KR100452954B1

KR100452954B1 - 가변영역 아미노산 치환을 통한 인간 4-1비비분자에 대한결합 특이성이 증가된 변형 인간화 항체의 제조방법

Info

Publication number: KR100452954B1
Application number: KR10-2002-0010231A
Authority: KR
Inventors: 박영우; 윤혜성; 장현숙; 라근배; 유진산; 정종근; 심동섭; 박미정; 김화동; 박정규
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2004-10-14
Also published as: KR20030070716A

Abstract

본 발명은 인간 4-1BB분자에 대해 특이성이 있고, 결합친화도가 높으면서, 4-1BB를 발현하는 활성화된 T세포에 결합력이 우수한 인간화된 단일클론항체의 변형체의 제조방법 및 이로부터 생산된 단일클론항체 및 이를 포함하는 약학조성물 제공에 관한 것으로서, 인간화항체 Hz4B4-2의 중쇄 가변영역 CDR2의 59 내지 61번째 아미노산 잔기들 중 61번째 세린을 아스파라진으로 치환하여 변형된 항체 LB00503 및 변형된 항체 LB00503의 중쇄의 가변영역의 항원결합부위인 CDR2의 오른편 경계에 있는 두 개의 아미노산 잔기인 65, 66번째 글루타민(Q)-글리신(G)을 라이신(K)-세린(S)으로 치환하여 항원결합친화도가 증가된 항체 LB00506들을 포함하는 변형 항체의 제조방법 및 단일클론항체, 이를 포함하는 자가면역치료 조성물을 제공한다.

Description

가변영역 아미노산 치환을 통한 인간 4-1비비분자에 대한 결합 특이성이 증가된 변형 인간화 항체의 제조방법 {Manufacturing Method of Enhancing binding affinity of Humanized antibody specific for human 4-1BB molecule through modifying amino acid substitutions in variable region}

본 발명은 인간 4-1BB분자에 대해 특이성이 있고, 결합친화도가 높으면서, 4-1BB를 발현하는 활성화된 T세포에 결합력이 우수한 변형된 인간화 단일클론항체의 제조방법 및 변형된 인간화 단일 클론 항체 및 이를 포함하는 약학조성물을 제공에 관한 것이다.

현재 30종 이상의 질환이 자가면역이 그 원인이거나 또는 그 병리상태에 자가면역반응이 관여하는 것으로 알려졌다. 상기 질환의 대표적인 예로 류머치스 관절염, 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease), 전신성 홍반성 낭창, 중증 근무력증, 사구체 신염, 악성 재생불량성 빈혈, 갑상선 질환, 고환염 등이 있다. 국내의 경우, 류머치스 관절염은 인구 100명당 한 명의 환자가 발생할 만큼 발병 빈도가 높다. 이러한 여러 자가면역질환들은 B림프구와 같은 작동세포의 기능이 근본적으로 항진되어 있는 경우도 있고, T림프구의 면역조절기능의 장애와 B림프구의 과반응이 복합적으로 작용하기도 한다.

T림프구 또는 B림프구의 증가된 면역반응도는 이론적으로 억제조절될 수 있고, 실제로 메토트렉세이트(methothrexate)와 세포독성제(cytotoxic agent), 방사선 조사, 흉선의 배액법(thoracic duct drainage), 항림프구 글로불린(ALG ; antilimphocyte globulin), 항흉선세포 글로불린(ATG ; antithymocyte globulin)과 같은 항림프구 혈청, 기타 면역 억제제에 의해 면역반응을 억제시키고 있다. 아주 최근에는 제약선진국을 중심으로 단일클론항체를 변형한 키메라 및 인간화항체를 이용하여 여러 단계의 임상실험을 진행하고 있다. 이들 항체의 표적분자들은 크게두가지로 나누어 분류할 수 있는데, 첫째는 림프구의 표면에 발현되는 분자인 CD4, CD5, CD8, IL-2R, CDw52, ICAM-1와 사이토카인인 TNFα와 IL-6을 예로 들 수 있다. 이중 일부는 임상실험 결과가 좋아서 몇 개의 항체는 상품화까지 진행되었다.

최근에 여러 장기의 이식이 활발히 시행되고 있는데, 1960년부터 1980년초까지는 면역억제 치료제로 프레드니손(prednisone)과 아자티오프린(azathioprine)이 사용되었으나, 1983년 미국 FDA에서 처음으로 장기이식에 사이클로스포린(cyclosporine)의 사용이 허가됨으로써 새로운 면역억제요법이 시행되었다. 또한 최근에 항림프구 글로불린과 항흉선세포 글로불린, OKT3와 같은 면역억제제가 추가되어 4개의 면역억제제가 장기이식 후에 발생하는 거부반응의 예방 치료에 사용되고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 면역억제제들의 공통적인 문제점은 면역계통 이외의 여러 다른 세포 혹은 정상적인 면역세포들에도 작용함으로써 심각한 부작용을 피할 수 없다는 점이다. 따라서, 활성화된 면역세포에 대해 특이성을 갖고 면역억제효과가 탁월하면서도 부작용이 없는 면역억제제의 개발이 요구되고 있다.

