KR19990067370A - 사람 gp３９에 대한 인간화된 항체, 이들을 함유하는조성물 및 이들의 치료학적 용도 - Google Patents

사람 gp３９에 대한 인간화된 항체, 이들을 함유하는조성물 및 이들의 치료학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 gp39에 결합하는 인간화된 항체 및 치료학적 제제로서의 이들의 사용법에 관한 것이다. 이러한 인간화된 항체는 특히 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

Description

사람 ｇｐ３９에 대한 인간화된 항체, 이들을 함유하는 조성물 및 이들의 치료학적 용도
면역 시스템은 이종 항원에 대한 두 형태의 항원 특이적 반응을 발생시킬 수 있다. 세포 중개 면역은 T 림프구에 의해 중개되는 면역 시스템의 이펙터(effector) 작용을 설명하는 데 이용되는 용어이다. 체액성 면역은 B 림프구에 의한 항원 특이적 항체의 생성을 설명하는 데 이용되는 용어이다. 대부분의 항원에 대한 체액성 면역의 발생은 항체 생산 B 림프구 뿐만 아니라 헬퍼(helper) T(이후에는 Th로 언급됨) 림프구도 필요하다. [참고 문헌 : Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:18-25 (1971); Claman and Chaperon, Transplant Rev., 1:92-119 (1969); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70:2624-2629 (1973); Raff et al., Nature, 226;1257-1260 (1970)]. 특정 신호 또는 "헬프(help)"는 흉성 의존(이후에는 TD로 언급됨) 항원의 자극에 대한 반응에서 Th 세포에 의해 제공된다. 일부 B 림프구 헬프는 Th 세포(예를 들어, IL-4 및 IL-5와 같은 림포카인)에 의해 방출된 가용성 분자에 의해 중개되는 동안, 또한 B 세포의 활성화는 B 세포와 T 세포 사이의 접촉 의존 상호작용을 필요로 한다. [참고 문헌 : Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1765 (1989)]. 이것은 B 세포 활성화는 B 세포상의 세포 표면 분자와 Th 세포사이의 필수적인 상호작용을 수반함을 나타낸다. 또한, 이러한 상호작용은 활성화된 T 세포의 단리된 원형질 막이 B 세포 활성화에 필요한 헬퍼 작용을 제공할 수 있다는 지식에 의해 지지된다. [참고 문헌 : Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146:1118-1124 (1991)].
또한, 접촉 의존 과정에서, "T 세포 헬퍼 작용"이라는 용어, 즉 CD4+T 림프구가 B 림프구의 활성화 및 분화를 지시함으로써, 항체 분자의 특이성, 분비 및 아아이소타입 코드화 작용을 조절하여 체액성 면역 반응을 조정한다는 것은 공지되어 있다. [참고 문헌 : Mitchell et al., J. Exp. Med., 128:821 (1968); Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:68 (1971); White et al., J. Exp. Med., 14:664 (1978); Reinherz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:4061 (1979); Janeway et al., Innunol. Rev., 101:39 (1988); O'Brien et al. J. Innunol., 141:3335 (1988); Rahetulla et al., Nature, 353:180 (1991); and Grusby et al., Science, 253:1417 (1991)].
T 세포가 B 세포를 분화시키는 것은 돕는 과정은 두 개의 다른 단계로 분활되어 있다; 유도 단계 및 이펙터 단계[참고 문헌: Vitetta et al., Adv. Innunol., 45:1 (1989); Noelle et al., Immunol. Today, 11:361 (1990)]. 유도 단계에서, 정지기 T 세포는 항원이 프라임(prime)된 B 세포에 접촉하고, 이러한 결합은 클로노타입 T 세포 수용체(TCR)-CD4 복합체가 B 세포상의 Ia/Ag 복합체와 상호 작용하게 한다[참고 문헌: Janeway et al., Innunol. Rev., 101:39 (1988); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 70:2624 (1973); Zinkernagel, Adv. Exp. Med., 66:527 (1976); Sprent, J. Exp. Med., 147:1159 (1978); Sprent, Immunol. Rev., 42:158 (1978); Jones et al., Nature, 292:547 (1981); Julius et al. Immunol., 126:1575 (1981); and Rogozinski et al., J. Immunol., 126:735 (1984)]. Ia/Ag의 TCR/CD4 인지는 안정한 T-B 동정 쌍 및 이방향성 T 및 B 세포 활성화의 형성을 유도한다[참고 문헌: Sanders et al., J. Immunol., 137:2395 (1986); Snow et al., J. Immunol., 140:367 (1988); Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745 (1989); and Kupfer et al., Annu. Rev. Immunol., 7:309 (1987)]. 이펙터 단계에서, 활성화된 T 세포는 림포카인의 분비[참고 문헌 : Thompson et al., J. Immunol., 134:369 (1985)] 및 접촉 의존 자극[참고 문헌 : Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Clement et al., J. Immunol., 140:3736 (1984); Crow et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol. 140:3736 (1988); Jover et al., Clin. Immunol. Immun., 53:90 (1989); Whalen et al., J. Immunol., 141:2230 (1988); Pollok et al., J. Immunol., 146:1633 (1991); and Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745 (1990)]함으로써 B 세포 분화를 유도하며, 상기 두 사항은 작은 정지 B 세포를 Ig 분비 세포로의 최종적인 분화를 유도하기 위해 T 세포에 필요하다[참고 문헌 : Clement et al., J. Immunol., 132:740 (1984); Martinez et al., Nature, 290:60 (1981); and Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:1612 (1980)].
T 세포 헬프의 유도 단계는 Ag에 의존적이고, MHC에 제한적임에도 불구하고[참고 문헌 : Janeway et al., Immun. Rev., 101:34 (1988); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 10:2624 (1973); Zinkernagle, Adv. Exp. Med. Biol., 66:527 (1976)], T 헬퍼 세포 작용의 이펙터 단계는 Ag에 독립적이고, MHC에 비제한적이다[참고 문헌 : Clement et al., J. Immunol., 132:740 (1984); Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736 (1988); Whalen et al., J. Immunol., 143:1715 (1988)]. 추가적인 대조 특성은 T 세포 헬프의 유도 단계가 종종 CD4 분자를 필요로 하고, 안티-CD4 mAb에 의해 억제되는 반면[참고 문헌 : Rogozinski et al., J.Immunol., 126:735 (1984)], 헬퍼 이펙터 작용은 CD4 분자를 필요로 하지 않고[참고 문헌 : Friedman et al., Cell Immunol., 103:105 (1984)], 안티-CD4 mAb에 의해 억제되지 않는다[참고 문헌 : Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736 (1988); Whalen et al., J.Immunol., 143:1745 (1988); and Tohma et al., J. Immunol., 146:2547 (1991)]. 비특이적 헬퍼 작용은 항원 특이적, 동종 쌍을 갖는 T-B 세포 상호작용의 국부적 성질에 의해 특이적 B 세포 표적에 집중되는 것으로 여겨진다[참고 문헌 : Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745 (1989); Kupfer et al., J. Exp. Med., 165:1565 (1987) and Poo et al., Nature, 332:378 (1988)].
최종 B 세포 분화가 T 세포 접촉 및 T 세포로부터의 림포카인 중개 자극 둘 모두를 필요로함에도 불구하고, B 세포 분화의 중간 단계는 분비되는 인자가 없이도 활성화된 T 세포 표면에 의해 유도될 수 있다[참고 문헌 : Crow et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Sekita et al., Eur. J. Immunol., 18:1405 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025 (1990); Noelle et al., FASEB J, 5:2770 (1991)]. B 세포상의 이러한 중개 영향은 표면 CD23 발현의 유도[참고 문헌 : Crow et al., Cell Immunol., 121:94 (1989)], 세포 순환 진행과 관련된 효소[참고 문헌 : Pollok et al., J. Immunol., 146:1633 (1991)] 및 림포카인에 대한 반응성[참고 문헌 : Noelle et al., FASEB J. 5:2770 (1989)]을 포함한다. B 세포 활성화를 통제하는 활성화 유도된 T 세포 표면 분자의 일부가 최근 확인되었다. 또한, 작용 연구는 B 세포 활성화를 통제하는 활성화 유도된 T 세포 표묜 분자의 일부 특성을 특징으로 한다. 첫 번째, T 세포는 활성화에 따른 B 세포를 자극할 수 있는 능력을 획득하였다[참고 문헌 : Bartlett et al., J. Immunol., 145:3956 (1990) and Tohma et al., J. Immunol., 146:2544 (1991)]. 둘 째, 활성화된 T 세포의 표면과 관련된 B 세포 자극 활성은 파라포름알데히드 고정된 세포상[참고 문헌 : Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Cros et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Pollok et al., J. Immunol., 146:1633 (1991); Tohma et al., J.Immunol., 146:2544 (1991); and Kubota et al., Immunol., 72:40 (1991)] 및 정제된 막 단편[참고 문헌 : Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025 (1990) and Martinez et al., Nature, 290:60 (1981)]. 셋 째, B 세포 자극 활성은 프로테아제 처리에 민감하다[참고 문헌 : Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Sekita et al., Eur. J. Immunol., 18:1405 (1988); and Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025 (1990)]. 넷 째, T 세포 활성화에 따른 이러한 표면 활성적인 구조를 획득하는 과정은 시클로헥시마이드(cycloheximide)에 의해 억제된다[참고 문헌 : Tohma et al., J. Immunol., 196:2349 (1991) and Hodgkin et al., J. Immunol., 195:2025 (1990)].
세포 표면 분자, 즉 CD40는 B 림프구가 항체에 의해 가교결합될 경우, B 세포 증식을 유도하는 비성숙 및 성숙 B 림프구상에서 확인되었다[참고 문헌 : Valle et al., Eur. J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140:142501430 (1988); Gruder et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989)].
CD40은 분자적으로 클로닝되고, 이를 특징으로 한다[참고 문헌 : Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-1410 (1989)].
CD40은 B 세포, 맞물려지는 덴트리틱(dentritic) 세포, 대식세포, 여포성 덴트리틱 세포, 및 흉선 상피상에 발현된다[참고 문헌 : Clark, Tissue Antigens 36:33 (1990); Alderson et al., J. Exp. Med., 178:669 (1993); Galy et al., J. Immunol. 142:772 (1992)]. 사람 CD40은 50kDa의 타입 Ⅰ형 막 단백질이며, 신경 성장 인자 수용체 계에 속한다[참고 문헌 : Hollenbaugh et al., Immunol., Rev., 138:23 (1994)]. IL-10의 존재하에 CD40을 통한 신호는 IgA, IgM 및 IgG 생성물을 유도하고, 이것은 아이소타입 스위치가 이러한 상호작용을 통해 조절된다는 것은 나타낸다. CD40과 이들의 리간드사이의 상호작용은 B 세포의 프라임된 상태를 잘 받아 들이는 이 후의 신호에 인도하는 프라임된 B 세포를 초래한다.
또한, CD40, gp39에 대한 리간드(또한 CD40 리간드 또는 CD40L로 불림)는 최근에 분자적으로 클로닝되고, 이를 특징으로 한다[참고 문헌 : Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. gp30 단백질은 활성화되고 정지기에 있는 않은 CD4+Th 세포상에 발현된다[참고 문헌 : Spriggs et al., J. Exp., Med., 176:1543-1550 (1992); and Roy et al., J. Immunol., 151:1-14 (1993)]. gp39 유전자로 트랜스펙션된 세포 및 이들의 표면상의 gp39 단백질의 발현은 트리거(trigger) B 세포 증식을 할 수 있고, 다른 자극 신호와 함께 항체 생성을 유도할 수 있다[참고 문헌 : Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); and Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. 특히, CD40, gp39에 대한 리간드는 마우스[참고 문헌 : Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6550 (1992); Armitage et al., Nature, 357:80 (1992)] 및 사람[참고 문헌 : Hollenbaugh et al., Embo. J. 11:4313 (1992)]에서 확인되었다. gp39는 타입 Ⅱ 형 막 단백질이며, TNF-α, TNF-β 및 FAS, CD27, CD30 및 4-1BB에 대한 리간드를 포함하는 새로운 유전자 표면 계의 일부이다.
gp39의 발현은 생체외 실험에서 안티-CD2 항체 또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와 이온마이신(ionomycin)을 이용함으로써 CD4+T 세포상에 쉽게 유도될 수 있다. 발현은 신속하고, 일시적이며, 6 내지 8 시간에서 피크를 이루고, 24 내지 48 시간에는 정지기 수준에 근접하게 되돌아 간다[참고 문헌 : Roy et al., J. Immunol., 151:2497 (1993)]. 생체내에서, gp39는 사람에서 림프절 여포의 외투막 및 센트로사이틱(centrocytic) 구역, 및 지라의 동맥주위 림프초에서 CD4+T 세포상에 CD40+B 세포와 함께 표출되는 것으로 보고되었다[참고 문헌 : Lederman et al., J. Immunol., 149:3807 (1992)]. gp39 T 세포는 IL-2, IL-4 및 IFN-γ를 생성한다[참고 문헌 : Van der Eetwegh et al., J. Exp. Med., 178:1555 (1993)].
