TW202144434A - 人源化cd19抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了人源化CD19抗體及其嵌合抗原受體、免疫細胞和應用。本發明的人源化CD19抗體是以FMC63嵌合抗體爲基礎，進行了人源化改造。本發明還提供了基於該人源化抗體建構的CAR-T細胞和雙CAR-T細胞及其相關應用。與利用FMC63所建構的CAR-T細胞相比，本發明建構的CAR-T細胞具有更高的毒殺效果和腫瘤清除能力。

Description

人源化CD19抗體及其應用
本發明涉及免疫治療領域，具體地涉及一種人源化CD19抗體及其應用。
抗體是身體在抗原刺激下産生的具有保護作用的蛋白質，由漿細胞分泌到血液等體液中。抗體可以與抗原特異性結合，起到中和毒素、阻止病原體入侵等作用。根據抗體與抗原特異結合的特性，可以開發針對疾病特異性生物標的的抗體藥物用於治療疾病。抗體藥已經應用到抗腫瘤領域和自身免疫的治療，同時在抗病毒和細菌感染、心腦血管、糖尿病以及罕見病治療等領域也發揮越來越重要的作用，是當前生物藥中複合增長率最高的一類藥物。
CD19是簇分化抗原的一種，是B細胞增殖、分化、活化及抗體産生有關的重要膜抗原。絕大多數的B細胞性惡性腫瘤表面都高度表現CD19，多個中心獨立展開的利用嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修飾的T細胞標靶表現CD19的B細胞復發、難治性惡性腫瘤取得了前所未有的成功。以CAR-T爲首的免疫療法給無數患者帶來了“治癒癌症”的希望。
然而，目前的免疫治療仍存在復發率高、安全性低等問題，本領域需要開發更加安全有效的免疫治療方法。
發明概要
本發明的目的在於提供一種人源化CD19抗體及其應用。
在發明的第一方面，提供了一種人源化CD19抗體，所述抗體包括SEQ ID NO: 1-7中任一所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 8-17中任一所示的抗體重鏈可變區。
在另一優選例中，所述抗體包括SEQ ID NO: 5或6所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 15、16或17中任一所示的抗體重鏈可變區。
在另一優選例中，所述抗體包括選自下組的抗體輕鏈可變區和抗體重鏈可變區：
抗體編號 重鏈可變區 的胺基酸序列 輕鏈可變區 的胺基酸序列
VH2+VL3 9 3
VH4+VL3 11 3
VH2+VL2 9 2
VH2+VL1 9 1
VH4+VL1 11 1
VH4+VL2 11 2
VH5+VL1 12 1
VH3+VL2 10 2
VH3+VL1 10 1
VH5+VL3 12 3
VH3+VL3 10 3
VH5+VL2 12 2
VH6+VL4 13 4
VH1+VL2 8 2
VH1+VL1 8 1
VH1+VL3 8 3
VH7+VL6 14 6
VH8+VL6 15 6
VH8+VL5 15 5
VH9+VL5 16 5
VH10+VL5 17 5
VH4+VL6 11 6
VH2+VL6 9 6
VH2+VL7 9 7
在另一優選例中，所述抗體包括SEQ ID NO: 5所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 16所示的抗體重鏈可變區；或者，
所述抗體包括SEQ ID NO: 5所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 17所示的抗體重鏈可變區；或者，
所述抗體包括SEQ ID NO: 6所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 15所示的抗體重鏈可變區。
在另一優選例中，所述的抗體爲雙鏈抗體、或單鏈抗體。
在另一優選例中，所述抗體爲抗體全長蛋白、或抗原結合片段。
在另一優選例中，所述抗體爲雙特異性抗體、或多特異性抗體。
在另一優選例中，所述抗體還包含位於重鏈可變區和輕鏈可變區之間的連結胜肽。
在另一優選例中，所述抗體如下式A或式B所示： VH -VL (A)； VL -VH (B) 式中，VH 爲所述抗體重鏈可變區；VL 爲所述抗體輕鏈可變區；“-”爲連結胜肽或肽鍵； 較佳地爲式B結構。
在另一優選例中，所述的連結胜肽爲1-4個連續的SEQ ID NO: 22 (GGGGS)所示的序列，較佳地1-4個，更佳地3-4個。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區中各區段的連接順序爲：人源化VL FR1-VL CDR1-人源化VL FR2-VL CDR2-人源化VL FR3-VL CDR3-人源化VL FR4；
在另一優選例中，所述重鏈可變區中各區段的連接順序爲：人源化VH FR1-VH CDR1-人源化VH FR2-VH CDR2-人源化VH FR3-VH CDR3-人源化VH FR4。
在本發明的第二方面，提供了一種標靶CD19的嵌合抗原受體(CAR)，所述CAR的抗原結合結構域爲本發明第一方面所述的人源化CD19抗體。
在另一優選例中，所述CAR的結構如下式I所示： L-scFv-H-TM-C-CD3ζ    (I) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； L爲無或訊息胜肽序列； scFv爲標靶CD19的抗原結合結構域； H爲無或樞紐區； TM爲跨膜結構域； C爲共刺激信號分子； CD3ζ爲源於CD3ζ的細胞溶質信號傳導序列。
在本發明的第三方面，提供了一種雙特異性CAR，所述雙特異性CAR標靶CD19和第一標的， 其中，所述雙特異性CAR中的標靶CD19的抗原結合結構域爲本發明第一方面所述的人源化CD19抗體； 並且，所述的第一標的選自下組： CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、Folate receptor α、Folate receptor β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2、或其組合。
在另一優選例中，所述的第一標的爲BCMA，並且所述雙特異性CAR中的標靶BCMA的抗原結合結構域(scFv)包括SEQ ID NO: 21所示的抗體重鏈可變區，和SEQ ID NO: 20所示的抗體輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述雙特異性CAR同時包含標靶第一標的的抗原結合結構域和標靶CD19的抗原結合結構域。
在另一優選例中，所述雙特異性CAR的結構如下式II所示： L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ    (II) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； L爲無或訊息胜肽序列； I爲柔性連接子； H爲無或樞紐區； TM爲跨膜結構域； C爲共刺激信號分子； CD3ζ爲源於CD3ζ的細胞溶質信號傳導序列； scFv1和scFv2兩者中一個爲標靶第一標的的抗原結合結構域，另一個爲標靶CD19的抗原結合結構域。
在另一優選例中，所述的scFv1和scFv2可以是各自獨立的，也可以是串聯的，或者是loop的結構。
在另一優選例中，所述的scFv1爲標靶第一標的的抗原結合結構域，所述scFv2爲標靶CD19的抗原結合結構域。
在另一優選例中，所述的scFv1爲標靶CD19的抗原結合結構域，所述scFv2爲標靶第一標的的抗原結合結構域。
在另一優選例中，所述柔性連接子I的序列包含1-6個，較佳地爲3-5個連續的SEQ ID NO: 22 (GGGGS)所示的序列。
在另一優選例中，所述標靶第一標的的抗原結合結構域的結構如下式C或式D所示： VL1 -VH1 (C)； VH1 -VL1 (D) 其中，VL1 爲抗第一標的抗體輕鏈可變區；VH1 爲抗第一標的抗體重鏈可變區；“-”爲連結胜肽或肽鍵。
在另一優選例中，所述標靶BCMA的抗原結合結構域的結構如下式C或式D所示： VL1 -VH1 (C)； VH1 -VL1 (D) 其中，VL1 爲抗BCMA抗體輕鏈可變區；VH1 爲抗BCMA抗體重鏈可變區；“-”爲連結胜肽或肽鍵； 較佳地爲式D結構。
在另一優選例中，所述標靶CD19的抗原結合結構域的結構如下式A或式B所示： VH -VL , (A)； VL -VH , (B) 式中，VH 爲所述抗體重鏈可變區；VL 爲所述抗體輕鏈可變區；“-”爲連結胜肽或肽鍵。
在另一優選例中，所述的scFv1和/或scFv2爲鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的單鏈抗體可變區片段，較佳地爲人源化的單鏈抗體可變區片段。
在另一優選例中，所述雙特異性CAR的結構如下式III或III’所示： L-VL3 -scFv3-VH3 -H-TM-C-CD3ζ    (III) L-VH3 -scFv3-VL3 -H1-TM-C-CD3ζ    (III’) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； 要素L、H、TM、C和CD3ζ如上所述； scFv3爲標靶CD19的抗原結合結構域，VH3 爲抗所述第一標的抗體重鏈可變區，且VL3 爲抗所述第一標的抗體輕鏈可變區；或者scFv3爲標靶所述第一標的的抗原結合結構域，VH3 爲抗CD19抗體重鏈可變區，且VL3 爲抗CD19抗體輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述的scFv3爲標靶BCMA的抗原結合結構域，VH3 爲抗CD19抗體重鏈可變區，且VL3 爲抗CD19抗體輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述的標靶BCMA的抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 21所示的抗體重鏈可變區，和SEQ ID NO: 20所示的抗體輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述雙特異性CAR的結構如下式III所示。
