CN112961242B - 抗b7h3抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗B7H3抗体及其应用，所述抗体可变区包括SEQ ID NO:25～39所示的氨基酸序列。本发明的抗B7H3抗体26B6、6F7、2B8和23H1对B7H3具有显著的结合能力，不仅可以结合纯化的或游离的B7H3蛋白，还可以结合细胞表面的B7H3蛋白；经过人源化改造后，进一步提高了抗体与B7H3的亲和力，在B7H3阳性肿瘤的临床诊断和/或治疗方面具有重要的应用前景。

Description

抗B7H3抗体及其应用
本申请为申请号为202010622482.X、申请日为2018-06-30、发明名称为“抗B7H3抗体及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及抗B7H3抗体及其应用。
背景技术
B7-H3是I型跨膜蛋白，属于B7免疫共刺激和共抑制家族，在人体中具有两种同种型2Ig-B7-H3和4Ig-B7H3，在小鼠中具有一种同种型2Ig-B7-H3，人2Ig-B7-H3与小鼠2Ig-B7-H3具有88％的氨基酸同一性。B7-H3具有免疫抑制功能，可以减少T细胞释放的I型干扰素(IFN)、降低NK细胞的细胞毒性。
B7-H3蛋白在正常组织(例如前列腺、乳腺、胎盘、肝脏、结肠和淋巴器官)中表达有限，但是在大部分恶性肿瘤中异常表达。在非小细胞肺癌细胞株和肿瘤组织中可以检测到B7-H3的表达，B7-H3 mRNA和B7-H3蛋白在6种非小细胞肺癌的细胞株中均高表达，在癌细胞的胞膜和胞质中也有表达，表达率约为73％。在表达B7-H3的肿瘤组织中，浸润性淋巴样细胞的数目显著降低，与淋巴结转移呈正相关(Sun Y,Wang Y,Zhao J,et al.B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer[J].Lung Cancer,2006,53(2):143-151.；赵文建，陈春燕，眭文妍等.B7-H3及其与肿瘤关系的研究进展[J].医学综述,2009,15(22):3430-3433.)。
B7-H3在肿瘤细胞中的过表达通常与肿瘤浸润淋巴细胞减少、癌症进展加快以及恶性肿瘤(神经系统肿瘤、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和透明细胞肾癌)的临床结果密切相关。由于其在多种肿瘤中广泛表达，B7-H3已成为癌症免疫疗法的潜在靶标。B7-H3特异性单克隆抗体(mAb)和抗体-药物偶联物在异种移植小鼠模型中显示出针对B7-H3阳性肿瘤细胞的抗肿瘤活性，并且I期临床试验显示出良好的安全性特征(NCT01099644，NCT02381314和NCT02982941)。由于B7-H3在肿瘤组织细胞中高表达，而在正常组织细胞中不表达或低表达，因此B7-H3被认为是某些肿瘤的诊断标志物。B7-H3与肿瘤的生物学特征具有密切的相关性，有望成为恶性肿瘤的治疗靶点。
hB7H3的结构示意图如图1所示，hB7H3的胞外结构由两个序列几乎完全一致的Ig-V结构域(Ig-V domain)+Ig-C2结构域(Ig-C2 domain)串联而成；一种表达量较高的可变剪接体缺少中间部分，胞外区仅具有一个Ig-V结构域+Ig-C2结构域；小鼠B7H3仅具有一个IgV+IgC2单元。Ig-V domain+Ig-C2 domain的结构与PD-L1类似，4个结构域之间主要以柔性连接肽连接，可以自由摆动；主要以单体形式表达，体外可能出现同源二聚化的现象；而人体内不存在与hB7H3同源性高于30％的蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供抗B7H3抗体及其应用，所述抗体单独和/或与其他药物联合用于癌症的治疗。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了抗B7H3的抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；
所述抗原结合片段的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示；
所述抗原结合片段的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示；
所述抗原结合片段的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示；
所述抗原结合片段的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示；
所述抗原结合片段的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示。
根据本发明，抗B7H3抗体26B6的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:17所示的CDR1、如SEQ ID NO:9所示的CDR2和如SEQ ID NO:1所示的CDR3；
轻链可变区包括如SEQ ID NO:21所示的CDR1、如SEQ ID NO:13所示的CDR2和如SEQ ID NO:5所示的CDR3；
SEQ ID NO:17：GYAFTEY；
SEQ ID NO:9：NPNTGG；
SEQ ID NO:1：PYRDDGGFHWYFDV；
SEQ ID NO:21：SASSSVSYMQ；
SEQ ID NO:13：DTSKLTS；
SEQ ID NO:5：QQWSSNPLT。
包含上述抗原结合片段的抗B7H3抗体26B6的重链可变区包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；人源化改造后的26B6的重链可变区包括如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:25(26B6HV)：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYAFTEYTMHWVKQSQGKSLEWIGGINPNTGGTTYNQKFNGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRPYRDDGGFHWYFDVWGAGTAVTVSSAS；
SEQ ID NO:26(26B6LV)：