4-1BB는 면역반응에서 T세포 및 항원표출세포의 표면에 발현되는 악세서리 분자(accessory molecule)의 일종으로서(Goodwin, et al., Eur. J. Immunol., 23, 2631(1993)), 종양괴사인자(TNF) 수용체군의 한 종류로 알려졌다(Mallett and Barclay, Immunol. Today 12, 220-222(1991)). 이러한 4-1BB는 55kDa의 호모다이머(homodimer)로서, ConA, 피토헤마글루티닌(PHA)과 이오노마이신(Ionomycin), 또는 항-CD3 등으로 활성화된 T세포주, 흉선세포 및 성숙 T세포 등에서 다양하게 발현되는 것으로 알려졌다(Kwon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967(1989); Pollok, et et al., J. Immunol. 150, 771-781(1993)). 또한, 4-1BB의 일부가 세포 안쪽에 존재하면서 프로테인 키나제의 한 종류인 p561ck와 결합되어 있는 것으로 보아, 4-1BB를 통하여 세포 밖의 신호가 세포 안으로 전달되는 것으로 추측되고 있다(Kim, et al., J. Immunol., 151, 1255-1262(1993)).

활성화된 인간 말초 T세포의 cDNA 라이브러리로부터 인간 4-1BB를 암호화하는 유전자가 분리되었는데, 이로부터 밝혀진 아미노산 서열은 쥐의 4-1BB와 60% 동일성을 가지며, 특히 세포질 영역에서 높은 보존율을 갖는 것으로 나타났다. 4-1BB 분자의 아미노산 서열을 분석해보면, CD40, CD27, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30 등과 함께 신경성장인자 수용체의 수퍼패밀리에 속하는 것을 알 수 있다(Alderson, et al., Eur. J. Immunol., 24, 2219(1994)). 또한, 쥐(mouse)의 T세포 표면에서 4-1BB와 단일클론항체(MAb)의 가교결합은 항-CD3로 활성화된 T세포의 증식을 몇배 증진시킨다고 보고되었다(Pollok, et al., J. Immunol. 150, 771-781(1993)).

또한, 4-1BB는 마크로파지 및 활성화된 B세포와 같은 항원-표출세포의 표면에 발현되는 결합친화도가 큰 리간드(4-1BBL)에 결합한다(Pollok, K. E. et al., J. Immunol. 150, 771-781(1993); Schwarz, H. et al., Blood, 85, 1043-1052(1995)). 4-1BB와 그의 리간드의 상호작용은 공자극 시그날을 만들어 T세포의 활성화와 성장을 유도한다(Goodwin, R. G. et al., Eur. J. Immunol., 23, 2631-2641(1993); Alderson, M. R. et al., Eur. J. Immunol., 24, 2219-2227(1994); Hurtado, J. C. et al., J. Immunol., 155, 3360-3367(1995); Pollok, K. E. etal., Eur. J. Immunol., 25, 488-494(1995); 및 DeBenedette, M. A. et al., J. Exp. Med., 181, 985-992(1995)). 이러한 관찰결과는 T세포-매개 면역반응의 조절에 있어서 4-1BB가 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다(Ignacio, M. et al., Nat. Med., 3, 682-685(1997)).

본 발명자들은 활성화된 T세포의 표면에 특이하게 발현되는 인간 4-1BB(h4-1BB)분자에 대해 특이성이 있는 마우스의 단일클론항체(MAb) 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주(대한민국 특허 등록 제10-204733-0000), 이들 마우스의 단일클론항체를 인간화한 인간화항체 Hz4B4-1과 Hz4B4-2(대한민국 공개특허공고 제10-2000-034847호)들을 제조한 바 있다. 인간화항체 Hz4B4-1은 인간 4-1BB분자에 대한 결합력을 극대화시키기 위하여 인간화를 적극적으로 하지 않은 항체인 반면, 인간화항체 Hz4B4-2는 인간화항체 Hz4B4-1을 보다 적극적으로 인간화한 항체이다.

본 발명자들은 인간화항체 Hz4B4-2를 상품화하기 위한 과정 중 이 항체의 활성화된 T세포에 대한 결합력이 현저히 저하되는 문제점을 발견하고, 이를 극복하는 과정에서 인간화 정도를 극대화하면서 T세포에 대한 결합력이 우수한 인간화된 단일클론항체를 개발하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 4-1BB분자에 대해 특이성이 있고, 결합친화도가 높으면서, 4-1BB를 발현하는 활성화된 T세포에 결합력이 우수하며, 인간화항체와 유사한 인간화된 단일클론항체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인간화된 단일클론항체를 포함하는, 자가면역질환(예를 들면, 류머치스 관절염, 염증성 장질환 등) 및 장기이식의 치료용 또는 면역억제용 약학조성물을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명에 따라 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 중쇄 가변영역의 인간화 과정을 도식화한 도면이다.

도 2는 본 발명에 따라 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 경쇄 가변영역의 인간화 과정을 도식화한 도면이다.

도 3은 항체 Hz4B4-2, LB00503 및 LB00506의 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동의 결과를 나타낸 사진이다.