在另一優選例中，所述的L爲選自下組的蛋白的訊息胜肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其組合。
在另一優選例中，所述L爲CD8來源的訊息胜肽。
在另一優選例中，所述L具有如SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的H爲選自下組的蛋白的樞紐區：CD8、CD28、CD137、或其組合。
在另一優選例中，所述的H各自獨立地爲CD8來源的樞紐區。
在另一優選例中，所述H具有如SEQ ID NO: 24所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的TM爲選自下組的蛋白的跨膜區：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其組合。
在另一優選例中，所述的TM各自獨立地爲CD8或CD28來源的跨膜區。
在另一優選例中，所述CD8來源的跨膜區具有如SEQ ID NO: 25所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述CD28來源的跨膜區具有如SEQ ID NO: 26所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的C爲選自下組的蛋白的共刺激信號分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB (CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其組合。
在另一優選例中，所述的C爲CD28和/或4-1BB來源的共刺激信號分子。
在另一優選例中，所述4-1BB來源的共刺激信號分子具有如SEQ ID NO: 27所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述CD28來源的共刺激信號分子具有如SEQ ID NO: 28所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述CD3ζ具有如SEQ ID NO: 29所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述CAR (優選地C端或N端)還包括細胞凋亡要素。
在另一優選例中，所述細胞凋亡要素與所述CAR或所述雙特異性CAR的L或CD3ζ透過T2A連接。
在本發明的第四方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼本發明第一方面所述的人源化CD19抗體、本發明第二方面所述的CAR或第三方面所述的雙特異性CAR。
在本發明的第五方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第四方面所述的核酸分子。
在另一優選例中，所述的載體選自下組：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、反轉錄病毒載體、轉座子、或其組合。
在另一優選例中，所述載體爲慢病毒載體。
在本發明的第六方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第五方面所述的載體、或染色體中併入有外源的本發明第四方面所述的核酸分子、或表現本發明第一方面所述的人源化CD19抗體、本發明第二方面所述的CAR或第三方面所述的雙特異性CAR。
在本發明的第六方面，提供了一種工程化的免疫細胞，所述的免疫細胞含有本發明第四方面所述的載體、或染色體中併入有外源的本發明第三方面所述的核酸分子、或表現本發明第一方面所述的人源化CD19抗體、本發明第二方面所述的CAR或第三方面所述的雙特異性CAR。
在另一優選例中，所述免疫細胞具有選自下組的一種或多種特徵： (a)  所述免疫細胞的PD-1基因表現是被默化的； (b)  所述免疫細胞爲T細胞，且所述T細胞的TCR基因表現是被默化的；和 (c)  所述免疫細胞表現外源性細胞凋亡要素； (d)  所述免疫細胞表現或分泌PD-1抗體、PD-L1抗體、CD47抗體、Tim3抗體、Lag3抗體、Tigit抗體、OX40抗體、ICOS抗體、IL7、CXCL19、IL21、IL15、IL2、IL18、或其組合；和 (e)  所述免疫細胞的細胞激素相關信號途徑被增强，其中所述細胞激素選自下組：IL7、CXCL19、IL21、IL15、IL2、IL18、或其組合。
在另一優選例中，所述的工程化的免疫細胞選自下組： (i)  嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)；或 (ii) 嵌合抗原受體NK細胞(CAR-NK細胞)。
在另一優選例中，所述免疫細胞表現外源性細胞凋亡要素。
在另一優選例中，所述的免疫細胞中CAR與細胞凋亡要素共表現。
在另一優選例中，所述的CAR與細胞凋亡要素透過自我切割要素相連接。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素位於CAR的N端或C端。
在另一優選例中，所述的自我切割要素包括2A序列或IRES序列，優選爲：P2A和T2A。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素選自下組：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、EGFRt、或其組合。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素的結構如下式IV所示： L2-D-F (IV) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； L2爲任選的訊息胜肽序列； D爲自殺開關要素； F爲跨膜要素。
在另一優選例中，所述的訊息胜肽爲來源GM-CSFR的訊息胜肽。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素選自下組：截短的表皮生長因子受體(EGFRt)、截短的CD19 (CD19t)基因、誘導的半胱天冬酶9基因(iCasp9)、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、或其組合。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素爲EGFRt。
在另一優選例中，所述的工程化的免疫細胞包括通用型CAR-T細胞。
在另一優選例中，所述通用型CAR-T細胞的TRAC和B2M基因被剔除。
在本發明的第八方面，提供了一種工程化的免疫細胞，所述免疫細胞含有外源的第一表現匣和第二表現匣，其中所述第一表現匣用於表現標靶第一標的的第一CAR，所述第二表現匣用於表現標靶CD19的第二CAR； 或所述免疫細胞表現所述標靶第一標的的第一CAR和所述標靶CD19的第二CAR； 其中，所述第二CAR中標靶CD19的抗原結合結構域(scFv)爲本發明第一方面所述的人源化CD19抗體； 並且，所述的第一靶點選自下組： CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、Folate receptor α、Folate receptor β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2、或其組合。
在另一優選例中，所述的第一標的爲BCMA，並且第一CAR中標靶BCMA的抗原結合結構域(scFv)包括SEQ ID NO: 21所示的抗體重鏈可變區，和SEQ ID NO: 20所示的抗體輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述第二CAR爲本發明第二方面所述的CAR。
在另一優選例中，所述第一CAR和第二CAR定位於所述免疫細胞的細胞膜。
在另一優選例中，所述免疫細胞的細胞膜上表現有標靶BCMA的第一CAR和標靶CD19的第二CAR。
在另一優選例中，所述的第一表現匣和第二表現匣位於相同或不同的載體上。
在另一優選例中，所述的第一表現匣和第二表現匣位於同一載體。
在另一優選例中，所述第一CAR的結構如下式V所示： L-scFv1’-H-TM-C-CD3ζ   (V) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； 要素L、H、TM、C和CD3ζ如上所述； scFv1’爲標靶BCMA的抗原結合結構域。
在另一優選例中，所述第一CAR和第二CAR透過2A肽連接。
在另一優選例中，所述2A肽的序列如SEQ ID NO: 30所示。
在另一優選例中，所述免疫細胞內還包括細胞凋亡要素。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素與所述雙特異性CAR透過T2A連接(或串聯)。
在另一優選例中，所述的細胞凋亡要素與所述第一CAR和/或所述第二CAR透過T2A連接。
在另一優選例中，所述免疫細胞的PD1基因表現是被默化的。
在另一優選例中，所述“PD-1基因表現是被默化的”指PD-1基因不表現或低度表現。
在另一優選例中，所述“低度表現”指所述免疫細胞PD-1基因的表現量G1與正常免疫細胞PD-1基因的表現量G0的比值，即G1/G0≤0.5，較佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地爲0。
在另一優選例中，所述“低度表現”指所述CAR-T細胞PD-1基因的表現量G1與正常T細胞PD-1基因的表現量G0的比值，即G1/G0≤0.5，較佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地爲0。
在本發明的第九方面，提供了一種製劑，所述製劑含有本發明第一方面所述的人源化CD19抗體、或本發明第七或八方面所述的工程化的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
在另一優選例中，所述製劑爲液態製劑。
在另一優選例中，所述製劑的劑型爲注射劑。
在另一優選例中，所述製劑中所述工程化的免疫細胞的濃度爲1×103 -1×108 個細胞/ml，較佳地1×104 -1×107 個細胞/ml。