QIVLTQSPAVMSTSPGEKVTMTCSASSSVSYMQWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLTSGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRADAAP；
SEQ ID NO:27(h26B6HV)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYTMHWVRQAPGQGLEWIGGINPNTGGTTYNQKFNGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRPYRDDGGFHWYFDVWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:28(h26B6LV)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMQWYQQKPGLAPRLLIYDTSKLTSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKRTV。
根据本发明，抗B7H3抗体6F7的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:18所示的CDR1、如SEQ ID NO:10所示的CDR2和如SEQ ID NO:2所示的CDR3；
轻链可变区包括如SEQ ID NO:22所示的CDR1、如SEQ ID NO:14所示的CDR2和如SEQ ID NO:6所示的CDR3；
SEQ ID NO:18：GFTFTDY；
SEQ ID NO:10：RNKANGYT；
SEQ ID NO:2：DSHYRPFAY；
SEQ ID NO:22：KSSQSLLNSGNQNNYLT；
SEQ ID NO:14：LASTRDS；
SEQ ID NO:6：QNDYTYPLT。
包含上述抗原结合片段的抗B7H3抗体6F7的重链可变区包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；人源化改造后的6F7的重链可变区包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:29(6F7HV)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISSDDSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDSHYRPFAYWGQGTLVTVSAAS；
SEQ ID NO:30(6F7LV)：
DIQMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQNNYLTWYQQKPGQPPKLLIYLASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKLELKRADAAP；
SEQ ID NO:31(h6F7HV)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVAFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSHYRPFAYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:32(h6F7LV1)：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLNSGNQNNYLTWYLQKPGQSPQLLIYLASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTV；
SEQ ID NO:33(h6F7LV2)：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQNNYLTWYQQKPGQPPKLLIYLASTRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIKRTV。
根据本发明，抗B7H3抗体2B8的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:19所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:3所示的CDR3；
轻链可变区包括如SEQ ID NO:23所示的CDR1、如SEQ ID NO:15所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3。
SEQ ID NO:19：GYTFTDG；
SEQ ID NO:11：NTNSGN；
SEQ ID NO:3：GVFYYGYGAWFAY；
SEQ ID NO:23：RASKTISNYLA；
SEQ ID NO:15：SGSTLQS；
SEQ ID NO:7：QQHHEYPLT。
包含上述抗原结合片段的抗B7H3抗体2B8的重链可变区包括如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；人源化改造后的2B8的重链可变区包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:34(2B8HV)：
QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKVSGYTFTDGAMHWVKRSHAKSLEWIGIINTNSGNTNYNQKFQGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARGVFYYGYGAWFAYWGQGTLVTVSAAS；
SEQ ID NO:35(2B8LV)：
DVQITQSPSYLTASPGETIIINCRASKTISNYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSDTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHHEYPLTFGAGTKLELKRADAAP；
