体提供。例如，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的、四特异性的、五特异性的、六特异性的或七特异性的或者具有七个以上特异性。例如，所述抗体可具有3、4、5、6、7、8或更多个效价。效价和特异性是指特异性表位或抗原结合。
在一个实例中，提供了包含本发明的重链和轻链的非人脊椎动物或细胞。任选地，所述脊椎动物或细胞基因组包含所述重链和轻链基因座，其中衍生自重链基因座的所述多肽链可变结构域与衍生自轻链基因座的多肽链可变结构域形成结合位点，其中所述结合位点特异性结合第一表位。例如，衍生自重链和轻链基因座的多肽链的表位结合部分是抗体可变结构域，其中衍生自重链基因座的所述链的表位结合结构域与衍生自轻链基因座的所述链的表位结合结构域结合，形成特异性结合第二表位的结合位点。在一个实施方案中，衍生自重链基因座的链中的表位结合部分是VH结构域；衍生自轻链基因座的链中的表位结合部分是VL结构域。在另一实施方案中，衍生自重链基因座的链中的表位结合部分是VL结构域；衍生自轻链基因座的链中的表位结合部分是VH结构域。重链和轻链之间的VH和VL结构域任选形成VH/VL对，每个VH/VL提供表位结合位点。当例如在重排和体细胞高变之后，链衍生自基因座，所述基因座编码RNA，所述RNA随之编码所述链。这可以发生在例如用第一表位免疫所述脊椎动物之后(即由产物链中N-末端可变结构域特异性结合的表位)。
在一个实例中，本发明的脊椎动物或细胞对于本文所述重链和/或本文所述轻链是纯合的。
方法
本发明还提供了体内产生、成熟和选择特异性结合第一和第二表位的多价抗体、抗体链和多肽的方法。为此，本发明提供了：
一种产生多价(例如二价，例如双特异性)多肽链的方法，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(例如其中所述表位是不同或相同的)，所述方法包括：
(a)在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中幼B细胞(例如T1和T2B细胞，例如脾B-细胞)中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座中表达的重链和轻链；
(b)用携带第一表位的第一个预定抗原免疫所述脊椎动物，获得同种型转换以表达至少一些重链基因座中的非-μ(例如γ)恒定区及表达已经经历体细胞高变的可变区(例如由IgG抗体重链提供的可变区)；及
(c)通过选择结合所述第一表位的可变区从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链(例如通过选择所述非-μ同种型的重链)，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
其中所述方法包括
(d)在所述脊椎动物基因组中重链基因座的非-μ恒定区中提供表位结合部分(或者特异性结合第二表位的其预定亲本)的核苷酸序列，其中在步骤(c)中选择的多肽链结合第一和第二表位。
任选在(a)中，所述重链包含CH1结构域。
本文关于脊椎动物和细胞描述的任选特征也适用于本发明方法。
例如在本发明的任何方法中，表位由不同的第一个和第二个抗原提供，因此产物是多特异性的(例如双特异性的，其中产物是二价的)。
在脾中，基于细胞表面标记IgM和IgD的水平，B细胞被鉴定为不成熟的(T1和T2)及成熟的(M)。T1细胞具有高IgM及低IgD。T2细胞具有中等水平的这二者。M细胞具有低IgM但具有高IgD(图2)。也见J Exp Med.1991May 1；173(5):1213-25；“Resolution andcharacterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bonemarrow”；Hardy RR et al and J Exp Med.1999Jul 5；190(1):75-89；“B celldevelopment in the spleen takes place in discrete steps and is determined bythe quality of B cell receptor-derived signals”；Loder F et al。
例如，在步骤(c)中，链的选择是从血清、血液、脾组织、淋巴结组织或者次级淋巴器官组织中选择。例如，所述链是B细胞分泌的链。
任选地，在本发明的任何方法中，所述多肽链包含一或多个重链恒定结构域，在此意义上，所述链可被认为是重链。在另一实施方案中，所述链是不包含恒定结构域的链，例如其中所述链由如本文所述V-L-E多肽组成。
可以通过任何标准基因组操纵技术进行步骤(d)，这为本领域技术人员显而易见。例如，使用ES细胞技术及后代生物体的随后世代。
在一个实例中，步骤(b)中每个体细胞突变的可变区是由没有CH1结构域的非-μ-型(例如IgG-型)重链提供的。这可用于产生仅重链(H2)抗体，特别是当轻链表达失活时。因此，例如步骤(b)包括在不存在轻链表达时表达体细胞突变的可变区。
本发明进一步提供了一种在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中产生多价(例如二价，如双特异性)多肽链的方法，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(例如其中所述表位是不同或相同的)，所述方法包括：
(a)用携带第一表位的第一个预定抗原免疫所述脊椎动物，获得同种型转换以表达脊椎动物的至少一些重链基因座中非-μ(例如γ)恒定区及表达经历体细胞高变的可变区(例如由IgG抗体重链提供)；及
(b)通过选择结合所述第一表位的可变区而从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链均包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
其中
(d)在所述脊椎动物基因组中重链基因座的非-μ恒定区中提供表位结合部分(或特异性结合第二表位的预定的亲本)的核苷酸序列(例如使用ES细胞技术进行)，其中在步骤(b)中选择的多肽链结合第一和第二表位。
在一个实例中，在步骤(a)中的每个体细胞突变的可变区由缺少CH1结构域的非-μ-型(例如IgG-型)重链提供。任选地，步骤(a)包括在不存在轻链表达时表达体细胞突变的可变区。
任选地，在本发明的任何方法中，所述脊椎动物是本发明的任何构型、方面、实施方案或实例所述的脊椎动物。
任选地，本发明的方法进一步包括分离或合成包含编码在所述方法中选择的多肽链的核苷酸序列的核酸；及任选人源化所述序列(例如用一或多个(或相应)人抗体恒定结构域置换非人抗体恒定结构域)。
本发明还提供了通过本发明的方法获得的多价(例如多特异性，如双特异性)多肽链或其衍生物，其特异性结合第一和第二表位。举例的衍生物(例如缀合物或晶体或糖基化形式)在WO2007024715的第9页第22行至第10页第4行、第10页第25行至第11页第6行及第47页第26行至第50页第23行揭示。这些实例特别并入本文，就如作为本发明可能的衍生物而具体及明确地揭示并可能包含于本文的一或多项权利要求中，除了本发明的抗体、链或多肽代替这些现有技术领域文献中揭示的抗体、链或多肽而使用。
产物
本发明提供了如下多价产物：
多价(例如多特异性，如双特异性)多肽链，其具有或由(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C组成，其中：
(i)V是特异性结合第一表位的抗体可变结构域，
(ii)X是不存在、是抗体铰链区或者包含恒定结构域的抗体恒定区(例如γ-型CH1，人γ恒定结构域，抗体铰链区-CH结构域；或者CH结构域-抗体铰链区)，
(iii)每个L均是任选的接头，
(iv)E是特异性结合第二表位的表位结合部分，及
(v)C是不存在或者包含一或多个(例如1、2、3或4个)恒定结构域的抗体恒定区(例如C是人γFc或者γCH1-铰链区-CH2-CH3)，
其中V是重排的抗体可变结构域，衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码表位结合部分(或者共有相同表位结合特异性的其亲本)的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID-模式体细胞高变。
这意味着在预定的表位结合结构域背景中，B细胞已经进行体细胞高变及选择重排的可变结构域。这优于现有方法，其中结合部分是单独选择的(例如在体外在单独的噬菌体展示实验中)及然后组合形成双特异性多肽。在现有技术领域中，提供了双特异性考虑，但是未构建具有良好的生物物理学特性及与体内动物系统表达相容的良好多肽。
因此，在小鼠中产生可变结构域的情况中，每个重排的可变结构域包含由小鼠AID导致的体细胞高变。已知AID的突变热点(见Mauel,R.W.&Gearhart,P.J.；“AID andsomatic hypermutation”Advances in Immunology2010.105:159-191”)，因此技术人员能容易地鉴别对于内源性AID在这种热点的一或多个突变(例如通过与在不存在任何突变的条件下产生的预测的氨基酸序列对比)。
在一个实例中，V是衍生自具有DH的人VH和JH的重排的抗体可变结构域。在另一实例中，V是衍生自人VL和JL重排的VL结构域(例如Vκ和Jκ或者Vλ和Jλ)。
在一个实施方案中，除了E之外，在V与C之间提供多个(例如1、2或3个)进一步的表位结合部分，每个进一步的表位结合部分均具有对各自表位的结合特异性。在一个实例中，所述表位结合部分具有不同的表位特异性。在另一实例中，其共有对于第二表位的特异性。例如，所述链具有或由结构V-X-L-E-L-E″L-C组成(N-至C-末端方向)，其中E″是进一步的表位结合结构域，例如对与第一和第二表位不同的第三表位具有结合特异性。
所述抗体铰链区可来自任何物种，例如小鼠铰链区、大鼠铰链区、人铰链区或骆驼铰链区。
举例的本发明的多肽从N-末端至C-末端如下文所示：
(i)V-dAb-人Fc(任选为二聚体)，其中V是VH、VHH或VL，及dAb是VH、VHH或VL；
(ii)V-dAb(任选为二聚体)，其中V是VH、VHH或VL，及dAb是VH、VHH或VL；
(iii)V-scFv-人Fc(任选为二聚体)，其中V是VH、VHH或VL；
(iv)V-scFv(任选为二聚体)，其中V是VH、VHH或VL，及dAb是VH、VHH或VL；
(v)mAb-dAb(即与一或多个dAb共价附着或包含其的mAb，例如在mAb重链中)，其中mAb的重链可变结构域是所述V结构域，其中V表示VH、VHH或VL；
(vi)Fab-dAb(即与一或多个dAb共价附着或包含其的Fab，例如在Fab的重链中)，其中Fab的重链可变结构域是所述V结构域，其中V表示VH、VHH或VL；
(vii)Fab2-dAb(即与一或多个dAb共价附着或包含其的Fab2，例如在Fab2的重链中)，其中Fab的重链可变结构域是所述V结构域，其中V表示VH、VHH或VL。
VHH表示骆驼重链单一可变结构域或者骆驼源化人VH单一可变结构域，如本领域所已知。
本发明提供一种产生本发明多肽链的方法，所述方法包括用第一表位免疫非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，导致也编码表位结合部分(E)的核苷酸序列中可变区基因的体细胞高变，所述可变区基因编码V；分离包含V和E的所述多肽链。所述方法任选进一步包括产生衍生多肽链(例如其人源化形式)，其保留对第一和第二表位的特异性。
根据产生多肽链的方法的一个实施方案，所述表位结合部分没有内源AID模式体细胞高变。因此，当本发明的小鼠用于产生所述链时，所述链的表位结合部分不包含内源(小鼠)AID突变，也不包含其核苷酸序列。有利地，这可得自所述表位结合部分核苷酸序列位于本发明重链基因座中S-μ或μ恒定区的下游。因此，所述表位结合部分的希望的特性(例如结合特性)不由AID突变而降低。
或者，所述表位结合部分包含内源AID模式体细胞高变。这可用于提供预定的表位结合结构域的体内选择的变体，该变体可以与N-末端可变结构域的库集组合及可以以此形式通过体内系统表达。可以根据一或多个希望的特性选择变体(以这种多价产物形式)，如表位结合亲和性与亲代表位结合部分相比得以改良。
本发明进一步提供了本发明多肽的二聚体，其中所述二聚体没有抗体轻链。因此，例如当所述多肽是没有CH1结构域的重链时，所述二聚体可提供多价(例如多特异性)仅重链(H2)抗体，所述抗体是在体内以这种形式产生、成熟和选择的。
本发明进一步提供了根据本发明的多肽、二聚体或方法，其中所述多肽具有(N-至C-末端方向)结构V-N-E、V-CH1-M-CH2-CH3-L-E或V-M-CH2-CH3-L-E，其中N是与任选抗体铰链区一起的L，M是任选的抗体铰链区。任选地，所述恒定结构域是人γ恒定结构域。因此，M可以是单独的L、铰链区-L、L-铰链区，或者铰链区。
本发明进一步提供了根据本发明的多肽、二聚体或方法，其中V是与第二个抗体可变结构域(V2)键合的肽，形成包含第一个和第二个可变结构域的结合位点，其特异性结合第一表位；任选其中V和V2作为scFv提供。例如，V是从本发明重链基因座中选择作为多价多肽链的VH(例如人VH)，其中VH与VL配对形成第一表位的结合位点(例如其中VL是由所述脊椎动物或细胞的轻链基因座编码的人VL)。在所述重链或编码其的核苷酸选择之后，使用重组DNA技术或蛋白质工程，可以将VL或编码其的核苷酸序列与VL(或VL核苷酸序列)组合，以产生包含N-末端scFv及表位结合部分的重链。所述scFv提供了第一表位的结合位点，所述表位结合部分提供了第二表位的结合位点。
在本发明的多肽、二聚体或方法的一个实施方案中，所述多肽没有CH1结构域。
在本发明的多肽、二聚体或方法的一个实施方案中，所述多肽包含CH1结构域，所述多肽存在于抗体中的第一个和第二个拷贝中，第一个多肽与第一个抗体轻链结合，第二个拷贝与与第二个抗体轻链结合。任选地，所述轻链是相同的。因此，所述产物可具有4链mAb-样结构。
本发明提供了包含本文所述二聚体、多肽链的抗体或其人源化形式。
本发明提供了一种二价(例如双特异性)抗体，其包含或者由重链的二聚体组成，其中每个重链是本文所述的多肽及具有(N-至C-末端方向)如下结构：
V-CH1-M-CH2-CH3-L-E
V-M-CH2-CH3-L-E
V-L-E-L-CH1-M-CH2-CH3
V-L-E-L-M-CH2-CH3
V-CH1-N-E
V-L-E-N-CH1，或者
V-N-E-L-CH1
其中N是与任选抗体铰链区一起的L，M是任选的抗体铰链区(因此M可以是单独的L、铰链区-L、L-铰链区，或者铰链区)；
任选其中所述恒定结构域是人恒定结构域(例如人γ恒定结构域)。
任选地，本发明的抗体或多肽的人和恒定区是人恒定区。
具有固定的表位结合结构域的体细胞高变的VH/VL对
任选地，所述抗体包含轻链的两个拷贝，每个重链与各自的轻链相关，其中每个重链中的V与其各自的轻链可变结构域形成抗原结合位点，每个轻链的可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。因此，每个重链的可变结构域可以选择作为V与轻链配偶体的V配对(例如VH/VL)，在用靶抗原免疫后在体内对所述V配对进行亲和性成熟并选择。例如，所述抗体是mAb-dAb(即重链上包含一或多个dAb的mAb结构，例如在其C末端)。
任选地，本发明抗体的人和恒定区是人恒定区。
本发明提供了多价(例如多特异性，如双特异性)抗体，其包含与轻链相关的重链，其中：
每个重链是上文所述多肽链，其具有或者由结构V-X-L-E-L-C组成，其中E是抗体可变结构域；
每个轻链是多肽链，其具有或者由结构V’-L’-E’-L’-C’组成(N-至C-末端方向)，其中
(i)V’是抗体可变结构域，
(ii)每个L’均是任选的接头，
(iv)E’是表位结合部分，及
(v)C’是不存在或者是包含恒定结构域(例如1、2、3、或4个恒定结构域，例如C’是人CL)的抗体恒定区；
其中
V’是重排的抗体可变结构域，衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码E’(或者特异性结合由E’特异性结合的表位的其亲本)的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
V’包含内源性AID-模式体细胞高变；
V与V’形成特异性结合第一表位的第一个结合位点；及
任选地，当E’是抗体可变结构域时，E与E’形成特异性结合第二表位的第二个结合位点(例如E是VH及E’是VL)。
在一个实例中，V’衍生自具有DH的人VH和JH的重排。在另一实例中，V’是衍生自人VL和JL的重排的VL结构域(例如Vκ和Jκ或者Vλ和Jλ)。
本发明还提供了抗原结合多肽，其包含与一或多个表位结合部分连接的蛋白质支架，其中所述抗原结合多肽包含至少两个表位结合位点，其中至少一个由表位结合部分提供，至少一个由与第二个抗体可变结构域配对的第一个抗体可变结构域提供，其中每个可变结构域是重排的抗体可变结构域，其衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码一或多个表位结合部分(或者具有相同表位结合特异性的其各自的亲本)的核苷酸序列中具有体细胞高变；其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
因此，在所述可变结构域是在小鼠中产生时，每个重排的可变结构域包含由小鼠AID导致的体细胞高变。已知AID的突变热点(见Mauel,R.W.&Gearhart,P.J.；“AID andsomatic hypermutation”Advances in Immunology2010.105:159-191”)，因此技术人员能容易地针对内源性AID鉴别在这种热点的一或多个突变(例如通过与在不存在任何突变下产生的预测的氨基酸序列对比)。
本发明还提供了抗原结合多肽，其是包含所述蛋白质支架的所述抗原结合多肽的拷贝。因此，所述拷贝的可变结构域不需要其自身已经在脊椎动物中产生，而是可以例如在体外从包含编码所述多肽的核苷酸序列的载体中表达。
在一个实例中，每个可变结构域均是重排的抗体可变结构域，其衍生自具有DH的人VH和JH的重排。在另一实例中，每个可变结构域是衍生自人VL与JL的重排的VL结构域(例如Vκ与Jκ或者Vλ与Jλ)。
在一个实例中，所述蛋白质支架是抗体支架，即包含重链的支架(或其二聚体，例如H2抗体)、包含重链与配对的轻链的支架(或其二聚体，例如H2L2抗体)。
在一个实例中，所述蛋白质支架是Ig支架，例如IgG支架。例如，IgG支架选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。例如，表位结合结构域在其轻链的N末端附着于所述Ig支架。例如，表位结合结构域在重链的N末端附着于所述Ig支架。例如，表位结合结构域在轻链的C末端附着于所述Ig支架。例如，表位结合结构域在重链的C末端附着于所述Ig支架。
在一个实例中，所述蛋白质支架包含或者由单价或二价抗体(例如二价单特异性抗体)组成。
在一个实例中，至少一个所述表位结合部分通过包含至少10个氨基酸(例如10-50个氨基酸)的肽接头与蛋白质支架连接。在一个实例中，一个(或每个)表位结合部分(例如结构域)通过接头及多个这种接头的组合与蛋白质支架连接，所述接头选自SEQ ID NO:53-60、SEQ ID NO:62-72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76-78和SEQ ID NO:112-114(其中所述序列是在WO2010136483中揭示的那些，所述公开并入本文作参考，用于本发明及可能包含于本发明的权利要求书中)。在一个实例中，所述接头选自(PAS)n(GS)m、(GGGGS)p(GS)m、(TVAAPS)p(GS)m、(GS)m(TVAAPSGS)p、(PAVPPP)n(GS)m、(TVSDVP)n(GS)m及(TGLDSP)n(GS)m，其中n＝是1-10的整数，m＝0或者1-4的整数，及p＝2-10的整数。
在一个实例中，所述接头选自(PAS)n(GS)m，其中n＝1-10的整数，m＝0或者1-4的整数。
在一个实例中，所述接头选自(TVAAPS)p(GS)m和(GS)m，其中m＝0或者1-10的整数，p＝2-10的整数。
本发明提供了编码上述抗原结合多肽的重链的多核苷酸序列。本发明提供了编码上述抗原结合多肽的轻链的多核苷酸序列。
本发明还涉及多特异性多肽，其可用于在患者中募集免疫效应细胞。因此，本发明提供了如上述的多特异性抗原结合多肽、二聚体或抗体，其能募集人免疫效应细胞的活性，通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原(例如人CD3)，能特异性结合所述效应抗原的多肽、二聚体或抗体的第一个表位结合位点，及能特异性结合除了效应抗原之外的靶抗原(例如人EpCAM或人CD19)的多肽、二聚体或抗体的第二个表位结合位点；任选地，其中所述靶抗原位于除了所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上。
例如，所述效应抗原选自CD3、CD16、CD32、CD64和CD89。
例如，所述靶抗原选自EGFR、VEGF、IGF-1R、Her2、c-Met(也已知为HGF)、HER3、CEA、CD33、CD79a、CD19、PSA、EpCAM、CD66、CD30、HAS、PSMA、GD2、ANG2、IL-4、IL-13、VEGFR2及VEGFR3。
在一个实施方案中，提供了本发明的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中第二表位是由人免疫效应细胞抗原(例如人CD3)提供的。
在一个实施方案中，提供了本发明的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中第一表位由除了效应抗原之外的靶抗原(例如人EpCAM或人CD19)提供；任选其中所述靶抗原是除了所述人免疫效应细胞之外的靶细胞的抗原。
本发明还提供了轻链和轻链二聚体。为此，本发明提供了多价(例如多特异性)轻链，其具有(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C，其中
(i)V是抗体可变结构域(例如VL)，其特异性结合第一表位，
(ii)X是不存在，或者是包含恒定结构域(例如CL)的抗体恒定区，
(iii)每个L均是任选的接头，
(iv)E是特异性结合第二表位的表位结合部分，及
(v)C是不存在或者包含恒定结构域的抗体恒定区(例如C是CL)，
其中V是重排的抗体可变结构域，衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
本发明还提供了这种轻链的二聚体。
提供相应的脊椎动物，其包含产生这种构建体的轻链基因座。为此，本发明提供了：
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含：
(i)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列及CL基因区段，其中所述脊椎动物表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分及CL结构域，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)；或者
(ii)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、CL基因区段、编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、CL结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)。
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，所述细胞基因组包含：
(i)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列及CL基因区段，其中所述细胞表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分和CL结构域，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)；或者
(ii)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、CL基因区段、编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述细胞表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、CL结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文所述任何表位)。
表位结合结构域的实例