도 4는 ELISA 방법에 의한 항체-항원결합친화도를 도시한 그래프이다.

도 5는 흘림세포계측법을 이용하여 항체 LB00506의 활성화된 T세포에 대한 결합력을 도시한 그래프이다.

도 6은 항체 LB00506의 표준 일방 혼합 림프구의 반응 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명에서는 인간 4-1BB분자에 대한 인간화 단일클론항체의 임상적 이용을 위하여 기존 개발된 인간화항체 Hz4B4-2 보다 인간 4-1BB분자에 대한 결합력 및 활성화된 T세포에 대한 결합력이 우수한 개량된 인간화된 단일클론항체가 제공된다.

본 발명자들은 인간화 단일클론항체 Hz4B4-2를 정제하여 분석하는 도중 Hz4B4-2의 중쇄에 당화(glycosylation)되어 있으며, 항원결합친화도가 약화되어 있으며, 활성화시킨 T세포에 대한 결합력도 현저히 약화되어 있는 사실을 발견하였다. 변형과정에서 항체의 가변영역에 당화가 새로 생기면 항체의 항원결합력에 영향을 줄 뿐 아니라, 정제 측면에서도 균일한 항체를 얻기가 어렵다. 따라서 Hz4B4-2의 당화부위를 제거하면서 항원결합친화도 및 T세포에 대한 결합력이 우수한 인간화항체의 개발을 착수하였다.

일차적으로 인간화항체 Hz4B4-2의 중쇄의 59 내지 61번째 아미노산 잔기는 아스파라진(N)-타이로신(Y)-세린(S)으로, 이는 전형적인 당화부위(glycosylation site ; N-X-S)이다. 당화부위를 제거하기 위하여 인간화항체 Hz4B4-2의 중쇄 및 경쇄 발현 벡터인 pANTIBODY(대한민국 특허출원 제 10-2002-2544호, 기탁번호; KCTC 10125BP)를 대상으로 부위지향 뮤타게네시스(site directed mutagensis)를 이용하여 61번째 세린을 인간화하기 이전 버전인 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 가변영역의 61번째 아미노산 잔기인 아스파라진으로 치환하였으며, 그 결과 변형된항체를 수득하였으며, 이를 LB00503으로 명명하였다.

LB00503의 항원결합친화도를 증가시키기 위하여 중쇄의 가변영역의 항원결합부위인 CDR2의 오른편 경계에 있는 두 개의 아미노산 잔기인 65, 66번째 글루타민(Q)-글리신(G)을 인간화하기 이전 버전인 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 CDR2의 동일위치에 있는 라이신(K)-세린(S)으로 치환하였으며, 그 결과 변형된 항체를 LB00506으로 명명하였다. 상기의 두 항체들은 변형전 항체인 Hz4B4-2에서 관찰된 당화가 나타나지 않음을 확인하였으며, LB00506과 LB00503의 인간 4-1BB분자에 대한 친화력은 Hz4B4-2 보다 순차적으로 증가하였으며, LB00506의 경우 Hz4B4-1의 수준에 버금감을 관찰할 수 있었다.

본 발명의 항체들은 활성화된 T세포의 표면에서 발현되는 인간 4-1BB분자를 인식하는 항체이며, 이들 항체들은 인간 4-1BB분자를 매개로 하여 활성화된 T세포의 활성을 억제하는 면역억제제로 사용하게 된다. 따라서 본 발명의 항체들은 인간 4-1BB분자 자체보다는 활성화된 T세포 상의 4-1BB분자와 잘 결합이 되어야 한다. 이와 같이 세포 표면의 분자와 항체의 결합은 보통 FACS 분석기기를 이용한 흘림세포계측법(flow cytometry)라는 방법을 사용하는 것이 일반적인 방법이다. 본 발명자들은 인간화항체 LB00506의 세포표면의 4-1BB분자와의 결합력을 FACS 분석기기를 이용하여 분석한 결과 인간화하기 이전의 항체인 4B4-1-1 결합력과 거의 유사한 사실을 관찰하였다. 이 사실은 인간화과정에서 활성화된 T세포와의 결합력이 거의 영향을 받지않았음을 의미한다.

또한, LB00506의 경우, 자극된 T세포에 의한 면역반응에서 우수한 면역억제반응을 보여주었다. 표준 일방 혼합 림프구 반응(one-way MLR ; one-way mixed lymphocyte reaction)은 유전학적으로 다른 두 사람의 혈액으로부터 채취한 단핵세포구(peripheral blood mononuclear cell, 이하 'PBMC'라 칭한다)를 서로 혼합하여 면역반응을 일으킨다. 이때 면역활성 자극인자로 두 사람 중 한 사람의 단핵세포구는 자극용 세포(stimulator)로 이용하고, 또 다른 사람의 단핵세포구는 반응용 세포로 이용한다. 본 실험에서는 자극용 세포를 반응용 세포와 혼합하기 전에 미토마이신 씨(mitomycin C)를 처리하여 자체증식을 미리 방지하였다. 이 시험은 T세포가 서로 다른 세포의 혼합에 의한 면역반응에 의해 세포증식이 일어나는 것을 확인할 수 있는 널리 알려진 시험방법이며, 실제 장기이식 수술시 얼어나는 면역거부반응과 유사한 원리를 가진 시험이다. 세포증식정도는 세포수의 증가를 나타내는 지표(DNA 합성증가)인³H-티미딘(³H-thymidine)의 DNA로의 삽입정도를 측정함으로써 정량화한다. 본 실험에서는 혼합 림프구 반응을 이용하여, 항 4-1BB 인간화항체인 LB00506이 T세포의 증식을 억제하는 효과가 있는지를 확인하는 것이 목적이며, 양성 대조 물질로 사이클로스포린 A(cyclosporin A ; 시그마사 ; 1㎍/㎖)을 사용하였고, 음성 대조 물질로는 4-1BB와 상관이 없는 인간 IgG를 사용하였다.