SEQ ID NO:36(h2B8HV)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTDGAMHWVRQAPGQGLEWIGIINTNSGNTNYNQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARGVFYYGYGAWFAYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:37(h2B8LV)：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTINCRASKTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHHEYPLTFGGGTKVEIKRTV。
根据本发明，抗B7H3抗体23H1的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:20所示的CDR1、如SEQ ID NO:12所示的CDR2和如SEQ ID NO:4所示的CDR3；
轻链可变区包括如SEQ ID NO:24所示的CDR1、如SEQ ID NO:16所示的CDR2和如SEQ ID NO:8所示的CDR3。
SEQ ID NO:20：GFTFTDY；
SEQ ID NO:12：RNKVNDYT；
SEQ ID NO:4：DSPYRPFAY；
SEQ ID NO:24：KSSQTLLNNGNQKNFLT；
SEQ ID NO:16：LASTRES；
SEQ ID NO:8：NDYTYPLT。
包含上述抗原结合片段的抗B7H3抗体23H1的重链可变区包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:38(23H1HV)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKVNDYTTEYSVSVKGRFTISRDNSQTILYLQMNTLRAEDSATYYCARDSPYRPFAYWGQGTLVTVSAAS；
SEQ ID NO:39(23H1LV)：
DIVMTQSPSSLTVTAGENVTMSCKSSQTLLNNGNQKNFLTWYQQKPGQPPKLLIYLASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKLELKRADAAP。
优选地，所述抗体还包括恒定区。
优选地，所述抗体分子可以是N端、内部或C端修饰，例如寡聚化、糖基化或与标记物的缀合的修饰，从而调节抗体的功能。
根据本发明，抗体糖基化可以调节抗体功能，影响其半衰期、免疫源性、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)等。抗体糖基化主要与抗体序列、氨基酸暴露位点、合成条件等因素有关，根据糖苷链类型，蛋白质糖基化可以分为四类，即以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点，形成-O-糖苷键型；以天冬酰胺的酰胺基、N-末端氨基酸的α-氨基以及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基为连接点，形成-N-糖苷键型；以天冬氨酸或谷氨酸的游离羧基为连接点，形成脂糖苷键型；以及以半胱氨酸为连接点，形成糖肽键。
第二方面，本发明提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述的抗原结合片段和/或抗体的DNA片段。
第三方面，本发明提供了表达载体，所述表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞包括第三方面所述的表达载体，和/或所述宿主细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
第五方面，本发明提供了抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将第一方面所述的抗体的编码核酸连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(2)提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。
作为优选技术方案，本发明提供了抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
采用包含特定比例的重链(HC)表达载体和轻链(LC)表达载体的抗体分泌系统、或采用包含编码HC和LC序列的单一载体，瞬时或稳定转染宿主细胞，所述宿主细胞例如可以是HEK 293或CHO；
采用常规方法从细胞培养液上清中获得纯化的抗体，例如，对于Fab片段，可以采用磷酸盐缓冲液(pH7.4)平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GEHealthcare)过滤培养上清，洗涤去除柱的非特异性结合组分；结合的抗体采用pH梯度洗脱液(20mM pH＝7Tris缓冲液至10mM pH＝3.0柠檬酸钠缓冲液，或pH＝7.4磷酸盐缓冲液至100mM pH＝3.0甘氨酸缓冲液)进行洗脱；
抗体采用SDS-PAGE检测，并可选地进行进一步纯化；
采用常规技术对抗体进行浓缩和/或无菌过滤，去除可溶性聚集体和多聚体，常规技术包括尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、多模式色谱或羟磷灰石色谱；
在色谱浓缩步骤之后，抗体的纯度大于95％，将高纯度抗体产物置于-70℃下冷冻或冻干。
第六方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗体。
优选地，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供了第一方面所述的抗原结合片段和/或抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的宿主细胞或第六方面所述的药物组合物在制备肿瘤检测试剂和/或肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括B7H3表达阳性的肿瘤。
优选地，所述肿瘤包括神经系统肿瘤、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或肝细胞癌中的任意一种或至少两种的组合。