在一个实例中，所述或每个表位结合部分或结构域选自如下：抗体可变结构域(例如VL或VH，抗体单一可变结构域(结构域抗体或dAb)，骆驼VHH抗体单一可变结构域，鲨鱼免疫球蛋白单一可变结构域(NARV)，NanobodyTM或骆驼源化VH单一可变结构域)；T-细胞受体结合结构域；免疫球蛋白超家族结构域；agnathan可变淋巴细胞受体(J Immunol；2010Aug1；185(3):1367-74；“Alternative adaptive immunity in jawlessvertebrates；Herrin BR&Cooper MD.)；纤连蛋白结构域(例如AdnectinTM)；抗体恒定结构域(例如CH3结构域，例如FcabTM的CH2和/或CH3)，其中所述恒定结构域不是功能性CH1结构域(定义为可以与轻链相关的CH1结构域)；scFv；(scFv)2；sc-双抗体；scFab；衍生自选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的centyrin和表位结合结构域；脂笼蛋白结构域；蛋白质A如蛋白质A的Z-结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A-结构域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热激蛋白(如及衍生自GroEI和GroES的表位结合结构域)；运铁蛋白结构域(例如trans-body)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C-型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人γ-晶体蛋白或人遍在蛋白(affilin)；PDZ结构域；蝎毒素；及人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
表位结合部分的进一步来源是在WO2007024715的第40页第23行至第43页第23行中揭示的可变结构域和抗体的VH/VL对。这个具体公开并入本文作参考，就如在本文明确描述了提供用于本发明的表位结合部分的基础及可能包含于本发明的权利要求书中。
“结构域”是折叠的蛋白质结构，其具有不依赖于其余蛋白质的三级结构。通常，结构域负责蛋白质的分立的功能性质，及在许多情况中可以添加、除去或转移至其它蛋白质而不丧失所述蛋白质和/或结构域的剩余部分的功能。“单一抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域，其包含抗体可变结构域的特征性序列。因此其包括完整的抗体可变结构域及修饰的可变结构域，例如其中一或多个环已经由序列置换，所述序列是抗体可变结构域的非特征性的，或者已经截短或包含N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，其保留全长结构域的至少结合活性和特异性。
短语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指抗体可变结构域(VH、VHH、VL)，其特异性结合抗原或表位，不依赖于不同的V区或结构域。免疫球蛋白单一可变结构域可以具有其它的、不同可变区或可变结构域形式(例如同或异多聚体)存在，其中所述其它区域或结构域不是由所述单一免疫球蛋白可变结构域结合抗原所必需的(即所述免疫球蛋白单一可变结构域结合抗原不依赖于另外的可变结构域)。“结构域抗体”或者“dAb”与“免疫球蛋白单一可变结构域”相同，其能结合如本文使用术语抗原。免疫球蛋白单一可变结构域可以是人抗体可变结构域，但是也包括来自其它物种如啮齿动物的单一抗体可变结构域(例如WO 00/29004所述)、铰口鲨和骆驼VHH免疫球蛋白单一可变结构域。骆驼VHH是免疫球蛋白单一可变结构域多肽，衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和骆马等物种，其产生天然缺失轻链的重链抗体。这种VHH结构域可以根据本领域可用的标准技术人源化，及这种结构域仍被认为是本发明的“结构域抗体”。如本文使用，“VH”包括骆驼VHH结构域。NARV是另一类型的免疫球蛋白单一可变结构域，其在软骨鱼包括铰口鲨中鉴别。这些结构域也称作新抗原受体可变区(通常缩写为V(NAR)或NARV)。进一步详细描述见MoI.Immunol.44,656-665(2006)和US20050043519A。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T-细胞上表达的CD28-家族受体。其细胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。相应于抗体CDR的环可以由异源序列取代以赋予不同的结合性质。工程化为具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称作Evibodies。进一步详细描述见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂笼蛋白是细胞外蛋白质家族，其转运小疏水性分子如类固醇、后胆色素、类维生素A和脂质。其具有刚性β-折叠二级结构，在圆锥结构的开口端具有许多环，其可以被工程化为结合不同靶抗原。Anticalins的大小为160-180个氨基酸，衍生自脂笼蛋白。进一步详细描述见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。Affibody是衍生自金黄色葡萄球菌的蛋白质A的支架，其可以被工程化为结合抗原。所述结构域由大约58个氨基酸的一束三螺旋组成。通过表面残基随机化已经产生文库。进一步详细描述见Protein Eng.Des.SeI.17,455-462(2004)和EP1641818A1。
AvimersTM是衍生自A结构域支架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采用定义的二硫键结构。多样性是通过由A-结构域家族呈现的天然变化的改组而产生的。进一步的详细描述见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和ExpertOpinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。
运铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。运铁蛋白可以通过在容许的表面环中插入肽序列而被工程化为结合不同的靶抗原。举例的工程化的运铁蛋白支架包括Trans-body。进一步的详细描述见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPinsTM)衍生自锚蛋白，其是介导整体膜蛋白质与细胞骨架附着的蛋白质家族。单一的锚蛋白重复是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33个残基的基序。其可以通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基而被工程化为结合不同的靶抗原。其结合界面可以通过增加模块数而增加(亲和性成熟方法)。进一步详细描述见J.MoI.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.MoI.Biol.369,1015-1028(2007)及US20040132028A1。
纤连蛋白是可以被工程化为结合抗原的支架。AdnectinsTM由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单位的第10个结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。在β-夹心的一个末端的三个环可以被工程化为使得Adnectin可以特异性识别感兴趣的治疗性靶。进一步的详细描述见Protein Eng.Des.SeI.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是组合的识别分子，其由恒定支架蛋白、典型为硫氧还蛋白(TrxA)组成，其含有插入在活性位点的一个限制的可变肽环。进一步的详细描述见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微体衍生自天然发生的长度为25-50个氨基酸的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥连，举例的微蛋白包括KalataBI和食鱼螺毒素和knottin。所述微蛋白具有可以被工程化为包括直至25个氨基酸而不影响所述微蛋白的整体折叠的环。关于工程化的knottin结构域的进一步的详细描述见WO2008098796。
其它表位结合部分和结构域包括用作支架以工程化不同的靶抗原结合性质的蛋白质，包括人γ-级晶体蛋白和人遍在蛋白(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C-型凝集素结构域(四连蛋白)，参见Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,edited by Stefan Dubel)的第七章及Protein Science 15:14-27(2006)。本发明的表位结合部分和结构域可以衍生自任何这些可选的蛋白质结构域。
在一个或每个表位结合部分的本发明的一个实施方案中，结构域或抗原结合位点结合抗原或第二表位，与每个抗原的KD为1mM，例如KD为10nM、1nM、500pM、200pM、100pM或10pM或更低(即更好的亲和性)，通过BiacoreTM或ProteonTM测量，如在WO2010136485中方法4和5或者如本文别处所述的BiacoreTM方法。
在一个或每个可变结构域的本发明的一个实施方案中，在本发明的多肽、链或抗体的N末端的可变结构域对或抗原结合位点结合抗原或第一表位，与每个抗原的KD为1mM，例如KD为10nM、1nM、500pM、200pM、100pM或10pM或更低(即更好的亲和性)，通过BiacoreTM或ProteonTM测量，如在WO2010136485中的方法4或5或者如本文别处所述的BiacoreTM方法。
在本发明的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体的一个实例中，所述或每个N-末端可变结构域或5’-末端可变区是人可变结构域或人可变区。
在本发明的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体的一个实例中，每个恒定区或结构域均是内源的非人脊椎动物恒定区或结构域。
本发明提供非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区及包含编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列的μ恒定区，其中所述脊椎动物表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合各自的第一和第二表位。这可用于产生μ-型多价(例如多特异性、如双特异性)重链和抗体。
本发明提供了非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其中所述细胞基因组包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区及包含编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列的μ恒定区，其中所述细胞表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。这可用于产生μ型多价(例如多特异性如双特异性)重链和抗体。
本发明提供了非人(例如大鼠或小鼠)脊椎动物或细胞，其表达多价、多特异性重链(或其二聚体)，其包含结构V-L-E或V-L-E-L(例如V-L-E-Fc或V-L-E-L-Fc)，其中V是N末端抗体可变结构域，L是任选的接头，以及E是表位结合部分，其中V和E特异性结合各自的第一和第二抗原，其中所述抗原是不同的。任选地，V是人可变结构域。
仅重链抗体及基因座
如上文所述及如下文例证，本发明还涉及改良的重链抗体(H2抗体)在体内的产生。
因此，本发明提供了非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中：
(a)所述脊椎动物表达IgM抗体，其包含分别由抗体重链和轻链基因座编码的重链和轻链；
(b)所述脊椎动物能表达非-μ(例如IgG)抗体，每个非-μ抗体重链均缺少功能性CH1结构域；及
(c)IgM抗体由淋巴细胞表达(例如幼B-细胞)，每个细胞包含表达由所述细胞表达的IgM抗体的轻链的功能性轻链基因座；及
其中
(d)所述非-μ抗体由淋巴细胞表达(例如成熟B-细胞、成浆细胞或浆细胞)，每个细胞均缺少功能性轻链基因座，其中非μ-抗体在不存在轻链表达时基本上由所述细胞表达。
任选地，在(a)中，每个重链均包含CH1结构域。
在一个实例中，在(b)中，非-μ抗体的表达是在用预定的抗原免疫及同种型转换之后。
本发明还提供了非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，例如根据紧接上文的实施方案的脊椎动物，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一个转换序列(例如S-μ，例如内源性S-μ)、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二个转换序列(例如S-γ，例如内源性S-γ)及缺少CH1基因区段的非-μ(例如γ)恒定区；
(ii)功能性抗体轻链基因座，以表达轻链(在VJ重排后)；
其中所述细胞可表达IgM抗体，其包含IgM型重链和轻链(任选每个重链均包含CH1结构域)；
其中每个细胞的重链基因座能经历同种型转换以产生非-μ(例如IgG)抗体，其在不存在轻链时包含一或多个非-μ-型(例如IgG-型)重链，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件，其中功能性轻链在同种型转换为所述非-μ型抗体之后不被表达。
相似地，本发明涉及细胞。因此，本发明提供了非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞，例如淋巴细胞或本文定义的其它细胞)，其中所述细胞基因组包含：
(i)功能性抗体轻链基因座以表达轻链；
(ii)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一个转换序列(例如S-μ，例如内源性S-μ)、μ恒定区(例如包含CH1基因区段)、第二个转换序列(例如S-γ，例如内源性S-γ)及缺少CH1基因区段的非-μ(例如γ)恒定区，以表达包含IgM型重链和轻链(任选每个重链均包含CH1结构域)的IgM抗体，及IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换以产生非-μ(例如IgG)抗体，其在不存在轻链时包含一或多个非-μ型重链，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件，其中功能性轻链在同种型转换为所述非-μ型抗体之后不被表达。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，关闭轻链表达的构件包括核苷酸序列(例如轻链可变区，轻链基因座的J区和/或CL区)，其是从所述轻链基因座中表达功能性轻链所必需的，其中所述核苷酸序列在表达IgM的幼B细胞中是功能性的，但是所述核苷酸序列在表达所述非μ型抗体的成熟B细胞中不存在或者基本上是非功能性的。
例如，所述脊椎动物中缺失全部或基本全部的每个轻链基因座。例如，通过缺失轻链恒定区基因区段和/或每个基因座的J区，使得κ(或者κ和λ)轻链基因座是非功能性的。缺失可以使用阶段特异性重组酶进行，如下文实施例中描述。例如，通过缺失轻链可变区(重排或未重排的V-J)基因区段，使得κ(或者κ和λ)轻链基因座是非功能性的。在另一实例中，通过在所述或每个轻链基因座中插入干扰序列如新霉素抗性核苷酸序列或者通过重组酶或转座酶介导的轻链基因座基因区段(例如恒定区和/或J区区段)的倒位，使得κ(或者κ和λ)轻链基因座是非功能性的。倒位可以失活基因座，如在本文提及的Kymab Limited PCT申请中详细论述。
在一个实例中，所述核苷酸序列是轻链基因座或其一部分，该序列侧翼是第一和第二位点特异性重组元件(SSRE)，其中所述基因组包含编码相应的位点特异性重组酶的一或多个基因，其中所述基因在表达IgM的幼B细胞中是失活的，但是在表达所述IgG型抗体的成熟B细胞中是活性的，切割第一个和第二个SSRE并使基因组缺失轻链基因座或其一部分或者失活所述基因座。
可以在ES细胞中进行需要的遗传操纵，以在随后的后代B细胞的分化阶段及相应的脊椎动物中可以实现条件性轻链失活，如下文例证。
在一个实施方案中，使用这种构件关闭κ链表达。在一个实施方案中，使用这种构件关闭λ链表达。在一个实施方案中，使用这种构件关闭κ和λ链表达。在使用小鼠系统的情况中，λ链表达通常低(大约5％)，因此可不必需关闭λ链表达，只要当同种型转换的链表达时关闭κ链表达即可。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，关闭轻链表达的构件包括核苷酸序列，其包含在表达IgM的幼B细胞中从所述轻链基因座中驱动轻链表达的调节元件(例如启动子)，其中所述调节元件在表达所述非μ型抗体的成熟B细胞中基本上是失活的或者不存在。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述核苷酸序列或调节元件侧翼(例如5’和3’立即上游和下游)是第一个和第二个组合元件(例如位点特异性重组元件或者转座酶元件，如piggyBac LTR)，其中所述基因组包含编码相应重组酶或转座酶的基因，其中所述基因在表达IgM的幼B细胞中是失活的，但是在表达所述非μ型抗体的成熟B细胞中是活性的，切割第一个和第二个重组元件并失活所述核苷酸序列或调节元件。所述切割可导致所述核苷酸序列或调节元件的缺失、易位和/或倒位，以使其失活。
举例的位点特异性重组元件和重组酶是frt/flp、dre/rox和cre/lox或者这些的组合。第一个和第二个重组元件可以是不同的。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述调节元件在表达IgM的幼B细胞中被诱导和/或在表达所述非μ型抗体的成熟B细胞中被抑制。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，关闭轻链表达的构件是表达包含重排轻链可变结构域的多肽链的基因组中的另一基因座，例如已知表位结合特异性的预定的VL。这使用轻链等位基因排除以关闭轻链表达。相似地，在可选的实例中，所述另一基因座是如上文定义的重链基因座，其中在所述同种型转换后，所述重链基因座编码包含所述重排的轻链可变结构域的抗体链。任选地，所述抗体链进一步包含第二个抗体可变结构域，任选其中轻链可变结构域和所述第二个抗体可变结构域特异性结合相应的第一和第二表位，其中所述表位是不同的。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述重排的轻链可变结构域衍生自如上文定义的重链基因座的未重排可变区(例如产生VL-Fc)，其中所述重链基因座的未重排的可变区包含在一或多个轻链J基因区段的5’的一或多个轻链V基因区段。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，抗体链包含(5’至3’方向)衍生自如上文定义的重链基因座可变区的可变结构域(例如产生VL-Fc)、任选的接头(例如本文定义的任何接头)及所述重排的轻链可变结构域。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分(或者多个表位结合结构域，例如2或3个与任选的接头，例如代替CH1结构域)的核苷酸序列，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价(例如二价，如双特异性)多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(例如其中所述表位是不同或相同的)。
例如，所述多肽链具有结构V-L-E，其中V是衍生自所述重排的重链基因座可变区的抗体可变结构域，L是任选的接头，以及E是表位结合结构域，如上文定义。
在所述脊椎动物的一个实施方案中，非-μ恒定区包含在所述表位结合部分3’的一或多个非-μ恒定区基因区段(例如CH2和CH3基因区段)，其中在同种型转换之后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其均包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分及所述一或多个非-μ恒定区基因区段。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，聚(A)位点在编码表位结合部分的核苷酸序列的3’(例如紧邻3’)，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其具有或者由结构V-X-L-E组成(N-至C-末端方向)，其中V是衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域，X是不存在或者是抗体铰链区或者是由γ恒定区编码的多肽，L是任选的接头，以及E是表位结合部分，任选其中所述脊椎动物表达V-X-L-E或V-L-E二聚体。
例如，聚(A)位点与终止密码子一起提供以终止转录。
例如，非-μ恒定区是γ型CH2-CH3。因此，在一个实例中，双特异性链表达，其具有结构V-CH2-CH3-L-E，这可例如是作为二聚体产生的(在这种情况中，所述链的CH2-CH3的相互亲和性可有助于二聚体化)。二聚体提供了针对每个表位特异性的多个结合位点，其可用于提供结合亲合力。本发明实施方案中γCH2和CH3的提供也可用于提供体内Fc活性，如半衰期延长、再循环、ADCC或者细胞杀死活性。ADCC和细胞杀死活性可用于治疗癌症、炎症疾病、自身免疫疾病和感染性疾病领域中的适应症。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或者ADCC是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞及巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)，使得这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞及随后用细胞毒素杀死靶细胞。指向靶细胞表面的配体特异性高亲和性IgG抗体刺激细胞毒性细胞，并是这种杀死所需的。靶细胞的裂解是胞外的，需要直接细胞与细胞接触，不涉及补体。
可以测定任何特定抗体通过ADCC介导靶细胞裂解的能力。为了评定ADCC活性，将感兴趣的抗体加入展示靶配体的靶细胞组合免疫效应细胞，其可以通过抗原抗体复合物激活，导致靶细胞的细胞溶解。细胞溶解通常通过溶解的细胞释放的标记(例如放射性底物、荧光染料或者天然细胞内蛋白)而检测。对于这种测定有用的效应细胞包括周围血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。体外ADCC测定的具体实例在Wisecarver et al,1985,19:211；Bruggemann et al,1987,J Exp Med 166:1351；Wilkinson et al,2001,JImmunol Methods 258:183；Patel et al,1995J Immunol Methods 184:29(所述文献均并入本文作参考)中描述。或者或此外，感兴趣的抗体的ADCC活性可以在体内评定，例如在动物模型中，如Clynes et al,1998,PNAS USA95:652所揭示，所述文献以其全部内容并入作参考。
“补体指导的细胞毒性”或者CDC是指细胞毒性形式，其中补体级联通过补体成分C1q与抗体Fc的结合而被激活。
如本文使用，术语“Fc”是指包含(N末端至C末端方向)免疫球蛋白CH2和CH3结构域的蛋白质。所述CH2和CH3结构域可以形成抗体或重链的至少一部分恒定区。
在一个实例中，聚(A)位点在编码一或多个非-μ恒定区基因区段的核苷酸序列的3’，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其具有或者由(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C组成，其中V是衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域，X不存在或是抗体铰链区或者非-μ恒定区编码的多肽，L是任选的接头，E是表位结合部分，以及Cn是一或多个非-μ恒定区基因区段(例如γFc)；任选其中所述脊椎动物表达V-X-L-E-L-C或者V-L-E-L-C二聚体。