본 실험의 결과에 따르면 LB00506과 Hz4B4-1 모두 0.1, 1, 10㎍/㎖의 농도에서 혼합 림프구 반응을 효과적으로 저해하였으며, 따라서 LB00506이나 Hz4B4-1과 같은 항 4-1BB 항체가 장기이식수술에서 생기는 거부반응을 억제하는 치료제로 이용될 수 있으며, 또한 과도한 면역반응에 기인한 류머치스 관절염 등과 같은 여러자가 면역질환에 대한 면역억제제로 이용가치가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 LB00506의 부위지향 뮤타게네시스를 위해 사용된 인간화항체 경쇄 및 중쇄의 유전자를 가지고 있는 발현 플라스미드 pANTIBODY(대한민국 특허출원 제 10-2002-2544호, KCTC 10152BP)는 2001년 12월 28일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁되었고, 또한, 본 발명의 일부인 인간화항체 LB00506을 생산하기 위한 발현 플라스미드 pANTIBODY-VER6를 포함하는 세포주 LB506-31-56(CHO cell line)은 2002년 1월 31일자로 동 유전자은행에 기탁하였다.

본 발명의 인간화항체는 인간 4-1BB에 대한 결합친화도가 높으면서 인간의 항체와 유사한 서열을 가지므로 자가면역질환의 치료제 또는 면역억제제(예를 들면, 장기이식시 거부반응 억제)로서 부작용없이 효과적으로 사용될 수 있다.

이러한 목적으로, 본 발명의 인간화항체를 유효성분으로서 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 자가면역질환의 치료용 또는 면역억제용 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 경구투여용 제제 또는 비경구투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구투여하거나 또는 경구투여할 수 있으며, 하루에 체중 1㎏ 당 1 내지 100㎎의 양을 1 내지 수회 나누어 투여할 수 있다. 특정환자에 대한 투여용량 수준은 사용될 특정항체, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명을 실시예에 의거하여 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 ; Hz4B4-1 인간화항체의 고안

단계 1 ; 마우스 단일클론항체 4B4-1-1, 인간화항체 Hz4B4-1 및 인간화항체 Hz4B4-2의 비교

본 발명자들은 인간화항체 Hz4B4-2를 상품화하기 위한 과정 중 이 항체의 활성화된 T세포에 대한 결합력이 현저히 저하되는 사실을 관찰하였다. 이러한 문제점을 밝히기 위하여 마우스 단일클론항체 4B4-1-1, 인간화항체 Hz4B4-1 및 인간화항체 Hz4B4-2를 면밀히 비교, 검토하였다. 이들의 비교는 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1과 도 2는 각각 인간 4-1BB분자에 대한 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 중쇄의 가변영역(108 아미노산 잔기) 및 경쇄의 가변영역(109 아미노산 잔기)을 인간화시킨 것을 도식화시킨 것이다. 마우스 단일클론항체 4B4-1-1(대한민국 공개특허공보 제1996-37064호)의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 인간화하기 위해 사용된 인간 항체 가변영역의 중쇄 유전자 M17750(Dersimonian, H. et al., J. Immunol., 139, 2496-2501(1987))과 경쇄 유전자 X82934(Esposito, G. et al., Arch. Virol., 142, 601-610(1997))를 마우스 단일클론항체 4B4-1-1 및 이 항체의 인간화항체들과의 아미노산 잔기의 서열을 비교하였다. 인간 항체인 M17750과 X82934의 아미노산 잔기를 흰 박스로 표기하였으며, 검은 박스는 마우스 단일클론항체 4B4-1-1에 독특한 아미노산 잔기를 나타낸다. 항원과의 결합에 중요한 역할을 하는 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3로 표시하였다. 도 1과 도 2의 'm', '1' 및 '2'는 각각 마우스 단일클론항체 4B4-1-1, 인간화항체 Hz4B4-1 및 인간화항체 Hz4B4-2의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 나타낸다.

도 1과 도 2에서 중쇄 및 경쇄의 아미노산 잔기들을 서로 비교한 결과, 본 발명자들은 두 가지의 문제점을 발견하였다. 첫번째 문제는 Hz4B4-2의 중쇄의 CDR2 부분에서 원래는 없던 당화 부위(NYS)가 새로이 생성되었다는 점이고(서열목록 서열정보번호 4 참조), 두번째 문제는 중쇄의 CDR2 부분의 오른쪽 경계부분의 아미노산이 과도하게 인간항체의 아미노산 잔기로 치환되어 있다는 점이다.

