CN115701436A

CN115701436A - 靶向siglec-15的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN115701436A
Application number: CN202110882915.XA
Authority: CN
Inventors: 请求不公布姓名
Original assignee: Fuzhou Tuoxin Tiancheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Fuzhou Tuoxin Tiancheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-02
Filing date: 2021-08-02
Publication date: 2023-02-10

Abstract

本发明涉及靶向siglec‑15的抗体和嵌合抗原受体及其应用。具体地，本发明涉及一种特异性靶向siglec‑15的scFv、抗体及其特异性CAR‑T细胞。本发明还提供了一种同时靶向siglec‑15的嵌合抗原受体免疫细胞，可有效治疗癌症或肿瘤，此外，本发明还提供了治疗AML血液肿瘤的标志物靶点siglec‑15。

Description

靶向siglec-15的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体地涉及靶向siglec-15的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)是模拟T细胞受体功能的人工受体，其融合了抗原与抗体或配体与受体的识别和结合特异性以及效应T细胞对被识别的肿瘤细胞的杀伤能力。CAR由CD8a引导肽、抗原识别区(配体或单链抗体或Fab片段)、跨膜区、以及T细胞的一系列信号转导区(CD28，CD3，CD137胞内信号传导结构域)依次连接而成。T细胞经修饰后，表面表达的CAR首先通过抗原识别区与肿瘤细胞表面抗原结合，然后通过其信号转导区将活化信号传递至胞内，靶向地激活T细胞对肿瘤细胞杀伤活性。将表达CAR的DNA序列克隆入慢病毒表达载体，并感染从患者血中分离出的T细胞，使T细胞表面表达相应的CAR，再将此修饰的T细胞再输回患者体内，修饰后的T细胞可以在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，达到清除肿瘤细胞的效果。

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类以骨髓和外周血中未成熟骨髓干细胞恶性增殖为特征且具有高度异质性的恶性肿瘤。经典的AML分型有FAB分型和MIC分型。其中较为重要的FAB分型(分为M0～M7型)。虽然近些年来对AML的治疗途径研究不断深入，新型治疗药物的研发和造血干细胞移植技术的发展都使得AML的预后有很大的改善，但治疗AML主要方式还是经典“3+7方案”，即化疗和造血干细胞移植，而且患者5年存活率仅维持在30％上下，由于目前AML具有治愈率与存活率低，而复发率高的特点，寻找新的生物标志物和靶向治疗分子显得尤为重要。

因此，本领域迫切需要开发一种有效的且安全性高的癌症或肿瘤，比如急性髓系白血病的治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效的且安全性高的癌症或肿瘤，比如急性髓系白血病的治疗方法。

本发明的第一方面，提供了一种抗体重链可变区，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:1、2、3或4所示的CDR1，

SEQ ID NO:5、6、7或8所示的CDR2，和

SEQ ID NO:9、10、11或12所示的CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区的CDR包括SEQ ID NO:N_H,N_H+4,和N_H+8所示的3个CDR，其中N_H分别为1、2、3或4。

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留siglec-15结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:25-28中任一所示的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

本发明第三方面提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:13、14、15或16所示的CDR1'，

SEQ ID NO:17、18、19或20所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:21、22、23或24所示的CDR3'。

在另一优选例中，所述轻链可变区的CDR包括SEQ ID NO:N_L,N_L+4,和N_L+8所示的3个CDR，其中N_L分别为13、14、15或16。

在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:29－32中任一所示的氨基酸序列。

本发明第四方面提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

本发明第五发明提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述抗体对人siglec-15(野生型)的亲和力的KD(M)≤1×10^-7，较佳地≤1×10^-8，更佳地≤8×10^-9。

在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:25－28中任一所示；和/或

所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:29－32中任一所示。

在另一优选例中，所述的抗体为IgG类型。

在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。

本发明第六方面提供了一种scFv，所述scFv包含如本发明第一方面所述的抗体重链可变区和如本发明第三方面所述的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述scFv还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。

在另一优选例中，所述scFv如下式A或式B所示：

V_H-V_L,(A)；或

V_L-V_H,(B)；

式中，V_H为所述抗体重链可变区；V_L为所述抗体轻链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。

在另一优选例中，所述的式A和B结构为从N端至C端。

在另一优选例中，所述的V_H和V_L之间的连接肽为1-4个连续的GGGGS所示的序列，较佳地1-4个，更佳地3-4个。

在另一优选例中，V_H的氨基酸序列包括选自SEQ ID No.:25-28中任一所示的V_H或其衍生V_H(或其活性片段)。

在另一优选例中，V_L的氨基酸序列包括选自SEQ ID No.:29－32中任一所示的V_L或其衍生V_L(或其活性片段)。

在另一优选例中，所述scFv包含如SEQ ID NO.:25所示的抗体重链可变区和如SEQID NO.:29所示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述scFv包含如SEQ ID NO.:26所示的抗体重链可变区和如SEQID NO.:30所示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述scFv包含如SEQ ID NO.:27所示的抗体重链可变区和如SEQID NO.:31所示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述scFv包含如SEQ ID NO.:28所示的抗体重链可变区和如SEQID NO.:32所示的抗体轻链可变区。

在另一优选例中，所述scFv包含如SEQ ID NO.:33-36所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.:33-36所示。

在另一优选例中，所述scFv的氨基酸序列与SEQ ID NO.:33-36所示的序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。

在另一优选例中，所述scFv靶向或结合于人siglec-15。

在另一优选例中，所述的scFv为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。

本发明第七方面提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五发明所述的抗体或本发明第六发明所述的scFv；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

本发明第八方面提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含如本发明第六方面所述的scFv。

在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：

Z1-T-H-TM-C-Z2(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

Z1为无或信号肽序列；

T为权利要求6所述的scFv；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

Z2为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。

在另一优选例中，所述的Z1为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述Z1为选自下组的蛋白的信号肽：CD8。

在另一优选例中，所述Z1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:37所示。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的绞链区：CD8。

在另一优选例中，所述的H的氨基酸序列如SEQ ID NO.:38所示。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD3 epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1、LAG-3、或其组合。

在另一优选例中，所述TM包括CD8来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.:39所示。

在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、或其组合。

在另一优选例中，所述C包括4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO.:40所示。

在另一优选例中，所述CD3ζ具有如SEQ ID NO.:41所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID No.:43-46中任一所示。

本发明第九方面提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞包括：

用于表达外源的如本发明第八方面所述的嵌合抗原受体的表达盒。

在另一优选例中，所述表达盒含有编码本发明第八方面所述的嵌合抗原受体的核酸序列。

在另一优选例中，所述表达盒分别还包含启动子和/或终止子。

在另一优选例中，所述启动子为哺乳动物启动子，优选地为EF1启动子。

在另一优选例中，所述启动子的序列如SEQ ID NO:42所示。

在另一优选例中，所述的表达盒位于载体上或整合在所述工程化的免疫细胞的染色体中。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述免疫细胞是离体的。