在一个实例中，所述非-μ恒定区是γ型CH2、CH3或CH2-CH3。因此，在一个实例中，双特异性链被表达，具有结构V-CH2-L-E-CH3，这可例如作为二聚体产生(在这种情况中，所述链之间的CH2和CH3的相互亲和性可有助于二聚体化)。二聚体提供了对于每个抗原特异性的多个结合位点，其可用于提供结合亲合力。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，所述或每个表位结合部分是本文揭示的任何这种部分，例如其选自抗体可变结构域(例如VL或VH，抗体单一可变结构域(结构域抗体或dAb)，骆驼VHH抗体单一可变结构域，鲨鱼免疫球蛋白单一可变结构域(NARV)，NanobodyTM或骆驼化VH单一可变结构域)；T-细胞受体结合结构域；免疫球蛋白超家族结构域；agnathan可变淋巴细胞受体；纤连蛋白结构域(例如AdnectinTM)；抗体恒定结构域(例如CH3结构域，例如FcabTM的CH2和/或CH3)，其中所述恒定结构域不是功能性CH1结构域；scFv；(scFv)2；sc-双抗体；scFab；衍生自选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的centyrin和表位结合结构域；脂笼蛋白结构域；蛋白质A如蛋白质A的Z-结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A-结构域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热激蛋白(如衍生自GroEI和GroES的表位结合结构域)；运铁蛋白结构域(例如trans-body)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C-型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人γ-晶体蛋白或人遍在蛋白(affilin)；PDZ结构域；蝎毒素；及人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，所述脊椎动物包含已经经历同种型转换以产生所述非-μ-型(例如IgG-型)抗体的淋巴细胞；或者已经经历同种型转换以产生所述非-μ-型(例如IgG-型)抗体的细胞。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，所述脊椎动物已经用预定抗原免疫，所述脊椎动物表达缺少CH1结构域的非-μ-型(例如IgG-型)抗体及包含特异性结合预定抗原的可变结构域；或者所述细胞分离自这种脊椎动物。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，所述或每个N-末端可变结构域或5’-末端可变区是人可变结构域或人可变区。人可变结构域是由衍生自重排的可变区DNA序列的RNA编码的可变结构域，其中所述重排是人V基因区段与人J基因区段的重排(如果所述重排的可变区是VH区，也任选具有人D基因区段)。因此，例如当所述RNA由重排的可变区DNA序列编码时，其衍生自这种DNA序列，任选具有在抗体产生期间在体内天然可见的突变。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，所述或每个N-末端可变结构域或5’-末端可变区是骆驼、骆驼源化人、小鼠、大鼠、啮齿动物、兔、鸡或者牛可变结构域或区域。
在所述肽、链、抗体、脊椎动物或细胞的一个实例中，每个恒定区或结构域是内源的非人脊椎动物恒定区或结构域。在所述多肽、链、抗体、脊椎动物或细胞的一个实例中，每个非-μ恒定区或结构域均是人非人脊椎动物恒定区或结构域。
在所述脊椎动物或细胞的一个实例中，所述淋巴细胞包含表达所述非-μ抗体或二价多肽链的B细胞，其中所述非-μ抗体或多价链特异于对于所述非人脊椎动物是外源的抗原(例如人抗原或感染性疾病病原体的抗原)；或者其中所述非人脊椎动物细胞是这种B细胞。
本发明还提供了如下B细胞、杂交瘤和产物。
从上述B细胞中产生的永生化B细胞或杂交瘤。
非-μ-型(例如IgG-型)抗体或多价链分离自上述B细胞或杂交瘤，或其人源化形式，其中非人恒定结构域已经由人恒定结构域置换。例如，所有非人恒定结构域均已缺失及任选用一或多个人恒定结构域置换(例如相应于缺失的非人结构域)。因此，在一个实施方案中，非人(例如小鼠)Fc由人Fc置换。
方法
本发明提供了改良的方法，以在体内产生同种型转换的非-μH2抗体和重链，如下文所述。
因此，本发明提供了一种在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中产生包含体细胞高变的可变区的多肽链的方法，所述方法包括：
(a)在脊椎动物幼B细胞中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座中表达的重链和轻链(任选所述重链包含CH1结构域)；
(b)用预定的表位免疫脊椎动物，获得在至少一些重链基因座中的同种型转换及已经经历体细胞高变的非-μ(例如IgG)抗体的表达，其中所述抗体包含缺少CH1结构域的重链及包含特异性结合所述抗原的可变区；及
(c)通过选择结合所述表位的可变区而从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
所述方法进一步包括在不存在轻链表达的条件下在步骤(b)中表达非-μ抗体。
例如，在步骤(c)中，从血清、血液、脾细胞或组织、淋巴结细胞或组织或者次级淋巴器官细胞或组织中选择所述链。
任选地，所述多肽链包含一或多个重链恒定结构域，及在这个意义上，所述链可以被认为是重链。在另一实施方案中，所述链是不包含恒定结构域的链，例如其中所述链是如本文所述的V-L-E多肽。
所述方法任选地包括从免疫的脊椎动物中分离表达包含结合所述表位的体细胞高变的可变区的多肽链的B细胞；及任选使所述细胞永生化或者从中产生杂交瘤。
所述方法任选包括获得编码选择的多肽链的核苷酸序列，所述多肽链包含结合所述表位的体细胞高变的可变区，并将所述核苷酸序列导入表达载体中以表达所述多肽链或者其人源化形式；任选其中载体是在宿主细胞中(例如大肠杆菌(E.coli)、酵母、毕赤氏酵母(Picchia)、酵母菌属(Saccharomyces)、CHO或HEK293细胞)。
在所述方法的一个实施方案中，所述脊椎动物如本发明任何方面所述。
本发明提供了通过所述方法获得的特异性结合所述表位的多特异性多肽链或者其衍生物。
可阶段转换的轻链基因座
如在本文及下文实例中所述，希望在本发明的脊椎动物和细胞中提供条件性的或者阶段特异性的轻链表达。这例如在当表达特异性结合预定表位或抗原的非-μ重链或抗体时是有用的。
因此，本发明提供了非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，任选如本发明任何其它方面所述，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，
(a)所述轻链基因座包含(5’至3’方向)轻链可变区和恒定区(例如Cκ或Cλ)，以在表达IgM抗体的淋巴细胞(例如幼B-细胞)中表达轻链；及
(b)在表达非-μ(例如IgG)抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
例如，所述轻链可变区包含一或多个人Vκ基因区段及一或多个人Jκ基因区段；或者一或多个人Vλ基因区段及一或多个人Jλ基因区段。
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或杂交瘤，任选如本发明任何其它方面所述，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，所述轻链基因座包含：
(a)(5’至3’方向)轻链可变区和恒定区(例如Cκ或Cλ)，以在表达IgM抗体的淋巴细胞(例如幼B-细胞)中表达轻链；及
(b)在表达非-μ(例如IgG)抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
例如，所述轻链可变区包含一或多个人Vκ基因区段及一或多个人Jκ基因区段；或者一或多个人Vλ基因区段及一或多个人Jλ基因区段。
关闭轻链表达的构件例如在上文及在实施例中提供。
在优选的实施方案中，每个重链和轻链基因座是内源性非人脊椎动物基因组的重链或轻链基因座，即其在所述类型的脊椎动物或细胞的重链或轻链基因座的种系位置。因此，在这个实例中，本发明的基因座可以通过将外源DNA插入内源(即非人脊椎动物)重链或轻链基因座中而构建。在另一实施方案中，本发明的基因座是在基因组中别处合成构建的(即不在内源性重链基因座位置)及可以在野生型脊椎动物或细胞中携带重链基因座的染色体不同的染色体上。例如，本发明的基因座是在Rosa26基因座构建的。
可以将一段人DNA序列以一段或以系列插入方式插入非人脊椎动物或细胞(例如ES细胞)的基因组中。例如，可以使用标准重组工程技术构建多个细菌人工染色体(BAC)，其间包含插入的完整的人恒定区DNA序列，每个BAC均包含所述DNA序列的一部分。通过使用系列BAC的系列插入(例如使用标准同源重组(例如见本文所述Regeneron and Ablexis PCT所述)或者系列重组酶介导的盒交换-sRMCE-(例如见本文所述Kymab Limited PCT所述)，技术人员可以在基因组中建立转基因基因座。当以此方式操纵ES细胞时，可以使用标准的ES细胞以植入供体胚囊中，然后植入代孕母体中。通过种系传递和任何必需的随后的繁殖和交配(再次是常规的)，技术人员可以获得携带本发明基因座的后代脊椎动物和细胞。所述基因座可以纯合状态(例如本发明的基因座在每个重链等位基因)或杂合状态(例如是失活的内源性重链的第二个等位基因，由此从第一个等位基因(携带本发明的基因座)仅重链表达，提供重链表达)存在。或者，本发明的不同基因座是在基因组中所述重链基因座的第一个和第二个等位基因中提供的，由此人同种型转换的重链的不同组合可以由所述基因座组合表达。
在一个实施方案中，所述基因组还包含转基因轻链基因座，其表达人轻链可变区，及内源性轻链表达基本上是失活的，内源性重链表达也基本上是失活的。这个实施方案有利地提供了可预测表达仅完全人重链和轻链N末端可变区的基因组，从这个抗体集合中，技术人员可选择(例如在用靶抗原免疫后)经历突变和成熟及通过所述脊椎动物或细胞的体内机制选择的非-μ型抗体(例如γ型)。
通过调和VH、D和JH重组及在内源性IgM中的初始表达，这有利地使得内源性RAG-1和RAG-2被有效应用，以及利用参与抗体和B细胞发育的内源性控制、突变和信号传导。本发明随后使得转换至人非-μC区，产生产物重链，其已经通过内源性激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)所致体细胞高变而亲和性成熟。通在用预定抗原免疫后，在小鼠在体内选择仍良好工作(例如良好表达、亲和性、生物物理特性)的这些重排的可变区(例如在表位结合部分背景中)并扩增。这保留了利用内源性抗体和B细胞产生和控制的优势，以及亲和性成熟和体内扩增选择的表达希望的抗体/重链的B细胞，利用小鼠(或者其它非脊椎动物)系统选择良好的完全人抗体和重链。这种方法优于现有技术领域中的体外工程化方法，其中针对良好的生物物理特性的选择、表达、亲和性等未包含在内(因此通常导致现有技术领域中的这些方法品质降低)及在体内初次产生后加上多个步骤程序。
在一个实施方案中，本发明的脊椎动物或细胞不表达所述非-μ同种型的内源性抗体重链。例如，这是使用标准方法以缺失或失活内源性重链可变区而实现的。因此，技术人员将获知当人V、D和J基因区段(或者人重排的VDJ)包含在重链基因座中时，由所述脊椎动物或细胞产生的预定的人非-μ同种型(例如IgG抗体)的重链(及包含其的抗体)总是包含人可变区。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述人非-μ恒定区是γ恒定区(例如γ-1、-2、-3或-4)。代替γ恒定区，所述恒定区可以是δ、α(例如α-1或-2)或者ε恒定区。因此，本发明使得技术人员可以根据所得抗体和重链的希望的恒定区功能性而设计所述脊椎动物或细胞的基因组。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述γ恒定区包含CH2和CH3基因区段以编码抗体Fc区。在一个实例中，所述恒定区还包含CH1基因区段。这可用于产生形成4链抗体(传统的H2L2抗体)一部分的重链。在另一实例中，所述恒定区缺少CH1基因区段。这可用于产生形成缺失轻链的仅重链抗体(H2抗体)的一部分的重链。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述基因组包含轻链基因座，其包含位于恒定区上游的人VL和JL基因区段，以表达包含人可变区的轻链；任选其中恒定区是人轻链恒定区。例如，所述基因组包含轻链基因座，其包含位于内源性κ基因座中内源性或人κ恒定区上游的人Vκ和Jκ基因区段，以表达包含人可变区的κ轻链。在这个实例中，其中所述脊椎动物是小鼠，其可不必需要人源化λ基因座，因为在小鼠中λ链表达相对低。任选地，所述λ基因座是失活的和/或包含位于内源性或人λ恒定区上游的人Vλ和Jλ。任选地，内源性κ链表达是失活的。
例如，在同种型转换后所述脊椎动物或细胞基本上不表达内源性轻链。
内源性抗体、抗体链或基因区段使用的失活是例如基本上完全失活或阻止(基本100％，即基本上无一(例如少于10、5、4、3、2、1或0.5％)内源性抗体链等(例如无内源性重链等)被表达)。这可以例如通过评定由所述非人脊椎动物或细胞产生的抗体库集而在抗体链(蛋白质)水平确定，或者通过评定抗体基因座的mRNA转录物而在核苷酸水平评定，例如使用RACE。在一个实施方案中，失活是大于50％(即50％或更低的抗体或转录物是内源性抗体链)、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。例如，在一个实施方案中，内源性重链表达基本上失活，由此不超过85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的脊椎动物的重链库集是由内源性重链提供的。例如，内源性重链表达基本上是失活的，由此脊椎动物重链库集基本上无一是由内源性重链提供的。例如，在一个实施方案中，内源性κ链表达基本上是失活的，由此不超过85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的脊椎动物κ链库集是由内源性κ链提供的。例如，内源性κ链表达基本上是失活的，由此脊椎动物κ链库集基本上无一是内源性κ链提供的。例如，在一个实施方案中，内源性λ链表达基本上是失活的，由此不超过85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的脊椎动物λ链库集是由内源性λ链提供的。例如，内源性λ链表达基本上是失活的，由此脊椎动物的λ链库集基本上无一是内源性λ链提供的。
在本发明的脊椎动物或细胞的一个实施方案中，γ恒定区不包含CH1基因区段。在这个实施方案中，在一个实例中，当非-μ重链表达时，轻链表达是失活的。这可用于产生非-μ同种型的仅重链抗体。
在一个实例中，所述可变区和/或μ恒定区分别在人和内源性种系构型中。术语“种系构型”是指种系基因组构型。例如，当人基因区段的相关顺序与人种系基因组中相应基因区段的顺序相同，则本发明的基因基因座中存在的人免疫球蛋白基因区段是种系构型。例如，当本发明的基因座包含假定的人免疫球蛋白恒定区基因区段A、B和C，当人种系基因组相应基因区段包含排列5’-A-B-C-3’时，这些基因区段以这个顺序排列(基因座中5’至3’顺序)；任选基因区段间也在种系构型中(即从A至C的核苷酸序列相应于人种系基因组中从A至C的一段连续核苷酸序列)。人种系序列的可用数据库和来源在下文论述。因此，在一个实例中，当人免疫球蛋白基因座的元件(例如基因区段、增强子或其它调节元件)提供在本发明的基因座中时，当所述元件的相关顺序与人种系基因组中相应元件的顺序相同及包括所述元件之间的人序列(这些相应于人种系基因组中相应元件之间的这种序列)，所述人Ig基因座元件是种系构型。因此，在一个假定的实例中，转基因基因座包含人元件以5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’排列，其中A、B和C是人免疫球蛋白基因区段，S1-S3是人基因区段间序列，其中相应排列5’-A-S1-B-S2-C-S3-3’存在于人种系基因组中。例如，这可以通过在本发明的转基因免疫球蛋白基因座中提供DNA插入体而实现，所述DNA插入体相应于人种系基因组中从A至C的DNA序列(或者所述插入体包含从A至C的DNA序列)。人种系基因组和免疫球蛋白基因座中的排列为本领域已知(例如见IMGT、Kabat及其它抗体资源)。
在一个实施方案中，重链基因座(或者每个重链基因座)的VH基因区段库集是基本完全的功能性人VH基因区段的库集；任选提供至少6个不同的人JH基因区段、27个不同的人D区段和至少40个不同的人VH基因区段。
在一个实施方案中，重链基因座(或者每个重链基因座)的VH基因区段库集是至少20、25、30、35或40个不同的人VH基因区段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括基于希望的抗体或重链特性(例如对靶抗原的结合亲和性)选择一或多个重链或抗体的步骤，其中选择的抗体包含非-μ重链，或者选择的重链是非-μ链。
抗体/链选择方法
本发明一方面提供了分离抗体、重链或编码所述抗体的核苷酸序列的方法，所述方法包括：
(a)用抗原免疫本发明的脊椎动物(见例如Harlow,E.&Lane,D.1998,5th edition,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY；和Pasqualini and Arap,Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257-259)，由此所述脊椎动物产生抗体；及
(b)从所述免疫的脊椎动物中分离特异性结合所述抗原的抗体或重链和/或编码所述抗体的至少重链可变区的核苷酸序列。
适当地，在本发明的方法中输送免疫原性量的抗原。本发明还涉及检测靶抗原的方法，包括用识别所述抗体/链的一部分的二级检测剂检测如上述产生的抗体或重链或者其衍生物。
在步骤(b)中分离所述抗体可以使用常规抗体选择技术进行，例如淘选已经固定在固体支持物上的抗原的抗体，任选增加严格性的重复循环，这些为本领域技术人员显而易见。
进一步的任选步骤是在步骤(b)之后，使重链可变区的氨基酸序列突变以改良结合所述抗原的亲和性。突变可以通过本领域技术人员熟知的常规技术产生，例如通过易错PCR进行。亲和性可以通过本领域技术人员熟知的常规技术确定，例如通过表面等离子体共振，例如使用BiacoreTM或ProteonTM。
此外或或者，作为进一步的任选步骤，在步骤(b)之后，使重链可变区的氨基酸序列突变，以进一步改良抗体的一或多个生物物理学特性，例如解链温度、溶液状态(单体或二聚体)、稳定性和表达(例如在CHO或大肠杆菌中)中的一或多个。
本发明一方面提供了本发明的抗体、链或多肽，任选用于人医药学中，例如用于治疗和/或预防人患者中的医学状况或疾病。
本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体、链或多肽或者其拷贝或衍生物。
任选地，所述方法包括从所述免疫的脊椎动物中分离B细胞的步骤，其中所述B细胞表达所述分离的抗体或重链；及任选使所述B细胞永生化。
任选地，所述方法包括从所述免疫的脊椎动物或B细胞中分离核苷酸序列的步骤，其中所述核苷酸序列编码所述分离的抗体或其重链。
所述方法提供了一种载体(任选在宿主细胞中)，其包含本发明的核苷酸序列或其拷贝或其衍生物，任选包含至多15、10、9、8、7、6、5、4、3、或1个突变。所述衍生物特异性结合靶抗原。
所述方法提供了一种治疗或预防人中与一或多个所述抗原表位相关或者由其导致的医学状况或疾病的方法，所述方法包括给病人施用在所述方法中获得的或者分离自本发明的脊椎动物或细胞的抗原特异性抗体或重链。
所述方法提供了在所述方法中获得的或者分离自本发明的脊椎动物或细胞的抗原特异性抗体或重链，用于治疗或预防人中与所述抗原相关或由其导致的医学状况或疾病。
所述方法提供了在所述方法中获得的或者分离自本发明的脊椎动物或细胞的抗原特异性抗体或重链在制备用于治疗或预防人中与所述抗原相关或由其导致的医学状况或疾病的药物中的应用。
如本领域技术人员已知，本发明任何构型中位于Ig基因座中恒定区上游的人基因区段(例如V或J基因区段)的可操纵地连接使得该基因区段可以在包含由所述基因座恒定区编码的序列的免疫球蛋白链中重组和表达。
在本发明任何构型的一个实施方案中，每个脊椎动物均是非人哺乳动物。在本发明任何构型的一个实施方案中，所述脊椎动物是小鼠、大鼠、兔、骆驼(例如美洲驼、羊驼或骆驼)、鸡、七鳃鳗或鲨鱼。例如，所有脊椎动物均是相同脊椎动物物种，例如均是小鼠或均是大鼠。
在本发明的任何构型中，所述人基因区或区段可以衍生自同一个体或不同个体，或者是合成的(合成突变的人基因区段)或者代表人共有序列。
构建其基因组包含人免疫球蛋白基因区段的非人脊椎动物和脊椎动物细胞的技术为本领域熟知。例如，参见WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009076464和US6586251所述，所述文献以其全部内容并入本文作参考。
在一个实例中，本发明任何构型的非人脊椎动物能产生至少1×106个不同功能性非-μ免疫球蛋白序列组合的多样性。
人可变区可适当地插入非人脊椎动物μ恒定区的上游，后者与下游人恒定区一起包含为编码全部恒定区或恒定区足够部分所需的所有DNA，以使得能特异性识别靶抗原的有效非-μ抗体/重链形成。
本发明的内源性μ非人脊椎动物恒定区任选是位于野生型基因座的内源性宿主野生型恒定区，对于重链是合适的。
在其中所述脊椎动物是小鼠的一任选方面，人可变区DNA(V、D和J基因区段)的插入靶向于小鼠基因组IgH基因座中J4外显子与内源性Sμ基因座之间的区域，及在一方面是插入在坐标114,667,090与114,665,190之间，优选在坐标114,667,090之后的114,667,091。
除非特别指出，小鼠的所有核苷酸坐标是相应于小鼠C57BL/6J品系NCBI m37所述那些，例如April 2007ENSEMBL Release 55.37h，例如NCBI37July 2007(NCBI build 37)(例如UCSC version mm9，见www.genome.ucsc.edu和http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)。除非特别指出，人核苷酸坐标是相应于GRCh37(例如UCSC version hg19，http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html),Feb 2009ENSEMBL Release55或者相应于NCBI36,Ensemble release 54所述那些。除非特别指出，大鼠核苷酸序列是相应于RGSC 3.4Dec 2004ENSEMBL release 55.34w或者Baylor College of Medicine HGSCv3.4Nov 2004(例如UCSC rn4，见www.genome.ucsc.edu和http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQreleases.html)所述那些序列。
提及的在内源性μ恒定区上游或下游的人可变区、恒定区或基因区段的位置是指所述抗体核苷酸元件的合适的相关位置，使得在脊椎动物体内μ形成及随后非-μ重链形成。因此，插入的人DNA和内源性恒定区及任何其它内源性序列是彼此可操纵地连接的，以产生抗体或抗体链。
作为人和非人抗体基因区段序列的来源，技术人员也已知如下可利用的数据库和资源(包括其更新资料)，其内容并入本文作参考：
Kabat数据库(G.Johnson and T.T.Wu,2002；World Wide Web(www)kabatdatabase.com)。由E.A.Kabat和T.T.Wu在1966年创建，Kabat数据库公开了抗体、T细胞受体、主要组织相容性复合物(MHC)I和II类分子及其它免疫学感兴趣的蛋白质的排列序列。可搜索界面由SeqhuntII工具提供，可获得关于序列排列、序列子群分类及产生变率绘图的多种用途。也见Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.,and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,NIH PublicationNo.91–3242,Bethesda,MD所述，将其并入本文作参考，特别是用于本发明中的人基因区段。
KabatMan(A.C.R.Martin,2002；World Wide Web(www)bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。这是简便查询Kabat序列数据库的的网站界面。
IMGT(the International ImMunoGeneTics InformationM.-P.Lefranc,2002；World Wide Web(www)imgt.cines.fr)。IMGT是一个整合的信息系统，其专攻所有脊椎动物物种的抗体、T细胞受体及MHC分子。其提供了标准化数据的常用入口，包括核苷酸和蛋白质序列、寡核苷酸引物、基因图、遗传多态性、特异性及二维(2D)和三维(3D)结构。IMGT包括三个序列数据库(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB、IMGT/PRIMERDB)，一个基因组数据库(IMGT/GENE-DB)、一个3D结构数据库(IMGT/3Dstructure-DB)，及一系列网站资源(“IMGT Marie-Paule page”)和交互工具。
V-BASE(I.M.Tomlinson,2002；World Wide Web(www)mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASE是从一千个以上的公开序列汇编的所有人抗体种系可变区序列的综合目录。其包括排列软件版本DNAPLOT(由Hans-Helmar Althaus和Werner Müller开发)，其容许重排的抗体V基因指派为其最接近的种系基因区段。