现有技术已经报道了B7H3在原发性肝癌(郭昊苏，杨易戎，李凯，贺康丽，李星悦，刘宏；血清中CYFRA21-1及sB7-H3检测对原发性肝癌的诊断意义[J]；中国现代医学杂志.)、食管鳞癌(孙楠，刘新波，曹娜娜，王玲；B7-H3基因在食管鳞癌患者外周血中的表达及其临床意义[J]；中国肿瘤外科杂志；201911(04)：247-250.)、神经母细胞瘤(廖茹，孙晓非，甄子俊，王娟，黄东生；神经母细胞瘤组织中B7H3的表达及临床意义[J]；中华实用儿科临床杂志；2019(11)：842-847.)、结肠癌(梁群英，张玉文，邱晓娣；B7-H3在结肠癌组织中的表达及其临床病理意义[J]；中国实用医刊；2018 45(15)：48-52.)和头颈部鳞状细胞癌(毛亮，范腾飞，武磊，于光涛，邓伟伟，陈磊，卜琳琳，马思锐，刘冰，边岩松，Ashok B Kulkarni，张文峰，孙志军；头颈鳞癌选择性阻断B7-H3可以通过减少髓源抑制细胞加强抗肿瘤免疫效果[C]；中华口腔医学会；2017：139.)等疾病的诊断价值，而抗B7H3抗体对B7H3表达阳性的肿瘤具有治疗效果，本发明的抗B7H3抗体26B6、6F7、2B8和23H1对B7H31对B7H3具有显著的结合能力，在B7H3表达阳性肿瘤的诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的抗B7H3抗体26B6、6F7、2B8和23H1对B7H3具有显著的结合能力，不仅可以结合纯化的或游离的B7H3蛋白，还可以结合细胞表面的B7H3蛋白；
(2)本发明的抗体经过人源化改造后，进一步提高了抗体与B7H3的亲和力；
(3)本发明的抗体及其人源化改造抗体在治疗B7H3阳性肿瘤中具有重要的应用前景。
附图说明
图1为hB7H3的结构示意图；
图2为流式检测抗体与B7H3的结合；
图3为ELISA检测抗体与B7H3的结合；
图4为流式检测人源化抗体与B7H3的结合。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1抗体的表达和纯化
本实施例制备抗B7H3抗体26B6(SEQ ID NO:25～26)、6F7(SEQ ID NO:29～30)、2B8(SEQ ID NO:34～35)和23H1(SEQ ID NO:38～39)，步骤如下：
采用包含特定比例的重链(HC)表达载体和轻链(LC)表达载体的抗体分泌系统稳定转染宿主细胞HEK 293；培养一段时间后，采用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)过滤细胞培养上清，洗涤去除柱的非特异性结合组分；结合的抗体采用pH梯度洗脱液(20mM pH＝7Tris缓冲液至10mM pH＝3.0柠檬酸钠缓冲液)进行洗脱；得到的洗脱液进行SDS-PAGE检测，并进一步纯化；纯化产物进行浓缩和无菌过滤，去除可溶性聚集体和多聚体，浓缩步骤之后，抗体的纯度大于95％，将高纯度抗体26B6、6F7、2B8和23H1置于-70℃下冷冻或冻干。
实施例2抗体的亲和力测试
将实施例1制备的高纯度抗体26B6、6F7、2B8和23H1进行亲和力检测，采用ForteBio亲和力测量方法(P.Estep等，High throughput solution-based measurementof antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):270-278.)，设置对照抗体huM30和Enoblituzumab(Eno)。huM30是日本第一三共公司(Daiichi Sankyo)的人源化B7H3抗体(CN103687945B)，DS-5573正在开展临床I期试验用于治疗B7H3阳性的实体肿瘤(NCT02192567)；Enoblituzumab是一款经过免疫分子优化的、针对B7-H3靶点的全新单克隆抗体，由MacroGenics采用独家Fc优化技术开发，具有独特的抗体优势和治疗潜力，全球尚无此类药物获批，Enoblituzumab代表了全球领先的B7-H3抗体药物。
简言之，将抗体装载至AHQ传感器上，将传感器在测定缓冲液中离线平衡30min，在线监测60s用于确立基线；将装载抗体的传感器与60nM抗原B7H3 ECD-His共孵育5min，随后转移至测定缓冲液中，5min后测定解离速率；动力学分析采用1:1结合模型进行。
结果如表1所示，相比于国外已经开展临床试验的对照抗体huM30和Eno，本发明筛选得到的2B8、26B8、23H1、6F7抗体与human B7H3 ECD-his蛋白具有同等或更优的结合活性。
表1抗体结合human B7H3 ECD-His的亲和力
Figure BDA0002952852020000061
实施例3抗体与HEK293细胞上B7H3的结合
本实施例采用流式细胞术检测实施例1制备的抗体与HEK293细胞上B7H3的结合，步骤如下：
采用PBS+5％BSA重悬5×105个HEK293细胞，4℃孵育30min；加入不同浓度抗体(1μg/mL～0.01μg/mL，10倍梯度稀释)，4℃孵育60min；离心洗涤后加入含有FITC-标记二抗(1:200，sigma，F9512)的PBS+5％BSA溶液，冰上避光孵育30min；将细胞洗涤3次后进行流式细胞术分析；
设置对照组huM30、Eno、NC和Cell+二抗。
结果如图2所示，采用流式细胞方法检测了对照抗体(huM30、Eno)和2B8、26B8、23H1、6F7抗体在终浓度分别为1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的条件下，与HEK293 B7H3蛋白的结合能力，相比于对照抗体，2B8、26B6、23H1、6F7抗体同HEK293 B7H3蛋白具有同等或更优的结合能力。
实施例4抗体的ELISA检测
采用间接ELISA法检测抗体2B8、26B8、23H1和6F7对不同长度B7H3蛋白胞外段的结合能力，将human B7H3-IgV-His、human B7H3-V1-C1-V2-His、human B7H3-IgC2、humanB7H3-ECD-His以及对照蛋白cyno-B7H3-His共5种抗原分别用包被缓冲液稀释至0.2μg/mL，向96孔ELISA包被板中各加入100μL/孔，4℃孵育过夜后用PBST溶液洗涤数次，1％BSA 37℃封闭1小时，每孔分别加入100μL终浓度为0.5μg/mL的抗体2B8、26B8、23H1、6F7，37℃孵育2小时后；PBST洗涤5次后，加入100μL稀释的HRP标记二抗，37℃孵育1小时；PBST洗涤5次后，显色剂显色20min，酶标仪上读取数值。