在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。

在另一优选例中，所述免疫细胞为非自体的。

在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

在另一优选例中，所述免疫细胞来自灵长目动物(优选为人)。

在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)

在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：NK细胞、T细胞、NKT细胞、(γδ)T细胞、单核细胞、或巨噬细胞。

本发明第十方面提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的scFv；以及

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

本发明第十一方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的scFv、本发明第七方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的嵌合抗原受体、本发明第十方面所述的抗体药物偶联物。

本发明第十二方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第十一方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

本发明第十三方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第十二方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第十一方面所述的核酸分子或表达本发明第八方面所述的嵌合抗原受体。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞、NK细胞或巨噬细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。

在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。

在另一优选例中，所述免疫细胞为异体的。

在另一优选例中，所述的细胞是CAR－T细胞，所述CAR－T细胞表达本发明第三方面所述的嵌合抗原受体。

本发明第十四方面提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第八方面所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：将本发明第十一方面所述的核酸分子或本发明第十二方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述导入包括同时、先后、或依次导入。

在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

本发明第十五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五发明所述的抗体、本发明第六方面所述的scFv、本发明第七方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的嵌合抗原受体、本发明第九方面所述的工程化的免疫细胞或本发明第十方面所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述宿主细胞包括工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述细胞的浓度为1×10³-1×10¹⁰个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物还含有预防和/或治疗癌症或肿瘤的其他药物(如抗体药物、化疗药物或其他CAR-T药物)。

本发明第十六方面提供了一种本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的scFv、本发明第七方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的嵌合抗原受体、本发明第九方面所述的工程化的免疫细胞、本发明第十方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十一方面所述的核酸分子、本发明第十二方面所述的载体、本发明第十三方面所述的宿主细胞或本发明第十五方面所述的药物组合物的用途，用于(i)制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂；和/或(ii)制备检测试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的抗体包括药物偶联物(ADC)形式的抗体。

在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括siglec-15高表达或阳性的肿瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病(MDS/MPD)、慢性骨髓增殖性疾病(SMPD)、前B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、T/NK细胞肿瘤、前淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病、T淋巴细胞白血病、T粒状淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成熟T细胞淋巴瘤/白血病、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病/sezary综合征(MF/SS)、周围T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴白血病(ALL)；前T细胞淋巴瘤/白血病；霍奇金淋巴瘤；肥大细胞增多症、肥大细胞白血病(MCL)、肥大细胞肉瘤(MCS)；巨噬细胞/组织细胞性肿瘤、树突状细胞肿瘤、朗格汉斯细胞组织增生症(LCH)、朗格汉斯细胞肉瘤(LCS)、滤泡树突状细胞肉瘤/肿瘤、树突状细胞肉瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：头颈部肿瘤、咽喉癌、肺癌、非小细胞肺癌、支气管癌、胃癌、胃癌腹膜转移肿瘤、食道癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌、结直肠癌腹膜转移肿瘤、小肠癌、肾脏肿瘤、肾癌、膀胱肿瘤、移行性上皮恶性肿瘤、内分泌肿瘤、甲状腺癌、肾上腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、卵巢癌腹膜转移肿瘤、子宫内膜癌、绒毛膜癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、生殖细胞肿瘤、精原细胞癌、胚胎原性肿瘤、神经系统肿瘤、脑胶质瘤、神经母细胞瘤、皮肤肿瘤、恶性黑色素瘤、淋巴癌、胸腺肿瘤、鼻咽癌、骨癌、肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、实体瘤转移性肿瘤如腹腔、胸腔、盆腔、实质器官处等转移瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断表达或高表达siglec-15的肿瘤。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中的siglec-15蛋白。

在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。

本发明第十七方面提供了一种用于预防和/或治疗癌症或肿瘤的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的scFv、本发明第七方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的嵌合抗原受体、本发明第九方面所述的工程的免疫细胞、本发明第十方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十一方面所述的核酸分子、本发明第十二方面所述的载体、或本发明第十三方面所述的宿主细胞或本发明第十五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或使用说明书。

本发明第十八方面提供了一种治疗疾病的方法，包括：给需要治疗的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的scFv、本发明第七方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的嵌合抗原受体、本发明第九方面所述的工程的免疫细胞、本发明第十方面所述的抗体药物偶联物、本发明第十一方面所述的核酸分子、本发明第十二方面所述的载体、或本发明第十三方面所述的宿主细胞或本发明第十五方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病包括癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症或肿瘤包括实体瘤和血液肿瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：头颈部肿瘤、咽喉癌、肺癌、非小细胞肺癌、支气管癌、胃癌、胃癌腹膜转移肿瘤、食道癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌、结直肠癌腹膜转移肿瘤、小肠癌、肾脏肿瘤、肾癌、膀胱肿瘤、移行性上皮恶性肿瘤、内分泌肿瘤、甲状腺癌、肾上腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、卵巢癌腹膜转移肿瘤、子宫内膜癌、绒毛膜癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、生殖细胞肿瘤、精原细胞癌、胚胎原性肿瘤、神经系统肿瘤、脑胶质瘤、神经母细胞瘤、皮肤肿瘤、恶性黑色素瘤、淋巴癌、胸腺肿瘤、鼻咽癌、骨癌、肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、实体瘤转移性肿瘤如腹腔、胸腔、盆腔、实质器官处等转移瘤、或其组合。

本发明第十九方面提供了一种体外检测样品中siglec-15蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在siglec-15蛋白。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。

本发明第二十方面提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物。

本发明第二十一方面提供了一种诊断试剂盒，包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗。

在另一优选例中，所述试剂盒含有本发明第二十方面所述的检测板。

本发明第二十二方面提供了一种Siglec-15基因、mRNA、cDNA、或蛋白或其检测试剂的用途，(i)用作检测血液肿瘤的标志物；和/或(ii)用于制备检测血液肿瘤的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述检测试剂还包括HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371、CD33的检测试剂。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述诊断试剂包括HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371、CD33的诊断试剂。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的Siglec-15基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人，更佳地，来源于被诊断患有血液肿瘤的患者。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于血液肿瘤患者。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因的登录号为284266。

在另一优选例中，所述Siglec-15mRNA的登录号为NM_213602.3。

在另一优选例中，所述Siglec-15蛋白的登录号为NP_998767.1。

在另一优选例中，所述检测是细胞或组织样本检测。

在另一优选例中，所述的检测包括免疫组化、免疫印迹和荧光定量PCR方法检测。

在另一优选例中，所述的检测是测定血液肿瘤组织、或一般组织样品。

在另一优选例中，所述的一般组织包括癌旁组织。

在另一优选例中，所述检测试剂包括Siglec-15的特异性抗体、Siglec-15的特异性结合分子、特异性扩增引物、探针或芯片。

在另一优选例中，所述的Siglec-15蛋白或其特异性抗体或特异性结合分子偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述Siglec-15的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明第二十三方面提供了一种用于检测血液肿瘤的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测Siglec-15基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测血液肿瘤。