Antibodies—Structure and Sequence(A.C.R.Martin,2002；World Wide Web(www)bioinf.org.uk/abs)。这个页面概括了关于抗体结构和序列的有用的信息。其提供了Kabat抗体序列数据的查询界面，关于抗体的一般信息，晶体结构以及其它抗体相关信息的链接。其还分配在Protein Databank(PDB)中保藏的所有抗体结构的自动化概括。特别感兴趣的是对抗体可变区的各种编号方案的彻底描述和对比。
AAAAA(A Ho’s Amazing Atlas of Antibody Anatomy；A.Honegger,2001；WorldWide Web(www)unizh.ch/～antibody)。这个资源包括结构分析、建模和工程化的工具。其采用统一方案综合抗体和T细胞受体序列的结构排列，并包括Excel macros以进行抗体分析和图示。
WAM(Web Antibody Modeling；N.Whitelegg and A.R.Rees,2001；World WideWeb(www)antibody.bath.ac.uk).由the Centre for Protein Analysis and Design atthe University of Bath,United Kingdom主持。基于AbM包装(先前由Oxford Molecular销售)使用确立的理论方法组合构建抗体Fv序列的3D模型，这个网站也包括最新的抗体结构信息。
Mike’s Immunoglobulin Structure/Function Page(M.R.Clark,2001；WorldWide Web(www)path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html)。这些页面提供关于免疫球蛋白结构和功能的教育材料，通过许多彩色图、模型和动画例证。可获得抗体人源化及MikeClark’s Therapeutic Antibody Human Homology Project的另外信息，其目的是使临床效力与治疗性抗体的可变区序列的抗免疫球蛋白应答相关联。
The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page,2000；World WideWeb(www)antibodyresource.com)。这个网站其自身描述是“抗体研究和供应商的完全指导”。提供了氨基酸测序工具、核苷酸抗体测序工具及杂交瘤/细胞培养数据库的链接。
Humanization bY Design(J.Saldanha,2000；World Wide Web(www)people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s)。这个资源提供了关于抗体人源化技术的综述。最有用的特征是超过40个的公开的人源化抗体的可搜索数据库(通过序列和文本)，包括设计问题、构架选择、构架反突变及人源化构建体的结合亲和性的信息。
也见Antibody Engineering Methods and Protocols,Ed.Benny K C Lo,Methods in Molecular BiologyTM,Human Press，及World Wide Web(www)blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-enginee ring-methods-and-protocols.pdf。
从中可获得B细胞的样品包括但不限于血液、血清、脾、脾组织、骨髓、淋巴、淋巴结、胸腺和阑尾。抗体和免疫球蛋白链可以得自每个先前提及的样品及也可得自如下非限制性的B细胞、腹水、杂交瘤和细胞培养物。
在本发明任何构型的一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的基因组已经被修饰为阻止或降低完全内源性抗体或重链的表达。为此的合适技术例如可见于WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364,、WO2009/076464、EP1399559和US6586251，所述文献并入本文作参考。在一个实施方案中，所述非人脊椎动物的内源性重链免疫球蛋白基因座的VDJ区及任选所述内源性轻链免疫球蛋白基因座(λ和/或κ基因座)的VJ区已经失活。例如，所有或部分非人脊椎动物VDJ区是通过哺乳动物内源性重链免疫球蛋白基因座中的倒位而失活，任选倒位区在所述内源性Ig基因座的上游或下游移动。例如，所有或部分非人脊椎动物VJ区通过在哺乳动物的内源性κ链免疫球蛋白基因座中的倒位而失活，任选倒位区在所述内源性Ig基因座的上游或下游移动。例如，所有或部分非人脊椎动物VJ区通过在哺乳动物的内源性λ链免疫球蛋白基因座中的倒位而失活，任选倒位区在所述内源性Ig基因座的上游或下游移动。在一个实施方案中，所述内源性重链基因座以内源性κ和λ基因座之一或这二者的此方式失活。
另外或或者，所述脊椎动物在阻止成熟宿主B和T淋巴细胞产生的遗传背景、任选在RAG-1-缺陷和/或RAG-2缺陷背景中产生。见US5859301关于产生RAG-1缺陷动物的技术。
在本发明的脊椎动物或细胞的任何构型的一个实施方案中，所述基因组包含抗体轻链基因座，其包含所有或部分人Igλ基因座，所述基因座包含至少一个人Jλ区和至少一个人Cλ区，任选Cλ6和/或Cλ7。任选地，所述轻链基因座包含多个人Jλ区，任选Jλ1、Jλ2、Jλ6和Jλ7的两或更多个，任选所有Jλ1、Jλ2、Jλ6和Jλ7。所述人λ免疫球蛋白基因座包含由系列J-C簇组成的一个独特的基因结构。为了利用这个特征，本发明在任选方面应用一或多个这种人J-C簇。因此，任选所述轻链基因座包含至少一个人Jλ-Cλ簇，任选至少Jλ7-Cλ7。这种转基因的构建通过能使用所有或部分人λ基因座而促进，由此所述转基因在种系构型中包含一或多个J-C簇，有利地还在人基因座的所述簇之间和/或在相邻的J与C区之间包含插入序列。这保护了插入序列内的任何调节元件，其可参与VJ和/或JC重组及可以被内源性AID(激活诱导的脱氨酶)识别。
本发明一方面提供了编码本发明的多肽、抗体、链或者衍生物的核苷酸序列，任选其中所述核苷酸序列是载体的一部分。合适的载体为本领域技术人员显而易见，例如常规的抗体表达载体，其包含所述核苷酸序列及与一或多个表达控制元件可操纵地连接在一起。
本发明一方面提供了药物组合物，其包含本发明的多肽、抗体、链或衍生物以及稀释剂、赋形剂或运载体(carrier)，任选其中所述组合物包含于IV容器内(例如IV包)或者与IV注射器连接的容器内。
本发明一方面提供了本发明的多肽、抗体、链或衍生物在生产治疗和/或预防人患者中疾病或状况的药物中的应用。
技术人员熟知标准的克隆技术和重组DNA技术，见例如Sambrook,J and Russell,D.(2001,3’d edition)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLab.Press,Plainview,NY)。
在进一步的方面中，本发明涉及根据本发明产生的人源化抗体和抗体重链，及所述抗体在人类医药中的应用。本发明还涉及药物组合物，其包含这种抗体或重链及药物可接受的运载体或其他赋形剂。
产生单克隆和多克隆抗体的方法为本领域熟知，本发明涉及在本发明的脊椎动物或细胞中应答抗原攻击产生的完全人源化的抗体和重链的多克隆和单克隆抗体。
再一方面，本发明涉及本发明的非人脊椎动物在抗体链库集背景中分析药物和疫苗的可能作用中的应用。
本发明还涉及鉴别或确认药物或疫苗的方法，所述方法包括为本发明的脊椎动物输送所述疫苗或药物及监测免疫应答、安全性谱、对疾病的作用中的一或多项。
本发明还涉及试剂盒，其包含本文揭示的抗体、多肽、链或衍生物及使用其的指导，任选具有合适的实验室试剂如缓冲剂、抗体检测试剂。
本发明还涉及产生抗体或其一部分的方法，所述方法包括提供：
(i)编码使用本发明的脊椎动物或细胞获得的多肽、抗体或链的核酸；或者
(ii)序列信息，从中编码使用本发明的脊椎动物或细胞获得的抗体、多肽或链的核酸可以表达，以产生抗体、链或多肽。
在一个实施方案中，每个脊椎动物是非人脊椎动物、小鼠或大鼠，其基因组包含：
(a)如上文定义的重链基因座；及
(b)抗体κ轻链基因座和/或抗体λ链基因座；
其中所述基因座中所有的V、D和J是人V、D和J；
其中内源性抗体重链和轻链表达已经失活；及
任选其中所述基因组对于所述重链和轻链基因座是纯合的。这可用于在所述脊椎动物中产生抗体和链中的可预测的仅人N-末端可变结构域。
在一个实施方案中，每个κ链基因座包含基本上完整的人功能性Vκ和Jκ库集；及每个λ链基因座包含基本上完整的人功能性Vλ和Jλ库集。“功能性”在此是指可排除Ig基因区段假基因和非功能性人Ig基因区段。
在一个实例中，本发明的基因基因座是重链基因座，其包含所述第一转换序列的S-μ转换序列(例如内源性S-μ)及所述第二转换序列的S-γ转换序列(例如内源性S-γ)。例如，所述C-μ区和转换序列是小鼠129C-μ区和转换序列；或者所述C-μ区和转换序列是小鼠Black 6C-μ区和转换序列。在另一实施方案中(其中所述非人脊椎动物物种是小鼠或大鼠)，S-μ是大鼠Sμ，C-μ区是小鼠的，任选是小鼠非-μC区3’的S-γ。
一方面，每个脊椎动物是小鼠，其遗传背景选自小鼠品系C57BL/6、M129，如129/SV、BALB/c，以及C57BL/6、M129的任何杂种如129/SV或BALB/c。
在一个实施方案中，本发明每个基因座的J阶段是人JH基因区段；任选其中每个重链基因座包含人JH基因区段的基本完整的功能性库集。
在一个实施方案中，本发明的每个基因座包含至少2、3、4、5或6个不同的人JH基因区段。
在一个实施方案中，本发明每个基因座的D区段是人D基因区段；任选其中每个重链基因座包含人D基因区段的基本完整的功能性库集。
在一个实施方案中，本发明的每个基因座包含至少5、10、15、20、25、26或27个不同的人D基因区段。
在一个实施方案中，每个重链基因座包含至少两个人JH基因区段，选自J1、J2、J3、J4、J5和J6；任选该组所有的基因区段。
在一个实施方案中，每个重链基因座包含人VH基因区段，选自：V6-1、V1-2、V1-3、V4-4、V7-41、V2-5、V3-7、V1-8、V3-9、V3-11、V3-15、V1-18、V3-20、V3-21、V3-23、V1-24、V2-26、V4-28、V3-30、V4-31、V3-33、V4-34、V4-39、V3-43、V1-45、V1-46、V3-48、V3-49、V5-51、V3-53、V1-58、V4-59、V4-61、V3-64、V3-66、V1-69、V2-70、V3-72、V3-73和V3-74；其中VH基因库集包含基本完全的人功能性VH基因库集。
在一个实施方案中，在本发明的脊椎动物或细胞中内源性抗体重链表达已经失活。例如，低于10、5、4、3、2、1或0.5％(或0)的重链由内源性重链提供(即重链其可变区衍生自非人脊椎动物V、D和J基因区段的重组)。
在一个实施方案中，库集的VL基因区段可以是重组的VL，即作为衍生自人VL与JL重组的可变区序列的一部分提供(例如其中VL和JL是人VL和JL)。
在一个实施方案中，每个轻链基因座的J区段是人JL基因区段；任选其中每个轻链基因座包含人Jκ或Jλ基因区段的基本完全的功能性库集(例如每个基因座包含人Vλ基因区段和Jλ基因区段，任选人Jλ基因区段的基本完全的功能性库集；或者每个基因座包含人Vκ基因区段和Jκ基因区段，任选人Jκ基因区段的基本完全的功能性库集)。
在一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞基因组的κ链库集包含功能性人Vκ基因区段的基本上完全的库集；任选提供至少5个不同的人Jκ基因区段及至少40个不同的人Vκ基因区段。
在一个实施方案中，所述κ链库集包含至少20、25、30、35或40个不同的人Vκ基因区段。
在一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞基因组的λ链库集包含功能性人Vλ基因区段的基本完全的库集；任选提供至少5个不同的人Jλ基因区段和至少40个不同的人Vλ基因区段。
在一个实施方案中，所述λ链库集包含至少20、25、30、35或40个不同的人Vλ基因区段。
在一个实施方案中，所述脊椎动物或细胞的每个轻链基因座包含至少2、3、4、5或6个不同的人Jκ或Jλ基因区段。
在一个实施方案中，在所述脊椎动物或细胞中内源性抗体κ和/或λ轻链表达已经失活。
为了在本发明方法中选择抗体、链或多肽，希望的抗体/链/多肽特性例如是结合预定抗原或表位的亲和性(例如通过表面等离子体共振确定)、与已知抗体竞争结合预定抗原或表位、表位特异性(例如通过X射线晶体学确定，与已知抗体竞争抗原结合，其中已知抗体特异性结合所述抗原(例如通过表面等离子体共振确定，如BiacoreTM或ProteonTM)、在ELISA或另一免疫测定中的性能、希望的生物物理学特性(例如解链温度，pI，溶液状态，聚集程度，贮存模式等)。在一个实施方案中，亲和性是通过表面等离子体共振确定的。
用于本发明中的免疫方法为本领域技术人员熟知，可包括传统的初免-加强方案、RIMMS或任何其它方案。佐剂可以与抗原一起给予，如本领域所已知的。
衍生抗体/链/多肽(根据本发明的任何方面)例如是与分离的抗体或链或多肽相比具有一或多个突变(例如以改良抗原结合亲和性和/或增强或失活Fc功能)的抗体/链/多肽。这种突变体特异性结合所述抗原。产生衍生物的突变或修改包括例如产生Fc增强或失活的突变。衍生物可以是在与毒性荷载或报道分子或标记或其它活性成分缀合后的抗体或链或多肽。
在一个实施方案中，所述脊椎动物是首次用于实验的(即如本领域所理解的这个术语，未用预定抗原免疫过的；例如在用于R&D的动物房提供的相对无菌环境中保持的这种脊椎动物)。在另一实例中，所述脊椎动物已经用预定抗原免疫，例如携带人表位的抗原。
在一个实施方案中，所述方法包括从根据希望的特性(例如结合抗原的亲和性)的所述群或库集中选择一或多个抗体重链(例如作为抗体的一部分)。
例如预期通过使用本发明，脾区室和/或骨髓B祖细胞区室中B细胞的比率基本不改变，及血清中免疫球蛋白水平是正常的，及正确的Ig亚型被表达。这表明本发明的基因座(例如重链基因座包含插入至少人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1，及所有人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27；及J1、J2、J3、J4、J5和J6)对于从转基因重链基因座的VDJ基因区段重排、B细胞受体(BCR)信号传导和适当的B细胞成熟是完全功能性的。
因此，一方面，预期本发明的小鼠可例如表达正常的相对比例的血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgM抗体。
“正常的”是指与在仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)中的表达是类似的，例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠，例如野生型小鼠。
因此，一方面，预期本发明的小鼠可例如表达：
(i)浓度为大约25-350μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-800μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-300μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-600μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-700μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
通过在平板上Ig捕获，随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在室温1小时，例如在20℃保温1小时)并使用所述标记量化Ig而确定(例如使用均与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，以在具有0.1％TweenTM的PBS中1/10000的比率缀合，随后在室温(例如20℃)在黑暗中使所述标记与四甲基联苯胺底物(TMB)生色4-5分钟，加入硫酸以终止标记生色，及在450nm读取标记)。
因此，一方面，预期本发明的小鼠可例如表达：
(i)浓度为大约25-150μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-300μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-200μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-200μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-400μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
通过在平板上Ig捕获，随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在室温1小时，例如在20℃保温1小时)并使用所述标记量化Ig而确定(例如使用均与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，以在具有0.1％TweenTM的PBS中1/10000的比率缀合，随后在室温(例如20℃)在黑暗中使所述标记与四甲基联苯胺底物(TMB)生色4-5分钟，加入硫酸以终止标记生色，及在450nm读取标记)。
因此，一方面，预期本发明的小鼠可例如以如下相对比率表达Ig：
(i)浓度为大约25-150μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-200μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约30-300μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-200μg/ml的血清IgM；
或者
(i)浓度为大约10-200μg/ml的血清IgG1；
(ii)浓度为大约0-500μg/ml的血清IgG2a；
(iii)浓度为大约20-400μg/ml的血清IgG2b；及
(iv)浓度为大约50-700μg/ml的血清IgM；
通过在平板上Ig捕获，随后与抗小鼠同种型特异性标记的抗体保温(例如在室温1小时，例如在20℃保温1小时)并使用所述标记量化Ig而确定(例如使用均与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠Ig同种型特异性抗体，以在具有0.1％TweenTM的PBS中1/10000的比率缀合，随后在室温(例如20℃)在黑暗中使所述标记与四甲基联苯胺底物(TMB)生色4-5分钟，加入硫酸以终止标记生色，及在450nm读取标记)。
因此，一方面，预期本发明的小鼠可例如在小鼠中表达来自脾B细胞的重链，所述小鼠产生正常比率或百分比的成熟脾B细胞，例如通过FACS确定。
“正常的”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)中成熟脾B细胞产生类似，例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠，例如野生型小鼠。
例如，由本发明的小鼠产生的至少40、50、60或70％的总脾B细胞是成熟B-细胞。脾B-细胞是B220+及以相对高水平表达B220，如本领域技术人员所已知。成熟脾B-细胞表达B220和IgD，均以相对高水平表达，如本领域技术人员所已知。在成熟脾B-细胞中，IgM表达相对低，再如本领域技术人员所已知。例如见J Exp Med.1999Jul 5；190(1):75-89；“Bcell development in the spleen takes place in discrete steps and isdetermined by the quality of B cell receptor-derived signals”；Loder F et al.所述。
任选地，所述小鼠产生正常比率的T1、T2及成熟脾B细胞，例如通过FACS确定。例如，本发明的小鼠产生大约40-70％成熟脾B-细胞、15-35％脾T1细胞及5-10％脾T2细胞(百分比是与全部脾B220-阳性(高)细胞群相比)。例如，大约40-60％成熟脾B-细胞、15-30％脾T1细胞及5-10％脾T2细胞。“正常的”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)中T1/T2/成熟脾B细胞比例类似，例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠，例如野生型小鼠。
因此，一方面，预期本发明的小鼠可例如在小鼠中表达重链，所述小鼠产生正常比率或百分比的骨髓B细胞祖细胞(例如通过FACS确定)。
在一个实施方案中，所述小鼠用于在小鼠中表达所述重链，所述小鼠产生正常比率或百分比的骨髓前(pre-)、原(pro-)和前原(prepro-)B-细胞(例如通过FACS确定)。更多关于祖细胞的讨论见J Exp Med.1991May1；173(5):1213-25；“Resolution andcharacterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bonemarrow”；Hardy RR et al所述。
“正常的”是指与仅表达小鼠抗体链的小鼠(例如首次用于实验的小鼠)中骨髓B细胞产生类似，例如其基因组仅包含野生型功能性Ig重链和轻链基因座的小鼠，例如野生型小鼠。
在这种小鼠的一个实例中，至少90％的重链是包含人可变区的重链。例如，至少90、95、96、97、98、99或99.5％或100％的重链包含人可变区，即衍生自人VH与人D和JH基因区段重组的可变区。
在一个实施方案中，所述脊椎动物、小鼠或细胞的基因组包含人κ基因区段：
(i)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8和Vκ1-9(及任选Vκ5-2和Vκ4-1)；或者
(ii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20(及任选Vκ2-24和/或Vκ1-13)；或者
(iii)Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ3-20、Vκ2-24、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-30和Vκ1-33(及任选Vκ2-29和/或Vκ2-40和/或Vκ1-39)；
及任选地包含
(iv)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
在一个实施方案中，所述基因组还包含：(i)至少人VH基因区段VH2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、6-1及所有人D和JH基因区段D1-1、2-2、3-3、4-4、5-5、6-6、1-7、2-8、3-9、5-12、6-13、2-15、3-16、4-17、6-19、1-20、2-21、3-22、6-25、1-26和7-27，及J1、J2、J3、J4、J5和J6；以及(ii)至少人基因区段Vκ2-24、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-13、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2、Vκ4-1、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。
LOX位点
新的Lox变体在如下实例中描述(lox2272/66和lox2272/71)。这些可用于位点特异性重组(例如在ES细胞或其它核酸来源中)。进一步地，由于这些位点不是相容的，因此其可用于RMCE(重组酶介导的盒交换)。因此，本发明包括：
位点特异性重组位点，其是lox2272/66。序列在下文提供。
位点特异性重组位点，其是lox2272/71。序列在下文提供。
lox2272/66:5’-ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAcggta-3’
lox2272/71:5’-taccgTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTAT-3’
包含lox2272/66和/或lox2272/71的DNA载体或DNA序列。例如，所述载体或序列包含侧翼是lox2272/66和lox2272/71的核苷酸序列(例如基因或基因区段序列)；任选其中lox位点是彼此相反的(这可用于固定插入基因组中的序列，如在实施例中解释)。在这个意义上，lox2272/66在所述核苷酸序列的5’(例如立即5’)，及lox2272/71在所述序列的3’(例如立即3’)。在另一实例中，lox2272/71在所述核苷酸序列的5’(例如立即5’)，及lox2272/66在所述序列的3’(例如立即3’)。在一个实例中，所述DNA序列是细胞基因组、例如ES细胞基因组或者B细胞基因组或者杂交瘤基因组或者iPS细胞基因组的一部分。
发明陈述
本发明的各个方面在如下条款中陈述。
1.