在本發明的第十方面，提供了一種本發明第一方面所述的人源化CD19抗體、或本發明第七或八方面所述的工程化的免疫細胞的用途，用於製備預防和/或治療癌症或腫瘤的藥物或製劑。
在另一優選例中，所述腫瘤選自下組：血液腫瘤、實體瘤、或其組合。
在另一優選例中，所述血液腫瘤選自下組：急性骨髓細胞白血病(AML)、多發性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、或其組合。
在另一優選例中，所述實體瘤選自下組：胃癌、胃癌腹膜轉移、肝癌、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腦膠質瘤、子宮內膜癌、睾丸癌、尿道腫瘤、甲狀腺癌、或其組合。
在另一優選例中，所述癌症或腫瘤爲多發性骨髓瘤。
在另一優選例中，所述癌症或腫瘤爲淋巴瘤。
在另一優選例中，所述的淋巴瘤選自下組：何杰金氏淋巴瘤(HL)，瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤(FL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球淋巴瘤(SLL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、柏基特氏淋巴瘤(BL)以及其他複雜B細胞非何杰金氏淋巴瘤。
在本發明的另一方面，提供了一種製備工程化免疫細胞的方法，所述的工程化免疫細胞表現本發明第一方面所述的人源化CD19抗體、本發明第二方面所述的CAR或第三方面所述的雙特異性CAR，包括以下步驟： 將本發明第四方面所述的核酸分子或本發明第五方面所述的載體轉導入免疫細胞內，從而獲得所述工程化免疫細胞。
在另一優選例中，所述免疫細胞爲T細胞或NK細胞。
在本發明的第十一方面，提供了一種製備工程化免疫細胞的方法，包括以下步驟： (1)   提供一待改造的免疫細胞；和 (2)   將用於表現標靶第一標的的第一CAR的第一表現匣導入到所述免疫細胞；和 (3)   將用於表現標靶CD19的第二CAR的第二表現匣導入到所述免疫細胞，從而獲得所述的工程化免疫細胞， 其中，所述第二CAR中標靶CD19的抗原結合結構域(scFv)爲本發明第一方面所述的人源化CD19抗體； 並且，所述的第一標的選自下組： CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、Folate receptor α、Folate receptor β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2、或其組合。
在另一優選例中，所述步驟(2)可在步驟(3)之前、之後、同時或交替進行。
在另一優選例中，當步驟(1)中的待改造的免疫細胞已經表現第一CAR或第二CAR時，則步驟(2)或步驟(3)可以省略。
在本發明的第十二方面，提供了一種套組，所述的套組用於製備本發明第七或八方面所述的工程化的免疫細胞，且所述套組含有容器，以及位於容器內的本發明第四方面所述的核酸分子、或本發明第五方面所述的載體。
在本發明的第十三方面，提供了一種套組，所述的套組用於製備本發明第七或八方面所述的工程化的免疫細胞，且所述套組含有容器，以及位於容器內的： (1)   第一核酸序列，所述第一核酸序列含有第一表現匣，所述的第一表現匣用於表現標靶第一標的的第一CAR；和 (2)   第二核酸序列，所述第二核酸序列含有第二表現匣，所述的第二表現匣用於表現所述標靶CD19的第二CAR； 其中，所述第二CAR中標靶CD19的抗原結合結構域(scFv)爲本發明第一方面所述的人源化CD19抗體； 並且，所述的第一標的選自下組： CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、Folate receptor α、Folate receptor β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2、或其組合。
在另一優選例中，所述的第一和第二核酸序列位於相同或不同的容器內。
在另一優選例中，所述的第一和第二核酸序列位於同一表現載體中。
在本發明的第十四方面，提供了一種本發明第七或八方面所述的工程化的免疫細胞的用途，用於預防和/或治療癌症或腫瘤。
在另一優選例中，所述癌症或腫瘤爲多發性骨髓瘤、血液瘤、淋巴瘤。
在本發明的第十五方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發明第七或八方面所述的細胞、或本發明第六方面所述的製劑。
在另一優選例中，所述疾病爲癌症或腫瘤。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次建構了一種新的人源化CD19抗體，其是以FMC63嵌合抗體爲基礎進行人源化改造獲得本發明還提供了基於該人源化抗體建構的CAR-T細胞和雙CAR-T細胞及其相關應用。與利用FMC63所建構的CAR-T細胞相比，本發明建構的CAR-T細胞和雙CAR-T細胞具有更高的毒殺效果和腫瘤清除能力。在此基礎上完成了本發明。術語
爲了可以更容易地理解本公開，首先定義某些術語。如本申請中所使用的，除非本文另有明確規定，否則以下術語中的每一個應具有下面給出的含義。在整個申請中闡述了其它定義。
術語“約”可以是指在本領域普通技術人員確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分地取决於如何測量或測定值或組成。
術語“給予”是指使用本領域技術人員已知的各種方法和遞送系統中的任一種將本發明的産品物理引入受試者，包括靜脈內，肌內，皮下，腹膜內，脊髓或其它腸胃外給藥途徑，例如透過注射或輸液。
應理解，本文中胺基酸名稱採用國際通用的單英文字母標示，與其相對應的胺基酸名稱三英文字母簡寫分別是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。CD19
CD19分子是B細胞表面的跨膜蛋白，它與B細胞活化、信號傳導及生長調節密切相關。CD19幾乎表現於所有B細胞的表面，標靶CD19的CAR-T細胞目前在白血病及淋巴瘤的治療中效果顯著。CD19還可以用於治療多發性骨髓瘤。B 細胞成熟抗原 (B cell maturation antigen, BCMA)
BCMA是一種跨膜蛋白，表現於成熟的B淋巴細胞表面，即漿母細胞及漿細胞表面。而多發性骨髓瘤正是由於漿細胞不正常的增生並侵犯骨髓導致。研究表明，BCMA表現於多發性骨髓瘤細胞上。標靶BCMA的Car-T細胞經證實能夠特異性殺死骨髓瘤細胞。但是一些患者接受標靶BCMA的CAR-T細胞治療後，依然會有復發的過程。針對這些再復發的病人，就需要再找到一個有別於BCMA的標的，才能繼續治療。抗體
如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。
如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱爲互補决定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱爲框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情况下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等, NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669頁(1991))。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恆定區的胺基酸序列歸爲明顯不同的兩類(稱爲κ和λ)中的一類。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分爲不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞型(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱爲α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的次單位結構和三維構型是本領域人員所熟知的。
一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱爲可變區域(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，透過其間的FR形成的β折叠在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位址。可以透過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。
本發明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。因此，本發明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。
在本發明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單株抗體，包括人的和非人的部分，可以透過標準的DNA重組技術獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單株抗體的可變區，和來自人免疫球蛋白的恆定區的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397，在此透過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補决定區(CDRs)和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此透過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單株抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。
在本發明中，抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。