실시예 2 ; Hz4B4-2 중쇄의 가변영역의 당화부위를 제거한 항체 LB00503의 제조 및 분석

단계 1 : 인간화 단일클론항체 Hz4B4-2의 중쇄 가변영역 CDR2 부분에의 당화가 되어있는지를 검사하기 위하여 정제된 항체를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 인간화항체 Hz4B4-1은 예상대로 약 55kDa의 중쇄와 약 25kDa의 경쇄가 관찰되었다. 반면, 인간화항체 Hz4B4-2는 약 55kDa의 중쇄를 나타내는 위치의 밴드가 이중밴드로 관찰되었다. 항체 Hz4B4-1의 중쇄를 나타내는 밴드가 항체 Hz4B4-2에서 관찰된 이중밴드 중 아래 밴드와 위치가 동일하다. 이러한 관찰은 항체 Hz4B4-2의 중쇄의 일부가 당화가 되어 분자량이 약간 커진 것으로 설명된다(도 3 참조).

단계 2 : 부위지향 뮤타게네시스에 의한 당화부위의 제거

일차적으로 인간화항체 Hz4B4-2의 중쇄의 59 내지 61번째 아미노산 잔기(서열정보번호 4의 NYS, 서열정보번호 5의 NYN, 서열정보번호 6의 NYN)가 아스파라진(N)-타이로신(Y)-세린(S)으로 이는 전형적인 당화부위(glycosylation site ; N-X-S)이다. 당화부위를 제거하기 위하여 부위지향 뮤타게네시스를 이용하여 61번째 세린(S)을 인간화하기 이전 버전인 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 가변영역의 61번째 아미노산 잔기인 아스파라진(N)으로 치환하였으며, 그 결과 변형된 항체를 LB00503으로 명명하였다(서열목록 서열정보번호 5 참조). 부위지향 뮤타게네시스는 인간화항체 Hz4B4-2 경쇄와 중쇄 단백질을 코딩하는 유전자를 동시에 함유하고 있는 발현벡터 pANTIBODY(대한민국 특허출원 제 10-2002-2544호, 기탁번호 : KCTC 10152BP)를 주형으로 하여 프라이머 VER3 (5'-ACTAACTACAACCAGAAGTTC-3')을 이용하여 뮤타게네시스(mutagenesis)를 실시하였다. 부위지향 뮤타게네시스는 미합중국 소재(주소 ; 2800 Woods Hollow Road, Medison, WI, USA) 프로메가사(Promega Inc.)의 상표 진에디터(GeneEditor^TMin vitro site-directed mutagenesis kit(cat # Q9280)을 이용하였으며, 당사에서 추천하는 방법을 따랐으며, 변형된 플라스미드는 pANTIBODY-VER3로 명명하였다.

단계 3 : 항체 LB00503을 발현하는 세포주 제조

항체단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 개발하기 위하여 우선 DHFR 결핍 CHO세포(ATCC CRL 9096)를 형질 감염 실험 전날 36㎜ 플레이트에 12배 정도 희석 분양한 후, 37℃, 이산화탄소 배양기에서 배양시켰다. 세포가 플레이트에 70내지 80% 정도 성장한 것을 확인한 후, 리포펙타민 플러스(Lipofectamine plus, Gibco BRL Cat. 10964-013/11514-015)로 플라스미드 pANTIBODY DNA를 세포 내로 형질전환시켰다. 이때 배지로는 10% 송아지 혈청, 하이포산틴(hypoxantine)과 티미딘(thymidine)이 각각 10㎍/㎖ 함유된 IMDM 배지(Isocove's modified Dulbecco's dedia, Gibco BRL Cat. 12200-069)를 사용하였다. 이틀 후에 하이포산틴과 티미딘이 없고 투석된 송아지 혈청이 10% Geneticin(Gibco BRL Cat. 11811-031)이 800㎍/㎖ 농도로 함유된 알파배지(complete alpha medium ; MEM(minimum essential medium), Gibco BRL Cat. 12000-022)로 교체하여 형질전환된 CHO 세포만이 성장할 수 있도록 선택배양을 하였다. 선택배양 시작일로부터 10 내지 14일이 경과된 후부터 살아남은 세포의 콜로니가 형성되기 시작하였다. 이중 성장속도가 양호한 세포들이 직경 100㎜ 배양접시당 107 이상될 때까지 배양한 후 일부를 동결 보관하고 일부는 유전자 증폭과정을 실행하였다.

형질전환된 유전자의 증폭은 DHFR의 저해제인 메토트렉세이트(MTX ; methotrexate)를 선택배지에 첨가해주고 세포를 배양하면서 그 농도를 단계적으로 증가시켜서 DHFR 유전자와 함께 항체 유전자의 증폭을 유도함으로써 수행하였다. 메토트렉세이트의 농도는 초기에는 30nM에서 시작하여 약 3배씩 증가시켜 나가는데 각 메토트렉세이트의 농도에서 최소한 2 내지 3회 이상 단계배양을 실시해서 정상적인 CHO세포의 성장과 성장속도를 보일 때 다음 단계의 메토트렉세이트로 그 농도를 증가시켰다. 특히 1μM의 메토트렉세이트 농도에서 성장속도가 양호한 세포주를 획득하였다.