多价
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一转换序列、μ恒定区、第二转换序列及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座均能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及
其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
或者
体内指导选择
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含Ig基因座，其包含(5’至3’方向)：(i)未重排的人可变区(例如重链可变区)以编码第一个可变结构域，(ii)编码任选的接头的序列，及(iii)重排的第二个可变结构域(例如VL结构域)的序列，其中序列(i)能经历重排，由此所述脊椎动物产生均具有表位结合位点的抗体链，其包含衍生自序列(i)和(iii)的第一个和第二个可变结构域，其中在第一个和第二个可变结构域之间无其它抗体结构域。
任选地，当所述基因座是重链基因座时，(i)、(ii)和(iii)是S-μ的5’。任选地，当所述基因座是重链基因座时，(i)是S-μ的5’，且(ii)和(iii)在S-μ下游。
或者
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区(例如重链可变区)、第一个转换序列、μ恒定区、第二个转换序列及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及
其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及第一个可变结构域(例如VL结构域)的核苷酸序列，其中在同种型转换之后，所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，包含分别衍生自第一个可变结构域核苷酸序列和所述重链基因座的可变区的第一个和第二个抗体可变结构域。
2.
多价
非人脊椎动物细胞(例如小鼠或大鼠细胞)，所述细胞基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一个转换序列、μ恒定区、第二个转换序列及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座均能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及
其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，以表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
或者
体内指导选择
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含Ig基因座，其包含(5’至3’方向)：(i)未重排的人可变区(例如重链可变区)以编码第一个可变结构域，(ii)编码任选的接头的序列，及(iii)重排的第二个可变结构域(例如VL结构域)的序列，其中序列(i)能经历重排，由此所述细胞产生均具有表位结合位点的抗体链，其包含衍生自序列(i)和(iii)的第一个和第二个可变结构域，其中在第一个和第二个可变结构域之间无其它抗体结构域。
或者
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，所述细胞基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区(例如重链可变区)、第一个转换序列、μ恒定区、第二个转换序列及非-μ(例如γ)恒定区；其中每个细胞的重链基因座能经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换；及
其中
(ii)所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和第一个可变结构域(例如VL结构域)的核苷酸序列，以表达多肽链，其包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，包含分别衍生自第一个可变结构域核苷酸序列及所述重链基因座可变区的第一个和第二个抗体可变结构域。
3.条款1的脊椎动物或条款2的细胞，其中所述基因组包含功能性抗体轻链基因座，以表达轻链；其中所述细胞可表达包含IgM-型重链和轻链的IgM抗体。
4.条款3的脊椎动物或细胞，其中所述轻链基因座包含关闭轻链表达的构件，其中在IgM至非-μ同种型转换后，功能性轻链不被表达。
5.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)：(a)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分及非-μ(例如γ)恒定结构域(例如γFc)，或者(b)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、非-μ(例如γ)恒定结构域(例如γFc)、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
6.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中所述非-μ恒定区是γ恒定区，及所述重链基因座能经历同种型转换以产生IgG抗体，其在不存在轻链时包含一或多个IgG重链，每个重链均缺少CH1结构域。
7.
多价
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含抗体重链基因座，所述基因座包含(5’至3’方向)重排的可变区及非-μ(例如γ)恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
在一个实施方案中，在重排的可变区与非-μ恒定区之间没有μ恒定区。
或者
体内指导选择
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含抗体重链或轻链基因座，所述基因座包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头的核苷酸序列及编码第一个可变结构域的重排的可变区，其中在同种型转换之后，所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，其包含分别衍生自重排的第二个可变结构域核苷酸序列和第一个可变结构域核苷酸序列的的第二个和第一个抗体可变结构域，其中第二个核苷酸序列在所述脊椎动物中已经重排。
8.非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或杂交瘤，所述细胞基因组包含(5’至3’方向)重排的可变区和非-μ恒定区；
其中
所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头的核苷酸序列和编码第一个可变结构域的重排的可变区，以表达包含(N-至C-末端方向)表位结合位点的多肽链，所述表位结合位点包含分别衍生自重排的第二个可变结构域核苷酸序列和第一个可变结构域核苷酸序列的第二个和第一个抗体可变结构域，其中第二个核苷酸序列在细胞中已经重排。
在所述脊椎动物或细胞的一个实施方案中，在编码第一个可变结构域的重排的可变区与非-μ恒定区之间无μ恒定区。
9.条款7的脊椎动物或条款8的细胞，其中所述重链基因座已经经历IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换。
10.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中提供所述接头和/或表位结合部分核苷酸序列代替非-μ恒定区中CH1结构域基因区段。
或者
前述任何条款的脊椎动物或细胞，其中提供所述接头或第一个可变结构域核苷酸序列代替非-μ恒定区中CH1结构域基因区段。
11.
多价
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞的基因组均包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区和第二个区域：
其中
第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中在免疫之后，所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
或者
体内指导选择
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞的基因组包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)未重排的可变区(例如重链可变区)和第二个区域(其是非-μ恒定区)；
其中
第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和第一个可变结构域(例如VL结构域)的核苷酸序列，其中在免疫之后，所述脊椎动物表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，其包含分别衍生自第一个可变结构域核苷酸序列和所述轻链基因座可变区的第一个和第二个抗体可变结构域。
12.
多价
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或杂交瘤，其中所述细胞基因组包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区和第二个区域；
其中
第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，以表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
或者
体内指导选择
非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或杂交瘤，其中细胞基因组包含抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)未重排或重排的可变区(例如重链可变区)及第二个区域；
其中
第二个区域包含(5’至3’方向)编码任选的接头和第一个可变结构域(例如VL结构域)的核苷酸序列，以表达多肽链，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)表位结合位点，所述表位结合位点包含分别衍生自第一个可变结构域核苷酸序列和所述轻链基因座可变区的第一个和第二个抗体可变结构域。
13.条款11的脊椎动物或者条款12的细胞，其是根据条款1-10任一项的脊椎动物或细胞。
14.条款13的非人脊椎动物或细胞，其中基因组包含所述重链和轻链基因座，其中所述衍生自重链基因座的多肽链可变结构域与衍生自轻链基因座的多肽链可变结构域形成结合位点，其中所述结合位点特异性结合第一表位。
15.条款14的脊椎动物或细胞，其中衍生自重链和轻链基因座的多肽链的表位结合部分是抗体可变结构域，其中衍生自重链基因座的链的表位结合结构域与衍生自轻链基因座的链的表位结合结构域相关，形成特异性结合第二表位的结合位点。
16.一种产生多价多肽链的方法，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位，所述方法包括：
(a)在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中在幼B-细胞中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座中表达的重链和轻链；
(b)用携带第一表位的第一个预定的抗原免疫所述脊椎动物，获得同种型转换以表达至少一些重链基因座中的非-μ(例如γ)恒定区及表达已经经历体细胞高变的可变区；及
(c)通过选择结合所述第一表位的可变区而从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
其中所述方法包括：
(d)在脊椎动物基因组中重链基因座的非-μ恒定区中提供表位结合部分的核苷酸序列，其中在步骤(c)中选择的多肽链结合第一和第二表位。
17.条款16的方法，其中步骤(b)中每个体细胞突变的可变区是由缺少CH1结构域的非-μ-型(例如IgG-型)重链提供的。
18.条款16或17的方法，其中步骤(b)包括在不存在轻链表达时表达体细胞突变的可变区。
19.一种在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中产生多价多肽链的方法，所述多肽链包含(N-至C-末端方向)抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位，所述方法包括：
(a)用携带第一表位的第一个预定的抗原免疫所述脊椎动物，获得同种型转换以表达所述脊椎动物的至少一些重链基因座中的非-μ(例如γ)恒定区及表达已经经历体细胞高变的可变区；及
(b)通过选择结合所述第一表位的可变区而从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
其中
(d)在脊椎动物基因组中重链基因座的非-μ恒定区中提供表位结合部分的核苷酸序列，其中在步骤(b)中选择的多肽链结合第一和第二表位。
20.条款19的方法，其中步骤(a)中每个体细胞突变的可变区是由缺少CH1结构域的非-μ-型(例如IgG-型)重链提供的。
21.条款19或20的方法，其中步骤(a)包括在不存在轻链表达时表达体细胞突变的可变区。
22.条款19-21任一项的方法，其中所述脊椎动物是根据条款1-15任一项所述的脊椎动物。
23.条款19-22任一项的方法，进一步包括分离或合成包含编码在所述方法中选择的多肽链的核苷酸序列的核酸，及任选人源化所述序列。
24.通过条款19-23任一项的方法获得的多特异性多肽链或其衍生物，其特异性结合第一和第二表位。
25.多价(例如多特异性)多肽链，其具有(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C，其中：
(i)V是特异性结合第一表位的抗体可变结构域，
(ii)X是不存在、抗体铰链区或者包含恒定结构域的抗体恒定区，
(iii)每个L均是任选的接头，
(iv)E是特异性结合第二表位的表位结合部分，及
(v)C是不存在或者是包含恒定结构域的抗体恒定区(例如C是人γFc)，
其中V是重排的抗体可变结构域，衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID-模式体细胞高变。
26.一种产生条款25的多肽链的方法，所述方法包括用第一表位免疫非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，导致也编码表位结合部分(E)、编码V的可变区基因的核苷酸序列中可变区基因的体细胞高变；及分离包含V和E的所述多肽链。
27.条款25的多肽或者条款26的方法，其中所述表位结合部分缺少内源性AID模式体细胞高变。
28.条款25的多肽或条款26的方法，其中所述表位结合部分包含内源性AID模式体细胞高变。
29.条款25-28任一项的多肽的二聚体，其中所述二聚体缺少抗体轻链。
30.条款25-29任一项的多肽、二聚体或方法，其中所述多肽具有(N-至C-末端方向)结构V-N-E、V-CH1-M-CH2-CH3-L-E或者V-M-CH2-CH3-L-E，其中N是与任选抗体铰链区一起的L，M是任选的抗体铰链区。
31.条款25-30任一项的多肽、二聚体或方法，其中V是与第二个抗体可变结构域(V2)键合的肽，形成特异性结合第一表位的包含第一个和第二个可变结构域的结合位点，任选其中V和V2以scFv提供。
32.条款25-31任一项的多肽、二聚体或方法，其中所述多肽缺少CH1结构域。
33.条款25-31任一项的多肽、二聚体或方法，其中所述多肽包含CH1结构域，及所述多肽存在于抗体中第一个和第二个拷贝中，第一个多肽与第一个抗体轻链结合，第二个拷贝与第二个抗体轻链结合。
34.包含条款25-33任一项的二聚体、多肽链或其人源化形式的抗体。
35.包含重链二聚体的二价(例如双特异性)抗体，其中每个重链是如条款25、27、28和30-33任一项的多肽，及具有结构(N-至C-末端方向):
V-CH1-M-CH2-CH3-L-E，
V-M-CH2-CH3-L-E，
V-L-E-L-CH1-M-CH2-CH3，
V-L-E-L-M-CH2-CH3，
V-CH1-N-E，
V-L-E-N-CH1或者
V-N-E-L-CH1，
其中N是与任选的抗体铰链区一起的L，M是任选的抗体铰链区；
任选地，其中所述恒定结构域是人恒定结构域。
36.条款35的抗体，其中所述抗体包含轻链的两个拷贝，每个重链与各自的轻链结合，其中每个重链中的V与其各自的轻链的可变结构域形成抗原结合位点，每个轻链的可变结构域包含内源性AID模式的体细胞高变。
37.多价(例如所特异性)抗体，其包含与轻链相关的重链，其中：
每个重链是条款25和27-35任一项所述的多肽链，其中E是抗体可变结构域；
每个轻链是具有(N-至C-末端方向)结构V’-L’-E’-L’-C’的多肽链，其中
(i)V’是抗体可变结构域，
(ii)每个L’是任选的接头，
(iv)E’是表位结合部分，及
(v)C’是不存在或者是包含恒定结构域的抗体恒定区(例如C’是人CL)；
其中
V’是重排的抗体可变结构域，衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码E’的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
V’包含内源性AID模式体细胞高变；
V和V’形成特异性结合第一表位的第一个结合位点；及
任选地，当E’是抗体可变结构域时，E和E’形成特异性结合第二表位的第二个结合位点。
38.包含蛋白质支架的抗原结合多肽，其与一或多个表位结合部分连接，其中所述抗原结合多肽包含至少两个表位结合位点，至少一个由表位结合部分提供，及至少一个由与第二个抗体可变结构域配对的第一个抗体可变结构域提供，
其中每个可变结构域是重排的抗体可变结构域，衍生自非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码一或多个表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
或者
包含蛋白质支架的抗原结合多肽，所述支架与一或多个表位结合部分连接，其中所述抗原结合多肽包含至少两个表位结合位点，至少一个由表位结合部分提供，及至少一个由与第二个抗体可变结构域配对的第一个抗体可变结构域提供，
其中第一个可变结构域是重排的抗体可变结构域，衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码第二个可变结构域及一或多个表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的第一个抗体可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
39.条款38的多肽，其包含至少一个通过肽接头与蛋白质支架连接的所述表位结合部分，所述肽接头包含至少10个氨基酸(例如10-50个氨基酸)。
40.条款25和27-39任一项的多特异性抗原结合多肽、二聚体或抗体，其通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原(例如人CD3)能募集人免疫效应细胞的活性，所述多肽、二聚体或抗体的第一个表位结合位点能特异性结合所述效应抗原，以及所述多肽、二聚体或抗体的第二个表位结合位点能特异性结合除了效应抗原之外的靶抗原(例如人EpCAM或人CD19)；任选其中所述靶抗原位于除所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上。
41.前述任何条款的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中第二个表位是由人免疫效应细胞抗原(例如人CD3)提供的。
42.前述任何条款的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中第一个表位由除了效应抗原之外的靶抗原(例如人EpCAM或者人CD19)提供；任选其中所述靶抗原是除了所述人免疫效应细胞之外的靶细胞的抗原。
43.前述任何条款的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中所述表位结合部分选自抗体可变结构域(例如VL或VH，抗体单一可变结构域(结构域抗体或dAb)，骆驼VHH抗体单一可变结构域，鲨鱼免疫球蛋白单一可变结构域(NARV)，NanobodyTM或骆驼源化VH单一可变结构域)；T-细胞受体结合结构域；免疫球蛋白超家族结构域；agnathan可变淋巴细胞受体；纤连蛋白结构域(例如AdnectinTM)；抗体恒定结构域(例如CH3结构域，例如FcabTM的CH2和/或CH3)，其中所述恒定结构域不是功能性CH1结构域；scFv；(scFv)2；sc-双抗体；scFab；衍生自选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的centyrin和表位结合结构域；脂笼蛋白结构域；蛋白质A如蛋白质A的Z-结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A-结构域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热激蛋白(如及衍生自GroEI和GroES的表位结合结构域)；运铁蛋白结构域(例如trans-body)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C-型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人γ-晶体蛋白或人遍在蛋白(affilin)；PDZ结构域；蝎毒素；及人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
44.前述任何条款的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中所述或每个N-末端可变结构域或5’-末端可变区是人可变结构域或人可变区。
45.前述任何条款的脊椎动物、细胞多肽、二聚体或抗体，其中每个恒定区或结构域是内源性非人脊椎动物恒定区或结构域。
46.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中
(a)所述脊椎动物表达IgM抗体，其包含分别由抗体重链和轻链基因座编码的重链和轻链；
(b)所述脊椎动物能表达非-μ(例如IgG)抗体，每个非-μ抗体重链缺少功能性CH1结构域；及
(c)所述IgM抗体由淋巴细胞表达，每个细胞包含功能性轻链基因座以表达由所述细胞表达的IgM抗体的轻链；及
其中
(d)所述非-μ抗体由淋巴细胞表达，每个细胞均缺少功能性轻链基因座，其中非-μ抗体在不存在轻链表达时由所述细胞表达。
47.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，其基因组包含：
(i)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一个转换序列、μ恒定区、第二个转换序列及缺少CH1基因区段的非-μ(例如γ)恒定区；
(ii)功能性抗体轻链基因座以表达轻链；
其中所述细胞可表达包含IgM-型重链和轻链的IgM抗体；
其中每个细胞的重链基因座能经历同种型转换以产生非-μ(例如IgG)抗体，其在不存在轻链时包含一或多个非-μ-型(例如IgG-型)重链，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件，其中功能性轻链在同种型转换为所述非-μ-型抗体之后不被表达。
48.非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其中所述细胞基因组包含：
(i)功能性抗体轻链以表达轻链；
(ii)抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、第一个转换序列、μ恒定区、第二个转换序列和缺少CH1基因区段的非-μ(例如γ)恒定区，以表达包含IgM-型重链和轻链的IgM抗体；及IgM至非-μ(例如IgG)同种型转换以产生非-μ(例如IgG)抗体，其在不存在轻链时包含一或多个非-μ-型重链，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件，其中功能性轻链在同种型转换为所述非-μ-型抗体之后不被表达。
49.条款46-48任一项的脊椎动物或细胞，其中关闭轻链表达的构件包括核苷酸序列(例如轻链可变区或者轻链基因座的CL区)，其是从所述轻链基因座中表达功能性轻链所必需的，其中所述核苷酸序列是在表达IgM的幼B-细胞中是功能性的，但是所述核苷酸序列在表达所述非-μ-型抗体的成熟B-细胞中不存在或者基本上是非功能性的。
50.条款46-49任一项的脊椎动物或细胞，其中关闭轻链表达的构件包括核苷酸序列，其包含调节元件(例如启动子)以在表达IgM的幼B细胞中驱动从所述轻链基因座的轻链表达，其中调节元件在表达所述非-μ-型抗体的成熟B-细胞中基本上是失活的或者不存在。
51.条款49或50的脊椎动物或细胞，其中所述核苷酸序列或调节元件侧翼是第一个和第二个组合元件(例如位点特异性重组元件)，及其中所述基因组包含编码相应重组酶或转座酶的基因，其中所述基因在表达IgM的幼B细胞中是失活的，但是在表达所述非-μ-型抗体的成熟B-细胞中是活性的，以切割第一个和第二个重组元件及失活所述核苷酸序列或调节元件。
52.条款50的脊椎动物或细胞，其中所述调节元件在表达IgM的幼B细胞中被诱导和/或在表达所述非-μ-型抗体的成熟B-细胞中被抑制。
53.条款46-48任一项的脊椎动物或细胞，其中关闭轻链表达的构件是基因组中的另一基因座，以表达包含重排的轻链可变结构域的多肽链。
54.条款53的脊椎动物或细胞，其中所述另一基因座是如条款47或48所述的重链基因座，其中在所述同种型转换后，所述重链基因座编码包含所述重排的轻链可变结构域的抗体链。
55.条款54的脊椎动物或细胞，其中所述抗体链进一步包含第二个抗体可变结构域；任选其中轻链可变结构域和所述第二个抗体可变结构域特异性结合相应的第一和第二表位，所述表位是不同的。
56.条款53-55任一项的脊椎动物或细胞，其中重排的轻链可变结构域衍生自如条款47或48定义的所述未重排的重链基因座的可变区，其中未重排的重链基因座可变区包含一或多个轻链J基因区段的5’的一或多个轻链V基因区段。