结果如图3所示，2B8、26B6抗体和对照抗体huM30、Eno具有相似的B7H3蛋白胞外段结合特点，不同的是，23H1、6F7抗体主要结合于的B7H3蛋白胞外段除Ig-C2区以外的位点。
实施例5抗体的人源化改造
对实施例1制备的抗体26B6、6F7和2B8进行人源化改造。简言之，将不同杂交瘤细胞分泌的抗体的基因序列与人胚胎系抗体的基因序列进行比对，找出同源性高的序列；分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列；考察空间立体结合方式；计算静电力、范德华力、亲疏水性和熵值，分析各杂交瘤细胞分泌的抗体基因序列中可与B7H3作用并维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人胚胎系基因框架，并在此基础上标配出必须保留的框架区氨基酸位点，合成随机引物，自制噬菌体文库，筛选人源化抗体文库(A.Pini等，Design and use of a phage display library:human antibodies withsubnanomolar affinity against a marker of angiogenesis eluted from a two-dimensional gel.Journal of Biological Chemistry,1998.273(34):21769-21776)。
得到h26B6(SEQ ID NO:27～28)、h6F7(SEQ ID NO:31～33)和h2B8(SEQ ID NO:36～37)。
实施例6人源化后抗体与HEK293细胞上B7H3的结合
本实施例采用流式细胞术检测实施例5制备的人源化抗体与HEK293细胞上B7H3的结合，步骤如下：
采用PBS+5％BSA重悬2×105个HEK293细胞，4℃孵育30min；加入不同浓度人源化抗体(5μg/mL～0.002286μg/mL，3倍梯度稀释)，4℃孵育60min；离心洗涤后加入含有FITC-标记二抗(1:200，sigma，F9512)的PBS+5％BSA溶液，冰上避光孵育30min；将细胞洗涤3次后进行流式细胞术分析，EC50采用Graphpad软件进行计算；
设置对照组huM30、Eno、NC和Cell+二抗。
结果如表2和图4所示，h26B6以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.3063μg/mL，h2B8以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.07789μg/mL，h6F7L1以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.6038μg/mL，h6F7L2以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.4096μg/mL，huM30以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.09737μg/mL。人源化改造后的h2B8抗体与人B7H3结合时表现出更优于huM30的EC50结果。
另外，将鼠源2B8、26B6、6F7抗体的轻、重链可变区连接到人抗体恒定区，获得了嵌合抗体ch2B8、ch26B6、ch6F7，其中，ch2B8以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.1315μg/mL，ch26B6以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.2323μg/mL，ch6F7以剂量依赖性的方式与B7H3结合，EC50值(n＝1)为0.2244μg/mL。
表2人源化抗体与B7H3的结合
h2B8 h6F7H1L1 h6F7H1L2 h26B6 huM30 ch2B8 ch6F7 ch26B6
EC50(μg/mL) 0.07789 0.6038 0.4096 0.3063 0.09737 0.1315 0.2323 0.2244
实施例7抗体和人源化抗体与B7H3的亲和力差异
本实施例采用ForteBio亲和力测量方法检测抗体在进行人源化改造后与B7H3的亲和力差异。
结果如表3所示，与表1的结果对比来看，经过人源化改造的h2B8抗体相比于未改造的抗体，具有更优的KD值，且较优于对照抗体huM30。
表3人源化抗体与human B7H3 ECD-His的亲和力
Figure BDA0002952852020000071
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州百暨基因科技有限公司
<120> 抗B7H3抗体及其应用
<130> 20200630
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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Thr
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser Gln Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Gly Phe His Trp Tyr Phe Asp Val
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Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Val Met Ser Thr Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Gly Ile Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Asn Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Gly Phe His Trp Tyr Phe Asp Val
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
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Asp Thr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