在本發明中，本發明的抗體還包括其保守性變異體，指與本發明抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而産生。 表 A
最初的殘基 代表性的取代 優選的取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro; Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
嵌合抗原受體 (CAR)
本發明的嵌合抗原受體(CAR)包括細胞外結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域。胞外結構域包括標的-特異性結合要素(也稱爲抗原結合結構域)。細胞內結構域包括共刺激信號傳導區和ζ鏈部分。共刺激信號傳導區指包括共刺激分子的細胞內結構域的一部分。共刺激分子爲淋巴細胞對抗原的有效反應所需要的細胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。
在CAR的胞外結構域和跨膜結構域之間，或在CAR的細胞溶質結構域和跨膜結構域之間，可併入連接子。如本文所用的，術語“連接子”通常指起到將跨膜結構域連接至多肽鏈的胞外結構域或細胞溶質結構域作用的任何寡肽或多肽。連接子可包括0-300個胺基酸，優選地2至100個胺基酸和最優選地3至50個胺基酸。
在本發明的一個較佳的實施方式中，本發明提供的CAR的胞外結構域包括標靶CD19的抗原結合結構域。本發明的CAR當在T細胞中表現時，能夠基於抗原結合特異性進行抗原辨識。當其結合其關聯抗原時，影響腫瘤細胞，導致腫瘤細胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，並導致患者的腫瘤負荷縮小或消除。抗原結合結構域優選與來自共刺激分子和ζ鏈中的一個或多個的細胞內結構域融合。優選地，抗原結合結構域與4-1BB信號傳導結構域、和CD3ζ信號結構域組合的細胞內結構域融合。
如本文所用，“抗原結合結構域” “單鏈抗體片段”均指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2 片段，或單一Fv片段。Fv抗體含有抗體重鏈可變區、輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位址的最小抗體片段。一般的，Fv抗體還包含VH和VL結構域之間的多肽連接子，且能夠形成抗原結合所需的結構。抗原結合結構域通常是scFv (single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一個完整抗體的1/6。單鏈抗體優選是由一條核苷酸鏈編碼的一條胺基酸鏈序列。作爲本發明的優選方式，所述抗原結合結構域包含特異性辨識CD19的抗體，任選地，所述抗原結合結構域還包含特異性辨識BCMA的抗體，較佳地爲單鏈抗體。
對於樞紐區和跨膜區(跨膜結構域)，CAR可被設計以包括融合至CAR的胞外結構域的跨膜結構域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結構域之一相關聯的跨膜結構域。在一些例子中，可選擇跨膜結構域，或透過胺基酸置換進行修飾，以避免將這樣的結構域結合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結構域，從而最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。
本發明的CAR中的胞內結構域包括4-1BB的信號傳導結構域和CD3ζ的信號傳導結構域。
優選地，本發明的CAR中還包括有細胞凋亡要素。
優選地，本發明的標靶CD19的scFv包括SEQ ID NO: 1-7中任一所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 8-17中任一所示的抗體重鏈可變區。雙特異性 CAR
CD19是分子量95 kDa的糖蛋白，表現於前B細胞和成熟B細胞膜表面，與B細胞Ca++的跨膜傳導途徑密切相關，對B細胞的增殖和分化具有調節作用。CD19主要表現在正常B細胞和癌變B細胞中，組織表現特異性較高，是一個很好的抗體或CAR-T免疫治療標的。但在免疫治療過程中，經常會出現B細胞的CD19表位丟失情况，造成病人對免疫治療無反應或者復發。
雙特異性是指同一個CAR可以特異結合、免疫辨識兩個不同的抗原，CAR結合任意一個抗原都能産生免疫反應。
本發明提供了標靶CD19和另一腫瘤標的的雙特異性CAR，如本發明第三方面所述。
在另一優選例中，所述雙特異性CAR標靶CD19和BCMA。
在本發明的一個較佳的實施方式中，本發明提供的CAR的胞外結構域包括標靶CD19和BCMA的抗原結合結構域，包括抗CD19的scFv和抗BCMA的scFv。
在另一優選例中，本發明提供一個針對CD19和BCMA抗原的雙特異性嵌合抗原受體。同時標靶CD19和BCMA的CAR結構組分可以包括訊息胜肽，抗CD19的scFv，抗BCMA的scFv，樞紐區，跨膜區，和胞內T細胞信號區，其中CD19scFv和BCMAscFv透過一個短的胜肽片段(G4S)xN相連。同時標靶CD19和BCMA的CAR結構如本發明第三方面所述。
在另一優選例中，本發明的CD19和BCMA雙特異性的CAR爲單一結構，包含抗CD19和BCMA的scFv。其中CAR包含CD19 scFv和BCMA scFv，CD19 scFv和BCMA scFv的排序和樞紐是其功能的主要影響因素。
本發明使用雙向標靶CD19和BCMA的CAR，與標靶單抗原的CAR相比，親和力顯著增强，免疫細胞的活性顯著增加，具有協同效應。此外，由於CD19和BCMA在腫瘤細胞中的表現位準不均一，雙標靶CAR-T治療範圍更廣泛。同時標靶CD19和BCMA的CAR-免疫細胞可以减少因單一表面抗原向下調控或者缺失造成的抗原逃逸的可能性。
在本發明的一個優選實施方式中，本發明利用人源化CD19 scFv建構雙特異性的CAR，可以進一步提高其毒殺效果和腫瘤清除能力。嵌合抗原受體 T 細胞 (CAR-T 細胞 )
如本文所用，術語“CAR-T細胞”、“CAR-T”、“本發明CAR-T細胞”包括本發明第三方面中包含的CAR-T細胞。
CAR-T細胞較其它基於T細胞的治療方式存在以下優勢：(1) CAR-T細胞的作用過程不受MHC的限制；(2)鑑於很多腫瘤細胞表現相同的腫瘤抗原，針對某一種腫瘤抗原的CAR基因建構一旦完成，便可以被廣泛利用；(3) CAR既可以利用腫瘤蛋白質抗原，又可利用糖脂類非蛋白質抗原，擴大了腫瘤抗原的標的範圍；(4)使用患者自體細胞降低了排異反應的風險；(5) CAR-T細胞具有免疫記憶功能，可以長期在體內存活。
本發明提供了包含標靶CD19的CAR和標靶另一腫瘤標的的CAR的雙特異性CAR-T細胞，如本發明第八方面所述。
在另一優選例中，所述的另一腫瘤標的爲BCMA。
在本發明的一個優選實施方式中，本發明利用人源化CD19 scFv建構雙特異性的CAR-T細胞，可以進一步提高其毒殺效果和腫瘤清除能力嵌合抗原受體 NK 細胞 (CAR-NK 細胞 )
如本文所用，術語“CAR-NK細胞”、“CAR-NK”、“本發明CAR-NK細胞”均指本發明第三方面中包含的CAR-NK細胞。本發明CAR-NK細胞可用於治療CD19高度表現的腫瘤，如多發性骨髓瘤、淋巴瘤等。
自然殺傷(NK)細胞是一類主要的免疫效應細胞，透過非抗原特異性途徑去保護身體免受病毒感染和腫瘤細胞的侵襲。透過工程化(基因修飾)的NK細胞可能獲得新的功能，包括特異性辨識腫瘤抗原的能力及具有增强的抗腫瘤細胞毒性作用。
與自體CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞還具有以下優點，例如：(1)透過釋放穿孔素和顆粒酶直接毒殺腫瘤細胞，而對身體正常的細胞沒有毒殺作用；(2)它們釋放很少量的細胞激素從而降低了細胞激素風暴的危險；(3)體外極易擴增及發展爲“現成的”産品。除此之外，與CAR-T細胞治療類似。自殺基因開關
爲進一步控制CAR-T細胞非腫瘤標靶和細胞激素釋放綜合症等不良，本發明中的CART細胞皆帶有自殺基因開關，在外源性藥物的作用下，可以有效清除體內的CAR-T細胞，阻斷未知的或不可控的長期毒性，以保證患者的安全。
本發明中所用自殺開關可以爲單純疱疹病毒胸苷激酶(the herpes symplex virus thymidine kinase，HSV-TK)、可誘導的半胱天冬酶9 (inducible caspase 9，iCasp9)、CD20、突變型人胸苷酸激酶(mutated human thymidylate kinase，mTMPK)等。比較而言，HSV-TK、iCasp9和CD20對CAR-細胞的清除能力等同，但是iCasp9和CD20的清除較迅速，HSV-TK清除速度較慢。
iCasp9自殺開關包含FKBP12-F36V結構域，可透過柔性連接子連接半胱天冬酶9，後者不含募集結構域。FKBP12-F36V包含一個FKBP結構域，在第36個胺基酸殘基位址上苯丙胺酸替代了纈胺酸。它具有高選擇性和次奈米莫耳親和力，能夠結合二聚合成配位子，如其他惰性小分子AP1903。當加入小分子後，能夠促使其二聚化，從而誘導細胞的凋亡，而對未攜帶自殺開關的正常細胞無效用。
誘導安全開關caspase9 (iCasp9)使用人的caspase9融合FK506結合蛋白(FKBP)，使其可以用化學誘導劑(AP1903 / Rimiducid，Bellicum Pharmaceutical)誘導形成二聚體，導致表現融合蛋白的細胞凋亡。
CD19和BCMA雖然在腫瘤細胞中高度表現，在正常B細胞也有表現，本發明工程化的免疫細胞在體內會攻擊正常B細胞。
如何控制CAR-細胞的安全性一直都是急需解决的問題。在CAR-細胞上加入安全開關，是用於終止CAR-細胞活性最安全的方式。在CAR-細胞産生嚴重毒性(CRS /神經毒性)或者在病人達到長期持續緩解後，可誘導的iCasp9安全開關控制CAR-細胞清除。載體
編碼期望分子的核酸序列可利用在本領域中已知的重組方法獲得，諸如例如透過從表現基因的細胞中篩選基因庫，透過從已知包括該基因的載體中得到該基因，或透過利用標準的技術，從包含該基因的細胞和組織中直接分離。可選地，感興趣的基因可被合成生産。