57.条款54或55的脊椎动物或细胞，其中所述抗体链包含(5’至3’方向)衍生自如条款47或48定义的所述重链基因座可变区的可变结构域、任选的接头及所述重排的轻链可变结构域。
58.条款47、48和49-57任一项的脊椎动物或细胞，当从属于条款47或48时，其中所述非-μ恒定区包含(5’至3’方向)编码任选的接头和预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
59.条款58的脊椎动物，其中非-μ恒定区包含所述表位结合部分3’的一或多个非-μ恒定区基因区段(例如CH2和CH3基因区段)，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其均包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分及所述一或多个非-μ恒定区基因区段。
60.条款58或59的脊椎动物或细胞，其中聚(A)位点在编码表位结合部分的核苷酸序列的3’，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，其具有或者由(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E组成，其中V是衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域，X不存在或者是抗体铰链区或者由γ恒定区编码的多肽，L是任选的接头，及E是表位结合部分，任选其中所述脊椎动物表达V-X-L-E或V-L-E二聚体。
61.条款58或59的脊椎动物或细胞，其中聚(A)位点在编码一或多个非-μ恒定区基因区段的核苷酸序列的3’，其中在同种型转换后，所述脊椎动物表达多价多肽链，所述多肽链具有或者由(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C组成，其中V是衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域，X不存在或者是抗体铰链区或者由非-μ恒定区编码的多肽，L是任选的接头，E是表位结合部分，及Cn是一或多个非-μ恒定区基因区段(例如γFc)；任选其中所述脊椎动物表达V-X-L-E-L-C或V-L-E-L-C二聚体。
62.条款46-61任一项的脊椎动物或细胞，其中所述表位结合部分选自抗体可变结构域(例如VL或VH，抗体单一可变结构域(结构域抗体或者dAb)，骆驼VHH抗体单一可变结构域，鲨鱼免疫球蛋白单一可变结构域(NARV)，NanobodyTM或骆驼化VH单一可变结构域)；T-细胞受体结合结构域；免疫球蛋白超家族结构域；agnathan可变淋巴细胞受体；纤连蛋白结构域(例如AdnectinTM)；抗体恒定结构域(例如CH3结构域，例如FcabTM的CH2和/或CH3)，其中所述恒定结构域不是功能性CH1结构域；scFv；(scFv)2；sc-双抗体；scFab；衍生自选自CTLA-4(EvibodyTM)的支架的centyrin和表位结合结构域；脂笼蛋白结构域；蛋白质A如蛋白质A的Z-结构域(例如AffibodyTM或SpA)；A-结构域(例如AvimerTM或MaxibodyTM)；热激蛋白(如及衍生自GroEI和GroES的表位结合结构域)；运铁蛋白结构域(例如trans-body)；锚蛋白重复蛋白(例如DARPinTM)；肽适体；C-型凝集素结构域(例如TetranectinTM)；人γ-晶体蛋白或人遍在蛋白(affilin)；PDZ结构域；蝎毒素；及人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域。
63.条款46-62任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物包含经历同种型转换的淋巴细胞以产生所述非-μ-型(例如IgG-型)抗体；或者所述细胞经历同种型转换以产生所述非-μ-型(例如IgG-型)抗体。
64.条款46-63任一项的脊椎动物或细胞，其中所述脊椎动物已经用预定抗原免疫，所述脊椎动物表达缺少CH1结构域及包含特异性结合预定抗原的可变结构域的非-μ-型(例如IgG-型)抗体；或者所述细胞分离自这种脊椎动物。
65.条款46-64任一项的脊椎动物或细胞，其中所述或每个N-末端可变结构域或者5’-末端可变区是人可变结构域或人可变区。
66.条款46-65任一项的脊椎动物或细胞，其中每个恒定区或结构域是内源性非人脊椎动物恒定区或结构域。
67.条款46-66任一项的脊椎动物或细胞，其中所述淋巴细胞包含表达所述非-μ抗体或二价多肽链的B细胞，其中所述非-μ抗体或多价链特异于对于所述非人脊椎动物是外源的抗原；或者其中所述非人脊椎动物细胞是这种B-细胞。
68.从条款67所述的B细胞产生的永生化的B细胞或者杂交瘤。
69.分离自条款67或68的B细胞或杂交瘤的非-μ-型(例如IgG-型)抗体或多价链，或者其人源化形式，其中非人恒定结构域已经由人恒定结构域置换。
70.一种在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中产生包含体细胞高变的可变区的多肽链的方法，所述方法包括：
(a)在脊椎动物幼B细胞中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座表达的重链和轻链；
(b)用预定表位免疫所述脊椎动物，获得至少一些重链基因座的同种型转换及经历体细胞高变的非-μ(例如IgG)抗体的表达，其中所述抗体包含缺少CH1结构域的重链及包含特异性结合所述抗原的可变区；及
(c)通过选择结合所述表位的可变区从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
所述方法进一步包括在不存在轻链表达时在步骤(b)中表达所述非-μ抗体。
71.条款70的方法，包括从免疫的脊椎动物中分离表达多肽链的B细胞，所述多肽链包含结合所述表位的体细胞高变的可变区，及任选使所述细胞永生化或者从中产生杂交瘤。
72.条款70或71的方法，包括获得编码选择的多肽链的核苷酸序列，所述多肽链包含结合所述表位的体细胞高变的可变区，并将所述核苷酸序列导入表达载体中以表达所述多肽链或者其人源化形式；任选其中载体是在宿主细胞中。
73.条款70-72任一项的方法，其中所述脊椎动物如条款46-69任一项所述。
74.通过条款70-73任一项的方法获得的特异性结合所述表位的多特异性多肽链或者其衍生物。
75.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，
(a)所述轻链基因座包含(5’至3’方向)轻链可变区和恒定区，以在表达IgM抗体的淋巴细胞中表达轻链；及
(b)在表达非-μ(例如IgG)抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
76.非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)或杂交瘤，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，所述轻链基因座包含：
(a)(5’至3’方向)轻链可变区和恒定区，以在表达IgM抗体的淋巴细胞中表达轻链；及
(b)在表达非-μ(例如IgG)抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
77.条款73的脊椎动物或者条款74的细胞，其中关闭轻链表达的构件在条款49-56任一项中列举。
78.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区及包含编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列的μ恒定区，其中所述脊椎动物表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
79.非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其中所述细胞基因组包含抗体重链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区及包含编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列的μ恒定区，其中所述细胞表达多价多肽链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述重链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位。
80.非人(例如大鼠或小鼠)脊椎动物或细胞，其表达多价多特异性重链(或其二聚体)，所述重链包含结构V-L-E或V-L-E-L(例如V-L-E-Fc或者V-L-E-L-Fc)，其中V是N-末端抗体可变结构域，L是任选的接头，及E是表位结合部分，其中V和E特异性结合各自的第一和第二抗原，其中所述抗原是不同的。
81.条款80的脊椎动物或细胞，其中V是人可变结构域。
82.多价(例如多特异性)轻链，其具有(N-至C-末端方向)结构V-X-L-E-L-C，其中：
(i)V是抗体可变结构域(例如VL)，其特异性结合第一表位，
(ii)X不存在，或者是包含恒定结构域的抗体恒定区(例如CL)，
(iii)每个L是任选的接头，
(iv)E是表位结合部分，其特异性结合第二表位，及
(v)C不存在或者是包含恒定结构域的抗体恒定区(例如C是CL)，
其中V是衍生自在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排的重排的抗体可变结构域，所得可变区基因在同样编码表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及
其中重排的抗体可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
83.条款82的轻链的二聚体。
84.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，其中所述脊椎动物包含淋巴细胞，每个细胞基因组包含：
(i)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区，编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，及CL基因区段，其中所述脊椎动物表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头、表位结合部分及CL结构域，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)；或
(ii)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、CL基因区段、编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述脊椎动物表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、CL结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)。
85.非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，所述细胞基因组包含：
(i)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区，编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列及CL基因区段，其中所述细胞表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、任选的接头和表位结合部分及CL结构域，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)；或者
(ii)抗体轻链基因座，其包含(5’至3’方向)重排或未重排的可变区、CL基因区段、编码任选的接头及预定的表位结合部分的核苷酸序列，其中所述细胞表达多价轻链，其包含(N-至C-末端方向)衍生自所述轻链基因座可变区的抗体可变结构域、CL结构域、任选的接头及表位结合部分，其中所述可变结构域和表位结合部分特异性结合相应的第一和第二表位(其可以是如本文定义的任何表位)。
86.包含特异于表位的结合位点的多肽，所述结合位点具有结构V1-L-E(任选V1-L-V2)，其中V1和V2是抗体可变结构域(例如分别为VH和VL或者均是VH)，E是表位结合部分，及L是任选的肽接头(例如长度为20、15或10个或更少的氨基酸)；及其中V1衍生自在非人脊椎动物中人可变区基因区段的体内重排，所得可变区基因在同样编码E的核苷酸序列中具有体细胞高变，其中V1包含内源性AID模式体细胞高变。在此“内源性”是指由对于所述脊椎动物是内源性的AID导致的模式(例如在所述脊椎动物是小鼠的情况中由小鼠AID导致的模式)。
87.一种产生条款86的多肽的方法，所述方法包括用所述表位免疫非人脊椎动物，获得通过Ig基因座的内源性AID所致体细胞高变，以产生编码V1和E的突变的Ig基因座，及分离所述多肽和/或编码所述多肽的核酸。
88.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其中所述脊椎动物或细胞的基因组的Ig重链或轻链基因座包含(5’至3’方向)：(i)编码第一个可变结构域的未重排的人可变区，(ii)编码任选的接头的序列，及(iii)编码表位结合部分的序列(任选第二个可变结构域的重排序列)。
在一个实例中，所述脊椎动物如条款1、7或11所述。在一个实施方案中，所述多肽或核酸在分离后被修饰或突变为产生(或编码)特异性结合所述表位的多肽衍生物。
89.第一个和第二个重排的抗体可变结构域在生产抗原结合多肽中的应用，所述多肽包含与一或多个表位结合部分连接的蛋白质支架，其中所述抗原结合多肽包含至少两个表位结合位点，至少一个由表位结合部分提供及至少一个由与第二个抗体可变结构域配对的第一个抗体可变结构域提供，其中所述应用包括：(i)通过在非人脊椎动物中可变区基因区段的体内重排而获得第一个可变结构域的序列，所得可变区基因在同样编码第二个可变结构域及一或多个表位结合部分的核苷酸序列中具有体细胞高变；及分离所述可变结构域序列，其中重排的第一个抗体可变结构域序列包含内源性AID模式体细胞高变；(ii)表达及组合所述可变结构域与蛋白质支架及一或多个表位结合部分，以产生所述抗原结合多肽；及(iii)分离所述多肽。
任选地，步骤(ii)中使用的第二个可变结构域包含内源性AID模式体细胞高变。
90.一种产生非人物种脊椎动物的方法，所述方法包括使所述物种的两个脊椎动物一起繁殖，其中这两个脊椎动物均如上述任一项条款所述。
91.前述任何条款的脊椎动物、细胞或方法，其中共有轻链在IgM阶段表达。
92.前述任何条款的脊椎动物或细胞，其基因组包含在IgM阶段表达共有轻链的构件。
所述共有轻链包含例如人Vκ1-39Jκ或Vκ3-20Jκ(例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)或者VpreB(如人VpreB)。这些可变结构域与VH杂乱配对，因此可用于在所述脊椎动物或细胞中抗体发生期间产生结合位点的库集。
在本发明任何多价方面的一个实施方案中，第一表位是人CD19表位，及第二表位是人CD3或CD16表位。
应理解本文描述的特定实施方案只是例证本发明而无限制本发明之意(除非特别指出)，所述实施方案可以根据本文所述本发明任何构型应用。本发明的主要特征在不偏离本发明范围的前提下可以用于各个实施方案中。本领域技术人员将意识到或者使用不超出常规的研究能确定本文所述特定程序的众多等价物。这种等价物被认为在本发明的范围内并由权利要求书覆盖。本申请书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请在此均以每个出版物或专利申请特别及单独地并入作参考的程度并入作参考。在权利要求书和/或本说明书中单词“一个”当与术语“包含”一起使用时可以是指“一个”，但是也意味着“一或多个”、“至少一个”及“一个或一个以上”。在权利要求书中，术语“或者”除非特别指出是仅一个选项或者选项是互斥的，则用于是指“和/或”，虽然本文支持是指唯一选项及“和/或”的定义。在本申请书中，术语“大约”用于表示数值包括用于确定所述数值的装置、方法固有的误差变化，或者在研究对象之中存在的变化。
如本说明书和权利要求书所用，单词“包含”(及任何形式的包含)、“具有(及任何形式的具有)”、“包括(及任何形式的包括)”或者“含有(及任何形式的含有)”是包括一切在内的或者开放式的，及不排除另外的未列举的元件或方法步骤。
如本文所用，术语“或者其组合”是指在该术语前列举的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”是指包括如下至少一种组合：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，及如果在特定背景下顺序是重要的，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个实例，显然包括含有一或多个项目的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解在任何组合中对项目的数目无限制，除非从上下文可以明显看出。
本发明的任何部分均可以组合任何其它部分阅读，除非从上下文可以明显看出。
根据本发明，不用过度实验即可产生及实施本文揭示和请求保护的所有组合物、群、脊椎动物、抗体、库集和/或方法。虽然在优选的实施方案中描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显然已知在不偏离本发明的观念、精神和范围内可以对本发明的组合物和/或方法及所述方法的步骤或步骤顺序加以改变。为本领域技术人员熟知的所有这种相似的取代和修饰被认为在如所附权利要求书定义的本发明的精神、范围和观念内。
本发明在如下非限制性假想实施例中更详细描述。
实施例
实施例1：改良的仅重链抗体的产生
图3是在本发明的非人脊椎动物中在体内产生仅重链抗体的改良的途径的示意图。图中示出转基因脊椎动物中重链基因座的结构。每个重链基因座包含一个包含位于内源性(例如小鼠或大鼠)S-μ转换序列上游的人VH、D和JH基因区段的可变区，及一个包含恒定区基因区段(CH1、CH2、CH3、H(铰链区)及m(膜区))的内源性C-μ区。在此下游是S-γ转换序列(例如内源性转换序列)和γ-1恒定区(例如内源性γ-1恒定区)。所述γ恒定区不包含CH1基因区段。缺失基因区段及特别缺失CH1的方法为本领域已知(见例如上文提及的Janssens 2006)。例如，通过同源重组或RMCE的缺失可以在非人脊椎动物的ES细胞组细胞中获得。进一步的例证在下文实施方案中提供，其中结合模块用于置换重链基因座中的γCH1。
4链IgM抗体(H2L2)可以通过在脊椎动物中组合来自重链基因座的重链与从轻链基因座中表达的轻链而产生，如在B细胞发育期间(例如在不成熟脾B细胞表面表达)。通过正常的IgM阶段，本发明提供了正常B细胞区室和主要的可变区库集的发生。
根据本发明，在随后的同种型(类别)转换阶段，如在用靶抗原免疫之后，通过条件性轻链敲除而关闭轻链表达(如下文进一步例证)。因此，从同种型转换的重链基因座中表达的重链可以形成没有CH1和轻链的重链二聚体(即H2抗体)。因此，在这些晚期阶段期间的仅重链表达和成熟是由所述脊椎动物在体内进行，不受轻链表达的妨碍(及避免了使用重链产生不希望的4链抗体H2L2及因此降低有用的H2产量和库集的危险)。因此，优势是在所述脊椎动物免疫之后使产生的同种型转换及成熟的仅重链抗体的产生和库集最大化。以此方式，不受任何轻链可变结构域配对的影响而使H2抗体的可变结构域成熟并选择，及因此根据在H2形式中的性能选择H2可变结构域。这可用于针对希望的体内抗原结合亲和性及H2溶解性和表达选择H2抗体。因此，这些H2抗体可以提供抗体单一可变结构域(dAb)的良好来源。
此外，通过适应正常的IgM早期阶段，保留使重链可变区库集(主要库集)最大化的机会，这提供了可从中随后选择H2抗体V结构域的良好库集。
实施例2：条件化轻链表达
条件化或阶段特异性表达可以根据本发明在B细胞区室和V库集发育早期进行。如实施例1所述，本发明提供了当同种型转换(非-μ)的重链表达时，轻链表达被关闭。
图4和5示出怎样工程化非人脊椎动物(在这个实施例中是小鼠)的基因组以提供这种条件化轻链表达的实例。小鼠染色体6含有激活诱导的胞苷脱氨酶(AICDA或AID)基因。其包含5个外显子，在图4上部示出的基因座中以实心方框示出。在5’和3’末端的UTR以空心方框示出。AID在B细胞中阶段特异性表达，当同种型转换的非-μ(例如γ)重链表达时确实是活性的。本发明人认识到这种表达谱可有利地以阶段特异性方式进行控制(harnessed)以表达重组酶(在这种情况中是重组酶)。使用本领域技术人员已知的ES细胞技术进行基因组操纵(例如使用RMCE，着陆垫(landing pad)、标记及转座酶活性，如WO2011004192所述，所述文献并入本文作参考)。合适的ES细胞为本领域技术人员已知，例如小鼠AB2.1细胞(可得自Baylor College of Medicine,Texas,USA)。
(a)通过AID调节性元件产生cre表达
将与用于工程化IGγ1基因座(见下文)相同的着陆垫靶向于AID基因座以置换包含AID基因的第5个外显子、终止密码子和3’UTR的序列(小鼠染色体6:坐标12256576-122564230)(图4)。正确靶向的克隆通过HAT选择并通过确定基因型证实。将插入载体插入以失活HPRT基因并将PuroΔTK置于与PGK启动子紧邻，所述插入载体具有结构loxP-PB3’LTR-相应于AID第5个外显子的序列和终止密码子-随后是T2A编码序列(5’-GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCT-3’)和cre基因-3’UTR-PB3’LTR-PuroΔTK-lox5171，如图4所示。通过嘌呤霉素选择正确靶向的克隆并通过连接PCR证实。所述插入在基因座中获得两个倒位的转座子结构(图4)。为了使其缺失，在这些克隆中瞬时表达PiggyBac转座酶，如本领域所已知。通过FIAU选择具有正确缺失的克隆并通过连接PCR证实。
T2A是从Thosea asigna病毒中鉴别的自身裂解肽。T2A-介导的裂解在真核细胞中是普遍现象。在蛋白质之间插入T2A序列使得多个蛋白质可以理论配比表达(Szymczak ALet al；“Development of 2A peptide-based strategies in the design ofmulticistronic vectors”；Expert Opin Biol Ther.5:627-638.)。
所得基因组结构在图4的底部示出，提供了在基因组中通过AID调节元件调节使AID与cre活性以阶段特异性方式共表达。
(b)条件化IGκ等位基因的产生
在小鼠ES细胞中，将着陆垫靶向于位于内含的IGκ增强子(iEκ)下游的IGκ基因座以置换编码Cκ区的外显子(小鼠染色体6：坐标70724743-70727043)(图5)。通过HAT选择正确靶向的克隆并通过确定基因型而证实。具有结构loxP-PB3’LTR-lox2272/66-Cκ外显子-lox2272/71-PB3’LTR-PuroΔTK-lox5171(图5)的靶向载体用于置换所述着陆垫中loxP与lox5171之间的序列。所述插入导致所述基因座中两个倒位的转座子结构(图5)。为了使其缺失，在这些克隆中瞬时表达PiggyBac超转座酶。通过FIAU选择具有正确缺失的克隆并通过连接PCR证实。lox2272/66(5’-ATAACTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAcggta-3’)和lox2272/71(5’-taccgTTCGTATA-AaGTATcC-TATACGAAGTTAT-3’)在Cκ外显子侧翼并相互倒位。从这种基因组工程化的ES细胞中产生后代小鼠，该小鼠也携带AID-cre基因以如实施例2(a)所述阶段特异性表达cre。在小鼠中，随着从AID-cre基因中cre表达，Cκ外显子被缺失，从而当同种型转换的重链表达时失活轻链表达。
在另一种设计中，其它或另外的κ基因座部分侧翼是lox位点，由此其在cre表达时被缺失。例如，图5中的方案可以改变，以便lox2272/66就在第一个Jκ基因区段的5’端，由此从第一个Jκ至Cκ的一段序列在cre表达时被缺失。或者，lox2272/66和lox2272/71可分别就在第一个和最后一个Jκ基因区段的5’和3’端侧翼，由此在cre表达时全部J区被缺失。
在一个实施方案中，在同种型转换阶段期间仅κ链表达被失活。在小鼠中，λ表达相对低(正常仅轻链的5％量级)，因此，可接受提供仅条件化κ链表达。在另一实施方案中，κ和λ链表达均是条件化的(例如基因组还包含在lox位点侧翼的Cλ)，在早期IgM阶段期间以阶段特异性方式发生，但是在同种型转换的非-μ重链表达期间则否。
实施例3：IGγ1基因座及多价重链和抗体的遗传工程化
参考图6，其示出在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)基因组中产生双特异性重链和抗体以及重链基因座以在体内产生其的方法示意图。
在图6的上部示出本发明的重链基因座，其包含(5’至3’方向)未重排的可变区(包含人VH、D和JH基因区段)、内源性S-μ、μ恒定区(包含CH1、H、CH2、CH3及M基因区段)、内源性S-γ-1和γ-1恒定区。后者包含核苷酸序列(称作结合模块或BM)，其包含接头和可变区结合结构域核苷酸序列，以及γ-1H、CH2、CH3及M基因区段。在这个实施例中，所述BM编码：
·接头(例如(GGGGS)3)-VH，其中VH是已知抗原结合特异性的抗体单一可变结构域(dAb)；或者
已知抗原结合特异性的scFv(VH-接头-VL或者VL-接头-VH)；或者
·dAb-接头-scFv。
因此，BM的结合部分是功能性的，不需要轻链配对。
在VDJ重排之后，IgM作为4链(H2L2)抗体表达。随后，在阶段特异性轻链敲除背景中在同种型(类别)转换后(例如在用靶抗原免疫后)(见实施例2)，γ-1型的H2抗体作为多特异性重链的二聚体而产生。每个重链均携带亲和性成熟的N-末端VH结构域，其特异性结合所述靶抗原。此外，每个重链包含针对BM选择的具有预定特异性的一或其它抗原结合位点。在这个实施例中，每个BM均就在铰链区-γ1Fc的立即N末端。因此，所述多特异性抗体有益地保留Fc功能(如FcRn结合及再循环以及ADCC和/或CDC功能)。