체액성 면역의 조절에서 gp39의 신규한 역할을 간파하는 유일한 방법은 사람 질환 즉, X 결합된 하이퍼-IgM 신드룸(HIM)의 연구에 의해 제공되어 왔다. HIM은 난해한 흉선 의존 체액성 면역 손실의 표본이 되는 X 결합된 면역결여이며, IgG, IgA 및 IgE를 생성할 수 없다. gp39 유전자에서의 돌연변이는 비작용 gp39 단밸질의 발현을 초래하고, HIM 환자로부터 헬퍼 T 세포는 B 세포를 활성화 시키기 못한다[참고 문헌 : Allen et al., Science, 259:990 (1993); Aruffo et al., Cell, 72:291 (1993); DiSanto et al., Nature, 361:541 (1993); Korthauer et al., Nature, 361:539 (1993)]. 이러한 연구는 펩티드/MHC 클래스 Ⅱ 복합물의 T 세포 수용체 맞물림 바로 후에, gp39가 동종 헬퍼 T 세포상에 유도되고, gp39의 B 세포상의 CD40로의 결합은 B 세포를 세포 순환으로 이동시키고, 면역글로불린(Ig) 분비물로 분화하고, 아이소타입을 스위칭시킨다.
기능 연구는 안티-gp39로의 마우스를 처리한 것은 완전하게 흉선 비의존 항원(TNP-Ficoll)이 아닌 흉성 의존 항원(SRBC 및 TNF-KLH)에 대한 항체 반응을 없애는 것으로 보고되었다[참고 문헌 : Foy et al., J. Exp. Med., 178:1567 (1993)]. 또한, 안티-gp39로의 처리는 콜라겐이 주입된 마우스에서 콜라겐 유도 관절염(CIA)의 방별을 억제한다[참고 문헌 : Durie et al., Science, 261:1328 (1993)]. 첫 번째로, 안티-gp39는 지라에서 메모리 B 세포 및 배심의 형성을 억제한다[참고 문헌 : Foy et al., J. Exp. Med., 180:157 (1994)]. 총괄적으로, 이러한 데이터는 T 세포상의 gp39와 B 세포상의 CD40의 상호작용이 흉선 의존 항원에 대한 항체 반응에 필수적이라는 광범위한 증가를 제공한다.
최근에, 많은 자가면역 질환의 쥐 모델이 질환 발병에서 안티-gp39 투여의 잠재적 치료학적 값을 구하는데 이용되어 왔다. 이러한 모델에서 연구 결과의 간단한 내용을 하기에 기재하였다:
콜라겐 유도 관절염 : CIA는 사람 자가면역 질환 류머티스 관절염(RA)에 대한 동물 모델이다[참고 문헌 : Trethorn et al., J. Exp. Med., 146:857 (1997)]. 이러한 질환은 이종구조 타입 Ⅱ 형 콜라겐의 투여에 의해 많은 종에서 유도될 수 있다[참고 문헌 : Courtenay et al., Nature, 283:665 (1980); Cathcart et al., Lab. Invest., 54:26 (1986)].
CIA 유도에서 안티-gp39의 효과를 연구하기 위해[참고 문헌 : Durie et al., Science, 261:1328 (1993)], 숫 DBA1/J 마우스에 프로인트 좌약에 완전히 유화된 병아리 타입 Ⅱ형 콜라겐을 꼬리의 바닥에 피내 주입하였다. 그 후, 21 일 후에 자극을 수행하였다. 마우스를 적절한 억제 항체 또는 안티-gp39로 처리하였다. 안티-gp39로 처리된 마우스 집단은 면역화된 비처리된 대조 마우스와 비교하여 안티-콜라겐 항체의 적정농도를 나타내지 않았다. 조직학적 분석은 안티-gp39 항체로 처리된 마우스가 면역화된 동물에서 관찰되는 질환의 염증 또는 통상적인 조직학적 질환의 어떤 징후도 나타내지 않는 다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 gp39-CD40 상호작용이 절대적으로 CIA의 유도에 필수적이라는 것을 나타낸다. 만약, T 세포와 B 세포 사이의 초기 동종 상호작용이 발생하지 않는다면, 자가항체 형성 및 염증 반응 유도와 같은 다운스트림 과정이 발생하지 않을 것이다.
최근에, gp39가 GM-CSF, IL-3 및 IFN-γ의 부재하에 TNF-α 및 IL-6을 생성하기 위한 백혈구를 활성화시키는 데 중요하다는 것이 알려졌다[참고 문헌 : Alderson et al., J. Exp. Med., 178:669 (1993)]. TNF-α는 CIA 질환 진행[참고 문헌 : Thorbecke et al., Eur. J. Immunol., 89:7375 (1992)] 및 RA[참고 문헌 : DiGiovane et al., Ann. Rheum. Dis., 47:68 (1988); Chu et al., Arthrit. Rheum., 39:1125 (1991); Brennan et al., Eur. J. Immunol., 22:1907 (1992)]에 관련되어 있다. 따라서, 안티-gp39에 의한 TNF-α의 억제가 관절염 마우스의 관절에서 충분한 안티-염증 효과를 가질 수 있다. 안티-gp39에 의한 TNF-α 및 T 세포-B 세포 상호작용의 억제 둘 모두는 CIA의 징후에 기여될 수 있다.
실험에 의한 알레르기성 뇌척수염(EAE) : EAE는 중추 신경계(CNS)의 실험상의자가면역 질환이며[참고 문헌 : Zamvil et al, Ann. Rev. Immunol., 8:579 (1990)], 사람 자가면역 질병에 대한 질환 모델 즉, 다발성 경화증(MS)[참고 문헌 : Alvord et al., "Experimental Allergic Model for Multiple Sclerosis" NY 511 (1984)]이다. CNS 또는 뇌염 유발 물질 프로테오리피드(PLP)로부터 억제된 미엘린 기본 단백질의 면역화에 의해 포유 동물 종에서 쉽게 유도될 수 있다. SJL/J 마우스는 감염되기 쉬운 종(H-2S)이며, EAE를 유도하는 동안, 이러한 마우스는 급성 마비성 질환을 발병시키고, 급성 세포성 침윤물이 CNS내에서 확인 가능하다.
클래슨과 공동 연구가(아지 공포되지 않은 데이터)는 SJL/J 마우스에서 EAE의 유도상의 안티-gp39의 효과를 연구하였다. 그들은 EAE 발병이 안티-gp39로 처리된 동물에서 완전하게 억압된다는 것을 발견하였다. 또한, 안티-PLP 항체 반응은 대조군 동물에서 획득된 반응과 비교하여 지연되고 감소되었다.
EAE는 질환 진행에서 자가항체 필요 조건에 대한 직접적인 증거를 갖는 않는 T 세포를 통하여 중개되는 세포 중개 자가면역 질환의 예이다. gp39와 CD40의 상호작용의 방해는 질환 유도 및 질환의 선택적 이동을 예방한다.
만성(c) 및 급성(a) 이식편 대 숙주 질환(GVHD): 만성 및 급성 GVHD는 숙주 이종의 MHC 대립 유전자에 대응하는 공여체 세포로부터 유도된다. cGVHD(H-2d-->H-2bd)에서, 증가된 폴리클로날 면역글로불린 생성물은 동질이형에 특이적인 헬퍼 T 세포와 숙주 B 세포의 상호작용에 기인한 것이다. 안티-gp39 항체의 생체내 투여는 비종대증과 관련된 cGVHD 유도 혈청 안티-DNA 자가항체, IgE 생성물, 생체외의 자연적인 면역글로불린 생성물을 차단하며, 질환 전달 능력을 차단한다[참고 문헌 : Durie F.H. et al., J. Clin. Invest., 94:133 (1994)]. 잔존하는 항체 생성물은 안티-gp39 투여 말기 후의 연장된 기간을 억제한다. aGVHD에서 유도된 안티-동종 세포독성 T 림프구(CTL) 반응은 또한 안티-gp39의 생체내 투여에 의해 억제된다. 이러한 데이터는 CD40-gp39 상호작용이 GVHD의 두 형태 모두의 발생에서 중요하다는 것을 암시한다. CTL 반응이 억제되고, 안티-gp39로의 짧은 처리가 질환의 장기가 예방을 유도한다는 사실은 동조 세포 및 안티-gp39 항체의 공동 투여에 의한 T 세포 구획에서 영구 변성을 암시한다.
많은 연구 그룹들은 gp39에 특이적인 쥐 항체의 생성법에 대해 보고해 왔으며, 이는 면역억제제로서 치료학적 유용성을 갖는 것으로 기재되어 있다. 예를 들어, 1993년 5월 27일에 공보된 WO 93/09812, 콜롬비아 유비버스티에 양도된 EP 0,555,880(1993년 8월 18일 공보), 다트머스 컬리지에 양도된 PCT US/94/09872(노엘레(Noelle) 등에 의해 1994년 9월 2일에 출원됨)에는 gp39에 특이적인 쥐 항체 및 치료학으로서의 이들의 이용법이 기재되어 있다.
그러나, 쥐 항체가 사람에게 치료학적 제제로서 적용될 수 있지만, 이들은 어느점에서는 불리한 점이 있다. 특히, 쥐 항체가 이종이기 때문에, 이들은 사람에 대한 면역원성이 될 수 있다. 쥐 항체는 종종 중화 항체 반응을 유도하며, 특히, 항체를 예를 들어, 만성 또는 재발하는 질환의 치료를 위해 반복적으로 투여해야 한다면 더욱 문제시된다. 또한, 이들은 쥐의 불변 도메인을 함유하기 때문에, 사람 이펙터 작용을 나타내지 않을 수 있다.
이러한 문제를 없애거나 감소시키기 위한 노력에서, 키메라성 항체가 발표되었다. 키메라성 항체는 두 개의 상이한 항체 통상적으로, 두 개의 상이한 종의 부분을 함유한다. 일반적으로, 이러한 항체는 사람 불변 및 다른 종, 통상적으로 쥐의 가변 영역을 함유한다. 예를 들어, 일부 마우스/사람 키메라성 항체는 부모 마우스 항체의 결합을 특성 및 사람 불변 영역과 관련된 이펙터 기능을 나타내는 것으로 보고되었다. 카빌리(Cabilly) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,816,567 호; 쇼에마커(Shoemaker) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,978,745호; 비에이버스(Beavers) 등에 의한 미국 특허 번호 제4,975,369호; 보스(Boss) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,816,397호를 참고하고, 이들은 모두 본 원에 참고 문헌으로 인용되었다. 일반적으로, 이러한 키메라성 항체는 미리 존재하는 쥐과 잡종으로부터 추출된 DNA로부터의 게노믹 유전자 라이브러리를 제조함으로써 구성되었다[참고 문헌 : Nishimura et al., Cancer Reserch, 47:999 (1987)]. 그 후, 라이브러리를 정확한 항체 단편 재배열 패턴을 나타내는 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 가변 영역 유전자로 스크리닝하였다. 대안적으로, cDNA 라이브러리를 잡종으로부터 추출된 RNA로부터 제조하고 스크리닝 하거나, 가변 영역을 중합효소 사슬 반응으로부터 수득하였다. 그 후, 클로닝된 가변 영역 유전자를 적합한 중쇄 또는 경쇄 사람 불변 영역 유전자의 클로닝된 카세트를 함유하는 발현 벡터로 결찰시킨다. 그 후, 키메라성 유전자를 선택의 세포 라인 일반적으로, 쥐의 골수종 라인에 발현시킨다. 이러한 키메라성 항체는 사람 치료에 이용되어 왔다.