在另一优选例中，所述容器中还含有选自下组的一种或多种检测试剂：HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371、CD33基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂。

在另一优选例中，所述的检测Siglec-15基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂包括：

(a).抗Siglec-15蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增Siglec-15的mRNA或cDNA的特异性引物。

在另一优选例中，所述检测是细胞或组织样本检测。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

(i)当检测对象的血液肿瘤的细胞或组织中Siglec-15表达量E1与一般细胞或组织的Siglec-15表达量E2之比≥2，则提示该检测对象患有血液肿瘤的几率高于一般人群；

其中，所述的E2是一般人群的一般细胞或组织的Siglec-15的表达量；

(ii)当检测对象的血液肿瘤的细胞或组织(如骨髓样本)中Siglec-15表达与包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的共表达量大于30％，则提示该检测对象患有血液肿瘤的几率高于一般人群。

在另一优选例中，所述的一般细胞或组织包括癌旁的细胞或组织。

本发明第二十四方面提供了一种检测血液肿瘤的方法，所述方法包括：

a)提供来自受试者的测试样品；

b)检测测试样品中Siglec-15蛋白的表达量E1；和/或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的表达量E2；和

c)将步骤b)中所测定的Siglec-15蛋白的表达量；和/或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的表达量与对照进行比较，

其中与所述对照相比，所述样品中Siglec-15蛋白的表达量高于参比值，表明受试者患血液肿瘤的风险高于一般人群(对照组人群)；和/或

与所述对照相比，所述样品中Siglec-15蛋白的表达量低于参比值，表明受试者患血液肿瘤的风险低于一般人群(对照组人群)；和/或

与所述对照相比，所述样品中Siglec-15表达与包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的共表达量大于30％，则表明受试者患有血液肿瘤的风险高于一般人群(对照组人群)。

在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述测试样品为血液肿瘤的细胞或组织。

在另一优选例中，所述参比值为截断值(cut-off值)。

在另一优选例中，所述参比值为样品中Siglec-15的相对表达水平。

在另一优选例中，所述参比值为2。

在另一优选例中，所述检测步骤(b)包括检测Siglec-15mRNA的量、或Siglec-15cDNA的量；和/或检测Siglec-15蛋白的量；和/或检测包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的mRNA的量、或其cDNA的量；和/或检测其蛋白的量。

在另一优选例中，通过荧光定量PCR或免疫组织化学检测样品中的Siglec-15蛋白；和/或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的蛋白的表达水平。

在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的。

本发明第二十五方面提供了一种确定治疗方案的方法，包括：

a)提供来自受试者的测试样品；

b)检测测试样品中Siglec-15蛋白的表达水平；和/或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的蛋白的表达水平；和

c)基于所述样品中的Siglec-15蛋白的表达水平；和/或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的蛋白的表达水平来确定治疗方案。

在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，当所述样品中Siglec-15蛋白的表达水平高于参比值，表明受试者患有血液肿瘤的风险的几率高于一般人群(对照组人群)，所述治疗方案包括Siglec-15抑制剂疗法。

在另一优选例中，当所述样品中Siglec-15表达与包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的共表达量大于30％，则表明受试者患有血液肿瘤的风险的几率高于一般人群(对照组人群)，所述治疗方案包括Siglec-15抑制剂疗法。

在另一优选例中，所述Siglec-15抑制剂疗法选自下组：

Siglec-15抑制剂疗法：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合；

在另一优选例中，当受试者患有血液肿瘤的风险几率高于一般人群(对照组人群)时，所述治疗方案还包括Siglec-15抑制剂疗法、Siglec-15抑制剂与其他治疗血液肿瘤药物的联用。

在另一优选例中，所述其他治疗血液肿瘤的药物选自下组：化疗药、单克隆抗体药物、免疫细胞药物、或其组合。

在另一优选例中，所述化疗药选自下组：甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羟基脲、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、吉西他滨、去氧助间霉素、2-氯脱氧腺苷、紫杉醇、长春碱、长春新碱、高三尖杉酯碱、喜树碱及其衍生物、柔红霉素、多柔比星、米托蒽醌、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶、环磷酰胺、氮芥、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、氟尿嘧啶、或其组合。

在另一优选例中，所述单克隆抗体药物包括利妥昔单抗(罗美华)。

本发明第二十六方面提供了一种Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(d)诊断和/或预防和/或治疗血液肿瘤。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因或其蛋白抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制Siglec-15基因或其蛋白表达的抑制剂。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括治疗有效量的Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

在另一优选例中，所述的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。

本发明第二十七方面提供了一种药物组合物，包括：

(a1)Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括：

(c)其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(c)的含量为1％-99％，较佳地，10％-90％，更佳地，30％-70％。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述组分(a1)和任选的组分(c)占所述药物组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、和口服剂型。

在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。

本发明第二十八方面提供了一种药盒，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂，或含有Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的药物。

在另一优选例中，所述药盒还包括：

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物，或含有其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物的药物。

在另一优选例中，所述药盒还含有(c1)第三容器，以及位于所述第三容器的Siglec-15的检测试剂。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器、第三容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物的单方制剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：

(a)将Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂用于(i)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗血液肿瘤；

(b)将Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂与其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物联用来(i)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗血液肿瘤；

(c)检测血液肿瘤患者的Siglec-15基因或其蛋白的表达水平，同时施用Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂来(i)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗血液肿瘤的方法；

(d)检测血液肿瘤患者的Siglec-15基因或其蛋白的表达水平，同时联用Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂；和其他预防和/或治疗血液肿瘤药物来(i)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗血液肿瘤的方法。

本发明第二十九方面提供了一种本发明第二十七方面所述的药物组合物或本发明第二十八方面所述的药盒的用途，用于(i)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(ii)预防和/或治疗血液肿瘤。

在另一优选例中，所述药物组合物中，Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的作用浓度为100-2000ng/ml，较佳地，500-1500ng/ml，更佳地，800-1000ng/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物的作用浓度为500-4000ng/ml，较佳地，1500-3500ng/ml，更佳地2000-3000ng/ml。

在另一优选例中，所述药物组合物或药盒包括(a)Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物；和(d)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物或药盒中，所述Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂；和(b)任选的其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物占所述药物组合物或药盒总重的0.01-99.99wt％,较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

本发明第三十方面提供了一种预防和/或治疗血液肿瘤的方法，包括：

给需要的对象施用Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂；或本发明第二十七方面所述的药物组合物或本发明第二十八方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述对象包括患有血液肿瘤的人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的施用剂量为0.5-5mg/kg体重，较佳地为1-4mg/kg体重，最佳地为2-3mg/kg体重。