단계 4 : 항체 LB00503의 순수분리 및 분석

단계 3에서 제조한 항체 LB00503을 발현하는 세포주를 플라스크 T175에서 무혈청배지(CHO-S-SFMII, Gibco사 제품)로 37℃, 5% 이산화탄소 조건을 유지하면서 배양한 다음, 이 배양액을 프로틴 G-세파로즈 칼럼(Protein-GSepharose, 파마시아(Pharmacia)사 제품)을 통과시켰다. 칼럼에 결합된 항체를 0.1M 글라이신 용액(pH 2.7)으로 용출시킨 후, 1M 트리스 용액(pH 9.0)으로 중화시키고, PBS완충용액(pH 7.0)에서 투석시켰다. 정제된 항체를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동(SDS-PAGE)하였다. 그 결과, 약 55kDa의 중쇄와 약 25kDa의 경쇄가 관찰되었다. 특히 중쇄에 해당하는 약 55kDa의 밴드는 단일밴드로 관찰이 되었다. 이는 Hz4B4-2의 중쇄에서 관찰된 이중밴드는 당화에 의한 것임을 나타낸다.

단계 5 : 항체 LB00503과 항체 Hz4B4-2의 항원결합친화도 비교

순수분리된 항체 LB00503과 항체 Hz4B4-2의 항원결합친화도를 비교하기 위해 GST-4-1BB를 항원으로 하여 엘리사(ELISA) 방법(Park et al., Hybridoma, 15, 435-441(1996))을 이용하여 비교하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 당화부위가 제거된 항체 LB00503의 항원 4-1BB에 대한 친화력이 당화된 항체 Hz4B4-2에 비해 증진됨을 관찰하였다. 이러한 관찰은 항체 Hz4B4-2 중쇄의 가변영역의 CDR2 부위에 당화는 항원 4-1BB에 대한 결합력을 방해한다고 볼 수 있다.

실시예 3 ; 항체 LB00503 보다 항원에 대한 친화력이 월등한 항체 LB00506의 제조 및 분석

본 발명자들이 위에서 언급한 것처럼 항체 Hz4B4-2 중쇄의 CDR2 부분의 오른쪽 경계부분의 아미노산이 과도하게 변형, 치환되어 있다. LB00503의 항원결합친화도를 증가시키기 위하여 중쇄의 가변영역의 항원결합부위인 CDR2의 오른편 경계에 있는 두 개의 아미노산 잔기인 글루타민(Q)-글리신(G)을 인간화하기 이전 버전인 마우스 단일클론항체 4B4-1-1의 CDR2의 동일위치에 있는 라이신(K)-세린(S)으로 치환하였으며, 그 결과 변형된 항체를 LB00506으로 명명하였다.

단계 1 : 부위지향 뮤타게네시스

발현벡터 pANTIBODY-VER3을 주형으로 하여 프라이머 VER6(5'-GAGAAGTTCAAGTCACGCGTGACA-3')을 이용하여 상기 실시예2와 동일한 방법으로 뮤타게네시스를 실시하였다. 변형된 플라스미드를 pANTIBODY-VER6라 명명하였다.

단계 2 : 항체 LB00506을 발현하는 세포주의 제조

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 항체 LB00506을 발현하는 세포주 LB506-31-56(CHO cell line)을 제조하였으며, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(KCTC 10165BP).

단계 3 : 항체 LB00506의 순수분리 및 분석

실시예 2와 동일한 방법으로 항체 LB00506을 순수 분리 정제하였다. 정제된 항체를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동(SDS-PAGE)하였으며, 그 결과 약 55kDa의 중쇄와 약 25kDa의 경쇄가 관찰되었다. 특히 중쇄에 해당하는 약 55kDa의 밴드는 단일밴드로 관찰되었다(도 3 참조).

단계 4 : 항체 LB00506의 항원결합친화도

순수분리된 항체 LB00506과 항체 Hz4B4-2의 항원결합친화도를 비교하기 위해GST-4-1BB를 항원으로 하여 엘리사(ELISA) 방법을 이용하여 비교하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. LB00506과 LB00503의 인간 4-1BB분자에 대한 친화력은 Hz4B4-2의 수준에 버금감을 관찰할 수 있었다.