일반적으로 양도된 출원 번호 제 07/912,292 호에서, "프리머타이지드"(상품명: Primatized) 항체는 사람 불변 및 구세계 원숭이 가변 영역을 함유하는 것으로 보고되었다. 이러한 프리머타이지드 항체는 이들의 낮거나 약한 면역원성이 제공된 사람에서 상당한 내성을 갖는다.
인간화된 항체 또한 당해분야에 공지되어 있다. 이상적으로, "인간화"는 원래 분자의 항원 결합 특성을 완전하게 보유하는 면역원성이 없는 항체를 유도한다. 원래의 하체의 항원 결합 특성을 모두 보유하기 위해서, 이들의 결합 부위의 구조가 "인간화된" 버전으로 완전히 재생성되어야 한다. 이것은 사람 프레임워크로 비사람 항체의 결합 부위를 하기의 이식법으로 이식함으로써 달성될 수 있다: (a) 사람 불변 영역으로 전체의 비사람 가변 도메인을 이식해서, 키메라성 항체를 생성하는 방법[참고 문헌 : Morrison et al., Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 81:6801 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 (1988)](리간드 결합 특성을 보존하고, 비사람 가변 도메인의 면역원성을 유지함); (b) 단지 비사람 CDR을 사람 프레임워크 및 불가결한 프레임원크 잔여물을 갖거나 갖지 않는 불변 영역에 이식하는 방법[참고 문헌 : Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1539 (1988)]; 또는 (c) 전체 비사람 가변 도메인을 이식하고(리간드 결합 특성을 보존하기 위해), 이들을 노출된 잔여물의 분별 있는 대체를 통해 사람 유사 표면으로 "클로킹(cloaking)"하는(항원성을 감소시키기 위해) 방법[참고 문헌 : Padlan, Molec. Immunol. 28:489 (1991)].
본질적으로, CDR 이식에 의한 인간화는 CDR을 단지 사람 프레임워크 및 불변 부뷩의 사람 단편으로 이식하는 방법을 포함한다. 이론상으로, 이것은 면역원성을 삭제하는 데 충분하다(만약 상이한 알로타입 또는 유전자형이 존재하는 것은 제외). 그러나, 원래의 항체의 일부 프레임워크 잔여물이 또한 보조되어야 한다는 것이 보고되었다[참고 문헌 : Riechmann et al., Nature, 332:323 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10,029 (1989)].
보존될 필요가 있는 상기 프레임워크 잔여물은 컴퓨터 모델링으로 확인할 수 있다. 대안적으로, 중요한 프레임워크 잔여물은 항체 결합 부위 구조로 공지된 것과 비교함으로써 잠재적으로 확인될 수 있다[참고 문헌 : Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)].
항체 결합에 잠재적으로 영향을 끼치는 잔여물은 여러 그룹으로 분리된다. 제 1 그룹은 결합 부위 표면에 접종함으로써, 항원과 직접적인 접촉을 유도할 수 있는 잔여물을 포함한다. 이들은 CDR에 근접하게 아미노-말단 잔여물을 포함한다. 제 2 그룹은 CDR 또는 반대 사슬에 접촉시킴으로써 CDR의 구조 또는 상대적인 정렬을 변형시킬 수 있는 잔여물을 포함한다. 제 3 그룹은 가변 도메인의 구조적 보존에 영향을 끼킬 수 있는 묻혀진 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 상기 그룹에서 잔여물은 일반적으로 채택된 넘버링 시스템에 따라 동일한 위치(패드란(Padlan), 1994(Id.))에서 발견되었다[참고 문헌 : Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5th ed., Pub. No.91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991].
그러나, 인간화된 항체가 사람에서 낮은 면역원성을 갖기 때문에 인간화된 항체는 바람직하지만, 이들의 생성물은 예측할 수 없다. 예를 들어, 항체의 서열 변형은 항원 결합의 상당한 또는 총 기능을 잃거나, 결합 특이성의 손실을 초래할 수 있다. 대안적으로, "인간화된 항체"는 서열 변형에 상관 없이 면역원성을 여젼히 나타낼 수 있다.
따라서, 원하는 항원에 대한 신규한 인간화된 항체의 현저한 필요성이 여전히 당해분야에 존재한다. 특히, gp39에 특이적인 인간화된 항체의 필요성이 당해분야에 존재하는 데, 그 이유는 면역치료학적 제제로서의 이들의 잠재 능력 때문이다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 사람 gp39에 특이적인 인간화된 항체를 제공하는 데 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 목적은 gp39에 대한 쥐의 24 내지 31항체 즉, 사람 gp39에 결합하는 특이적 쥐의 항체로부터 유도된 인간화된 항체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 사람 gp39에 특이적인 인간화된 항체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 목적은 24 내지 31 즉, 사람 gp39에 특이적으로 결합하는 쥐의 항체로부터 유도된 인간화된 항체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또 다른 발명의 목적은 예를 들어, 전신성 홍반성 루프스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 당뇨병과 같은 자가면역 질환, 및 이식편 대 숙주질환 및 이식 거부반응과 같은 비자가면역 질환을 포함하는 gp39 발현의 조정 및/또는 gp39/CD40 결합 상호작용의 억제에 의해 처리되는 사람 질환을 치료하기 위한 사람 gp39에 대한 인간화된 항체를 이용하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대해 인간화된 항체를 코드화하는 핵산서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 보다 특이적인 목적은 24 내지 31 항체 즉, 사람 gp39항원에 특이적으로 결합하는 쥐의 항체로부터 유도된 인간화된 항체를 코드화하는 핵산서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대해 인간화된 항체 특히, 24 내지 31 항체, 즉, 사람 gp39 항원에 대해 특이적으로 결합하는 쥐의 항체로부터 유도된 인간화된 항체를 발현시키는 벡터를 제공하는 데 있다.
발명의 간단한 설명
본 발명의 가장 광범위한 구체예로서, 본 발명은 쥐의 24 내지 31 항체의 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상 보유하는 인간화된 항체, 및/또는, 예를 들어, T 세포 의존 항체 생성을 측정하는 B 세포 검정에서, 쥐의 항체 24 내지 31의 시험관내 기능활성을 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 1/3 이상 보유하는 인간화된 항체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 인간화된 항체는 24 내지 31 항체 농도의 3배 이하의 농도에서의 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성의 최대 효능 절반의 1/10이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상을 보유한다.
본 발명은 또한 쥐의 24 내지 31 항체와 동일한 에피토프에 결합하고/거나, 쥐의 24 내지 31 항체와 경쟁하여 CD40이 gp39에 결합하는 것을 억제하고/거나, 24 내지 31 항체의 CDR를 함유하는 인간화된 항체에 관한 것이다.
본 발명은 더욱 바람직하게는 하기된 인간화된 가변 경서열 및/또는 인간화된 가변 중서열을 함유하는 쥐의 24 내지 31 항체로부터 유도된 인간화된 항체에 관한 것이며:
하기 군으로부터 선택된 인간화된 가변 중서열에 관한 것이고:
또한 상기 서열의 변이체 및 등가물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 변이체 및 등가물은 gp39 항원 결합 친화성에 실질적으로 영향을 주지 않는 방법으로 상기 동정된 인간화된 가변 중서열 및/또는 경서열중의 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 치환, 추가 및/또는 삭제에 의해 변형되는 인간화된 면역글로불린 서열을 포함하는 것으로 인지되어야 한다. 특히, 본 발명은 보존성 치환 돌연변이체, 즉, 하나 이상의 아미노산이 유사한 아미노산으로 치환되는 변이체 및 등가물을 포함한다. 예를 들어, 보존성 치환은 동일한 종류내에서 아미노산을 치환하는 것으로, 예를 들어, 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산을 동일한 종류의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 보존성 아미노산 치환은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 그러한 변이체 및 등가물은 쥐 모체의 24 내지 31항체로서 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3이상 함유할 것이며, 더욱 바람직하게는 쥐 24 내지 31 항체로서 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/3 이상 함유할 것이다. 또한, 그러한 변이체 및 등가물은 바람직하게는, 예를 들어, T 세포 의존 항체 생성을 측정하는 B 세포 검정에서, 쥐 항체 24 내지 31의 시험관내 기능 활성을 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 1/3 이상 함유할 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 변이체 및 등가물은 예를 들어, T 세포 의존 항체 생성을 측정하는 B 세포 검정에서, 쥐 항체 24 내지 31의 시험관내 기능 활성을 약 1/3 이상 보유할 것이다. 더욱 특히, 이러한 항체는 모 24 내지 31 항체 농도의 약 3배 이하의 농도에서의 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성중의 절반 최대 효능을 보유할 것이다.
본 발명은 또한 인간화된 항체의 발현을 코드화하는 핵산서열 뿐만 아니라 제조합 숙주 세포에서 인간화된 항체를 생성시키는 발현 벡터에 관한 것이다. 가장 바람직한 구체예에서, 이러한 DNA 서열은 하기된 인간화된 가변 중서열 및/또는 인간화된 가변 경서열을 코드화할 것이며:
하기 군으로부터 선택된 인간화된 가변 중서열을 코드화할 것이다:
또한, 본 발명은 상기 서열의 등가물 및 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 gp39에 특이적인 상기 동정된 인간화된 항체의 약제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, gp39 발현을 돌연변이시키거나 gp39/CD40 상호작용을 억제시킴으로써 치료될 수 있는 질환을 치료하기 위한 인간화된 안티-gp39 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 특히 자가면역질환, 예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스 및 ITP의 치료에 사용되는 gp39에 특이적인 상기 동정된 인간화된 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명는 또한, 이식편 대 숙주질환을 포함한 비자가 면역질환의 치료 및 이식 거부반응을 억제하는데 사용되는 gp39에 대한 인간화된 항체의 용도에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 24 내지 31항체로부터 유도된 인간화된 항체 및 키메라성 항체를 발현시키는 데 사용된 IDEC 발현 벡터 N5KG1을 도시하는 도면이다.
도 2a는 사람 PBL를 가용성 gp39-CD8, 재조합 사람 IL-4 및 쥐 24 내지 31 항체 또는 대조 쥐 IgG1 모노클로날 항체와 접촉시키는 B 세포 증식 검정의 결과를 나타내는 도면으로서, 24 내지 31 항체가 gp39에 의해 유도된 B 세포 증식을 억제함을 입증하고 있는 도면이다.
도 2b는 상이한 농도의 24 내지 31 항체 및 IGD+B 세포의 존재하에 배양된 인간화된 안티-CD3 으로 활성화된 미토마이신 처리된 T 세포를 사용하는 B 세포 분화검정의 결과를 나타내는 도면으로서, 24 내지 31 항체가 사람 B 세포에 의한 T 세포 의존 다클론성 항체 생성을 억제함을 입증하고 있는 도면이다.
도 3은 gp39 형질감염체 및 비형질감염된 CHO 세포의 FACS를 나타내는 도면이다.
도 4는 VL#1 또는 바람직한 인간화된 가변 경서열(1)로 일컬어지는 바람직한 인간화된 가변 경서열(상보성 결정영역을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 5는 VL#2 또는 바람직한 인간화된 가변 경서열(2)로 일컬어지는 바람직한 인간화된 가변 경서열(상보성 결정영역을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 6은 VH#1 또는 바람직한 인간화된 가변 중서열(1)로 일컬어지는 바람직한 인간화된 가변 경서열(상보성 결정영역을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 7은 24 내지 31 항체(비인간화된)의 가변 경서열의 아미노산 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 8은 24 내지 31 항체(비인간화된)의 가변 중서열의 아미노산 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 9는 gp39 발현 CHO 세포에 대한 쥐의 24 내지 31 항체, 키메라성 24 내지 31 항체 및 인간화된 24 내지 31 항체의 결합을 비교하는 도면이다.