在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物的施用剂量为5-70mg/kg体重，较佳地为10-50mg/kg体重，最佳地为20-40mg/kg体重。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的施用频率为1-4次/周，较佳地为2-3次/周。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。

在另一优选例中，所述其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物的施用时间为20-90天，较佳地为20-60天，最佳地为30-40天。

在另一优选例中，所述Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂与任选的其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物同时或先后施用。

本发明第三十一方面提供了一种体外非治疗性的抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖的方法，包括步骤：在Siglec-15基因或其蛋白抑制剂的存在下，培养血液肿瘤细胞，从而抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖。

在另一优选例中，所述血液肿瘤细胞高表达Siglec-15蛋白。

在另一优选例中，所述方法还包括向血液肿瘤细胞的培养体系中添加其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物，从而抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖。

在另一优选例中，所述血液肿瘤细胞为体外培养的细胞。

本发明第三十二方面提供了一种筛选预防和/或治疗血液肿瘤的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中Siglec-15的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中Siglec-15的表达量(E0)和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的Siglec-15的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对Siglec-15的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗血液肿瘤的候选化合物。

在另一优选例中，所述的Siglec-15的表达量是通过荧光定量PCR或免疫组织化学检测而得出的。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对血液肿瘤细胞生长或增殖的抑制作用；和/或进一步测试其对Siglec-15基因是否有下调的作用。

在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤：测试组中，血液肿瘤细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察血液肿瘤细胞的数量和/或生长情况；在对照组中，在血液肿瘤细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察血液肿瘤细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中血液肿瘤细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对血液肿瘤细胞的生长或增殖有抑制作用的预防和/或治疗血液肿瘤的候选化合物。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。

在另一优选例中，所述哺乳动物为患有血液肿瘤的哺乳动物。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述细胞包括血液肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了3个Siglec-15(简称S15)抗体对人源及鼠源蛋白的结合能力；

用实验室构建的高表达人源S15的CHO细胞株及高表达鼠源S15的CHO细胞监测128、413、304共3个抗体对人源和鼠源S15的结合情况，克隆号为128的抗体仅结合人源的S15，413和304可结合人源及鼠源的S15。

图2显示了304和216抗体可特异结合高表达细胞株以及AML细胞株。128，413，304，216抗体分别对高表达细胞株和AML细胞株U937进行染色，304和216抗体可结合U937细胞。

图3显示了Siglec-15在不同肿瘤细胞中的差异性表达。Jurkat、Nalm6、K562细胞均无S15表达，而来源于恶性组织细胞性淋巴瘤的U937和急性白血病细胞系的THP1、Kasumi-1、HL60细胞中均表达Siglec-15。表明304抗体可特异结合AML细胞。

图4显示了304抗体可特异结合AML患者肿瘤细胞；选用304抗体对AML患者肿瘤细胞株进行染色，304抗体可结合AML患者肿瘤细胞。

图5显示了Siglec-15在正常骨髓干细胞中不表达。两例健康人骨髓样本均有干细胞(CD34+)，Siglec-15表达均低于10％。

图6显示了304-CAR-T的体外杀伤能力；体外杀伤试验，用304抗体序列构建304-CAR-T细胞，并用CAR-T细胞分别杀伤U937及实验室构建的Siglec-15高表达株Nalm6-S15细胞，均表现出特异杀伤的能力，并有较高的IFN-R的分泌。

图7显示了304-CAR-T体内的杀伤能力。用U937细胞株构建NCG小鼠模型，并分别用304-CAR-T及非相关靶点的TX103 CAR-T进行治疗，发现304-CAR-T可显著抑制肿瘤的生长。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种特异性靶向siglec-15的scFv、抗体及其特异性CAR-T细胞。具体地，本发明意外地获得具有极其优异的亲和力和特异性的抗siglec-15单克隆抗体，并且基于该抗体获得了人源化抗体。本发明抗体能够高特异性地结合siglec-15抗原，其具有很高的亲和力。并且本发明的scFv与siglec-15的亲和力高，特异性好，能特异性靶向siglec-15，尤其是siglec-15全长抗原及胞外区域。此外，本发明还提供了一种靶向siglec-15的嵌合抗原受体免疫细胞，可有效治疗癌症或肿瘤。

此外，本发明还意外发现，在血液肿瘤细胞或组织中的siglec-15基因或其蛋白的表达显著高于正常组织中的siglec-15的基因或其蛋白的表达，并且，申请人还发现，因此，siglec-15基因或其蛋白可用作检测血液肿瘤的标志物，并且siglec-15基因或其蛋白可与HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371、CD33基因或其蛋白组合用于检测血液肿瘤。并且，申请人还意外的发现，siglec-15基因或其蛋白的抑制剂可有效(a)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(b)预防和/或治疗血液肿瘤，并且，siglec-15基因或其蛋白的抑制剂可与任选的其他预防和/或治疗血液肿瘤的药物联用，并且对血液肿瘤的治疗有显著的效果。在此基础上，完成了本发明。

本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的工程化的免疫细胞进行详细说明。本发明的工程化的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的工程化的免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)；当免疫细胞为T细胞时，TCR等同于CAR(或CAR可替换为TCR)。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。

如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。

如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗人Siglec-15抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。

如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗人Siglec-15抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

scFv

如本文所用，scFv为单链抗体可变区片段，可特异性识别抗原。此外，在本发明中也可以是抗原结合结构域。

在本发明中，本发明的scFv包括本发明第一方面所述的重链可变区和本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述scFv还包含重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。

在另一优选例中，所述scFv如下式A或式B所示：

V_H-V_L,(A)；或

V_L-V_H,(B)

式中，V_H为所述抗体重链可变区；V_L为所述抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。

在另一优选例中，所述的V_H和V_L之间的连接肽为1-4个连续的GGGGS所示的序列，较佳地2-4个，更佳地3-4个。

在另一优选例中，所述scFv靶向或结合于人siglec-15。

抗体

如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其较链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2、IgG3，IgG4。轻链根据恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到竣基端依次排列的顺序序为:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。

本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的抗人siglec-15的单克隆抗体。制备时用siglec-15抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源siglec-15抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。人源化抗体可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。

术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，siglec-15)的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、CL和CH1结构域组成的单价片段；

(ii)F(ab')₂片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；

(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；

(iv)由抗体的单臂的V_H和V_L结构域组成的Fv片段。

Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，siglec-15分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于1O^-8M、1O^-9M或lO^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别人siglec-15的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述抗原结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的人siglec-15的氨基酸序列的抗体。

术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约1O^-8M、1O^-9M或lO^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合siglec-15，由使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。