本發明也提供了其中插入本發明的表現匣的載體。源於反轉錄病毒諸如慢病毒的載體是實現長期基因轉移的合適工具，因爲它們允許基因轉殖長期、穩定的併入並且其在子細胞中增殖。慢病毒載體具有超過源自致癌反轉錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的優點，因爲它們可轉導非增殖的細胞，諸如肝細胞。它們也具有低免疫原性的優點。
簡單概括，通常可操作地連接本發明的表現匣或核酸序列至啓動子，並將其併入表現載體。該載體適合於複製和併入真核細胞。典型的選殖載體包含可用於調節期望核酸序列表現的轉錄和轉譯終止子、初始序列和啓動子。
本發明的表現建構體也可利用標準的基因傳遞方案，用於核酸免疫和基因療法。基因傳遞的方法在本領域中是已知的。見例如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通過引用全文併入。在另一個實施方式中，本發明提供了基因療法載體。
該核酸可被選殖入許多類型的載體。例如，該核酸可被選殖入如此載體，其包括但不限於質體、噬菌體、噬菌體衍生物、動物病毒和黏接質體。特定的感興趣載體包括表現載體、複製載體、探針産生載體和定序載體。
進一步地，表現載體可以以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是公知的並在例如Sambrook等(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒學和分子生物學手册中進行了描述。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的複製起點、啓動子序列、方便的限制酶位址和一個或多個可選擇的標記(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美國專利號6,326,193)。
已經開發許多基於病毒的系統，用於將基因轉移入哺乳動物細胞。例如，反轉錄病毒提供了用於基因傳遞系統的方便的平臺。可利用在本領域中已知的技術將選擇的基因插入載體並包裝入反轉錄病毒顆粒。該重組病毒可隨後被分離和傳遞至體內或離體的對象細胞。許多反轉錄病毒系統在本領域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。
額外的啓動子要素，例如增强子，可以調節轉錄開始的頻率。通常地，這些位於起始位址上游的30-110 bp區域中，儘管最近已經顯示許多啓動子也包含起始位址下游的功能要素。啓動子要素之間的間隔經常是柔性的，以便當要素相對於另一個被倒置或移動時，保持啓動子功能。在胸苷激酶(tk)啓動子中，啓動子要素之間的間隔可被增加隔開50 bp，活性才開始下降。取决於啓動子，表現出單個要素可合作或獨立地起作用，以起動轉錄。
合適的啓動子的一個例子爲即時早期巨細胞病毒(CMV)啓動子序列。該啓動子序列爲能夠驅動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高位準表現的强組成型啓動子序列。合適的啓動子的另一個例子爲延伸生長因子-1α (EF-1α)。然而，也可使用其他組成型啓動子序列，包括但不限於類人猿病毒40 (SV40)早期啓動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啓動子、MoMuLV啓動子、鳥類白血病病毒啓動子、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒即時早期啓動子、魯斯氏肉瘤病毒啓動子、以及人基因啓動子，諸如但不限於肌動蛋白啓動子、肌球蛋白啓動子、血紅素啓動子和肌酸激酶啓動子。進一步地，本發明不應被限於組成型啓動子的應用。誘導型啓動子也被考慮爲本發明的一部分。誘導型啓動子的使用提供了分子開關，其能夠當這樣的表現是期望的時，打開可操作地連接誘導型啓動子的多核苷酸序列的表現，或當表現是不期望的時關閉表現。誘導型啓動子的例子包括但不限於金屬硫蛋白啓動子、糖皮質激素啓動子、孕酮啓動子和四環素啓動子。
爲了評估CAR多肽或其部分的表現，被引入細胞的表現載體也可包含可選擇的標記基因或報導基因中的任一個或兩者，以便於從透過病毒載體尋求被轉染或感染的細胞群中鑑定和選擇表現細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上並用於共轉染程序。可選擇的標記和報導基因兩者的側翼都可具有適當的調節序列，以便能夠在宿主細胞中表現。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
報導基因用於鑑定潛在轉染的細胞並用於評估調節序列的功能性。通常地，報導基因爲以下基因：其不存在於受體有機體或組織或由受體有機體或組織進行表現，並且其編碼多肽，該多肽的表現由一些可容易檢測的性質例如酶活性清楚表示。在DNA已經被引入受體細胞後，報導基因的表現在合適的時間下進行測定。合適的報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表現系統是公知的並可利用已知技術製備或從商業上獲得。通常，顯示最高位準的報導基因表現的具有最少5個側翼區的建構體被鑑定爲啓動子。這樣的啓動子區可被連接至報導基因並用於評估試劑調節啓動子-驅動轉錄的能力。
將基因引入細胞和將基因表現入細胞的方法在本領域中是已知的。在表現載體的內容中，載體可透過在本領域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如，表現載體可透過物理、化學或生物學手段轉移入宿主細胞。
將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染法、粒子轟擊、微注射、電穿孔等等。生産包括載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領域中是公知的。見例如Sambrook等(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。將多核苷酸引入宿主細胞的優選方法爲磷酸鈣轉染。
將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是反轉錄病毒載體，已經成爲最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純疱疹病毒I、腺病毒和腺相關病毒等等。見例如美國專利號5,350,674和5,585,362。
將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠；和基於脂質的系統，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體。用作體外和體內傳遞工具(delivery vehicle)的例示性膠體系統爲脂質體(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒傳遞系統的情况下，例示性傳遞工具爲脂質體。考慮使用脂質製劑，以將核酸引入宿主細胞(體外、離體 (ex vivo)或體內)。在另一方面，該核酸可與脂質相關聯。與脂質相關聯的核酸可被封裝入脂質體的水性內部中，散布在脂質體的脂雙層內，經與脂質體和寡核苷酸兩者都相關聯的連接分子附接至脂質體，陷入脂質體，與脂質體複合，分散在包含脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質聯合，作爲懸浮液包含在脂質中，包含在膠束中或與膠束複合，或以其他方式與脂質相關聯。與組成物相關聯的脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體不限於溶液中的任何具體結構。例如，它們可存在於雙分子層結構中，作爲膠束或具有“摺疊的(collapsed)”結構。它們也可簡單地被散布在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質爲脂肪物質，其可爲天然發生或合成的脂質。例如，脂質包括脂肪小滴，其天然發生在細胞質以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、胺基醇類和醛類的該類化合物中。
在本發明的一個優選地實施方式中，所述載體爲慢病毒載體。製劑
本發明提供了一種含有本發明第一方面所述的CAR-T細胞，以及藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。在一個實施方式中，所述製劑爲液態製劑。優選地，所述製劑爲注射劑。優選地，所述製劑中所述CAR-T細胞的濃度爲1×103 -1×108 個細胞/ml，更優地1×104 -1×107 個細胞/ml。
在一個實施方式中，所述製劑可包括緩衝液諸如中性緩衝鹽水、硫酸鹽緩衝鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發明的製劑優選配製用於靜脈內施用。治療性應用
本發明包括用編碼本發明表現匣的慢病毒載體(LV)轉導的細胞(例如，T細胞)進行的治療性應用。轉導的T細胞可標靶腫瘤細胞的標誌物CD19或CD19和BCMA，協同活化T細胞，引起T細胞免疫反應，從而顯著提高其對腫瘤細胞的毒殺效率。
因此，本發明也提供了刺激對哺乳動物的標靶細胞群或組織的T細胞-媒介的免疫反應的方法，其包括以下步驟：給哺乳動物施用本發明的CAR-T細胞。
在一個實施方式中，本發明包括一類細胞療法，分離病人自體T細胞(或者異源供體)，活化並進行基因改造産生CAR-T細胞，隨後注入同一病人體內。這種方式患移植物抗宿主病概率極低，抗原被T細胞以無MHC限制方式辨識。此外，一種CAR-T就可以治療表現該抗原的所有癌症。不像抗體療法，CAR-T細胞能夠體內複製，産生可導致持續腫瘤控制的長期持久性。
在一個實施方式中，本發明的CAR-T細胞可經歷穩固的體內T細胞擴展並可持續延長的時間量。另外，CAR媒介的免疫反應可爲過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR-修飾T細胞誘導對CAR中的抗原結合結構域特異性的免疫反應。例如，抗BCMA和/或CD19的CAR-T細胞引起抗表現BCMA和/或CD19的細胞的特異性免疫反應。