도 10은 gp39 발현 CHO 세포에 대한 24 내지 31 항체(비오틴) 및 인간화된, 키메라성 및 24 내지 31 항체의 결합을 비교하는 경쟁검정의 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 미토마이신 C 처리된 T 세포의 존재하에 배양된 B 세포에 의한 사람 IgM 생성에 대한 본 발명의 인간화된 24 내지 31 항체 및 쥐의 24 내지 31 항체의 효과를 측정하는 검정의 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 gp39 발현 CHO 세포에 대한 본 발명의 두가지의 인간화된 항체의 결합을 비교하는 검정 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 쥐의 24 내지 31항체에 대한 스캐차아드도(Scatchard plot)를 나타내는 도면이다.
도 14는 인간화된 버젼 1에 대한 스캐차아드도를 나타내는 도면이다.
도 15는 인간화된 버젼 2에 대한 스캐차아드도를 나타내는 도면이다.
도 16은 gp39-CD8 융합 단백질의 존재하에 H24 내지 31.1을 결합시키는 FcRI를 나타내는 도면으로서, 항원에 복합화될 때 H24 내지 31.1만이 Fc 수용체 I을 결합시킴을 나타내는 도면이다.
도 17은 gp39-CD8 융합 단백질의 존재하에 H24 내지 31.1을 결합시키는 FcRII를 나타내는 도면으로서, 항원에 복합화될 때 H24 내지 31.1만이 Fc 수용체 II을 결합시킴을 나타내는 도면이다.
도 18은 알라마르 블루(Alamar Blue)를 사용한 상보성 의존 세포성 세포독성을 나타내는 도면으로서, H24 내지 31.1이 약 0.5㎍/㎖농도에서 세포성장을 50% 억제함을 나타내는 도면이다.
도 19는 gp39+CHO 결합된 H24 내지 31.1(인간화된 25 내지 31 버전 1)을 결합시키는 Clq의 측정을 나타내는 도면이다. 특히, 다양한 농도의 H24 내지 31.1로 표지된 gp39+CHO 세포가 과량의 사람 Clq(상보성 인자 1)중에서 배양되며, 이어서, FITC 표지된 염소 안티-사람 Clq와 함께 배양된다. 이러한 샘플을 흐름 세포측정법으로 분석하여 세포의 Clq로의 상대적인 표적화를 측정하였다. 본 도면은 또한 세포의 Clq로의 표적화가 항체 농도에 좌우되고, H24 내지 31.1 Fab 단편(Clq 결합없음)이 Clq를 결합하지 않고 있음을 나타낸다.
도 20은 T 세포 반응 대 T 세포 의존 리콜 항원에 대한 H24 내지 31.1의 효과를 나타내는 도면이다. 본 도면은 또한 TT 유도된 성장 및 IL-2 생성이 ≥ 1㎍/㎖ H24 내지 31.1에 의해 약 40% 로 최대한 억제됨을 나타내는 도면이다.
도 21은 T 세포 의존 B 세포 분화에 대한 H24 내지 31.1의 효과를 나타내는 도면이다. 본 도면은 또한 H24 내지 31.1이 1ng/㎖에서 약 85% 억제함을 나타낸다. 보다 높은 농도에서 나타난 IgG 생성의 명백한 증가는 본 시험의 불가능에 기인되어 B 세포에 의해 생성된 항체로부터의 H24 내지 31.1을 구별하는 것이다.
도 22는 T 세포 의존 B 세포 분화에 대한 H24 내지 31.1 Fab의 효과를 나타내는 도면이다. T 세포 의존 B 세포 IgG 생성의 안티-gp39항체 억제가 또한 도시되어 있다. 본 도면은 또한 전체 H24 내지 31.1 항체와 Fab 단편 사이의 IgG 생성의 억제에 차이가 없음을 나타낸다.
도 23은 T 세포 의존 리콜 항원에 대한 항원 특이적 B 세포 반응의 유도에 대한 H24 내지 31.1의 효과를 나타낸다. 시험관내에서 3일 동안 데타누스 톡소이드(tetanus toxoid)로 프라이밍된 사람 비장 세포를 약 1x107세포/SCID의 농도로 SCID 마우스에 옮긴다. 6일 후에, 생성된 hu-SPL-SCID 마우스에 PBS(그룹 1) 또는 300㎍ H24 내지 31.1(그룹 1 및 그룹 2)를 주입시킨다. 다음 날, Hu-SPL-SCID에 테타누스 톡소이드를 주었다. 그룹 3의 마우스는 3일 간격으로 상기 두 가지를 300 ㎍ H24 내지 31.1으로 주입된다. 마우스를 다양한 시점에서 출혈시키고 사람 IgG 안티-테타누스 톡소이드 역가 수준을 ELISA로 측정한다. 본 도면은 또한 H24 내지 31.1의 주입이 테타누스 톡소이드 특이적 반응을 약 90% 까지 억제시킴을 나타낸다(그룹 3). 전체 사람 IgG의 수준이 세 그룹 사이에서 비교된다.
도 24는 가용성 gp39-CD8에 의한 사람 B 세포의 증식을 나타내는 도면이다. 상이한 농도의 CD8-gp39가 4일간의 증식 검정에서 부화된 사람 B 세포와 IL-4와 함께 배양된다. gp39-CD8이 없는 상태에서 B 세포와 IL-4 배양물중에 함유된 CPM을 기준으로 사용하고 gp39-CD8로 자극된 시험 배양물의 전체 CPM으로부터 감하였다.
도 25는 H24 내지 31에 의해 B 세포 증식을 억제하는 도면이다. 상이한 농도의 H24 내지 31.1 항체가 4일간의 증식 검정에서 IL-4(1000 U/㎖) 및 10 ㎍/㎖의 gp39-CD8과 함께 배양된 B 세포(1x105)과 함께 배양된다. PWM과 IL-4와 함께 배양된 세포가 B 세포 증식에 양성 대조군으로 작용한다. CPM은 삼중으로 시험된 샘플의 평균 CPM을 나타낸다.
도 26은 24 내지 31항체의 인간화된 항체에 의한 gp39에 결합하는 CD40-Ig의 차단을 나타내는 도면이다. 본 도면은 또한 쥐의 24 내지 31 항체 및 인간화된 24 내지 31 항체가 CD4-Ig의 결합을 차단함을 나타낸다.
본 발명은 사람 gp39에 특이적인 인간화된 항체, 이러한 항체를 코드화하는 DNA, 이들의 제조 방법, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 치료학적 약제로서의 이러한 인간화된 항체의 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 항체는 예를 들어, 이식편 대 숙주질환을 포함하는 비자가면역 질환 뿐만 아니라 예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병 및 전신성 홍반성 루프스를 포함하는 자가 면역 질환을 치료하고 이식 거부반응을 방지하는데 적용될 수 있다.
본 발명의 설명하게 전에, 본원에 사용되는 특정의 용어를 정의하고자 한다.
인간화된 항체 - 용어 인간화된 항체는 모체 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만, 사람에게는 면역원성이 적은 비-사람 항체, 전형적으로 쥐의 항체로부터 유도되는 항체를 나타낸다. 이러한 항체는 (a) 비사람 가변 도메인을 사람 불변영역상에 이식하여 키메라 항체를 생성시키거나, (b) 중요한 골격 잔기를 보유하거나 보유하지 않은 사람 골격영역 및 불변영역에 비사람 CDR를 이식하거나, (c) 전체 비사람 가변 도메인을 이식하고, 표면 잔기 치환으로 사람 유사 부분으로 이들을 "클로킹"함으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 방법이 문헌[Johnes et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855(1984)]; 문헌[Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988)]; 및 문헌[Padlan, Molec. Immun., 28:489-498(1991)]; 문헌[Padlan, Molec. Immin., 31(3): 169-217(1994)]에 기재되어 있으며, 본 발명에서는 상기 문헌을 참조로 인용한다.
상보성 결정 영역, 또는 CDR - 본원에 사용된 용어 카뱃(Kabat: 1991)등에 의해 설명된 본래의 면역글로불린 결합부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
골격영역 - 본원에 사용된 FR은 CDR 사이에 끼워지는 아미노산 서열을 나타낸다. 이러한 항체 부분은 적절한 배향으로 CDR을 고정(CDR이 항원에 결합되게 함)시키는 것으로 작용한다.
불변영역 - 이펙터 기능을 부여하는 일부의 항체 분자. 본 발명에서, 쥐의 불변 영역은 사람 불변영역으로 치환된다. 키메라성 또는 인간화된 항체의 불변영역은 사람 면역글로불린으로부터 유도된다. 중쇄 불변영역은 다섯가지의 아이소타입: 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤(mu)중의 어느 한 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 또한, 다양한 서브클래스의 중쇄(예, IgG 서브 클래스의 중쇄)가 상이한 이펙터 기능을 나타내며, 그로 인해서, 요구되는 중쇄 불변영역을 선택함으로써, 요구되는 이펙터 기능을 지니는 키메라성 항체가 생성될 수 있다. 바람지간 불변영역은 감마 1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이다. 감마 1(IgG1) 아이소타입의 Fc 영역이 더욱 바람직하다. 경쇄 불변영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda)형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형일 수 있다.
키메라 항체 - 키메라 항체는 전형적으로 상이한 종인 두 가지의 상이한 항체로부터 유도된 서열을 함유하는 항체이다. 가장 전형적으로는, 항체는 사람 및 쥐의 항체 단편, 일반적으로는 사람 불변영역 및 쥐의 가변 영역을 포함한다.
면역원성 - 수용체에 투여된 경우에 면역반응(체액성 또는 세포성)을 유도하는 표적 단백질 또는 치료학적 잔기의 능력의 측정치. 본 발명은 인간화된 항체 또는 이의 단편의 면역원성에 관한 것이다.
면역원성이 감소된 인간화된 항체 또는 키메라성 항체 - 본 항체는 모항체, 예를 들어, 24-1 항체에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 항체 또는 인간화된 항체를 나타낸다.
모항체의 결합 특성을 실질적으로 보유하는 인간화된 항체 - 본 항체는 인간화된 항체 또는 키메라성 항체를 생성시키는데 사용된 모항체에 의해 인식된 항원에 특정적으로 결합하는 능력을 보유하는 인간화된 항체 또는 키메라성 항체를 의미한다. 24 내지 31 항체의 결합 특성을 실질적으로 보유하는 인간화된 항체 또는 키메라성 항체는 사람 gp39에 결합할 것이다. 바람직하게는 인간화된 항체 또는 키메라성 항체는 모항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 항원 결합 친화성 및 결합성을 나타낼 수 있다. 이상적으로는, 항체의 친화성은 모항체 친화성의 10% 이상, 바람직하게는, 30% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 친화성은 모항체의 50% 이상일 것이다. 항원 결합 친화성을 검정하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 절반-최대 결합 검정, 경쟁검정, 및 스캐차아드 분석을 포함한다. 적합한 항원 결합 검정이 본원에 기재되어 있다.
본 발명은 사람 gp39에 결합하는 신규한 인간화된 모노클로날 항체 및 치료제로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간화된 항체를 코드화하는 핵산서열 및 재조합 숙주 세포에서의 이들의 발현에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 사람 gp39에 특이적으로 결합하는 쥐의 항체 24 내지 31로부터 유도된 인간화된 항체에 관한 것이다.
쥐의 항체 24 내지 31은 시험관내 및 생체내에서 gp39를 기능적으로 불활성화시키는 사람 gp39에 대해 유도된 쥐의 항체이다. 따라서, 이러한 항체는 gp39의 불활성화 및/또는 gp39/CD40 상호작용의 변화 또는 억제가 요구되는 질환을 치료하는 데 효능적인 특성을 지닌다. 특히, 이러한 질환으로는 자가면역질환, 예컨대, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, ITP, 당뇨병, 및 전신성 홍반성 루푸스 뿐만 아니라 비자가면역질환, 예컨대, 이식편 대 숙주질환 및 이식 거부반응이 포함된다.