如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

人siglec-15特异性抗体

本发明提供抗人siglec-15抗体(以下简称siglec-15抗体)。具体地，本发明提供一种针对siglec-15的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(V_H)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(V_L)氨基酸序列。本发明siglec-15抗体通过剌激抗原特异性T细胞应答，增强T细胞的抗肿瘤作用，从而最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。

优选地，重链可变区(V_H)氨基酸序列和轻链可变区(V_L)氨基酸序列的各自CDR选自下组：

(1)SEQ ID NO:1

(2)SEQ ID NO:2

(3)SEQ ID NO:3

(4)SEQ ID NO:4

(5)SEQ ID NO:5

(6)SEQ ID NO:6

(7)SEQ ID NO:7

(8)SEQ ID NO:9

(9)SEQ ID NO:10

(10)SEQ ID NO:11

(11)SEQ ID NO:12

(12)SEQ ID NO:13

(13)SEQ ID NO:14

(14)SEQ ID NO:15

(15)SEQ ID NO:16

(16)SEQ ID NO:17

(17)SEQ ID NO:18

(18)SEQ ID NO:19

(19)SEQ ID NO:20

(20)SEQ ID NO:21

(21)SEQ ID NO:22

(22)SEQ ID NO:23

(23)SEQ ID NO:24；

上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有siglec-15结合亲和力的序列。

在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。

本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。

本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')₂、或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。

其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。

本发明抗体可以是靶向人siglec-15的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。

在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO:1-12中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有siglec-15结合亲和力的序列，位于重链可变区(V_H)的CDR区。

在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO:13-24中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有siglec-15结合亲和力的序列，位于轻链可变区(V_L)的CDR区。

在本发明的一种更优选实施例中，V_H CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ IDNO:1-12中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有siglec-15结合亲和力的序列；V_L CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ ID NO:13-24中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有siglec-15结合亲和力的序列。

本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

抗体的制备

任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的siglec-15抗体。例如，可以用连接或天然存在的siglec-15蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。

任何合适形式的siglec-15都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对siglec-15特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。

生产本发明的siglec-15抗体的示例性方法描述于实施例1、2。

人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1或IgG4亚型。

同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。

人源化本发明siglec-15抗体的示例性方法描述于实施例6。

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将不同轻链和重链的编码序列，以不同的组合形式融合在一起，形成单链抗体。并通过对不同组合或不同链接修饰的单链抗体的功能进行检测分析，获得优化的单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输己与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物或动物细胞(如哺乳动物细胞)。

本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。

siglec-15

唾液酸结合Ig样凝集素家族，即Siglecs家族，是经典的免疫球蛋白样凝集素蛋白家族。在生理条件下，只有15种Siglec分子在介导免疫抑制的髓细胞和免疫细胞表面表达，具有免疫抑制特性。当Siglecs识别所有哺乳动物细胞表达的含唾液酸的聚糖时，可以帮助免疫细胞区分自我和非自我。而唾液酸化病原体也可以通过Siglec依赖的相互作用破坏和促进免疫应答，或者下调免疫细胞反应并逃避免疫监视。Siglecs在免疫细胞激活和抑制受体的调节中具有重要作用，它可以影响宿主-病原体的相互作用、神经变性、自身免疫性疾病调节破骨细胞分化和癌症。由于其在免疫细胞上的表达受限、内吞特性和调节受体信号的能力，已成为细胞定向治疗的重要靶点。

Siglec-15(简称S15)作为细胞表面跨膜受体，由免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。免疫球蛋白样结构域由2个胞外Ig域组成，包括一个包含唾液酸结合位点的N端V-set域和2型恒定区(IgC2)区组成。其通过其跨膜结构域中的带正电荷的氨基酸与酪氨酸的激活基序(ITAM)适配器分子DAP12缔合，并通过募集SYK激酶激活受体。

Siglec-15不同于其他家族成员。它显示出与B7-H1以及许多其他B7家族成员相似的结构域成分和高度同源性。更重要的是，Siglec-15和B7-H1在人肺癌组织中的表达是互斥的，故Siglec-15除了可能与B7家族成员一样，除了具有免疫调节功能之外，可能还具有一种独特的调节机制：Siglec-15除了与TCR以及CD44结合之外，未发现Siglec-15与其他受体结合，并且不与B7-H1、PD-1、B7-1或任何其他已知的B7家族配体或受体相互作用。

Siglec-15在多种人类肿瘤组织中表达于肿瘤细胞、肿瘤相关的基质细胞，以及肿瘤浸润的巨噬或单核细胞等髓系细胞上，Siglec-15基因敲出并不会导致小鼠明显的自身免疫疾病或其他症状，巨噬或单核细胞等髓系来源的Siglec-15可以通过调节细胞生长来抑制抗原特异性T细胞的免疫应答。在多种小鼠肿瘤模型中，抗Siglec-15单克隆抗体α-S15，可以阻断巨噬或单核细胞等髓系细胞来源的Siglec-15的免疫抑制作用来提高体内抗肿瘤免疫反应。

在本发明中，对肿瘤细胞，如急性髓系白血病(AML)肿瘤细胞的样本进行检测，发现siglec-15在部分肿瘤细胞中高表达，本发明所制备的靶向siglec-15的嵌合抗原受体，可有效的在体外和体内杀伤肿瘤细胞，对AML肿瘤细胞，显示了很好的抗肿瘤作用。

外源T细胞抗原受体

如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。

外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD19和/或BCMA的抗体，较佳地为单链抗体。

在本发明中，本发明的scFv还包括其保守性变异体，指与本发明scFv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括CD28和/或4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

在本发明的一优选实施方式中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:43-46中任一所示。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-T细胞。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于治疗CD19和BCMA高表达的肿瘤。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明第六方面所述的核酸分子、本发明第七方面所述的载体、或本发明第八方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10¹⁰个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁹个细胞/ml。在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物Siglec-15，协同激活T细胞，引起免疫细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗Siglec-15的CAR-T细胞引起抗表达Siglec-15的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗Siglec-15scFv、铰链和跨膜区、和CD28和/或4-1BB；和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或其他基因工程改造或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或体腔(如腹腔)注射施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或肿瘤转移位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

血液肿瘤

血液系统肿瘤主要指造血和淋巴组织类的肿瘤，按照细胞系来源可将血液肿瘤分为四种类型：髓系肿瘤、淋巴系肿瘤、组织细胞肿瘤和肥大细胞肿瘤。其中，髓系肿瘤包括急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合症(MDS)、慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)、骨髓增生异常/慢性骨髓增殖性疾病(MD/CMPD)等；淋巴系肿瘤包括：急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤/burkitt淋巴细胞白血病、幼(前)淋巴细胞白血病(Pre-ALL)、慢性淋巴白血病/小细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、毛细胞白血病(HCL)、浆细胞骨髓瘤(多发性骨髓瘤/浆细胞瘤MM)、大颗粒淋巴白血病(GLL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、淋巴瘤细胞白血病等。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