儘管本文公開的數據具體公開了包括抗CD19 scFv或CD19和BCMA scFv、樞紐和跨膜區、和4-1BB / CD28和CD3ζ信號傳導結構域的慢病毒載體，但本發明應被解釋爲包括對建構體組成部分中的每一個的任何數量的變化。
可治療的癌症包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。癌症可包括非實體瘤(諸如血液學腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括實體瘤。用本發明的CAR治療的癌症類型包括但不限於癌、胚細胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌症和兒童腫瘤/癌症。
血液學癌症爲血液或骨髓的癌症。血液學(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(諸如急性淋巴球性白血病、急性骨髓細胞白血病、急性骨髓性白血病和成骨髓性、前骨髓性、粒-單核細胞型、單核細胞性和紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性骨髓細胞(顆粒細胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴球性白血病)、真性紅細胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏疾病、非何杰金氏淋巴瘤(無痛和高等級形式)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合症、多毛細胞白血病和脊髓發育不良。
實體瘤爲通常不包含囊腫或液體區的組織的異常腫塊。實體瘤可爲良性或惡性的。不同類型的實體瘤以形成它們的細胞類型命名(諸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。實體瘤諸如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、間皮瘤、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、卵巢癌。
本發明的CAR-修飾T細胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內療法的疫苗類型。優選地，哺乳動物爲人。
對於離體免疫，以下中的至少一項在將細胞施用進入哺乳動物前在體外發生：i)擴增細胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細胞，和/或iii)冷凍保存細胞。
離體程序在本領域中是公知的，並在以下更完全地進行討論。簡單地說，細胞從哺乳動物(優選人)中分離並用表現本文公開的CAR的載體進行基因修飾(即，體外轉導或轉染)。CAR-修飾的細胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者可爲人，和CAR-修飾的細胞可相對於接受者爲自體的。可選地，細胞可相對於接受者爲同種異基因的、同基因的(syngeneic)或異種的。
除了就離體免疫而言使用基於細胞的疫苗之外，本發明也提供了體內免疫以引起針對患者中抗原的免疫反應的組成物和方法。
本發明提供了治療腫瘤的方法，其包括施用給需要其的對象治療有效量的本發明的CAR-修飾的T細胞。
本發明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作爲藥物組成物與稀釋劑和/或與其他組分諸如IL-2、IL-17或其他細胞激素或細胞群結合施用。簡單地說，本發明的藥物組成物可包括如本文所述的標靶細胞群，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結合。這樣的組成物可包括緩衝液諸如中性緩衝鹽水、硫酸鹽緩衝鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發明的組成物優選配製用於靜脈內施用。
本發明的藥物組成物可以以適於待治療(或預防)的疾病的方式施用。施用的數量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病症、和患者疾病的類型和嚴重度——儘管適當的劑量可由臨床試驗確定。
當指出“免疫學上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本發明組成物的精確量可由醫師確定，其考慮患者(對象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉移程度和病症的個體差異。可通常指出：包括本文描述的T細胞的藥物組成物可以以104 至109 個細胞/kg體重的劑量，優選105 至106 個細胞/kg體重的劑量(包括那些範圍內的所有整數值)施用。T細胞組成物也可以以這些劑量多次施用。細胞可透過使用免疫療法中公知的注入技術(見例如Rosenberg等，NewEng.J. of Med.319:1676，1988)施用。對於具體患者的最佳劑量和治療方案可透過監測患者的疾病跡象並因此調節治療由醫學領域技術人員容易地確定。
對象組成物的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組成物可被皮下、皮內、瘤內、淋巴结内、脊髓內、肌肉內、透過靜脈內(i.v.)注射或腹膜內施用給患者。在一個實施方式中，本發明的T細胞組成物透過皮內或皮下注射被施用給患者。在另一個實施方式中，本發明的T細胞組成物優選透過i.v.注射施用。T細胞的組成物可被直接注入腫瘤，淋巴結或感染位置。
在本發明的某些實施方式中，利用本文描述的方法或本領域已知的其他將T細胞擴展至治療性位準的方法活化和擴展的細胞，與任何數量的有關治療形式結合(例如，之前、同時或之後)施用給患者，所述治療形式包括但不限於用以下試劑進行治療：所述試劑諸如抗病毒療法、西多福韋和介白素-2、阿糖胞苷(也已知爲ARA-C)或對MS患者的那他珠單抗治療或對牛皮癬患者的厄法珠單抗治療或對PML患者的其他治療。在進一步的實施方式中，本發明的T細胞可與以下結合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環孢菌素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、麥考酚酯和FK506，抗體或其他免疫治療劑。在進一步的實施方式中，本發明的細胞組成物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環磷醯胺結合(例如，之前、同時或之後)而施用給患者。例如，在一個實施方式中，對象可經歷高劑量化療的標準治療，之後進行周邊血液幹細胞移植。在一些實施方式中，在移植後，對象接受本發明的擴展的免疫細胞的注入。在一個額外的實施方式中，擴展的細胞在外科手術前或外科手術後施用。
施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病症的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據本領域接受的實踐實施。通常，每次治療或每個療程，可將1×106 個至1×1010 個本發明經修飾的T細胞(如，CAR-T20細胞)，透過例如靜脈回輸的方式，施用於患者。本發明的主要優點包括：
(a) 篩選到的人源化抗體具有相似的親和力
(b) 篩選到的人源化抗體scFv序列建構的CAR-T細胞具有比FMC63建構的CAR-T更高的毒殺能力
(c) 篩選到的人源化抗體scFv序列建構的雙特異性CAR-T細胞具有比FMC63建構的雙特異性CAR-T更高的針對CD19標靶細胞的毒殺能力
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人， 分子轉殖：實驗室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例 1 人源化抗體的設計
以抗人CD19抗原的FMC63嵌合抗體爲母代抗體，在其重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列的基礎上，對框架區進行人源化替換，設計抗人CD19抗原的人源化抗體。
透過軟體，設計獲得7種人源化的輕鏈可變區(VL1-VL7，胺基酸序列如SEQ ID NO: 1-7所示)和10種人源化的重鏈可變區(VH1-VH10，胺基酸序列如SEQ ID NO: 8-17所示)。對上述輕鏈可變區和重鏈可變區進行組合，可獲得多個包含不同重鏈可變區和輕鏈可變區的人源化抗體序列。在後續實施例中，進一步檢測人源化抗體的親和力。實施例 2 Biacore 測定的不同抗體的親和力活性：
對實施例1中的部分抗體進行親和力測試，待測抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區組成情况如表1所示。
利用HEK293細胞表現待測抗體，利用Protein A進行純化。使用表面等離子共振技術(SPR)進行測定，抗體固定使用Fc捕獲法。 表1 人源化抗體的親和力測試結果
抗體編號 抗體結構 Kd (1/s) KD (M)
FMC63 FMC63 1.29E-04 4.28E-09
6 VH2+VL3 3.95E-04 4.47E-08
12 VH4+VL3 4.37E-04 5.61E-08
5 VH2+VL2 5.26E-04 6.68E-08
4 VH2+VL1 5.68E-04 6.98E-08
10 VH4+VL1 5.84E-04 8.10E-08
11 VH4+VL2 6.05E-04 8.92E-08
13 VH5+VL1 6.37E-04 9.97E-08
8 VH3+VL2 6.38E-04 1.09E-07
7 VH3+VL1 6.88E-04 1.11E-07
15 VH5+VL3 1.43E-03 1.42E-08
9 VH3+VL3 1.59E-03 1.58E-08
14 VH5+VL2 1.80E-03 1.48E-08
16 VH6+VL4 4.93E-03 2.10E-05
17 陰性對照 7.15E-03 3.39E-07
2 VH1+VL2 7.38E-03 7.95E-09
1 VH1+VL1 8.08E-03 5.76E-08