그러나, 쥐의 항체 24 내지 31이 치료제로서 효능적으로 적합하게 하는 기능적인 특성을 지니지만, 이러한 항체는 다수의 단점을 내재하고 있다. 즉, 이러한 항체는 쥐로부터 생성되기 때문에 사람에게는 면역원성을 나타낼 것이다. 또한, 이러한 항체는 쥐의 불변서열을 함유하기 때문에, 완전한 범위의 사람 이펙터 기능을 나타내지 못할 것이며, 사람에게 투여되는 경우에 보다 신속하게 사라질 수 있다. 이러한 단점이 어떠한 질환상태 또는 사람의 치료에 있어서는 문제가 되지 않을 수 있지만, 치료된 질환이 만성 또는 재발 특성인 경우에 실질적으로 우려된다. 재발성 또는 만성질환의 예에는, 예를 들어, 자가면역 질환이 포함되며, 숙주는 자가 항원에 대해 자가면역반응을 지속적으로 또는 만성적으로 나타낸다.
따라서, 쥐의 항체 24 내지 31과 관련된 이러한 단점, 즉, 사람에서의 잠재성 면역원성 및 사람 이펙터 기능의 저하를 완화시키기 위해서, 본 발명의 발명자들은 쥐의 24 내지 31 항체의 개선되고 인간화된 유도체를 생성시키고자 하였다. 이러한 사항이 본 발명의 목적이지만, 바람직한 결과는 통상적이거나 예측할 수 있는 것이 아니었다. 항체를 인간화하는 데는 변화된 아미노산 서열을 주의해서 선택해야 하며, 치환되는 잔기를 적합하게 선택해야 한다. 그 이유는 항체 가변 영역의 변화가 수개의 아미노산 잔기와 연루되는 항체 가변 영역의 변화인 경우에도 항원 결합에 실질적으로 유해한 영향을 줄 수 있기 때문이다. 예를 들어, 인간화된 항체는 모 항체에 비해 실질적으로 감소된 친화성 및/또는 항원-특이성을 나타낼 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 쥐의 항체를 포함한 항체의 인간화 방법이 문헌에 기재되어 있다. [참조예, Padlan, Molec. Immunol., 31(3):169-217(1994); Padlan, Molec. Immunol., 28:484-498(1991); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]. 상기 문헌의 모든 내용을 본 발명에서는 참조로 인용한다. 이러한 방법에는 특히 CDR 이식에 의한 인간화를 포함한다. [문헌: Johnes et al., Nature, 321:522-525(1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1539(1988)] 및 보다 상세한 문헌[Padlan, Molec. Immunol., 28:489(1991) and Padlan, Molec. Immunol., 31:169(1994)]. 상기 인간화 방법은 비필수 골격 아미노산 잔기의 선택 및 적절한 치환돌연변이에 의한 이들의 변화와 연루된다. 상기 참조문헌은 본 발명에서 이의 모든 내용을 참조로 인용한다.
상기 주지된 바와 같이, CDR 이식 기술은 어떠한 예에서는 성공적이지만, 생성되는 인간화된 항체의 친화성에 실질적으로 역효과가 있을 수 있다. 이러한 결과는 어떠한 골격 잔기가 항체 결합에 영향을 주거나 이에 필수적이고 적어도 영향을 주기 때문인 것으로 사료된다. 본 발명의 기술; 패들란(padlan (1994)(Id.))은 이들 쥐의 골격 잔기만을 유지시키기 때문에 더욱 더 개선되고 있으며, 상기 골격 잔기는 가능한 한 사람에서의 분자의 표면특성을 유지시키면서 항체 결합 부위의 보존에 중요성을 두고 있다. 따라서, 이러한 기술은 모항체의 항원 결합 특성을 보유하는 인간화된 항체를 생성시키는 효능을 지니고 있다. 이러한 이유로 하여, 이러한 기술은 사람 gp39에 특이적인 쥐의 항체 24 내지 31로부터 유도된 인간화된 항체를 효능적으로 생성시키는 수단으로서 본 발명자에 의해 선택되었다.
24 내지 31 항체(하기 실시예에서 상세히 설명됨)의 가변영역을 클로닝하여 도 7 및 도 8에 각각 도시된 24 내지 31항체에 의해 사용된 VL및 VH서열을 동정하였다. 서열화한 후에, 가변영역을 인간화하였다. 상기 주지되는 바와 같이, 이러한 과정은 실질적으로 본원에 참조로 인용된 패들란(1994)(Id.)의 방법에 따라서 수행되었다.
본 발명은 일반적으로 비사람 골격을 사람 골격 잔기로 치환하고, 항원 결합 특성을 보존시키는데 중요한 이들의 골격 잔기를 보유시키는 것을 포함한다. 이상적으로는, 이러한 방법은 이종 항체의 표면에 사람 유사 특성을 부여하여, 내부를 보유시키고 항원 결합 특성에 영향을 주는 잔기를 접촉시키면서 면역원성을 보다 적게 한다.
더욱 특히, 도 7 및 도 8에 도시된 24 내지 31 VK및 VH서열은 "주형"으로 일컬어지는 보고된 서열의 사람 항체에 비해 인간화된다.
특히, 24 내지 31 VK이 인간화되어 주형으로 사용된다:
(a) VL#1에 있어서, 사람 V-카파 서브그룹 I 서열, 예를 들어, DEN등, 뿐만 아니라, 생식세포주 012[참조, Cox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836(1994)], 및 VL#2에 있어서, 사람 V-카파 서브그룹 IV 서열, 예를 들어, LEN. 이러한 주형 서열은 공지되어 있으며, 문헌[Kabat et al. (1991)(Id.)] 또는 진뱅크(GenBank)에 보고되어 있다.
24 내지 31 VH#1은 인간화되어 주형으로 사용된다:
(a) 사람 VH서브그룹 IV 서열, 58p2 및
(b) (GenBank Accession No.) Z18320 및 생식세포주 3d75d 문헌[S.van der Maarel et al., J. Immunol., 150:2858-2868(1993)].
이러한 주형 가변 항체 중서열은 공지되어 있으며, 문헌[Kabat et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest,"5th Ed., NIH (1991)] 및 진뱅크(GenBank)에 보고되어 있다.
주형 사람 가변 중서열 및 경서열은 24 내지 31 전체와의 고도의 서열 상동성 뿐만 아니라 "중요한" 잔기, 즉, VL:VH경계를 포함하는 것으로 사료되는 잔기; 상보성 결정 영역과 접촉되는 잔기, 또는 내부로 포인팅(pointing)된 잔기를 포함한 상이한 특이성의 수를 기준으로 하여 선택된다. 또한, 주형은 24 내지 31 FV의 정전하를 가능한 한 많이 보유하도록 선택되며, 항원 결합에 영향을 주는 것으로 사료되는 그밖의 특이적 아미노산 잔기를 보유하도록 선택된다.
이러한 방법은 하기 표 1 및 표 2에 기재되는 24 내지 31항체로부터 유도된 하기된 바람직하게 인간화된 VL및 VH중서열을 생성시킨다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은, 또한, 바람직한 인간화된 서열, 예를 들어, gp39 결합에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 서열의 등가물 및 변이체를 포함한다. 상보성 결정 영역이 도 7 및 도 8에 도시되어 있으며, 이들 영역은 모(비인간화된) 24 내지 31 항체의 전체 가변 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 함유한다.
인간화된 24 내지 31 VL 서열
인간화된 24 내지 31 VH 서열
이를 통해서 알 수 있는 바와 같이, VH및 VL에 대하여 네 개의 바람직한 인간화된 골격 서열을 설계하였다. 따라서, 보존성 개질부를 함유하는 균등물 및 변체를 제외하고sms, 상기 동정된 인간화된 VH및 VL24 내지 31 서열을 사용하여 합성할 수 있는 16개의 상이한 가능한 인간화된 24 내지 31 항체가 존재한다.
이들 인간화된 가변 중서열 및 경서열을 함유하는 인간화된 24 내지 31 항체는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 바람직한 가변 서열의 어떠한 조합이라도 함유하는 인간화된 서열은 사람 gp39를 결합시키는 인간화된 항체를 생성시킬 것으로 기대된다. 더욱이, 이들 서열을 기초로 하여, 표 1 및 표 2에 기재된 번호를 사용하는 선호도는 하기와 같을 것으로 기대된다:
(1) #1 VH을 갖는 #1 VL(버전 1)
(2) #1 VH을 갖는 #2 VL(버전 2)
(3) #2 VH을 갖는 #1 VL(버전 3)
(4) #2 VH을 갖는 #2 VL(버전 4)
상기 동정된 인간화된 VH및 VL서열은 예를 들어 하나 이상의 추가 치환 개질부의 도입, 및 또한 다른 아미노산의 첨가에 의해 추가로 개질될 수 있다. 항원(gp39) 결합에 역효과를 미치지 않는 추가의 개질부가 선택될 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 문헌[Kabat numbering scheme, Kabat et al. (1991) (Id.)]에 따라서 잔기 34, 43, 44 및 68 중 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 VH쇄가 추가로 개질될 것으로 생각한다. 또한, 본 발명자들은 VL쇄중의 잔기 85가 개질될 것으로 생각한다. 항체 조합 부위의 구조적인 특징에 기초하는 경우에는, 상기 잔기의 개질이 항원 결합에 역효과를 미치지 않아야 한다고 믿는다. 더욱이, 하나 이상의 보존성 아미노산 치환의 도입이 gp39 결합에 역효과를 미치지 않을 것으로 기대된다.
목적하는 인간화된 24 내지 31, VH및 VL서열을 보다 잘 기술하기 위해서, 바람직한 인간화된 골격 서열이 또한 하기 표 3에 기재되어 있으며, 여기에는 이들 서열이 비인간화된 뮤린 24 내지 31 VH및 VL골격 서열 뿐만 아니라, 주형 사람 골격 가변 중서열 및 경서열, 즉, 사람 DEN VK1, 사람 012/V36 배선, 사람 LEN VKIV, 사람 58p2, 사람 Z18320 및 사람 3d75d와 비교되어 있다.
VK 골격 영역 비교 - 인간화된 안티-gp39
FR1 FR2
사람 012/V3b 배선사람 DEN VKI쥐의 24-31인간화된 패들란 VL#1
FR3 FR4
사람 012/V3b 배선사람 DEN VKI쥐의 24-31패들란(Padlan) VL#1
FR1 FR2
사람 LEN VKIV쥐의 24-31인간화된 패들란 VL#2
FR3 FR4
사람 LEN VKIV쥐의 24-31패들란 VL#2
FR1
사람 58p2쥐의 24-31인간화된 패들란 VH#1사람Z18320겐뱅크(GenBank)사람 3d75d 배선인간화된 패들란 VL#2
FR2 FR3
사람 58p2쥐의 24-31패들란 VH#1
사람 Z18320사람 3d75d패들란 VH#2
사람 58p2쥐의 24-31패들란 VH#1
사람 Z18320패들란 VH#2
인간화된 항체를 생성시키기 위해서, 동정 이전의 인간화된 VL및 VH서열을 코딩시키는 DNA 서열이 합성된다. 주지된 바와 같이, 이들 네 개의 인간화된 VL서열과 네 개의 인간화된 VH서열을 고려하게 되면, 합성될 수 있는 16개의 가능한 인간화된 항원 결합 부위가 존재하게 된다. 또한, 아미노산 잔기 및/또는 보존성 치환 변이체의 가능한 혼입에 의한 인간화된 VH의 잔기 34, 43, 44 및 68, 및 인간화된 VH의 잔기 85의 가능한 치환을 고려하게 되면, 더욱 많은 가능한 인간화된 항원 결합 부위가 존재한다. 상보성 결정 영역 및 상응하는 DNA 서열을 포함하여 두 개의 바람직한 인간화된 가변 경서열(1) 및 (2), 및 바람직한 인간화된 가변 중서열(1)은 각각 도 6, 4 및 5에 도해되어 있다.
공지된 서열의 단백질용으로 코딩되는 DNA를 합성하기 위한 방법은 당해기술분야에 속한다. 상기 방법을 사용하여, 목적하는 인간화된 VL및 VH서열을 코딩시키는 DNA 서열이 합성된 후, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터 시스템에서 발현된다. 이것은 사람의 불변 도메인 서열을 갖는 융합 단백질로서 발현시키려는 인간화된 VL및 VH서열을 제공하여 작용성 (항원 결합) 항체를 생성시키기만 한다면 어떠한 벡터 시스템에서도 효과적일 수 있다.