参比值

如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较siglec15的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

在本发明中，所述参比值指截断值(cut-off值)，指血液肿瘤细胞或组织中的siglec15的相对表达水平，优选相对表达水平为2(荧光定量PCR)。

非血液肿瘤的样品

如本文所用，术语“非血液肿瘤样品”包括但不限于未患有血液肿瘤的人群，血液肿瘤患者的非血液肿瘤组织。

siglec15蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“siglec15蛋白”、“siglec15多肽”可互换使用，都指具有siglec15氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的siglec15蛋白。此外，该术语还包括全长的siglec15及其片段。本发明所指的siglec15蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

Siglec-15作为细胞表面跨膜受体，由免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。免疫球蛋白样结构域由2个胞外Ig域组成，包括一个包含唾液酸结合位点的N端V-set域和2型恒定区(IgC2)区组成。其通过其跨膜结构域中的带正电荷的氨基酸与酪氨酸的激活基序(ITAM)适配器分子DAP12缔合，并通过募集SYK激酶激活受体。

Siglec-15在多种人类肿瘤组织中表达于肿瘤相关的基质细胞或肿瘤细胞，以及肿瘤浸润的巨噬/髓系细胞上，Siglec-15基因敲出并不会导致小鼠自身免疫疾病或其他症状，巨噬细胞/髓系来源的Siglec-15可以通过调节细胞生长来抑制抗原特异性T细胞的免疫应答。在多种小鼠肿瘤模型中，抗Siglec-15单克隆抗体α-S15，可以阻断巨噬/髓系细胞来源的Siglec-15的免疫抑制作用来提高体内抗肿瘤免疫反应。

人的Siglec-15蛋白全长为328个氨基酸(登录号为NP_998767.1)。小鼠的Siglec-15蛋白的登录号为NP_001094508.1)。

在本发明中，术语“Siglec-15基因”、“Siglec-15多核苷酸”可互换使用，都指具有Siglec-15核苷酸序列的核酸序列。

人Siglec-15基因的基因组全长18420bp(NCBI GenBank登录号即Gene ID:NC_000018.10)，其转录产物mRNA序列全长2948bp(CDS 987bp)(NCBI GenBank登录号为NM_213602.3)。

小鼠Siglec-15基因的基因组全长14949bp(NCBI GenBank登录号即Gene ID:NC_000084.7)，其转录产物mRNA序列全长2323bp(CDS 1026bp)(NCBI GenBank登录号为NM_001101038.2)。

人和鼠Siglec-15，蛋白序列相似性为82％。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了Siglec-15的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的Siglec-15核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的Siglec-15多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人Siglec-15多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Siglec-15多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Siglec-15编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗Siglec-15的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人Siglec-15多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Siglec-15基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Siglec-15基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人Siglec-15蛋白的分子，也包括那些并不影响人Siglec-15蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人Siglec-15基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Siglec-15基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Siglec-15蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人Siglec-15蛋白功能的抗体以及不影响人Siglec-15蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人Siglec-15基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Siglec-15基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人Siglec-15蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或细胞样本)中的人Siglec-15蛋白。

检测方法

利用Siglec-15存在于血液肿瘤的细胞或组织中，本发明还提供了检测血液肿瘤的方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测Siglec-15的高通量二代测序法以及Sanger测序、荧光定量PCR(qPCR)、原位免疫荧光法(FISH)和免疫组化等。

检测试剂盒

基于Siglec-15与血液肿瘤的相关性，即Siglec-15存在于血液肿瘤的细胞或组织中，因此Siglec-15可以作为血液肿瘤的一种诊断标志物。

本发明还提供了一种检测血液肿瘤的试剂盒，它含有检测Siglec-15基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测血液肿瘤，优选的，所述容器中还含有选自下组的一种或多种检测试剂：HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371、CD33基因、mRNA、cDNA、或蛋白的检测试剂。

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：

检测方法和试剂盒

本发明涉及定量和定位检测人Siglec-15；和/或HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人Siglec-15；和/或HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个的蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)血液肿瘤。

一种检测样品中是否存在Siglec-15蛋白的方法是利用Siglec-15蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与Siglec-15蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Siglec-15蛋白。

Siglec-15s蛋白或其多核苷酸可用于Siglec-15蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗Siglec-15的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的Siglec-15蛋白。在一优选实施方式中，Siglec-15蛋白或其多核苷酸可与包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个蛋白或其多核苷酸组合用于Siglec-15蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗Siglec-15或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个蛋白的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的Siglec-15蛋白或包含但不限于HLA-DR、CD38、CD117、MPO、TIM3、CD70、CD371中的一个或多个蛋白。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的抗体具有高亲和力，高特异性的特点。

(2)本发明的人源化抗体或scFv仍具有针对Siglec-15高亲和力和高特异性。

(3)本发明的scFv与Siglec-15的亲和力高，特异性好，能特异性靶向Siglec-15，尤其是Siglec-15全长抗原及胞外区域。

(4)本发明所制备的靶向siglec-15的嵌合抗原受体，可有效的在体外和体内杀伤肿瘤细胞，如AML肿瘤细胞，显示了很好的抗肿瘤作用。

(5)本发明首次发现体外构建的Siglec-15(简称S15)抗原和AML细胞上表达的S15抗原在结构上存在差异：用构建的S15抗原免疫产生的抗体，部分可结合构建的高表达株，部分可结合AML细胞株，部分可双结合。这种现象在以往的抗体生产中鲜有发生。

(6)本发明首次发现，在血液肿瘤的细胞或组织中的Siglec-15的基因或其蛋白的表达显著高于正常组织中的Siglec-15的基因或其蛋白的表达，因此，Siglec-15基因或其蛋白可用作检测血液肿瘤。

(7)本发明首次发现，Siglec-15基因或其蛋白的抑制剂可有效(a)抑制血液肿瘤细胞的生长或增殖；和/或(b)预防和/或治疗血液肿瘤。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

重链可变区的CDR、轻链可变区的CDR、重链可变区、轻链可变区、CAR结构中元件序列如表1-表5中所示。

表1.重链可变区中互补决定区CDR序列

实施例1小鼠免疫

选取8-10周龄雌性Balb/c小鼠，用100ul含50ug人源siglec15和鼠源Fc(hSiglec15-mFc)的融合蛋白和完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma-Aldrich)混合物在小鼠多个部位经皮下免疫(s.c.)。2周后，用50-100ug的该融合蛋白和弗氏不完全佐剂(IFA)(Sigma-Aldrich)对小鼠再进行免疫，以后每两周重复，共免疫3次。每次免疫后2周取小鼠血清进行血清滴度测试。当效价足以融合时，用含60ug融合蛋白的PBS通过腹膜内注射(i.p.)来增强小鼠免疫。