在另一个实施方案中(其中没有阶段特异性轻链敲除)，同种型转换的重链与轻链一起表达作为4链抗体(H2L2)的一部分。CH1存在于重链基因座的非-μ(例如γ)恒定区中。在这些抗体中，使N-末端VH/VL对成熟并针对用于免疫的靶抗原选择。在实施方案中，希望BM位于非-μCH1基因区段或铰链区的下游，以便CH1不与轻链中CL配对，所述BM存在于一部分恒定区上，其不需要与轻链结构域配对。例如，BM核苷酸序列可位于非-μ恒定区中CH2基因区段的立即5’端(及因此在产物重链和抗体中CH2或Fc的立即N-末端)，或者其可以置换CH2或CH3，或者其可以是CH3的3’端(即在所得产物中在Fc的C-末端)。对于后者，例如BM可编码任选的接头-dAb(其中已知dAb抗原结合特异性)；所得4链产物是在每个重链的C末端具有dAb的mAb。
对轻链基因座可以进行相似的排列，以便可以产生本发明的多价(例如双特异性)轻链。
实施例4：产生分泌的同种型转换的及成熟的多价多特异性抗体及链
本发明人设计了一种方法，在B细胞区室和V库集发育的早期阶段期间使得膜结合的4链IgM正常细胞表面表达，然后特别设计的本发明的多价重链和抗体分泌，其是类别转换及成熟的(例如在免疫后)。
参考图7，其例证了在野生型脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中膜结合或分泌的抗体的剪接与聚腺苷酸化之间的竞争。
在B细胞发育早期，IgM通过包含膜-锚结构域(在重链基因座中由M编码)的重链在表面表达。
之后，在成浆细胞和浆细胞阶段，代替的是抗体分泌。这是由于缺少M的转录终止及CH3与M之间聚A信号活性所致(这与M的3’的聚A不同，如图7所示)。
根据本发明的这个实施例，可以将终止密码子(转录终止位点)和聚A插入在编码表位结合部分的序列的立即3’端(或者最3’的部分)。在图8中，这在BM与H之间示出。例如，这可以通过包括聚A和侧翼的内含子序列(包括终止密码子)而进行，其相应于脊椎动物基因组(例如人基因组，小鼠基因组，大鼠基因组或者非人基因组)中CH3与M之间的一段DNA序列。合适的DNA序列是相应于小鼠染色体12:坐标113324868-113328978及人染色体14:坐标106206531-106207817的序列。如图8和图9示出(任选在条件化κ轻链敲除中)，所得脊椎动物或细胞的细胞中的可变剪接可以产生如下分泌的产物：(i)V-BM-H-γ1Fc(其可例如二聚化以产生包含Fc的双特异性H2抗体)；或者(ii)V-BM(作为单体或二聚体)。例如，通过工程化强于CH3与M之间的聚A信号的BM与H之间的聚A信号，对于后一产物可能是有利的。在CH3与M之间使用较强的聚A信号对产物(i)是有利的。或者，可以忽略CH3与M之间的聚A，以便仅分泌的V-BM(作为单体或二聚体)产生。
图10A和10B示出构建本发明的相关重链基因座的详细描述。将具有结构“PiggyBac(PB)5’LTR-HPRT3’部分-loxP-HPRT5’部分-lox5171-PGK启动子-PB5’LTR”(图10A)的着陆垫靶向于小鼠ES细胞的Cγ1基因座中，以置换编码CH1和铰链区的外显子及其之间的内含子(小鼠染色体12:坐标113329794-113330598)。通过HAT选择正确靶向的克隆并通过确定基因型证实。在靶向着陆垫之后，插入一个插入载体，所述载体含有结构“loxP-PB3’LTR-编码BM的序列-具有与CH3与M1外显子之间的内含子相似序列的内含子-编码铰链区的外显子-PB3’LTR-编码嘌呤霉素-δ-胸苷激酶(PuroΔTK)的基因-lox5171”(图10B)，以通过cre重组酶介导的盒置换(RMCE)置换所述着陆垫中loxP与lox5171之间的序列。在这个实施例中，载体中的铰链区序列与在第一个步骤中缺失的铰链区序列相同，但是可以构建不具有铰链或者具有不同铰链的插入载体，例如当ES细胞是小鼠或大鼠ES细胞时，铰链区来自人或骆驼或者是不同的小鼠或大鼠品系。通过嘌呤霉素选择正确插入的克隆并通过连接PCR证实。所述插入导致基因座中两个倒位的转座子结构(图10B)。为了切除这两个转座子，将PiggyBac超转座酶(Yusa,K et al.PNAS.2010.108:1531-1536)在这些克隆中瞬时表达。通过胸苷类似物5-碘-2’-氟-2’-脱氧-1-β-D-阿拉伯糖基-呋喃尿嘧啶(FIAU)选择具有正确缺失的克隆并通过连接PCR证实。
如图10B所示，上述产物(i)和(ii)是可能的。
实施例5：产生条件化共有轻链等位基因
参考图11A和11B。尽管可用于工程化任何非人脊椎动物基因组，但是这个实施例用于工程化小鼠基因组。
失活内源性可变区
内源性小鼠Vκ-Jκ基因区段的倒位失活内源性κ可变区表达。图11A示出为此使用重组酶介导的盒置换的方法。在存在cre重组的条件下，在插入的loxP位点的重组导致内源性小鼠κ可变区DNA倒位，其使内源性Vκ的表达失活。最终步骤使用piggyBac转座酶以除去5’盒，仅剩下3’盒位于κ基因座中，以用于图11B所示方法中。
插入条件化Vκ
参考图11B。将DNA片段连接在一起以产生插入序列(见下文序列)，所述DNA片段包括合成的共有轻链基因组序列(启动子、前导外显子、内含子和编码共有轻链的外显子)、小鼠基因组内含的Eκ区及lox2272/66和lox2272/71-floxed小鼠Cκ区。所述插入序列在载体pBR322中与loxP-PB3’LTR和PB3’LTR-无启动子PuroΔTK基因-lox5171进一步亚克隆，形成插入载体。在内源性小鼠Vκ-Jκ基因区段倒位之后，将所述插入载体插入倒位的内源性IGκ基因座中，使用RMCE及Cre瞬时表达进行。在插入后，通过piggyBac转座酶的瞬时表达切除具有转座子结构的5’和3’末端中的修饰盒。所得lox-侧翼的Cκ序列可以在如上述阶段特异性cre表达如在类别转换阶段的基础上缺失，通过使用AID调节元件以驱动Cre表达。
本发明人确信，使用共有轻链可变区人Vκ1-39Jκ或Vκ3-20Jκ(例如Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)或者VpreB(如人VpreB)是有益的，因为这种可变区与人VH区杂乱配对，因此可具有对于选择(在4链IgM阶段)人VH结构域序列有利的支架能力，可提供有益的主要库集以随后在类别转换后在H2抗体中进行选择VH结构域，其中所述VH结构域与VL结构域未配对。
共有轻链插入序列(5’-3’):
atctttcagggacaatgatgcccatgcaggcagcatatttataatgcacagtaaacactaggaggaaacaaggcagtgagagaggaaagagagcagcgataccgaaaatgtcctcagcgagaagctaccacagaggatgaatggagatcaagcccacgtggaaacatgggaaaatgtctcagtatttttccacctaagaagggagggagatggggtatgtatacacctccctgtcctcactgattgagggctttccgagaggatgctcattccaggtgctgtgataggccatgtgtacaggcagggctgccttctccagcttcagatagagcagtgaggaaaagatatggccatggggggtcagcagaagtacagcaaagggaaaagggaaagggtagcaagagtgacaactatattcaccccccccacacacacacacacacacacgaaattgtgtattgcaatccagaactgcttctctctgaacctaaatcttagcaagcagtttaccagtaactgcccttgaaattcaggcccctggaaaggagcagggggttgtgtacaggctataccacagcagtctgcccacccttagtgatgcatgagtaatgctccctggactccccaggttctagtcttctcatgtcgatgtagttgattccacttcccttgctgcacaaccaggctgggatgcctgggcagaggcagacatgtgaggtataggggttcaaatctgtttccaagttttatccagcttcaaagcatttctccgtgtacatgagcggtggcttgacaggagatggagactctctttcctggatgtgaggcaaggaggcaggcgtctgagtcaggatgatgtccctactcactgctaaagagaaaagtggctttgatggtgcagggcagggaaatgcactgagtggtcgccaccctcacagaagagaaagtgttcactgacctggcctttccccagggcctctccctcccattgctttccagaaagccatgatttttgagagccacacctgaacactcacaaacattatggtgggaaaagcagatcagagcattaggcaagttgcattaccttggccttcttcctttggagacaattgatgtggggttctagattgacccagagtttcaagtttatcctgattcaggcttcaacagctggaggaagaaacagagatgttttttgaagtaaacagatctagcattactaatcaacccttcatactgatgacctatgggaaataatacccaagggcagaaaaatgggcagaataaggggagccccaaaccaagacgaagctgctgcccattgagaccctgggtattacagagacctatagctctggataatggaagatctatgagtggcacaggcgctgaggaatcacagcatcattatcgtgcatctgcagggaattgcttgtaaatatactggtaattacaaatgtttaaggtcactacaaatactttggagtgtattaaatatgcttctgataaagactgtttttctcacatgaaacaatgggaaccatgtgacaatcacagaggtgttgttactatagcaaaagggattgttactctccacatccctttaagtaacttgaaggcctgatagacccaccctctaagacttcattagacattccctacgaatggttatactctcctgtatactcccaatacaactctaaaatatattattccatatagtccttaggtttgtattaaagtttgacttttttccttcaaaatatctcttgtcacaacagcggctctagagagaaatacattccctccaggcaaatctatgctgcgctggtctgacctgggaccctggggacattgcccctgtgctgagttactaagatgagccagccctgcagctgtgctcagcctgccccatgccctgctgattgatttgcatgttccagagcacagccccctgccctgaagacttttttatgggctggtcgcaccctgtgcaggagtcagtctcagtcaggacacagcATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGgtaaggatggagaacactaggaatttactcagccagtgtgctcagtactgactggaacttcagggaagttctctgataacatgattaatagtaagaatatttgtttttatgtttccaatctcagGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACgtaagtacacttttctcatctttttttatgtgtaagacacaggttttcatgttaggagttaaagtcagttcagaaaatcttgagaaaatggagagggctcattatcagttgacgtggcatacagtgtcagattttctgtttatcaagctagtgagattaggggcaaaaagaggctttagttgagaggaaagtaattaatactatggtcaccatccaagagattggatcggagaataagcatgagtagttattgagatctgggtctgactgcaggtagcgtggtcttctagacgtttaagtgggagatttggaggggatgaggaatgaaggaacttcaggatagaaaagggctgaagtcaagttcagctcctaaaatggatgtgggagcaaactttgaagataaactgaatgacccagaggatgaaacagcgcagatcaaagaggggcctggagctctgagaagagaaggagactcatccgtgttgagtttccacaagtactgtcttgagttttgcaataaaagtgggatagcagagttgagtgagccgtaggctgagttctctcttttgtctcctaagtttttatgactacaaaaatcagtagtatgtcctgaaataatcattaagctgtttgaaagtatgactgcttgccatgtagataccatggcttgctgaataatcagaagaggtgtgactcttattctaaaatttgtcacaaaatgtcaaaatgagagactctgtaggaacgagtccttgacagacagctcaaggggtttttttcctttgtctcatttctacatgaaagtaaatttgaaatgatcttttttattataagagtagaaatacagttgggtttgaactatatgttttaatggccacggttttgtaagacatttggtcctttgttttcccagttattactcgattgtaattttatatcgccagcaatggactgaaacggtccgcaacctcttctttacaactgggtgacctcgcggctgtgccagccatttggcgttcaccctgccgctaagggccatgtgaacccccgcggtagcatcccttgctccgcgtggaccactttcctgaggcacagtgataggaacagagccactaatctgaagagaacagagatgtgacagactacactaatgtgagaaaaacaaggaaagggtgacttattggagatttcagaaataaaatgcatttattattatattcccttattttaattttctattagggaattagaaagggcataaactgctttatccagtgttatattaaaagcttaatgtatataatcttttagaggtaaaatctacagccagcaaaagtcatggtaaatattctttgactgaactctcactaaactcctctaaattatatgtcatattaactggttaaattaatataaatttgtgacatgaccttaactggttaggtaggatatttttcttcatgcaaaaatatgactaataataatttagcacaaaaatatttcccaatactttaattctgtgatagaaaaatgtttaactcagctactataatcccataattttgaaaactatttattagcttttgtgtttgacccttccctagccaaaggcaactatttaaggaccctttaaaactcttgaaactactttagagtcattaagttatttaaccacttttaattactttaaaatgatgtcaattcccttttaactattaatttattttaaggggggaaaggctgctcataattctattgtttttcttggtaaagaactctcagttttcgtttttactacctctgtcacccaagagttggcatctcaacagaggggactttccgagaggccatctggcagttgcttaagatcagaagtgaagtctgccagttcctcccaggcaggtggcccagattacagttgacctgttctggtgtggctaaaaattgtcccatgtggttacaaaccattagaccagggtctgatgaattgctcagaatatttctggacacccaaatacagaccctggcttaaggccctgtccatacagtaggtttagcttggctacaccaaaggaagccatacagaggctaatatcagagtattcttggaagagacaggagaaaatgaaagccagtttctgctcttaccttatgtgcttgtgttcagactcccaaacatcaggagtgtcagataaactggtctgaatctctgtctgaagcatggaactgaaaagaatgtagtttcagggaagaaaggcaatagaaggaagcctgagaatatcttcaaagggtcagactcaatttactttctaaagaagtagctaggaactagggaataacttagaaacaacaagATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAACGGTAattgtatatatgtgcatcctggccccattgttccttatctgtagggataagcgtgcttttttgtgtgtctgtatataacataactgtttacacataatacactgaaatggagcccttccttgttacttcataccatcctctgtgcttccttcctcagGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTtagagacaaaggtcctgagacgATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAACGGTA
所述序列包含如下成分(数字涉及序列中的位置)：
1.人Vκ1-39启动子:1894-2000
2.重排的人Vκ1-39/Jκ5:2026-2537
a.前导外显子:2026-2080
b.Vκ1-39/Jκ5外显子:2205-2537
3.小鼠内含子序列:2538-4891
4.Lox2272/66:4892-4925
5.小鼠Cκ外显子:5083-5402
6.Lox2272/71:5425-5458
在另一实施方案中，不进行最初的倒位小鼠可变区DNA的步骤，代之以通过插入如上述共有Vκ而使小鼠Vκ表达基本失活。
实施例6：共有VL结构域多特异性：在Cγ1基因座中产生串联ScFv等位基因
参考图12A和12B。尽管可用于工程化任何非人脊椎动物基因组，但是这个实施例用于小鼠基因组的工程化。所述方法用共有Vκ代替内源性γ恒定区的内源性CH1。所述方法也可以用于插入结合模块在共有Vκ的3’。
合成DNA片段，其包括编码结构“接头(L1)-共有人轻链VκJκ-接头(L2)–结合模块”的外显子及含有“可变剪接位点-聚腺苷酸化位点”的内含子，并将其插入loxP-PB3’LTR与PB3’LTR-无启动子PuroΔTK基因-lox5171盒之间，以产生插入载体(图12B；所述可变剪接位点-聚腺苷酸化位点是用具有垂直阴影的小方框表示的，在结合模块与铰链区之间示出)。所述接头可以是编码1-4个“Gly-Gly-Gly-Gly-Ser”的序列。所述共有轻链区可以是人序列，例如编码人Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1或者人VpreB(见下文序列)或者重排的或种系VλJλ的序列。所述结合模块可以是编码单链Fv(ScFv)或者重排的VHDJH或者任何其它形式的表位结合部分或结构域的序列，以结合第一个人靶抗原(例如所述抗原是人CD3或者人CD16或者另一细胞表面抗原，以使效应细胞杀死靶细胞)。可变剪接位点-聚腺苷酸化位点可以由与Cγ1H3与M1外显子(例如小鼠基因组)之间的内含子序列相似或相同的序列提供，其包含结构“可变剪接位点-编码分泌形式IgG1的羧基末端的序列-终止密码子–聚腺苷酸化位点”。将所述插入载体靶向小鼠ES细胞中的Cγ1H1，代替先前插入的着陆垫，通过如图12A所示RMCE及Cre的瞬时表达进行。在插入之后，具有转座子结构的5’和3’末端中的修饰盒通过piggyBac转座酶的瞬时表达切除。使用标准方法从ES细胞中产生后代小鼠。
通过将所述表位结合部分序列(结合模块)置于μ转换序列及μ恒定区(在这种情况中是γ-1区)的下游，这个序列被遮掩与所述基因座中AID突变热点远离。
在首次用于实验的B细胞阶段，所得基因座可产生膜结合的重链(例如作为H2抗体的一部分)，其由如下结构组成(N末端至C末端方向)：
VH-L1-共有VL-L2-结合模块-铰链区-Fc-膜锚定区
在这个实施例中，所述结合模块是特异性结合人CD3或人CD16A的scFv(例如下文进一步描述)。
在用靶抗原(例如人CD19或人EpCAM)免疫小鼠后，成浆细胞和血浆B-细胞表达分泌的重链(例如作为分泌的H2抗体的一部分)，结构在图12B底部倒数第二行示出，如下以N末端至C末端方向：
scFv1-L2-结合模块
在此，scFv1由“VH-L1-VL”提供，其中VL基于共有VL及scFv1特异性结合用于免疫的靶抗原(例如CD19或EpCAM)。在这个实施例中，第二个scFv(结合模块)特异性结合CD3或CD16A。
或者，存在以N末端至C末端方向的分泌的结构(见图12B最下一行)：
scFv1-L2-结合模块-铰链区-Fc
可以缺失CH3与M1之间的聚A位点，以消除这个产物的产生，并因此有利于分泌的scFv1-L2-结合模块产生。
有利地，所述结合结构域已经在体内完全组合并选择，避免了本领域中依赖于用于这种组合和选择的一或多个体外步骤的问题。
生物改良(Biobetter)
在一个实施例中，产生现有抗体的生物改良形式，其中所述抗体特异于一种抗原。在这个实施方案中，所述结合模块包含scFv(或其它结合形式)，其特异性结合所述抗原及包含在所述抗体结合位点中发现的VH与VL配对。共有VL是在所述配对中发现的VL。基因座包含在共有VL序列5’的人V、D和J基因区段。在从所得ES细胞中产生非人脊椎动物之后，将所述脊椎动物用所述抗原免疫，在体内实现VDJ重组和成熟。因此，将成熟的VH与共有VL及结合模块scFv组合，产生产物scFv-接头-scFv，其中scFv均特异于所述抗原。使用这种方法，可以获得结合所述抗原的产物，及可以选择与所述靶具有更高结合亲和性和/或与原始起始抗体相比结合不同表位的产物，或者具有更希望的治疗效力、表达或生物物理特性的产物。
因此，在本发明的一方面，由本发明的产物结合的表位是在相同抗原物种上发现的表位。
在另一实施例中，省略3’scFv结合模块，以便产生在N末端的单一scFv结合位点，这是在存在现有(原始)抗体的VL条件下经历指导选择的结合位点。如上文所述，选择的VH/VL配对可用于克隆进重链和轻链表达载体中，以产生是原始抗体的生物改良形式的抗体。
实施例7:共有VL结构域多特异性:抗-CD19/抗-CD3/抗-CD16双特异性构建体
本发明涉及多特异性多肽，其可用于募集患者免疫效应细胞。因此，本发明提供了多特异性抗原结合多肽、二聚体或抗体，其能募集人免疫效应细胞的活性，通过特异性结合如下抗原而实现：(i)效应抗原(例如人CD3)，其位于人免疫效应细胞上，及(ii)除了所述效应抗原之外的靶抗原(例如人EpCAM或人CD19)；任选其中所述抗原位于除了所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上。例如，抗-CD19/抗-CD3产物可用于治疗患者癌症，如白血病或非霍奇金淋巴瘤。为此，这个实施例提供了这种产物。实例示于表1。
表1：特异于CD19和CD3或CD16的双特异性产物实例
*或者可以使用模拟(种系)VL序列。
在另一个实施方案中，L2和L3每个单独地选自：
VEGGSGGSGGSGGSGGVD；或
(GGGGS)；或
(GGGGS)2；或
(GGGGS)3；或
(GGS)3；或
AKTTP；或
AKTTPRLGG；或
EEGEFSEA。
其它选项在下文提供。
见图13示出基因座构建方法和一些举例产物。在图13D和E中，BM1包含从在所述基因座的5’部分的可变区重排而产生的序列；BM2衍生自插入的已知结合模块的序列。
在另一个实施方案中，可以省略共有VL和L1(如图12B所示在共有VL的5’的接头)，以便最终产物含有N-末端dAb(单一可变结构域，其特异性结合用于免疫的所述抗原，例如CD19)。任选地，代替使用scFv，所述结合模块可以是dAb，其特异性结合第二个抗原(例如CD3或CD16)。因此，产物包含(N-至C-末端)dAb1-接头-dAb2，其中dAb结合不同的抗原(或者在相同抗原物种上的不同表位，例如产生改良的生物改良产物)。
在另一实施例中，所述结合模块序列插入在CH3的3’(图13C)。
在一个实施例中，所有结合模块可变区均是人可变区。另外或或者，共有VL是人VL。因此，在人V、D和J基因区段存在于共有VL序列的5’的IgH基因座的情况中，在用抗原免疫之后，产生双特异性产物，其结合结构域均是人结构域(所述产物具有特异于用于免疫的抗原的5’scFv及特异于其它抗原的3’scFv)。所述5’结合结构域在应答免疫时而体内选择和成熟。所述3’结合结构域将保留对其最初结合的抗原(例如CD3或CD16)的特异性。
关于V区与合适接头的连接及将这种产生的scFv或结合单位与其它结合模块连接以产生单-或双特异性结合实体以及这种接头的优化等一般概念在文献中广泛描述(例如见Neri D,Momo M,Prospero T,Winter G.J Mol Biol.1995Feb 24；246(3):367-73)；Wright MJ,Deonarain MP.Mol Immunol.2007Apr；44(11):2860-9)。接头长度可影响优先产生的分子形式。例如，单体双特异性串联scFv或者所谓的双抗体形式是由两个单独的多肽链提供的，其中V区形成VH-VL结合模块。
举例的L3序列是：
VEGGSGGSGGSGGSGGVD，由GTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGAC编码
GGGGSGGGGSGGGGS(也已知为(G4S)3)，由GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT编码
GGGGSGGGGSGGGGS(以已知为(G4S)2)，由GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT编码
GGGGS，由GGAGGTGGTGGATCC编码
AKTTP，由gccaaaacaacaccc编码(见WO2004024771)
AKTTPRLGG(见WO2004024771)
EEGEFSEA，由gaagaaggtgaattttcagaagca编码(见US20090214574)
举例的L2序列是：
GGSGGSGGS(以已知为(G2S)3)，由GGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCT编码