실시예 4 ; 흘림세포계측법(flow cytometry)을 이용한 항체 LB00506의 활성화된 T세포에 대한 결합력의 검사

단계 1 : CEM T세포의 활성화

CEM 세포를 2 ~ 3 * 10⁵내지는 1 ~ 2 * 10⁶으로 유지하며 보통 2 내지 3일마다 새로운 배지를 첨가해준다. 배지로는 1.5g/ℓ 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 4.5g/ℓ 글루코스(glucose), 10mM HEPES, 1.0mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 2mM 엘-글루타민(L-glutamine), 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum)이 들어있는 RPMI 1640 배지(media)를 사용한다. CEM 세포의 자극(stimulation)을 위해서는 1 * 10⁶에 PMA(10ng/㎖)와 아이오노마이신(ionomycin)(1㎍)을 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 자극된 CEM 세포를 FACS 세척용액(PBS, 10mM HEPES, 2% FBS, 0.1% 소듐 아지드(sodium azide))로 세척한 후, 한 시료당 1 * 10⁶을 분주하였다. 여기에 검사할 항체를 각각 50㎍/㎖로 만들어 100㎕씩 처리하고, 4℃에서 40분 동안 반응시켰다. 반응 후, FACS 세척용액으로 재차 세척한 후, FITC 형광염색약과 결합된 항-인간 IgG(FITC(fluorescein isothiocyanate)-conjugated anti-human IgG)를 처리하고, 4℃에서 40분 동안 방치시켰다. FACS 세척용액으로 한번 더 세척하였다.

단계 2 : 흘림세포계측법

시료를 측정하기 전에 FACSort(Becton Dickinson사, 미국)를 실험 대기상태로 준비하여 두고, 준비된 세포와 항체와의 결합정도를 측정하기 위하여 상표명 '셀 퀘스트(Cell Quest)'(Becton Dickinson사, 미국) 프로그램을 구동시킨 후, 돗트플롯(dot plot)을 설정하고, 플롯패널(plot panel)에서 플롯소스(plot source)를 획득(acquisition) 상태로 지정한다. 또한 선택(option)에서 세포를 10,000건(event) 만 셀 수 있도록 지정한다. 히스토그램 플롯(histogram plot)에서도 플롯패널에서 히스토그램 소스(histogram source)를 획득 상태로 하고 변수(parameter)를 우선 FL1-H 500으로 지정한다. 히스토그램 플롯에서 CHO(dhfr-) 세포의 피크(peak)가 10⁰내지 10¹사이에 오도록 Fl1-H를 다시 조정한다. 돗트플롯의 FCS와 SSC축을 선형모드(linear mode)로 두고 분석하는 동안 FSC값을 500 전후에서 세부 조정하고, SSC값이 큰 세포 즉, 죽은 세포들이 많을 경우 살아있는 세포들만 선택(gating)하여 데이타를 얻는다. 음성 대조의 피크가 정해지면 항체(4B4-1-1과 LB00506)를 처리한 시료를 넣고 측정하였다. 히스토그램 플롯에서의 X축은 FL1으로 형광정도를 나타내며 Y축은 그에 해당하는 세포수를 의미한다.

인간화항체 LB00506의 세포표면의 4-1BB분자와의 결합력을 FACS분석기기를 이용하여 분석한 결과, 인간화하기 이전의 항체인 4B4-1-1 결합력과 거의 유사한 사실을 관찰하였다(도 5 참조). 이 사실은 인간화과정에서 활성화된 T세포와의 결합력이 거의 영향을 받지 않았음을 의미한다.

실시예 5 ; 인간화항체 LB00506의 면역억제능 검사

단계 1 : PBMC 준비

소듐 시트레이트로 처리된 혈액(sodium citrate : blood = 1 : 9)을 PBS에 같은 비율로 희석하였다. PBS로 희석된 혈액과 같은 부피의 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)용액(Sigma사)을 먼저 50㎖ 원추형 시험관(conical tube)에 넣은 후, 천천히 위의 희석된 혈액을 첨가했다. 2000rpm(900 * g)에서 30분 동안 원심분리한 뒤, 펠렛을 취하여 멸균한 다른 시험관으로 옮겼다. HBSS로 두번 세척한 후 완전(complete) RPMI로 재현탁시켰다(1 * 10⁶세포/㎖).

단계 2 : 표준 일방 혼합 림프구 반응(standard one-way MLR)

자극세포로 사용될 PBMC를 미토마이신 씨(mitomycin C)로 처리하였다. 이때 미토마이신 씨의 최종농도는 25㎍/㎖이 되게 하였고, 37℃에서 30분간 배양한 뒤, PBS로 세번 세척하였다. 반응세포로 사용될 PBMC는 1 * 10⁶세포/㎖로 배양배지(complete RPMI 배지)에 준비하였다. 각각의 자극세포와 반응세포의 혼합액을 96-웰 U bottom plate에 웰당 50㎕씩 첨가한 후 0.1㎍/㎕, 1㎍/㎕, 10㎍/㎕의 농도로 희석시킨 항체를 웰당 100㎕씩 첨가하였다. 음성대조로 인간 IgG를 사용하였다. 위와같이 준비한 플레이트를 37℃에서 72시간 배양시킨 후, 웰당 50μCi/㎖³H-티미딘(Amersham)을 20㎕씩 넣고 16시간 더 배양시켰다. 배양한 세포를 96웰 세포 수확기(harvester ; 팩커드사(Packard))에서 유니필터-96 지에프/비(Unifilter-96 GF/B ) 필터 플레이트(GF/B 필터가 붙어있는 96-웰 플레이트 ; 팩커드사)를 사용하여 수확하고 상등액이 남아있는 잔여³H-티미딘을 제거하였다. 유니필터를 건조기에서 건조시킨 다음, 바닥면에 봉합용 접착테이프를 붙이고, 신틸레이션액(scintillation fluid)를 웰당 35㎕씩 넣었다. 상품명 탑실-에스(TopSeal^TM-S)로 유니필터를 봉한 뒤, 마이크로플레이트 섬광계수기(microplate scintillation counter ; 상품명 탑카운트(TopCount) ; 팩커드사)로 측정하였다.