实施例2抗体筛选

融合免疫后的小鼠脾脏细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(来源ATCC)，以获得杂交瘤细胞：用二氧化碳处死上述免疫增强后的小鼠，无菌收获小鼠脾脏。用ACK缓冲液(来源LONZA)，将整个脾脏解离成单细胞悬液并溶解红细胞。将SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞和脾细胞在50ml锥形离心管中按1∶1的比例混合。离心后，弃上清液，加入50％聚乙二醇(PEG，Roche)进行细胞融合。将融合后的细胞在HAT选择培养基中培养8-10天，通过酶联免疫吸附试验筛选出能产生结合表达hSiglec15细胞的抗体的杂交瘤细胞，并用流式细胞仪分析验证。筛选出4个阳性克隆，编号分别为128、413、216和304，它们能与表达于CHO细胞上的hSiglec15蛋白结合。而后，使用有限稀释技术进行阳性杂交瘤亚克隆，以获得纯的单克隆株。

实施例3抗siglec15抗体对人源及鼠源S15蛋白结合特异性

用PCR的方法获取人源和鼠源的Siglec15的DNA片段用于构建Siglec15(S15)高表达的质粒。将构建的质粒用于慢病毒载体的包装，收获慢病毒载体，超离浓缩。将获取的慢病毒载体用来转导CHO细胞，得到稳定表达人源Siglec15(CHO/hS15)和表达鼠源siglec15(CHO/mS15)的CHO工程细胞。分别用200ng上述的128，413，304抗体对以上两种细胞进行流式染色，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，加入1ul APC anti-mouseIgG(Biolegend公司),4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，用流式细胞仪进行检测，检测以上3个抗体对人源和鼠源siglec15蛋白的结合能力。

结果如图1所示。结果表明，128抗体仅结合人源siglec15；413和304抗体可以同时结合人源和鼠源的siglec15蛋白。

实施例4抗siglec15抗体与急性髓系白血病(AML)肿瘤细胞的结合能力验证

用PCR的方法获取人源Siglec15的DNA片段用于构建S15高表达的质粒。将构建的质粒用于慢病毒载体的包装，收获慢病毒载体，超离浓缩。将获取的慢病毒载体用来转导Nalm6细胞，得到稳定表达人源Siglec15的Nalm6细胞(Nalm6-S15)。用128，304，413，216抗体对Nalm6-S15细胞株以及急性髓系白血病(AML)肿瘤细胞株U937进行染色，4℃避光孵育30min，加入PBS洗涤2次；加入1ul PE anti-mouseIgG(Biolegend公司)，4℃避光孵育30min；PBS洗涤2次，通过流式细胞仪分析鉴别以上抗体对AML细胞株的结合能力。

结果如图2所示，128、413抗体仅可结合Nalm6-S15细胞株；304、216抗体可以同时结合Nalm6-S15细胞株和U937 AML肿瘤细胞株。说明216、304抗体可特异性识别并结合肿瘤细胞上的Siglec15蛋白抗原,其中304显示相对更强的结合能力，因此选用304用于后期实验。

实施例5siglec15在不同肿瘤细胞中的表达的情况

用304抗体对血液肿瘤-非AML细胞系Jurkat、Nalm6、K562；AML细胞系：Kasumi-1、THP1、U937、HL60分别进行流式染色。染色方法如下：取1-5×10⁵个培养的肿瘤细胞，加入2ml PBS洗涤2次，加入304抗体200ng 4℃条件下避光孵育30min；加入2ml PBS洗涤2次；加入1ul anti-mouse IgG(PE标记，Biolegend),于4℃避光孵育30min；PBS洗涤2次，通过流式细胞仪进行检测分析，验证304抗体对不同肿瘤细胞的结合能力。

结果如图3所示，304抗体不结合Jurkat、Nalm6和K562细胞，提示这3株非AML细胞无Siglec15的表达；而304抗体可结合AML细胞Kasumi-1、THP1、U937、HL60，表明AML肿瘤细胞株上有较广泛的Siglec15蛋白表达，304抗体对该蛋白具有有效的结合能力。

实施例6AML患者肿瘤细胞表达siglec15情况

用304抗体对AML患者肿瘤细胞进行流式染色：将临床获取的AML骨髓样本，500g离心5min，弃掉上清，加入3-5倍体积的ACK lysing buffer(Lonza)进行红细胞裂解，室温静置3-5min；加入含2％FBS的PBS进行洗涤，500g离心5min，洗涤2次；加入200ng的304抗体，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次；加入1ul anti-mouseIgG(APC标记，Biolegend公司),4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次；加入CD45(V500标记，Biolegend公司)、CD371抗体(PE标记，Biolegend公司)，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，应用流式细胞仪进行检测分析，验证304抗体对临床AML患者骨髓样本肿瘤细胞的结合能力。

图4所示为3例急性髓系白血病(AML)患者肿瘤细胞的流式检测结果，结果显示304抗体可结合AML患者样本中的大部分肿瘤细胞，表明AML肿瘤细胞有很高的Siglec15抗原表达，且304抗体可特异性结合AML肿瘤细胞上的Siglec15。

实施例7siglec15在正常人骨髓样本中的表达情况

随机获取2例临床剩余废弃的健康人骨髓样本，每个样本1ml。样本处理如下：500g离心5min，弃掉上清，加入3-5倍体积的ACK lysing buffer(Lonza)进行红细胞裂解，室温静置3-5min；加入含2％FBS的PBS进行洗涤，洗涤2次；加入200ng的304抗体，4℃避光孵育30min；PBS洗涤2次，加入1ul anti-mouseIgG(APC标记，Biolegend公司),4℃避光孵育30min；PBS洗涤2次，加入1ul CD34抗体(Percp-cy5.5标记，Biolegend公司)，4℃避光孵育30min；PBS洗涤2次，应用流式细胞仪进行检测分析。验证骨髓样本中干细胞有无siglec15的表达。

如图5所示为2例健康人骨髓样本的检测结果：2例样本均有CD34+的干细胞，对该细胞群进行Siglec15表达的分析，结果显示干细胞群中Siglec15阳性细胞不超过10％，表明健康人骨髓干细胞仅少量表达Siglec15蛋白，提示siglec15做为靶点的安全性。

实施例8体外杀伤和细胞因子分泌

采用重叠PCR技术将304抗体的单链抗体片段(scFv)、人CD8α铰链区和跨膜区、人41BB胞内区或CD28胞内区基因、人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，形成完整的S15-CAR基因载体，同样的方法构建对照CAR-T细胞基因载体(control CAR-T，TX103 CAR-T)。采用第三代的4质粒包装系统进行CAR慢病毒载体制备，将制备的慢病毒进行超离浓缩。