3 VH1+VL3 7.94E-02 4.07E-08
結果顯示，人源化的待測抗體中VH2+VL3、VH4+VL3、VH2+VL2的親和力相對較高。表中， FMC63是具有人源Fc片段的嵌合抗體，陰性對照爲沒有捕獲抗體情况親和力測定的對照。實施例 3 CAR-T 細胞的製備及其表現情况
從供體血液中分離單個核細胞，使用Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich)進行密度梯度離心，並富集T細胞(EasySep 人T細胞富集套組，Stemcell Technologies)，使用偶聯anti-CD3 / anti-CD28的磁珠活化培養和擴增T細胞；培養基使用X-vivo15 (300 IU/ml rhIL2)；所有細胞均置於37℃，5% CO2 恆溫培養箱中培養。
利用實施例1中設計的部分抗體建構CD19標靶的CAR-T細胞。包裝慢病毒，轉染T細胞後使用流式細胞術測定CAR-T表面CAR的表現情况。
結果如圖1所示，利用各待測抗體建構的CAR-T細胞表面均能檢測到CAR的表現。實施例 4 CAR-T 細胞的毒殺試驗
使用穩定表現CD19的HeLa細胞，透過即時細胞分析(RTCA)檢測實施例3建構的CAR-T細胞毒殺力。
將HeLa-CD19標靶細胞培養過夜，然後將效應細胞(FMC63 CAR-T細胞，實施例3製備的人源化CD19 CAR-T細胞，未轉染T細胞)：HeLa-CD19標靶細胞以數量比1：1比例混合培養，通過RTAC檢測效應細胞對標靶細胞的毒殺情况。
結果如圖2所示，NT對照組(未轉染T細胞對照組)和培養基對照組(空白對照組)對Hela-CD19細胞沒有毒殺，而人源化的scFv建構的CAR-T細胞表現出對標靶細胞顯著的毒殺能力，與利用FMC63建構的CAR-T細胞(FMC63 CAR-T)的毒殺能力相比，11# (L3H1)、1# (L1H1)、6# (L2H1)、16# (L4H6)相對CD19有顯著的毒殺能力提高。實施例 5 Luciferase 法檢測 CAR-T 細胞對標靶細胞 Nalm6 的毒殺
使用螢光素酶標記的腫瘤標靶細胞進行毒殺能力的檢測。透過將螢光素酶基因轉入標靶細胞，轉殖篩選後獲得穩定表現細胞株Nalm6-Luc。進行實驗時，加入螢光素基質，螢光素酶與螢光素反應即可産生螢光，透過檢測螢光的强度可以測定螢光素酶的活性，檢測細胞的存活比率，即可得到各CAR-T細胞的毒殺效應。
結果如圖3所示，人源化的scFv建構的CAR-T細胞表現出對標靶細胞顯著高於FMC63-CAR-T的毒殺能力。實施例 6 Biacore 測定的不同抗體的親和力活性
對實施例1中的部分抗體進行親和力測試，待測抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區組成情况如表2所示。
利用HEK293細胞表現待測抗體，利用Protein A進行純化。使用表面等離子共振技術(SPR)進行測定，抗體固定使用Fc捕獲法。 表2 人源化抗體與嵌合抗體的親和力測試結果
Ligand ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU)
FMC63 1.83E+05 2.38E-04 1.30E-09 80.2
VH7+VL6 1.30E+05 5.92E-04 4.57E-09 93.1
VH8+VL6 1.17E+05 3.83E-04 3.26E-09 78.3
VH8+VL5 1.55E+05 6.02E-04 3.87E-09 91.2
VH9+VL5 1.09E+05 1.86E-04 1.70E-09 81
VH10+VL5 1.18E+05 1.82E-04 1.55E-09 87
VH4+VL6 1.29E+05 1.21E-03 9.31E-09 106.8
VH2+VL6 1.79E+05 1.24E-03 6.93E-09 96.9
VH2+VL7 1.81E+05 1.16E-03 6.39E-09 96.4
結果顯示，與嵌合抗體相比，各待測抗體的親和力略有下降，其中人源化的待測抗體VH9+VL5、VH10+VL5、VH8+VL6的親和力相對較高，與嵌合抗體FMC63無顯著差別。實施例 7 抗體與標靶細胞結合的檢測
檢測實施例1中的部分抗體與CD19陽性標靶細胞SU-DHL-10和Raji的表面結合情况。
分別使用CD19陽性的SU-DHL-10或Raji細胞株，使用不同濃度下的人源化後的抗體對標靶細胞進行結合，結合後使用二抗(螢光標記的anti-Fc抗體)進行染色，清洗殘餘抗體後，使用流式細胞術分析陽性率，繪製抗體結合細胞表面抗原的結合曲綫。
結果如圖4所示，各待測抗體均能與CD19陽性標靶細胞結合，結合能力與FMC63無顯著差別。實施例 8 CAR-T 細胞的製備及其表現情况
利用實施例1中設計的部分抗體，採用實施例3類似的方法，建構人源化的CAR-T細胞。
使用不同的檢測方法(protein L、anti-FMC63抗體、CD19抗原)檢測CAR的表現情况，並對表現率進行比較。
結果如圖5所示，利用各待測抗體建構的CAR-T細胞表面均能檢測到不同程度的CAR表現。實施例 10 RTCA 法檢測 CAR-T 細胞的毒殺
採用實施例4類似的方法，透過即時細胞分析(RTCA)檢測實施例8建構的CAR-T細胞對標靶細胞Hela-CD19的毒殺。
結果如圖6所示，人源化的scFv建構的CAR-T細胞表現出對標靶細胞顯著的毒殺能力，部分人源化CAR-T細胞的毒殺能力優於FMC63 CAR-T細胞。實施例 11 Luciferase 法檢測 CAR-T 細胞的毒殺
採用實施例5類似的方法，檢測實施例8建構的CAR-T細胞對標靶細胞Nalm6及Raji的毒殺。
結果如圖7所示，人源化的scFv建構的CAR-T細胞表現出對標靶細胞顯著高於FMC63-CAR-T的毒殺能力。實施例 12 CAR-T 細胞對標靶細胞 Nalm6 及 Raji 的毒殺過程中 IFNγ 的釋放
在實施例8的標靶細胞毒殺實驗結束後，取最終的上清液使用ELISA法測定其中的細胞激素IFNγ。
結果如圖8所示，部分人源化的scFv建構的CAR-T細胞對標靶細胞Nalm6及Raji産生高位準的INFγ釋放。實施例 13 體內毒殺活性的檢測
選取6-12周大的NOG小鼠，皮下注射3×105 Raji細胞。6天後檢測腫瘤移植物的負荷，分成腫瘤負荷相當的組別，分組後一天分別注射實施例8建構的CAR-T細胞，CAR-T處理後評估小鼠腫瘤體積負荷。每隻小鼠腹腔注射3 mg d-luciferin (Perkin Elmer Life Sciences)，四分鐘後使用Xenogen IVIS Imaging System (Perkin Elmer Life Sciences)拍照，曝光30 s。生物發光的信號按照發出的光子量計算，光子量使用曝光時間、表面積歸一化，最後得出光子量/s/cm2 /球面角度(p/s/cm2 /sr)。
結果顯示，人源化CD19抗體VH9+VL5、VH10+VL5、VH8+VL6改造的CAR-T細胞均可以消除Raji細胞皮下模式小鼠的腫瘤，且可以延長模式小鼠的生存期。其中，人源化CD19抗體VH9+VL5改造的CAR-T細胞效果最好，如圖9所示，可以更强的消除Raji細胞模式小鼠的腫瘤，抗腫瘤效果優於FMC63改造的CAR-T細胞。實施例 14 CAR-T 細胞的非特異性的檢測
Lucierase法檢測實施例8建構的CAR-T細胞的非特異性毒殺情况。採用剔除CD19的Raji-KO19和Nalm6-KO19細胞，以及細胞表面不表現CD19的K562和CCRF細胞作爲標靶細胞，檢測CAR-T細胞對上述細胞的毒殺情况。
結果如圖10所示，人源化CD19抗體改造的CAR-T細胞沒有表現出非特異性毒殺，不會毒殺不表現CD19的細胞。實施例 15 動物體內人源化後的雙 CAR
分別利用人源化的scFv和FMC63，以及BCMA抗體建構同時標靶BCMA及CD19的雙CAR-T細胞，並檢測體內毒殺活性。雙CAR的結構如圖12A所示。BCMA scFv的重鏈可變區如SEQ ID NO: 21所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO: 20所示。
選取6-12周大的NOG小鼠，皮下注射3×105 Raji細胞。6天後檢測腫瘤移植物的負荷，分成腫瘤負荷相當的組別，分組後一天分別注射上述製備的雙CAR-T細胞，CAR-T處理後評估小鼠腫瘤體積負荷。每隻小鼠腹腔注射3 mg d-luciferin (Perkin Elmer Life Sciences)，四分鐘後使用Xenogen IVIS Imaging System (Perkin Elmer Life Sciences)拍照，曝光30 s。生物發光的信號按照發出的光子量計算，光子量使用曝光時間、表面積歸一化，最後得出光子量/s/cm2 /球面角度(p/s/cm2 /sr)。
結果顯示，人源化CD19抗體VH9+VL5、VH10+VL5、VH8+VL6改造的雙特異性CAR-T細胞均取得了比FMC63改造的雙特異性CAR-T (Dual CAR-T)更强的消除Raji細胞模式小鼠腫瘤的能力，抗腫瘤效果基本相當。其中，人源化CD19抗體VH9+VL5改造的雙特異性CAR-T細胞效果最好，如圖11所示，表明其顯著的抗腫瘤功效。實施例 16 人源化的雙 CAR-T 與鼠源雙 CAR-T 毒殺能力比較
分別利用人源化CD19 scFv (VH9+VL5)和FMC63，以及BCMA抗體建構同時標靶BCMA及CD19的雙特異性CAR-T細胞。雙特異性CAR的結構如圖12B和12C所示。BCMA scFv的重鏈可變區如SEQ ID NO: 21所示，輕鏈可變區如SEQ ID NO: 20所示。
採用實施例5類似的方法，使用螢光素酶標記的腫瘤標靶細胞對建構的雙特異性CAR-T細胞進行毒殺能力的檢測。
結果如圖13所示，人源化的scFv建構的雙CAR-T細胞表現出對標靶細胞顯著高於鼠源雙CAR-T細胞的毒殺能力。實施例 17 人源化的通用型雙 CAR-T 的生産及表現測試
利用實施例16中建構的人源化雙CAR-T細胞和鼠源雙CAR-T細胞，並剔除T細胞TRAC及B2M基因，建構人源化的通用CAR-T細胞。
採用實施例3類似的方法，使用不同的檢測方法(anti-FMC63抗體、CD19抗原)檢測CAR的表現情况，並對表現率進行測定，使用anti-B2M及CD3的抗體，對剔除效率進行測定。