재조합 항체, 특히 인간화된 항체의 발현에 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포는 당해기술분야에 공지되어 있다.
하기의 참고문헌은 본원에 참조로 인용되는 재조합 면역글로불린의 발현에 적합한 대표적인 방법 및 벡터가 기술되어 있다: [참고문헌: Weidle et al.,Gene, 51:21-29 (1987); Dorai et al.,J. Immunol., 13(12):4232-4241 (1987); De Waele et al.,Eur. J. Biochem., 176:287-295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49:1738-1745 (1989); Wood et al.,J. Immunol., 145(a):3011-3016 (1990); Bulens et al.,Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington et al.,Biol. Technology, 10:169 (1992); King et al.,Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page et al.,Biol. Technology, 9:64 (1991); King et al.,Biochem. J., 290:723-729 (1993); Chaudary et al.,Nature, 339: 394-397 (1989); Jones et al.,Nature, 321:522-525 (1986); Morrison and Oi,Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12051-12055 (1994); Singer et al.,J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3): 215-219 (1994); Queen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma et al.,J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992)]. 또한, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터가 시판되고 있다.
작용성 면역글로불린을 발현시킬 수 있는 것으로 공지된 숙주 세포는 그 밖의 다른 숙주 세포중에서도 특히, 예를 들어, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 골수종 세포, 대장균과 같은 박테리아, 사카로마이스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 세포와 같은 포유류 세포를 포함한다. 이들 중에서, CHO 세포는 면역글로불린을 효과적으로 발현시키고 분비시키는 이들의 능력 때문에 많은 연구자들에 의해 사용된다.
본질적으로, 인간화된 항체의 재조합 발현은 두가지 일반적인 방법 중의 한 방법에 의해 수행된다. 첫 번째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변 영역에 융합된 가변 중서열 및 경서열 둘 모두를 발현시키는 단일 벡터로 트렌스펙션된다. 두 번째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변 영역에 융합된 가변 중서열 또는 경서열을 각각 발현시키는 두 개의 벡터로 트렌스펙션된다.
사람의 불변 도메인 서열은 당해기술분야에 잘 공지되어 있으며, 문헌에 보고되어 있다. 바람직한 사람 VL서열은 카파 및 람다 불변 경서열을 포함한다. 바람직한 사람의 불변 중서열은 변경된 효과 또는 작용, 예를 들어 증강된 체내 반감기 및 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 사람 감마 1, 사람 감마 2, 사람 감마 3, 사람 감마 4 및 이들의 변화된 변형을 포함한다.
사람 감마 4 불변 도메인의 바람직한 개질은 P 및/또는 E 개질을 포함하는데, 이들은 본원에 참조로 인용된 1995년 9월 6일에 출원된 공동 양도된 대리 서류 제 012712-165호에 기술된 바와 같이 각각 위치 236에서 루신이 글루탐산으로 변화 또는 위치 229에서 세린이 프롤린으로 변화되는 것을 언급한다.
특히 바람직한 벡터 시스템은 공동으로 양도된 미국특허출원 제 08/476,237호(1995년 6월 7일 출원), 제 08/397,072호(1995년 1월 25일 출원), 제 08/147,696호(1993년 11월 3일 출원), 제 07/977,691호(1992년 11월 13일 출원), 제 07/912,122호(1992년 6월 10일 출원), 07/886,281호(1992년 3월 23일 출원) 및 제 07/735,064호(1991년 7월 25일 출원)에 기술된 발현 벡터를 포함한다.
특히, 이들 출원에는 하기의 내용을 포함하는 TCAE 5.2 및 TCAE 6으로 언급된, 재조합 항체를 생성시키기 위한 벡터 시스템이 기술되어 있다:
1) 세로 순서로 배열된 네 개의 전사 카셋트
(a) 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역. TCAE 5.2에서, 이것은 사람의 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역(카파 넘버링 아미노산 108-214, 타성준기준표본 Km3)이고, TCAE 6에서는 사람 면역글로불린 경쇄 람다 불변 영역(카파 넘버링 아미노산 108-215, 유전자형 Oz 마이너스, Mcg 마이너스, Ke 마이너스 타성준기준표본)이다.
(b) 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 두 구조물 모두에서 사람 면역글로불린 중쇄는 감마/불변 영역(카파 넘버링 아미노산 114-478 타성준기준표본 Gm1a, Gm12)이다.
(c) DHFR (자신의 진핵성 프로모터 및 폴리아데닐화 영역을 함유함); 및
(d) NEO (자신의 진핵성 프로모터 및 폴리아데닐화 영역을 또한 함유함).
2) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카셋트는 면역글로불린 쇄의 분비를 위한 합성 시그날 서열을 함유하며;
3) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카셋트는 전사 리딩 프레임을 보유하지만 면역글로불린 쇄에서 통상적으로 발견된 아미노산을 변경시키지는 않는 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 삽입을 허용하는 특이적 DNA 링크를 함유한다.
아넥스(ANNEX) 2 벡터는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (네오) 개시 코돈에서 두 개의 상이한 개질부를 함유하는 TCAE 벡터의 개질부이다. 제 1 개질부는 프레임 업스트림 번역 개시 부위의 외부가 부가된 부분이다. 제 2 개질부는 네오 유전자의 개시 부위가 개질되어 효과가 감소된 부분이다. 네오스플라(NEOSPLA) 벡터는 아넥스 2 벡터의 개질부이다. 네오 유전자는 합성 공여체/수용체 스플라이스 부위를 사용하여 두 부분으로 쪼개어 졌으며, 경쇄, 중쇄, 및 DHFR 유전자는 네오 인트론의 내부에 위치한다.
이들 벡터는 CHO 세포에서 바람직하게 이용된다. 목적하는 항체는 상기된 벡터 시스템에서 바람직하게 발현된다.
그러나, 번호 24 내지 31 항체로부터 유도된 목적하는 인간화된 항체 서열은 작용성 항체를 발현시키는 어떠한 벡터 시스템, 즉, gp39 항원을 결합시키는 어떠한 벡터 시스템에서도 발현될 수 있다.
특히, 본 발명자들은 사람 카파 및 사람 감마 1 불변 영역을 함유하는 N5KG1 발현 벡터를 사용하여 CHO 세포내 24 내지 31로부터 유도된 천연(개질되지 않은) VL및 VH서열 뿐만 아니라 목적하는 인간화된 VL및 VH서열을 발현시키도록 선택하였다. N5KG1 발현 벡터는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 원하는 경우에,24 내지 31로부터 유도된 키메라 항체는, CHO 세포에서 발현될 때, (CHO- gp39 트랜스펙턴트에 입증된 결합에 의해) gp39를 결합시킨다. 또한, 24 내지 31로부터 유도된 본 발명의 수개의 인간화된 항체는, 이러한 벡터 시스템을 사용하여 발현될 때, 작용성(gp39 결합) 항체를 생성시킨다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 상세하게 기술된다. 이들 실시예는 설명의 한 예로서 제공되며, 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
인간화용 24 내지 31 항체의 선택
동물 모델에서의 축적된 증거를 통해서 안티-gp39 투여가 다양한 자가면역 과정을 억제하며, 동종 이식 거부를 간섭하는 것을 알 수 있다. 이들 결과는 사람 gp39에 대한 항체가 자가면역 질환의 조절 및 사람의 타성 조직 및 기관의 이식에 있어 중요한 치료적 가치를 가질 수 있는 강제적인 증거를 제공한다. 사람 gp39에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)는 문헌[Lederman et al., J. Immunol., 199:3817 (1992)]에 보고되어 있으며, 체외에서 gp39-CD40 상호 작용을 차단하는데 있어 이의 작용성 활성이 평가되어 있다. 사람 면역 시스템에 대한 안티-gp39 항체의 작용성 영향을 보다 면밀하게 조사하기 위해서, 안티-사람 gp39 mAbs의 패널을 발생시켰다. 이러한 패널로부터, 특정의 mAb가 우수한 것으로 나타났으며, 이것을 체외 및 체내에서 gp39의 작용성 비활성에 대해서 광범위하게 시험하였다.
보다 상세하게는, 사람 gp39 (gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질로 면역반응 시킨 후, 활성화된 사람 말초 혈액 T 세포의 공격에 의해 6개의 뮤린(모두 IgG1) 안티-gp39 항체의 패널을 발생시켰다. 사람 말초 혈액 T 세포의 흐름 세포계수 분석을 통해 mAb가 활성화된 (PMA/이오노마이신), 그러나 휴면하지는 않는, CD3+T 세포에 발현된 세포 표면 분자를 인지했다는 것과, 반응성의 패턴이 재조합 CD40 융합 단백질(CD40-Ig)에서 나타난 반응성 패턴과 유사하다는 것(데이타는 나타내지 않음)을 입증하였다. [35S] 대사적으로 표지된 활성화된 사람 말초 혈액 T 세포의 면역침전을 통해서 6개의 mAbs 각각이 CD40-Ig에 의해 침전된 것과 유사한 크기(33kDa)의 분자를 침전시켰다는 것을 알 수 있었다. 결국, CD40-Ig를 gp39에 결합시키는 것은 동일한 분자의 항체 표시 인지부의 존재시에 차단되었으며, 추가로 이들의 특이도를 확인하였다. 모든 6개의 mAbs가 gp39 작용을 억제할 수 있었지만, 광범위한 분석을 위해 하나의 mAb, 24 내지 31을 선택하였다.
실시예 2
T 세포 의존성 B 세포 증식 및 분화는 안티-gp39에 의해 차단된다.
많은 연구는 리간드, gp39에 의해 CD40을 통해서 전달된 시그날이 B 세포 활성, 증식, 분화 및 이소타이프 스위칭을 유발시킨다는 증거를 제공하였다. 안티-gp39 24 내지 31 mAb가 gp39 작용을 차단하는지의 여부를 결정하기 위해서, 24 내지 31의 존재 또는 부재시에 gp39(gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질로 B 세포를 배양시키고,3H-티미딘 혼입에 의해 B 세포 증식성 반응을 평가하였다. 도 2a에 도시된 결과는 gp39-CD8이 B 세포를 활발하게 증식시킨다는 것을 입증하였다. 안티-gp39 24 내지 31 mAb 존재는 2.5μg/ml의 농도에서 gp39-CD8에 의해 유발된 B 세포 증식을 완전하게 제거하였다. 24 내지 31이 T 세포 유도된 B 세포 분화를 간섭하는 지의 여부를 결정하기 위해, 24 내지 31의 존재 또는 부재시에 안티-CD3 활성화된 T 세포로 B 세포를 공동 배양하였다. 12일 후에, 폴리클로날 IgM, IgG 및 IgA 생성율을 평가하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 24 내지 31의 첨가는 폴리클로날 IgM, IgG 및 IgA 항체 생성률(90-99%)을 방해하였따. 이들 결과는 T 세포 의존성 B 세포 분화에서 gp39-CD40 상호 작용에 대한 요건을 수립하는 앞서의 문헌[Nishioka et al., J. Immunol., 153:1027 (1994)]을 확실하게 하며, gp39 작용을 차단하는데 새로이 특성화된 안티-사람 gp39 24 내지 31 mAb의 사용을 추가로 입증한다.
실시예 3
안티-gp39는 사람 PBL로 재구성된 중증혼합면역결핍증에 걸린 마우스에서 체내 파상풍 톡소이드 특이적 항체 생성을 차단한다.
많은 연구는 사람 면역 시스템이 사람 말초 혈액 림프구와 합치된 중증혼합면역결핍증(scid)에 걸린 마우스(hu-PBL-scid mice)의 사용을 통해 실험 조건하에서 연구될 수 있음을 수립하였다[참고문헌: Mosler et al., Nature, 335:256 (1988); McCune et al., Science, 241:1632 (1988)]. 장기간의 키메리즘(chimerism)은 사람 PBL로 주입에 의해 중증혼합면역결핍증에 걸린 마우스에 의해 달성되며, 항원 특이적 2차 항체 반응은 항원으로 체내 공격된 hu-PBL-scid 마우스에서 검출된다[참고문헌: Carlsson et al., J. Immunol., 148:1065 (1992); Duchosal et al, Cell Immunol., 139:468 (1992)]. 이러한 시스템은 사람 T 및 B 세포에 의해 도출되는 면역 반응에 대한 체내 안티-gp39 투여의 면역억제 효과를 평가하기 위해 개발되었다.