将健康人的PBMC用CD3/CD28激活剂进行活化，活化18-24h后加入慢病毒载体进行转导，转导后的细胞继续培养至第9天，分别收获Control CAR-T和S15 CAR-T细胞。将两种CAR-T细胞分别与过表达S15的细胞Nalm6-S15和天然表达S15的AML细胞株U937共孵育进行体外杀伤实验和细胞因子分泌实验：将肿瘤细胞用无钙镁的PBS洗涤2次；2×10⁶/ml密度重悬；加入5mM CFSE(Invitrogen)至终浓度为5uM，37℃孵育7min；加入含10％FBS的基础培养液终止孵育；离心后用完全培养液将肿瘤细胞浓度调整至5×10⁵/ml；CAR-T细胞计数后调整细胞数至5×10⁶CAR⁺cell/ml；96孔板中按照CAR-T细胞：肿瘤细胞(E:T)比分别为10比1、5比1、2.5比1、1.25比1、0.625比1加入各细胞，每个梯度3个复孔，每孔终体积为200ul；37℃避光共孵育12h后，每孔吸取15-20ul用于细胞因子检测(BD，CBA Kit)。将孵育后的细胞收集至流式管，每管监测前加入10ul的5ug/ml的DAPI进行死细胞标记，通过流式细胞仪进行检测分析。

结果如图6所示：304S15-CAR-T对S15阴性的Nalm6细胞株没有杀伤能力，IFN-r分泌水平较低；304S15-CAR-T对过表达S15的Nalm6-S15细胞显示出较高的体外细胞杀伤水平和IFN-r的分泌；和control CAR-T相比，304S15-CAR-T表现出对U937细胞株更强的杀伤水平以及更高的IFN-r的分泌。说明在体外实验中304S15-CAR-T具有靶向S15的特异性的杀伤能力，且对天然表达S15的AML细胞株具有杀伤作用。

实施例9S15 CAR-T体内药效试验

用上述S15 CAR-T细胞在小鼠肿瘤模型上进行动物实验:购买6-8周的NCG免疫缺陷鼠(江苏集萃生物科济有限公司)，小鼠检疫1周后尾静脉注射5×10⁴Nalm6-S15-Luc(萤火虫荧光素酶)肿瘤细胞；肿瘤接种后第4天，将小鼠称重，按照10ul/10g剂量腹腔注射D-Luciferase底物，10min后，用异氟烷麻醉小鼠，放入小动物活体成像仪监测肿瘤大小。将小鼠按成像结果Total Flux值排序后平均分为3组，每组5只，当天分别用PBS、1×10⁷CAR-TS15 CAR-T或Control CAR-T进行尾静脉注射治疗，治疗体积为200ul/只，治疗当天标记为D0。在肿瘤治疗后的第6天和第9天按照上述方法持续进行小动物活体成像监测肿瘤大小。

结果如图7所示：Control CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤生长迅速，第6天时肿瘤细胞已经扩散至全身，第9天时和PBS组已无明显差异。S15 CAR-T组，在肿瘤注射后第6天和第9天，和Control CAR-T组相比肿瘤细胞生长得到显著抑制。表明S15 CAR-T细胞能显著抑制小鼠体内S15阳性肿瘤细胞的生长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 福州拓新天成生物科技有限公司

<120> 靶向siglec-15的嵌合抗原受体及其应用

<130> P2020-0703

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

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130 135 140

Ala Ser Leu Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ile Ser Ser

145 150 155 160

Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys

165 170 175

Leu Trp Ile His Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser

210 215 220

Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 37

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 38

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 39

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 39

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 40

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 40

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 41

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 41

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 42

<211> 544

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 42

ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300

gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360

cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420

cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480

tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540

ctac 544

<210> 43

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 43

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Ala Tyr Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys

50 55 60

Ser Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly Phe Ala Phe

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Lys Val Thr Met Ser

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Ala

195 200 205

Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr

210 215 220

Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

245 250 255

Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg

275 280 285

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

290 295 300

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

305 310 315 320

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

325 330 335

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

340 345 350

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

355 360 365

Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

370 375 380

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

385 390 395 400

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

405 410 415

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

420 425 430

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

435 440 445

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

450 455 460

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

465 470 475 480

Pro Pro Arg

<210> 44

<211> 494

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 44

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Asn Tyr Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Ile Lys

65 70 75 80

Tyr Asn Glu Lys Phe Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Gly Tyr Asp Asn Asp Pro Leu Asp

115 120 125

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met

165 170 175

Arg Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser Val Asn Gln Asn Asn

180 185 190

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser Trp Val Pro Asp Arg Phe Thr

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val His

225 230 235 240

Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Asn His Gly Ser Phe

245 250 255

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

260 265 270

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

275 280 285

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

305 310 315 320

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

325 330 335

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

340 345 350

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

355 360 365

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

370 375 380

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

385 390 395 400

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

405 410 415

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

420 425 430

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

435 440 445

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

450 455 460

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

465 470 475 480

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 45

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 45

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

35 40 45

Ser Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys

50 55 60

Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

145 150 155 160

Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala

165 170 175

Thr Gln Asp Ile Val Lys Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

180 185 190

Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly

195 200 205

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu

225 230 235 240

Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

260 265 270

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala

275 280 285

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

290 295 300

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

305 310 315 320

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

325 330 335

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

340 345 350

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

355 360 365

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg

<210> 46

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 46

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

20 25 30

Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Phe Gly Tyr

35 40 45

Thr Phe Thr Asn His His Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

85 90 95

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Val Phe Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Ala Asn Tyr Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys

165 170 175

Arg Ala Ile Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser

180 185 190

Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile His Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro

195 200 205

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser

210 215 220

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

245 250 255

Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro

275 280 285

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

290 295 300

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

305 310 315 320

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

325 330 335

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

340 345 350

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

355 360 365

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

370 375 380

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

405 410 415

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

435 440 445

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

450 455 460

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

465 470 475 480

Pro Arg

Claims

1.一种抗体重链可变区，其特征在于，所述抗体重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:1、2、3或4所示的CDR1，

SEQ ID NO:5、6、7或8所示的CDR2，和

SEQ ID NO:9、10、11或12所示的CDR3。

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:13、14、15或16所示的CDR1'，

SEQ ID NO:17、18、19或20所示的CDR2'，和

SEQ ID NO:21、22、23或24所示的CDR3'。

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区。

6.一种scFv，其特征在于，所述scFv包含如权利要求1所述的抗体重链可变区和如权利要求3所述的抗体轻链可变区。

7.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、权利要求5所述的抗体或权利要求6所述的scFv；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

8.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述CAR包含如权利要求6所述的scFv。

9.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞包括：

用于表达外源的如权利要求8所述的嵌合抗原受体的表达盒。

10.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、权利要求5所述的抗体或权利要求6所述的scFv；以及