1㎕/㎖의 동일한 농도에서 각 항체들의 억제효과를 비교해 볼 때, LB00506의 경우는 87.6%, LB00501의 경우는 62%, IgG의 경우는 0% 이므로, LB00506은 LB00501보다 면역억제능이 우수하고, 음성대조인 인간 IgG는 효과가 없는 것으로 보아 LB00506의 면역억제효과는 4-1BB를 발현하는 T세포에 특이적으로 생각된다. LB00506이 사이클로스포린 에이(cyclosporine A)에 비해서는 면역억제능이 약간 떨어지는 것으로 보이나, 10㎕/㎖에서의 LB00506의 저해효과는 88.5%로 사이클로스포린 에이의 효과와 통계적으로 비교시 유의성 있는 차이는 없다. 또한 사이클로스포린 에이는 면역억제효과는 뛰어나나, 여러 장기에 비특이적으로 작용하여 신장독성 및 면역독성 등이 알려져 있으므로, T세포에만 선택적으로 작용할 LB00506의 선택적인 면역억제능이 보다 큰 의미가 있다고 할 수 있다(도 6 참조).

따라서, 본 발명에 의하면 인간 4-1BB분자에 대해 특이성이 있고, 결합친화도가 높으면서, 4-1BB를 발현하는 활성화된 T세포에 결합력이 우수하며, 인간화항체와 유사한 인간화된 단일클론항체들 LB00503 및 LB00506 및 이를 포함하는 약학조성물을 제공하는 효과가 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

<110> SUNG, Jae kap; LG CHEM INVESTMENT, LTD. <120> Manufacturing Method of Enhancing binding affinity of Humanized a ntibody specific for human 4-1BB molecule through modifying amino acid substitutions in variable region <130> NK-0281 <160> 6 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence in the CDR2 site of the heavy chain variable region of humanized antibody N17750 <400> 1 Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence in the CDR2 site of the heavy chain variable region of humanized antibody 4B4-1-1 <400> 2 Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequences in the CDR2 site of the heavy chain variable reqion of hyminized antibody Hz4B4-1 <400> 3 Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence in the CDR2 site of the heavy chain variable region of hymanized antibody Hz4B4-2 <400> 4 Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence in the CDR2 site of the heavy chain variable region of humanized antibody LB00503 <400> 5 Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence in the CDR2 site of the heavy chain variable region of hymanized antibody LB00506 <400> 6 Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser

Claims

인간 4-1BB 분자에 대한 특이성이 증가된 변형 항체의 제조 방법에 있어서,

인간화항체 Hz4B4-2의 (1) 중쇄의 가변영역 CDR2의 59 내지 61번째 아미노산 잔기들 중 61번째 세린을 아스파라진으로 치환하거나; (2) 중쇄의 가변영역의 항원결합부위인 CDR2의 오른편 경계에 있는 두 개의 아미노산 잔기인 65, 66번째 위치의 글루타민(Q)-글리신(G)을 라이신(K)-세린(S)으로 치환하거나; 또는 상기 (1), (2)의 변형을 동시에 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 4-1BB 분자에 대한 특이성이 증가된 변형 항체의 제조 방법.
제 1항에 있어서,

아미노산 잔기의 변형은 인간 4-1BB분자에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화항체 Hz4B4-2를 코딩하는 염기서열이 클로닝된 발현벡터를 주형으로 하여 부위지향 뮤타제네시스(site-directed mutagenesis)를 이용하고, 상기 변형된 발현벡터의 세포 내 발현을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 인간 4-1BB 분자에 대한 특이성이 증가된 변형 항체의 제조 방법.
삭제
제 2항에 있어서,

발현벡터의 세포 내 발현은 포유동물세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 인간 4-1BB분자에 대한 특이성이 증가된 변형 항체의 제조 방법.
제2항의 변형된 발현벡터는 중쇄의 가변영역 CDR2의 59 내지 61번째 아미노산 잔기들 중 61번째 세린을 아스파라진으로 치환되고, 중쇄의 가변영역의 항원결합부위인 CDR2의 오른편 경계에 있는 두 개의 아미노산 잔기인 65, 66번째 위치의 글루타민(Q)-글리신(G)이 라이신(K)-세린(S)으로 치환된 것을 특징으로 하는 pANTIBODY-VER6 (기탁번호 KCTC 10165BP).
제 5항의 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 세포주 LB506-31-56 (기탁번호 KCTC 10165BP).
제 6항의 세포주로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 변형된 항체 LB00506.
유효성분으로서 제 7항의 인간화항체 및 약제학적으로 수용가능한 부형제 등을 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료용 또는 면역 억제용 약학조성물.