그 결과가 도 2b에 도시되어 있는 실험을 통해서 24 내지 31에 의한 gp39 작용의 차단이 체외의 사람 B 세포에 의한 T 세포 의존성 폴리클로날 Ig 생성에 의해 억제한다는 사실을 입증하였다. 24 내지 31이 체내에서 항원 특이적 B 세포 항체 생성을 억제하는 지의 여부를 결정하기 위해서, 사람 PBL(hu-PBL-scid)로 주입되어 파상풍 톡소이드(TT)로 면역 처리된 C.B-17 scid/scid 마우스를 24 내지 31 또는 PBS로 처리하고, 이차 (IgG) 안티-TT 항체 반응을 평가하였다. 그러나, 안티-gp39로 처리(24 내지 31; 250μg/1일, 1주일당 2회)하였더니 조사된 10마리의 마우스 중 9마리의 마우스에서 이차 안티-TT 항체 반응은 완전히 제거되었으며, 이러한 사실은 gp39 작용의 체내 차단이 항원 특이적 체액 반응의 억제를 또한 유발시켰음을 나타낸다.
파상풍 톡소이드로 면역처리된 C.B-17 scid/scid 마우스에 사람 PBL의 접목 이후에 2차 항파상풍 항체 반응의 제거*. 4 내지 6주 된 C.B-17-scid/scid 마우스에 20×106사람 PBL 및 0.25ml 파상풍 톡소이드를 주입시켰다.
수용 계통* 처리¶ 항파상풍 항체(O.D·±SE)§(항파상풍 항체를 함유하는 마우스의 빈도)
7일 14일 21일 28일
C.B-17 scid/scid PBS <0.02 (0/10) 2.30±0.042(7/10)* 0.224±0.040(8/10)** 0.137+0.007(4/10)
안티-gp39 0.162(1/10) <0.02(0/10) <0.02 (0/10) <0.02 (0/10)
¶ 안티-gp39 24-31 또는 PBS (250μg/1회 주입)를 전체 실험에 걸쳐서 일주일에 두 번 투여하였다. §혈청내 사람 항파상풍 톡소이드 항체의 수준은 일라이자에 의해 1주일 마다 결정되었다. 1:10 희석비에서 0.100 O.D. 보다 큰 사람 항파상풍 톡소이드 항체의 혈청 수준을 갖는 모든 마우스는 포지티브로 고려되었다. 단지 포지티브 마우스만이 표에 기재된 평균 ± SE 값의 계산에 사용되었다. 파상풍 톡소이드로 면역처리되 지 않은 사전 면역 마우스로부터 혈청내 인간 항파상풍 톡소이드의 수준은 <0.02 O.D.였다. 데이터는 평균 ± SE로서 제시되어 있다. * 안티-gp39 처리된 그룹 보다 상당히 다름(p=0.222).** 안티-gp39 처리된 그룹 보다 상당히 다름(p<0.001)
실시예 4
안티-gp39 처리는 hu-PBL-scid 비장 세포의 항원 특이적 T 세포 증식 반응을 방해하지 않는다.
안티-gp39로 hu-PBL-scid 마우스의 처리가 체내의 항원 특이적 T 세포의 반응성을 변경시키는 지의 여부를 결정하기 위해서, TT로 면역처리하고 24 내지 31로 처리한 hu-PBL-scid 마우스로부터 비장 세포의 증식 반응을 체외에서 평가하였다. 대조군 또는 안티-gp39 치리된 hu-PBL-scid 마우스로부터의 비장 세포를 TT 또는 배지 단독으로 배양시켰고, 6일 경과 후,3H-티미딘을 혼입시켜 증식 반응을 평가하였다. 표 5에는 상기 실험의 결과가 기재되어 있다. 안티-gp39로 처리한 hu-PBL-scid 마우스는 처리하지 않은 hu-PBL-scid 마우스와 같이 TT로 체외 자극 에 유사하게 반응하였다(5/10 대 3/10 마리의 마우스가 반응). 안티-TT 항체가 NOD/LtSz-scid /scid 마우스에서 검출될 수 없었음(데이타는 도시되지 않음)에도 불구하고, 마수납 동물로서 NOD/LtSz-scid /scid 마우스를 사용하는 실험은 유사한 결과를 야기시켰다. 이들 데이터는 안티-gp39로 처리가 hu-PBL-scid 마우스에서 항원 특이적 T 세포의 작용성 활성 또는 삭제를 야기시키지 않는다는 것을 나타내며, 안티-gp39에 의해 TT 특이적 항체 반응의 억제가 T 세포 비활성화라기 보다는 gp39-CD40 상호 작용의 차단 및 후속하는 B 세포 반응으로 인한 것이라는 논쟁을 뒷받침해준다.
안티-gp39 처리는 파상풍 톡소이드로 면역처리된 C.B-17-scid/scid 또는 NOD/LtSz-scid 마우스내에 사람 PBL의 접목 이후에 항파상풍 T 세포 증식성 반응을 변경시키지 않는다.
수용 계통* 처리¶ 반응하는 마우스의 빈도§
C.B-17 scid/scid PBS안티-gp39 3/105/10
NOD/LtSz-scid/scid PBS안티-gp39 5/106/10
* 4 내지 6주 된 C.B-17-scid/scid 또는 NOD/LtSz-scid/scid 마우스에 20×106인간 PBL 및 0.25ml 파상풍 톡소이드를 주입시켰다. ¶ 안티-gp39 24-31 또는 PBS (250μg/1회 주입)를 전체 실험에 걸쳐서 2주 마다 복강내로 투여하였다. §사람 PBL을 주입하고 파상풍 톡소이드로 면역처리한 마우스로부터의 비장 세포를 배지 단독 또는 파상풍 톡소이드(2.5 또는 5.0μg/ml)의 존재하에 1×105세포/ml의 농도에서 배양시켰다. 6일 경과후에3H-티미딘 혼입에 의해 증식을 평가하였다. "S.I. = cpm 파상풍 - cpm 배지/cpm 배지" 식을 사용하여 자극율을 계산하였다. 2.0 보다 큰 S.I.는 포지티브로 고려된다.
실시예 5
gp39 CHO 트랜스펙턴트 세포주의 발생
최근에, 본 출원에서 제안된 인간화된 안티-gp39 24 내지 31 결합 연구용 시약으로서 사용하기 위해 세포 표면 gp39를 구조적으로 발현시키는 CHO 트랜스펙턴트를 발생시켰다. 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)-활성화된 사람 PBL의 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 온길이 gp39 유전자[참고문헌: Hollenbaugh et al, Immunol. Rev., 138:23 (1994)]를 증폭시켜서 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 증강제 요소의 전사 조절하에서 IDEC's INPEP4 벡터로 클로닝시켰다. CHO 트랜스펙턴트를 수립하여 50nM 메토트렉세이트중에서 증폭시켰다. ELISA(데이타는 도시하지 않음) 및 FACS 분석에 의해 세포 표면 gp39를 발현시키는 것이 트랜스펙턴트, 50D4임을 확인하였다. 형질감염체는 또한 mgp39 CHO(막결합 gp39 형질감염 CHO 세포)로서 언급된다.
실시예 6
CHO 발현계를 사용하는 항체의 고도의 발현
IDEC 독점 N5KG1 발현 인자를 인간화 안티-gp39 24 내지 31 항체의 발현을 위해 CHO 세포에 사용하였다. 상기 인자를 도 1에 개략적으로 도시하였다. 재조합 항체의 고도의 발현은 상기 인자 및 유사한 인자를 사용하여 CHO 세포에서 지속적으로 수득하였다. 이들 인자를 사용하여, 고비율, 즉 5 내지 10%의 G418 내성 클론이 상당한 양(1-10㎎/ℓ 항체)의 재조합 단백질을 발현시킴을 발견하였다. 이들은 일반적으로 단일 플라스미드 복제 성분이고, 메토트렉세이트를 사용하여 쉽게 증폭되어 30 내지 100 pg/세포/일의 분비된 면역글로불린을 수득할 수 있다. 표 6은 상기 계를 사용하여 CHO 세포에서 발현되는 3개의 항체의 유전자 증폭 전 및 후에 수득되는 항체 수준을 기재한 것이다.
IDEC의 CHO 발현 기술을 사용한 항체 생성 수준
항체 증폭전 (㎎/ℓ) 스피너 플라스크에서의 증폭후 (㎎/ℓ) 발효기에서의 증폭후 (㎎/ℓ)
안티-CD4 γ1안티-CD4 γ4안티-CD20 1-2 3-4 5-10 100-110 125-150 200-300 950 N.D. 650
실시예 7
24 내지 31 V K 및 V H DNA 서열의 클로닝
안티-gp39 24 내지 31 VK및 VH유전자 단편을 클로닝시키고 서열화시켰다. 이들의 서열의 분석 후에, V 영역 유전자 단편의 인간화 변형체를 설계하였다. 상응하는 DNA 서열을 합성하고, 사람 불변 영역 유전자를 함유하는 고도의 인자로 클로닝시켰다. 그 다음, 인간화 24 내지 31 항체를 생성시키는 CHO 형질감염체를 형성시켰다. 안티-gp39 항체의 인간화 변형체가 이것의 gp39 결합 친화성을 보유하는 지를 확인하기 위해, 쥐 및 인간화 항체의 상대적 친화성을 직접 결합 및 경쟁 검정으로 비교하였다. 또한, gp39에 대한 CD40 결합을 차단하고 T 세포 의존성 항체 생성을 억제하기 위한 인간화 24 내지 31의 능력을 평가하였다.
1. 24 내지 31 VK및 VH유전자 단편의 클로닝
a. cDNA의 제조.
폴리A+mRNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 인비트로겐 코포레이션 MicroFast Track(상표명) mRNA 단리 킷을 사용하여, 24 내지 31 하이브리도마의 생성에 사용되는 융합 파트너인 24 내지 31 하이브리도마 및 NS 세포주 각각의 2x106세포로부터 제조하였다 [참조 : Carroll et al., Mol. Immunol., 10:991 (1988)]. 제 1 가닥 cDNA를 50 pmol의 올리고-dT 및 5 유닛 M-MLV 역전사 효소(프로메가)[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]을 사용하여 합성시킨 후, 세파덱스 G-25 크로마토그래피 정제하였다.
b. VK및 VHcDNA의 PCR 증폭.
24 내지 31 및 NS1 cDNA를 3' 불변 영역 프라이머와의 조합에서 VK또는 VH리더 서열에 대해 특이적인 5' 프라이머의 패널을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' VH프라이머의 패널은 조운즈(Jones) 및 벤딩(Bending)의 문헌[Bio/Technol., 9:88 (1991); Errata, Bio/Technol., 9:579 (1991)]에 기술된 것과 동일하다. 5' VK의 패널[조운즈 등의 (Id.)]을 변형시켜 Sal I 클로닝 자리 인식 서열(GTCGAC)을 Bgl II 인식 서열(AGATCT)로 전환시켜서, IDEC의 N5KG1 발현 인자로의 증폭된 유전자 단편의 클로닝을 촉진시켰다 (도 1 참조). 3' VK및 VH프라이머는 아미노산 위치 108-109(카바트(Kabat) 등의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed., NIH (1991)]에 따라 번호를 매김)에서 Bsi WI 클로닝 자리 서열 및 위치 114-115에서 Nhe I 클로닝 자리 서열을 각각 함유하고, 하기의 서열을 갖는다 :
TGCAGCATCCGTACGTTTGATTCCAGCTT(CK) 및
GGGGGTGTCGTGCTAGCTG(A/C)(G/A)GAGAC(G/A)GTGA(Cγ1).
상기 프라이머 패널은 C2B8 안티-CD20 항체[Nishioka et al., J. Immunol., 153:1027 (1994)] 및 많은 다른 마우스 VK및 VH유전자 단편(도시되지 않음)을 증폭시키고 클로닝시키기 위해 양수인에 의해 이미 사용된 것이다.