結果如圖14所示，通用CAR-T細胞的TRAC及B2M基因被剔除，同時可以表現BCMA及人源化CD19的CAR。實施例 18 人源化的通用型雙 CAR-T 細胞及非通用 CAR-T 細胞的毒殺能力
採用實施例5類似的方法，使用螢光素酶標記的腫瘤標靶細胞對實施例17建構的雙CAR-T細胞進行毒殺能力的檢測。
結果如圖15所示，通用型的雙CAR-T細胞表現出與非通用CAR-T細胞CAR-T細胞類似的毒殺能力。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作爲參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作爲參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞的CAR表現情况。 圖2顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞對Hela-CD19細胞的毒殺(RTCA法)。圖中各編號表示利用相應編號抗體建構的CAR-T細胞，其對應的抗體結構如表1所示。 圖3顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞對Nalm6-luc細胞不同效靶比細胞下的毒殺能力比較(Luciferase法)。圖中各編號表示利用相應編號抗體建構的CAR-T細胞，其對應的抗體結構如表1所示。 圖4顯示了FMC63及人源化FMC63抗體對CD19陽性細胞SU-DHL-10和Raji細胞的結合能力(FACS法)。圖中，FMC63表示嵌合抗體FMC63。 圖5顯示了不同流式測試試劑對FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞表面CAR分子測試出的陽性率。 圖6顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞在不同效靶比條件下對Hela-CD19標靶細胞的毒殺能力(RTCA法，Index80表示的是80%標靶細胞被殺所需的小時數)。 圖7顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞對Nalm6-luc和Raji-luc標靶細胞在不同效靶比條件下毒殺能力的比較。 圖8顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞對Nalm6-luc和Raji-luc標靶細胞在不同效靶比條件下毒殺標靶細胞過程中IFNγ的釋放情况。 圖9顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv改造的CAR-T細胞對Raji模式的NOG小鼠體內藥效對比。 圖10顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv (H9L5)改造的CAR-T細胞對陰性標靶細胞不毒殺(Luciferase法)。 圖11顯示了FMC63及人源化FMC63抗體scFv (H9L5)改造的雙特異CAR-T細胞對Raji模式NOG小鼠體內腫瘤清除能力的比較。 圖12A顯示了實施例15建構的雙CAR的結構。 圖12B顯示了實施例16建構的鼠源雙CAR的結構。 圖12C顯示了實施例16建構的人源化雙CAR的結構。 圖13顯示了人源化的雙CAR-T與鼠源雙CAR-T毒殺能力比較。圖中，NT表示陰性對照，L表示鼠源雙CAR-T細胞，HL表示人源化雙CAR-T細胞。 圖14顯示了人源化後的雙CAR-T細胞的通用CAR-T的生産。圖中，NT表示陰性對照，HL-DKO表示雙剔除的通用型人源化雙CAR-T細胞。 圖15顯示了人源化後的雙CAR-T細胞的常規CAR-T及通用CAR-T的毒殺效果比較。圖中，NT表示陰性對照，HL-DKO表示雙剔除的通用型人源化雙CAR-T細胞，HL表示人源化雙CAR-T細胞。 附圖中，LmHn或HnLm (m,n爲正整數)表示利用具有VLm和VHn的人源化抗體建構的CAR-T細胞，CAR的具體結構中，VL在前，VH在後。除圖4外，各圖中的FMC63表示利用FMC63建構的CAR-T細胞。

Claims (15)

  1. 一種人源化CD19抗體，其特徵在於，所述抗體包括SEQ ID NO: 1-7中任一所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 8-17中任一所示的抗體重鏈可變區。
  2. 如請求項1所述的人源化CD19抗體，其特徵在於，所述抗體包括SEQ ID NO: 5或6所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 15、16或17中任一所示的抗體重鏈可變區。
  3. 如請求項1所述的人源化CD19抗體，其特徵在於，所述抗體包括SEQ ID NO: 5所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 16所示的抗體重鏈可變區；或者， 所述抗體包括SEQ ID NO: 5所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 17所示的抗體重鏈可變區；或者， 所述抗體包括SEQ ID NO: 6所示的抗體輕鏈可變區，和SEQ ID NO: 15所示的抗體重鏈可變區。
  4. 一種標靶CD19的嵌合抗原受體(CAR)，所述CAR的抗原結合結構域(scFv)爲請求項1所述的人源化CD19抗體。
  5. 一種雙特異性CAR，其特徵在於，所述雙特異性CAR標靶CD19和第一標的， 其中，所述雙特異性CAR中的標靶CD19的抗原結合結構域爲請求項1所述的人源化CD19抗體； 並且，所述的第一標的選自下組： CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、Folate receptor α、Folate receptor  β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2、或其組合。
  6. 如請求項5所述的雙特異性CAR，其特徵在於，所述雙特異性CAR的結構如下式III或III’所示： L-VL3 -scFv3-VH3 -H-TM-C-CD3ζ    (III) L-VH3 -scFv3-VL3 -H1-TM-C-CD3ζ   (III’) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； L爲無或訊息胜肽序列； H爲樞紐區； TM爲跨膜結構域； C爲共刺激信號分子； CD3ζ爲源於CD3ζ的細胞溶質信號傳導序列； scFv3爲標靶CD19的抗原結合結構域，VH3 爲抗所述第一標的抗體重鏈可變區，且VL3 爲抗所述第一標的抗體輕鏈可變區； 或者，scFv3爲標靶所述第一標的的抗原結合結構域，VH3 爲抗CD19抗體重鏈可變區，且VL3 爲抗CD19抗體輕鏈可變區。
  7. 如請求項5所述的雙特異性CAR，其特徵在於，所述雙特異性CAR的結構如下式II所示： L-scFv1-I-scFv2-H-TM-C-CD3ζ    (II) 式中， 各“-”獨立地爲連結胜肽或肽鍵； L爲無或訊息胜肽序列； I爲柔性連接子； H爲樞紐區； TM爲跨膜結構域； C爲共刺激信號分子； CD3ζ爲源於CD3ζ的細胞溶質信號傳導序列； scFv1和scFv2兩者中一個爲標靶第一標的的抗原結合結構域，另一個爲標靶CD19的抗原結合結構域。
  8. 如請求項5所述的雙特異性CAR，其特徵在於，所述雙特異性CAR包括標靶第一標的的第一CAR和標靶CD19的第二CAR，所述的第一CAR與第二CAR透過自我切割要素相連接。
  9. 一種多核苷酸，其特徵在於，所述的多核苷酸編碼請求項1所述人源化CD19抗體、請求項4所述的標靶CD19的嵌合抗原受體、或請求項5所述的雙特異性CAR。
  10. 一種工程化的免疫細胞，其特徵在於，所述的免疫細胞染色體中併入有外源的請求項9所述的核酸分子、或表現請求項1所述人源化CD19抗體、請求項4所述的標靶CD19的嵌合抗原受體、或請求項5所述的雙特異性CAR。
  11. 如請求項10所述的工程化的免疫細胞，其特徵在於，所述的工程化的免疫細胞包括通用型CAR-T細胞。
  12. 如請求項11所述的工程化的免疫細胞，其特徵在於，所述通用型CAR-T細胞的TRAC和B2M基因被剔除。
  13. 一種工程化的免疫細胞，其特徵在於，所述免疫細胞含有外源的第一表現匣和第二表現匣，其中所述第一表現匣用於表現標靶第一標的的第一CAR，所述第二表現匣用於表現標靶CD19的第二CAR； 或所述免疫細胞表現所述標靶第一標的的第一CAR和所述標靶CD19的第二CAR； 其中，所述第二CAR中標靶CD19的抗原結合結構域(scFv)爲請求項1所述的人源化CD19抗體； 並且，所述的第一標的選自下組： CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-acetyl GD2、O-acetyl GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRα、TCRβ、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、Frizzled、OX40、Notch-1-4、APRIL、CS1、MAGE3、Claudin 18.2、Folate receptor α、Folate receptor  β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2、或其組合。
  14. 一種製劑，其特徵在於，所述製劑含有請求項1所述人源化CD19抗體、或請求項10或13所述的工程化的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
  15. 一種請求項1所述人源化CD19抗體、請求項4所述的標靶CD19的嵌合抗原受體、或請求項5所述的雙特異性CAR、或請求項10或13所述的工程化的免疫細胞的用途，其特徵在於，用於製備預防和/或治療癌症或腫瘤的藥物或製劑。
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