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Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asp Ser Gln Ser Ile
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Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
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<213> 人工序列
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Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gly
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Ala Met His Trp Val Lys Arg Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Ile Ile Asn Thr Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Ile Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro
<210> 36
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gly
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Thr Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Phe Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Val Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Val
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Thr Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Pro Tyr Arg Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser
115 120
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
115

Claims (15)

1.抗B7H3的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段包含重链可变区的CDR1-3和轻链可变区的CDR1-3，其中，所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示，
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示，
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 20所示，
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示。
2.抗B7H3抗体，其特征在于，所述抗体包括权利要求1所述的抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的抗B7H3抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区为如SEQ IDNO: 38所示的氨基酸序列，所述抗体的轻链可变区为如SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的抗B7H3抗体，其特征在于，所述抗体还包括恒定区。
5.根据权利要求2所述的抗B7H3抗体，其特征在于，所述抗体修饰有糖基化基团。
6.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1所述的抗原结合片段或权利要求2-5任一项所述的抗体的DNA片段。
7.表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求6所述的核酸分子。
8.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求7所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求6所述的核酸分子。
9.一种抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将权利要求2-5任一项所述的抗体的编码核酸连接入质粒，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
（2）提取筛选的阳性克隆的表达载体，转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗体。
10.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求2-5任一项所述的抗体。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
13.如权利要求1所述的抗原结合片段、权利要求2-5任一项所述的抗体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主细胞或权利要求10-12任一项所述的药物组合物在制备肿瘤检测试剂或肿瘤治疗药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括B7H3表达阳性的肿瘤。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括神经系统肿瘤、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或肝细胞癌中的任意一种或至少两种的组合。
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