GGGGSGGGGSGGGGS(以已知为(G4S)3)，由GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT编码
GGGGSGGGGSGGGGS(以已知为(G4S)2)，由GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT编码
GGGGS，由GGAGGTGGTGGATCC编码
VEGGSGGSGGSGGSGGVD，由GTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGAC编码
可用于这种双特异性治疗剂的人抗-CD3可变区例如是：(见WO2010132872，其序列并入本发明作参考)
VH(其是WO2010132872中的SEQ ID NO:2)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQMGYWHFDLWGRGTLVTVSS
由如下序列编码：
caggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc
tcctgtgcag cgtctggatt caagttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa gaaatactat
gtagactccg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacaaatg
ggctactggc acttcgatct ctggggccgt ggcaccctgg tcactgtctc ctca
VL(其是WO2010132872中的SEQ ID NO:4)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIK
由如下序列编码：
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccgct cactttcggc
ggagggacca aggtggagat caaa
人抗CD3VH
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFKFSpYGMHlWVRQAPGKGLEWVAlVIWYDGSKKYYVDSVKGIRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR^GYWHFDLIWGRGTLVTVSS
由如下序列编码：
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
人抗-CD3VL
EIVLTQS PATLSLS PGERATLSCIRASQSVSSYLAJWYQQKPGQAPRLLIYIDASNRATIGI PARFSGSGSGTDFTLT I SSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGTKVEIK
由如下序列编码：
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
CD3结合VH和VL的进一步实例在下文示出。
抗CD3VH
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
由如下序列编码：
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
抗CD3VH
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS
由如下序列编码：
Caggtgcagctgcagcagtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattacagccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca
抗CD3VL
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
由如下序列编码：
GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA
抗CD3VL
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
由如下序列编码：
Gatatcgtgctcactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaac
CD3的合适的scFv结合模块可因此由如下序列编码：
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA
翻译为如下多肽序列：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEL
或者，可以使用组成用于CD16效应细胞募集的结合部分的VH和VL序列，其有利于NK-细胞而不是T-细胞的募集。举例的人抗-CD16可变区在US2009021474中描述。
人抗-CD16A VH
EVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS
由如下序列编码：
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCCGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTTAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCTAGAGGTAGTGCTTATTACTACGATTTTGCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
人抗-CD16A VL
QPVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL
由如下序列编码：
CAGCCTGTGCTGACTCAGCCATCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCACGATCTCCTGTGGGGGACACAACATTGGGAGTAAAAATGTGCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATTTATCAGGATAATAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCGATGGATGAGGCTGACTACTATTGTCAGGTGTGGGACAATTACAGTGTGCTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
CD16结合V区的进一步实例在EP1314741中描述，其序列在此并入本发明作参考。
抗-CD16结合VL
DIQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSNTGTVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGHTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYNNHWVFGGGTKLTVL
由如下序列编码：
GATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAA
抗-CD16结合VH
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGKATVTADTSSRTAYVQVRSLTSEDSAVYFCARSASWYFDVWGARTTVTVSS
由如下序列编码：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCG
包括编码GGGGSGGGGSGGGGS(G4S)3的接头(粗体字显示)的CD19结合scFv VL-VH的实例：
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS
由如下序列编码：
GATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCC
包括编码GGGGSGGGGSGGGGS(G4S)3的接头(以粗体字显示)的CD19结合scFv VH-VL的实例：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK
由如下序列编码：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTGGCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACTCTGACTGCAGACGAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTAGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGACGGGAGACTACGACGGTAGGCCGTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAA
具有来自CD19结合抗体的固定的VL和特异于人CD3的scFv的如表x中所述模块实例编码为：
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGATATCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATTTGAACTGGTACCAACAGATTCCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGATGCATCCAATCTAGTTTCTGGGATCCCACCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGAAGGTGGATGCTGCAACCTATCACTGTCAGCAAAGTACTGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAAGGAGGTGGTGGATCCGATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGACGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAA
获得如下氨基酸序列：
GGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLEL
在本发明的脊椎动物或细胞中在体内产生的N-末端人VH结构域如上所述与所述氨基酸序列在体内融合。与特异于CD19的编码的VL配对的VH结构域可以例如通过用人CD19免疫本发明的转基因脊椎动物而产生。所述脊椎动物(例如小鼠)基因组中重链基因座的VDJ基因区段的体内重组将产生一个scFv模块，其由在动物体内选择的VH及在脊椎动物基因组中编码的VL组成，其特异于通过接头与特异于人CD3的结合模块连接的人CD19，如上文所述。
免疫程序
本领域已经描述了针对产生单克隆抗体的CD19细胞表面抗原的免疫程序(PEZZUTTO,A.,B.,RABINOVITCH,P.S.,LEDBETTER,J.A.,MOLDENHAUER,G.andCLARK,E.A.,CD19monoclonal antibody HD37inhibits anti-immunoglobulin-induced Bcell activation and proliferation.J.Immunol.；Pezzutto A,B,Feller A,Moldenhauer G,Schwartz R,Wernet P,et al.HD37monoclonal antibody:a usefulreagent for further characterization of"non-T,non-B"lymphoid malignancies.In:Reinherz EL,Haynes BF,Nadler LM,Bernstein ID,editors.Leukocyte typingII.Proceedings of the 2nd International Workshop on Human LeukocyteDifferentiation Antigens；1984Sept 17-20；Boston,USA.New York,Berlin,Heidelberg,Tokyo:Springer-Verlag；1986.Volume 2.p.391-402.138,2793–2799(1987)。
筛选CD19特异性scFv
筛选特异于人CD19的本发明的分子可以如及Milstein所述从通过小鼠(或其它脊椎动物)脾细胞与骨髓瘤细胞系融合而产生的杂交瘤细胞的培养上清中筛选。这可以例如通过使用流式细胞计量术或者免疫测定技术，如基于细胞的ELISA或者成像技术如Li-Cor OdyseeTM，筛选与在细胞表面上表达人CD19的原代细胞或者永生化细胞系的结合而实现。同样，可以使用重组蛋白质进行双特异性ELISA和SPR筛选，例如Moore et al.,2011所述(Moore PA,Zhang W,Rainey GJ,et al.Application of dual-affinity re-targeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-celllymphoma.Blood.2011；117(17):4542-4551)。选择结合人CD19阳性的杂交瘤克隆并使用相同技术针对分别与人CD19和人CD3的结合进行二级筛选。对这些选择的克隆的功能性分析包括CD19介导的B细胞淋巴瘤细胞系的杀伤或者人PBMC制备物中B细胞的耗竭，这两项均如Moore et al.,2011所述。
实施例8：转基因非人脊椎动物
工程化小鼠IgG1恒定区(着陆垫插入)
为了可以在体内选择多价(例如多特异性或双特异性)多肽链，例如其具有结构VH1-L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-铰链区-CH2-CH3，如下文详述对小鼠IgG1恒定区进行工程化。
构建称作R232的进入载体，以靶向含有如图14A所示特征的小鼠IgG1恒定区，除非特别指出则使用标准分子生物学技术进行。一旦靶向载体插入IgG1恒定区中，其作为着陆垫以通过RMCE插入任何DNA片段，可例如是基因或多个基因、结合模块如抗体单一可变结构域(dAb)、ScFv、肽等。
购自Source BioScience LifeSciences的含有IgG1恒定区的小鼠129BACbMQ263j18通过重组工程5’和3’同源臂(HA)而恢复。所述5’-HA为2707bp，所述3’-HA为3001bp，在质粒pBR322中进行恢复。用于恢复的寡聚物含有掺入的限制位点以便于下游克隆。所述5’-HA含有限制位点NotI和MluI，而3’-HA含有限制位点EcoRI和KpnI。将各自的同源臂相继克隆进载体R3中，其含有失活的piggyBAC转座子元件及两个PB5’LTR，在其内PGK启动子和HPRT基因分成两个部分(5’HPRT和3’HPRT)。所述3’-HPRT部分侧翼是loxP和突变体lox5171位点。5’和3’-HA克隆进R3产生所述进入载体R232。
制备所述进入载体以通过用NotI限制酶线性化而靶向进ES细胞。将大约10μg线性化的R232质粒DNA用于靶向进在IgH基因座含有人VDJ基因区段的ES细胞。在含有次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷(HAT)的培养基上选择靶向的ES克隆，通过PCR对正确靶向的克隆确定基因型。
结合模块载体构建
除非特别指出，则使用标准分子克隆技术构建结合模块载体。将含有铰链区、CH2、CH3、M1及M2结构域的IgG1恒定区从BAC bMQ263j18中通过重组工程恢复。将来自如WO2004/106381中论述的包含特异于人CD3和人CD19的结合结构域的双特异性单链抗体构建体的scFv用作针对CD3的固定的结合模块。整体的结合模块结构与在WO2004/106381中论证的构建体2(Sequence ID no.1；protein ID no.2)的结构相似，不同之处是不包括CD19的可变重链及CD19的可变轻链用单一重排的共有轻链置换。在EP2505654中论证了当用感兴趣的抗原免疫时，小鼠遗传工程化为表达与单一重排的轻链(例如Vk1-39/J或Vk3-20/J)结合的反向嵌合免疫球蛋白重链，产生B细胞，其包含多种人V区段重排及表达多种高亲和性抗原特异性抗体。为此，在不存在VH时使用重排的Vk1-39Jk5以形成第二个抗原的结合模块的一部分(这将组合通过在基因座5’的人可变区基因区段的重排产生的VH)。在固定的CD3结合结构域的下游，包含位于小鼠IgG1CH1与铰链区结构域之间的内含子序列，以允许CD3结合结构域与铰链区结构域的剪接以及因此剩余的IgG1恒定区。通过GeneArt(Invitrogen)合成构建结合模块结构域和内含子DNA，其具有如下序列：
L1-VL(Vk1-39Jk5)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD3)-内含子-序列
L1是接头1：
GGGGSGGGGSGGGGS
由如下序列编码：
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT
L2是接头2：
SGGGGS，由TCCGGAGGTGGTGGATCC编码
L3是接头3：
VEGGSGGSGGSGGSGGVD
由如下序列编码：
GTCGAAGGTGGAAGTGGAGGTTCTGGTGGAAGTGGAGGTTCAGGTGGAGTCGAC
VL(Vk1-39Jk5)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRK
由如下序列编码：
Gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtacccctccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgtaag
VH(CD3)：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
由如下序列编码：
GATATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
VL(CD3)：
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
由如下序列编码：
GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
将含有铰链区、CH2、CH3、M1及M2的恢复的小鼠IgG1恒定区通过NdeI和MluI限制位点克隆在合成构建的结合模块结构域的下游。所得结合模块和IgG1恒定区作为单一片段通过HindIII和MluI克隆进载体R217中及在两个PB 3’LTR之间，其也含有puro-δ-TK选择盒并与lox位点相容进入载体以进行RMCE。所述结合模块的最终结构示于图14B并称作R246。
将结合模块载体R246靶向含有着陆垫的ES细胞是通过RMCE及Cre重组酶瞬时表达及在含有嘌呤霉素的培养基中选择克隆而实现的。ES细胞中正确靶向的结合模块载体置换所述着陆垫并在插入的结合模块的5’和3’末端再组成两个功能性piggyBAC转座子。这两个功能性转座子在修饰元件和选择盒的侧翼，因此这些通过超-piggyBac转座酶的瞬时表达而同时便利地切除。结合模块载体的靶向及随手的双重切除通过PCR相继分析。
使用标准程序从ES细胞中产生后代小鼠。
从嵌合小鼠中扩增双特异性转录物
将两只嵌合小鼠(表2)在出生25天后处死，收集其脾和淋巴结，使用Trizol试剂(Life Technologies)根据厂商指导提取总RNA(图15a)。
表2：嵌合的双特异性转基因小鼠的详细描述
将脾切片成3等份，从中提取总RNA。使用特异于小鼠IgG1CH2结构域的反向引物从大约5μg总RNA中合成第一链cDNA，使用5’-RACE二代试剂盒(Roche)。将此cDNA用High PurePCR纯化试剂盒(Roche)纯化。在第一链cDNA加入聚(A)尾，使用重组末端转移酶和dATP根据厂商指导进行。所述dA-加尾的cDNA直接用于PCR扩增，使用寡dT-锚定引物及特异于小鼠IgG1CH2结构域的内部反向引物1(第一轮单一半嵌套PCR)(图15B)。进行第二轮PCR，使用1μl凝胶提取的第一轮PCR产物作为模板，使用与第一轮PCR相同的嵌套寡聚体(第二轮单一半嵌套PCR)或者使用进一步的特异于小鼠CH2结构域的内部反向引物2(第二轮双重半嵌套PCR)及PCR锚引物(图15C)。使用Qiagen凝胶提取试剂盒将相应于预期大小(大约1.7kb)的双特异性转录物的PCR产物进行凝胶提取及DNA纯化。进行第三轮PCR使用进一步的特异于CH2结构域的内部反向引物3(第三轮三重半嵌套PCR)(图15D)以降低扩增任何非特异性DNA片段的可能性。
结果
双特异性抗体转基因小鼠产生
对含有插入的人VDJ基因的转基因小鼠进行进一步工程化。通过在着陆垫中靶向首先置换IgG1恒定区。所述着陆垫便于通过RMCE插入结合模块，其含有如下结构：L1-VL1-L2-VH2-L3-VL2-铰链区-CH2-CH3-内含子序列-M1-M2，其没有CH1结构域。为了使在体内选择的V基因与接头1(L1)进行RNA剪接，将一剪接受体置于L1的5’末端。此外，对位于内源性小鼠IgG1CH1与铰链区之间的基因内区域在所述结合模块内的VL2与铰链区之间进行工程化，以使得两个结构域正确剪接。此外，为了使得VH基因至L1可以通用选择和重排及因此重链和轻链配对，使用共有轻链(Vk1-39/Jk5)作为VL1。
使用5’-RACE分析年幼的首次用于实验的嵌合小鼠(25天龄)的mRNA转录物，其相应于预期大小的新的双特异性抗体。对从脾和骨髓中收获的总RNA中合成的cDNA进行三轮相继的半嵌套PCR，使用特异于IgG1CH2结构域的引物，在从小鼠KMBS2.1d淋巴结中提取的RNA中可以检测到相应于预期大小(大约1.7kb)的新双特异性抗体的转录物。这些转录物的大小与从种系等位基因中扩增的那些转录物的大小(大约850bp)显然不同(图15)。
图16示出用SalI消化的PCR产物的凝胶。可见相应于预期大小的双特异性抗体转录物的条带。进行测序以进一步证实该结果。
本发明人确信其提供了一种产生指导选择产物的方法，所述产物是稳定的且可以在体内通过自然选择、VDJ重排和类别转换重组而产生，进一步地其中在不存在CH1结构域时，所述恒定区可以被改变而不负面影响VDJ重排和类别转换重组。

Claims (23)

1.在非人脊椎动物中产生包含体细胞高变的可变区的多肽链的方法，所述方法包括：
(a)在脊椎动物中在幼B细胞中表达IgM抗体，其中所述抗体包含分别从重链和轻链基因座中表达的重链和轻链；
(b)用预定的表位免疫所述脊椎动物，并获得在至少一些重链基因座中的同种型转换及已经经历体细胞高变的非-μ抗体的表达，其中所述抗体包含缺少CH1结构域的重链及包含特异性结合所述抗原的可变区；及
(c)通过选择结合所述表位的可变区从所述免疫的脊椎动物中选择一或多个多肽链，其中每个选择的链包含特异性结合所述表位的体细胞高变的可变区；及
所述方法进一步包括在不存在轻链表达时表达步骤(b)中的非-μ抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述非-μ抗体是IgG。
3.权利要求1或2的方法，其中所述脊椎动物是小鼠。
4.权利要求1或2的方法，其中所述脊椎动物是大鼠。
5.权利要求1或2的方法，包括从所述免疫的脊椎动物中分离表达包含结合所述表位的体细胞高变的可变区的多肽链的B细胞。
6.权利要求3的方法，包括从所述免疫的脊椎动物中分离表达包含结合所述表位的体细胞高变的可变区的多肽链的B细胞。
7.权利要求4的方法，包括从所述免疫的脊椎动物中分离表达包含结合所述表位的体细胞高变的可变区的多肽链的B细胞。
8.权利要求5的方法，进一步包括使所述细胞永生化或者从中产生杂交瘤。
9.权利要求6或7的方法，进一步包括使所述细胞永生化或者从中产生杂交瘤。
10.非人脊椎动物细胞或者杂交瘤，其基因组包含抗体重链基因座和抗体轻链基因座，所述轻链基因座包含：
(a)在5’至3’方向包含可变区和恒定区，以在表达IgM抗体的淋巴细胞中表达轻链；及
(b)在表达非-μ抗体的淋巴细胞中关闭轻链表达的构件。
11.权利要求10的细胞或杂交瘤，其是大鼠细胞。
12.权利要求10的细胞或杂交瘤，其是小鼠细胞。
13.非人脊椎动物细胞，其中所述细胞基因组包含：
(i)功能性抗体轻链基因座，以表达轻链；
(ii)抗体重链基因座，其在5’至3’方向包含重排或未重排的可变区、第一个转换序列、μ恒定区、第二个转换序列及缺少CH1基因区段的非-μ恒定区，以表达包含IgM型重链和轻链的IgM抗体；及IgM至非-μ同种型转换以在不存在轻链时产生包含一或多个非-μ型重链的非-μ抗体，每个重链均缺少CH1结构域；及
(iii)关闭轻链表达的构件，其中在同种型转换为所述非-μ型抗体之后功能性轻链不表达。
14.权利要求13的细胞，其是小鼠细胞。
15.权利要求13的细胞，其是大鼠细胞。
16.权利要求13、14或15的细胞，其是淋巴细胞。
17.权利要求13、14或15的细胞，其中关闭轻链表达的构件包括核苷酸序列，其是从所述轻链基因座中表达功能性轻链必需的，其中所述核苷酸序列在表达IgM的幼B细胞中是功能性的，但是所述核苷酸序列在表达所述非-μ型抗体的成熟B细胞中不存在或者无功能。
18.权利要求16的细胞，其中关闭轻链表达的构件包括核苷酸序列，其是从所述轻链基因座中表达功能性轻链必需的，其中所述核苷酸序列在表达IgM的幼B细胞中是功能性的，但是所述核苷酸序列在表达所述非-μ型抗体的成熟B细胞中不存在或者无功能。
19.权利要求17的细胞，其中所述核苷酸序列是轻链可变区或者轻链基因座的CL区。
20.权利要求18的细胞，其中所述核苷酸序列是轻链可变区或者轻链基因座的CL区。
21.权利要求16的细胞，其是永生化B细胞或从B细胞中产生的杂交瘤，其中所述B细胞表达所述非-μ抗体，其中所述抗体特异于抗原。
22.权利要求18的细胞，其是永生化B细胞或从B细胞中产生的杂交瘤，其中所述B细胞表达所述非-μ抗体，其中所述抗体特异于抗原。
23.权利要求20的细胞，其是永生化B细胞或从B细胞中产生的杂交瘤，其中所述B细胞表达所述非-μ抗体，其中所述抗体特异于抗原。
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