24 내지 31 VK및 VH유전자 단편의 증폭에 대한 정확한 프라이머 쌍을 결정하기 위해, 24 내지 31 cdna를 CK프라이머와 조합하여 있는 11개의 5'VK프라이머 중 하나 또는 Cγ1 프라이머와 조합하여 있는 12개의 5'VH프라이머 중 하나를 함유하는 23개의 개별적 반응으로 증폭시켰다. 비교를 위해, cDNA를 동일한 패널의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 1㎕ cDNA(cDNA 샘플의 1/50)를 5 유닛의 Tag DNA 폴리머라아제(페르킨 엘머), 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 각각 0.25mM의 dCTP, dGTP, dATP 및 TTP, 50 pmol 3' 불변 영역 프라이머 및 50 pmol 5'프라이머를 함유하는 100㎕ 최종 부피로 증폭시켰다. 증폭 사이클은 95℃에서 1분 동안의 변성, 50℃에서 2분 동안의 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 연장을 34회 반복하는 것으로 구성된다. 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. VK및 VH에 대한 독특한 증폭된 생성물을 수득하는 24 내지 31 PCR 반응을 반복하고, 중복 PCR 반응으로부터의 생성물을 클로닝시켰다. PCR 증폭 생성물을 아가로오스 겔 정제하고[Sambrook et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1988)], Bgl II 및 Bsi (VK에 대해) 또는 Sal I 및 Nhe I (VH에 대해)으로 절단하였다. 생성물을 IDEC 인자인 N5KG1 내로 결찰시켰다 [참조 : Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)].
E. Coli XL1-blue 세포(스트라타진)의 형질전환 후에, 플라스미드 DNA를 제조하고, VK및 VH서열을 중복 구성물로부터 수득하였다 (캘리포니아, 라 졸라, 스크립스 리서치 인스티튜트 코어 패실리티에 의해 서열화가 수행됨). NS1 융합 파트너의 내인성 경쇄 및 중쇄의 서열은 공지되어 있으며 [Carroll et al., Mol. Immunol., 10:991 (1988); Kabat et al., (1991) (Id.)], 이들을 사용하여 NS1 융합 파트너 V 영역에 대한 24 내지 31의 증폭으로부터 유발되는 PCR 생성물을 구별하였다.
실시예 8
인간화 24 내지 31 V 영역을 코드화하는 유전자 단편의 합성
인간화 VL및 VH(1)로서 표 1 및 2에서 확인한 가장 바람직한 인간화 24 내지 31 VK및 VH서열을 함유하는 인간화 변형체를 함성하였다. 더욱 상세하게는, 상기 인간화 VK및 VH영역을 코드화하는 4쌍의 오버랩핑된 상보적 올리고누클레오티드(올리고)를 합성하고(미들랜드 케미칼즈), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제하였다 [참조 : Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)]. 각각의 올리고는 길이상 염기가 약 100개이고, 20개의 염기에 의해 인접 상보적 올리고누클레오티드를 오버랩핑된다. VK및 VH5' 올리고는 Bgl WI 및 Nhe I 클로닝 자리를 갖고, 3' 올리고는 Bsi WI 및 Nhe I 클로닝 자리를 갖는다. 각각의 변동 영역 유전자 단편을 하기의 과정을 사용하여 하기에 도해된 합성 올리고로부터 어셈블링시켰다 [참조 : Watson et al., Recombinant DNA, 2nd Ed., Scientif. Amer. Books, NY, NY (1992)]. 상보적 올리고쌍(A+E, B+F, C+G, D+F)을 제조업자의 프로토콜에 따라 각각의 프라이머 및 T4 폴리누클레오티드 키나아제(프로메가) 300 pmol을 사용하여 키나아제화시켰다. 올리고를 95℃로 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 어닐링시켰다. 어닐링된 올리고쌍을 6 유닛의 T4 DNA 리가아제(New England Biolabs)를 사용하여 결찰시켰다 (A/E와 B/F, 및 C/G와 D/H). 적합한 5' 또는 3' 클로닝 자리 제한 엔도누클레아제에 의한 절단 후에, 약 200개의 염기쌍 DNA 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후에 전기용출에 의해 정제하였다[Sanbrook et al, (Id.)]. 합성 유전자 단편을 CMV 프로모터 및 인핸서 요소의 전사적 조절하에, IDEC 독점 고도 발현 인자인 N5KG1 내에 삽입하였다. 결찰 반응은 각각 100:100:1의 몰비로 2개의 겔 정제된 단편(A/E/B/F 및 C/G/D/H) 및 N5KG1을 함유한다. XL1-블루 세포의 형질전화 후에, 플라스미드 DNA를 제조하고 합성 유전자 단편의 서열을 확인하였다. 생성된 구성물인 h24 내지 31은 인간화 24 내지 31 V 영역 단편 및 사람 카파 및 감마 1 불변 영역을 코드화시킨다. 제시된 바와 같이, 상기 항체는 "(1)" 서열로서 표 1 및 표 2에서 확인된 인간화 변동 중서열 및 인간화 변동 경서열을 함유하고, 최적 gp39 TJDWLFDFM 갖는 인간화 항체를 제공하는 것으로 예측되는 변형체 1 또는 H24 내지 31.1로서 언급된다. 또한, VH#1과 조합하여 VL#2를 함유하는 구성물(인간화 24 내지 31 또는 H24 내지 31.2의 변형체 2)가 생성된다. IDEC 독점 인자를 사용하는 유사한 구성물을 IDEC 안티-CD20 [Reff et al., Blood, 83:425 (1994)] 및 안티-CD4[Newman et al., Biol. Technology, 10:1455 (1992)] 항체의 고도의 발현을 위해 사용하였다.
실시예 9
2. 인간화 24 내지 31의 생성 및 특징화
a. 인간화 24 내지 31을 생성시키는 CHO 형질감염체(변형체 1 및 변형체 2)의 생성
인간화 24 내지 31을 발현시키는 CHO 형질감염체(변형체 1 또는 변형체 2)를 h24 내지 31 DNA가 선형화된 4x106개의 CHO 세포(변형체 1 또는 변형체 2)의 전기영동에 이은 G418 중에서의 선택에 의해 생성시켰다. G418 내성 클론으로부터의 세포 배양 상등액을 면역 글로불린을 포착하기 위해 염소 안티-사람 카파를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 면역 글로불린 생성에 대해 검정하였다. 면역 글로불린 결합을 사람 IgG에 대해 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 콘쥬게이트 염소 항체로 인큐베이팅시킨 후, 0.0175% H2O2를 포함하는 시트르산염 완충제(9-34 g/l C6H8O7및 14.2 g/l Na2HPO4)(pH 5.0) 중에서 HRP 기질, 0.4㎎/㎖ O-페닐렌-디아민(OPD)로 인큐베이팅시킴으로써 측정하였다. 플레이트를 490 nm에서 Molecular Decices "Vmax, kinetic microplate reader" 분광기에서 판독하였다.
실시예 10
인간화 24 내지 31에 의한 gp39에 대한 CD40-Ig 결합의 차단
인간화 안티-gp39가 gp39에 결합한 것을 확인한 후에, 인간화 안티-gp39가 이것의 수용체에 대한 리간드의 결합을 차단하기 위한 능력을 보유함을 확인하기 위한 검정을 수행하였다. 이를 위해, 활성화된 사람 말초혈 T 세포, 또는 gp39-형질감염된 CHO 세포인 50D4를 4℃에서 15분 동안 쥐과 동물 24 내지 31의 분류된 농축물 및 인간화 변형체 1 및 변형체 2 24 내지 31으로 사전 처리하였다. 상기 사전 인큐베이션 후에, CD40-Ig-비오틴을 첨가하고, PE-아비딘을 사용한 흐름 세포학에 의해 결합을 측정하였다. 도 26은 변형체 1이 4㎍/㎖에서 CD40-Ig 결합을 50% 감소시키고, 쥐과 동물 24 내지 31이 약 12㎍/㎖에서 결합을 50% 감소시키고, 변형체 2가 20㎍/㎖ 이상에서 결합을 50% 감소시킴을 예시한다.
실시예 11
24 내지 31에 의한 B 세포 증식 및 분화의 차단
쥐과 동물 24 내지 31이 gp39 기능을 차단하는 지를 확인하기 위해, B 세포를 일정 용량 범위의 쥐과 동물 24 내지 31 또는 인간화 24 내지 31의 존재 또는 부재하에 gp39(gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질과 배양하였다. B 세포 증식 반응을 도 2A에 도시된 바와 같이3H-티미딘 혼입에 의해 검정하였다.
T 세포 의존성 B 세포 분화(Ig 생성)를 gp39에 대해 mAb에 의해 차단하였다. 쥐과 동물 24 내지 31 항체가 활성화된 사람 T 세포의 표면 상에서 발현되는 온전한 gp39의 기능을 차단하는 데에 효과적인지를 확인하기 위해, T 세포 유도 B 세포 분화를 억제하기 위한 상기 인간화된 24 내지 31 항체의 능력을 검정하였다. B 세포를 인간화 24 내지 31 및 쥐과 동물 24 내지 31의 존재 또는 부재하에 안티-CD3 활성화 T 세포와 동시 배양하였다. 다클론성 IgM, IgG 및 IgA 생성을 12일 후에 검정하였다 (도 2B 참조). 이들 결과로, 안티-gp39 24 내지 31이 CD40 결합을 차단할 수 있고, CD40을 통한 T 세포 의존성 B 세포 활성화에 간섭할 수 있음이 확인되었다.
실시예 12
결합 용량
본 실시예는 항체의 농도에 대해 gp39 항원에 대한 쥐과 동물, 키메라 및 인간화(변형체 1) 24 내지 31 항체의 반응성을 측정하기 위해 수행하였다.
프로토콜 :
플레이트 제조
1. 96-웰 플레이트 상의 각각의 웰에 50개의 폴리-1-리신을 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 가볍게 쳐서 폴리-1-리신을 제거하였다.
2. mgp39-CHO 세포(실시예 5에 기술된 막 gp39인 세포 표면을 발현시키는 차이니즈 햄스터 난세포)를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리시킴으로써 HBSS로 3회 세척하였다. 세포를 HBSS 중에 2x106세포/㎖로 재현탁시켰다.
3. 50㎕의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 2000 rpm에서 원심분리시켰다.
4. 50㎕/웰의 얼음 냉각 0.5% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅시켰다.
5. 플레이트 및 얼룩을 가볍게 쳐서 과량의 글루타르알데히드를 제거하였다. 0.1% BSA를 갖는 150㎕/웰의 100 mM 글리신을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트는 즉시 사용하거나, 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 동결시킬 수 있다.
결합 검정
1. 플레이트를 해빙시키고, 글리신 완충제를 제거하였다.
2. 1㎍/㎖에서 출발하여 희석 완충제 중에서 시험 항체를 연속적으로 희석시켰다 (1:2). 50㎍/웰의 각각의 희석물을 중복 전달하였다. 실온에서 2시간 동안인큐베이팅시켰다.
3. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
4. 염소 안티-사람 IgG HRP 또는 염소 안티-마우스 IgG HRP의 1:2000 희석물 50㎕/웰을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다.
5. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
6. 50㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가하고, 플레이트를 20-30분 동안 전개시켰다. 플레이트를 490 nm의 백그라운드 파장과 함께 405 nm의 파장에서 판독하였다.
7. 흡수도 대 항체 농도의 그래프를 플롯팅하였다.
결과 및 결론 :
항체의 농도에 대해 3개의 안티-gp39 항체(24 내지 31의 쥐과 동물, 키메라 및 인간화 변형체 1)에 대한 결합 용량은 본질적으로 상위에 있다 (도 9 참조). 이것은 이들 항체가 사람 gp39에 대해 유사한 결합 용량을 가짐을 잘 제시하는 것이며, 이는 인간화 항체가 쥐과 동물 24 내지 31의 gp39 결합 친화성을 보유함을 제시하는 것이다.
실시예 13
비오틴 표지 쥐과 동물 24 내지 31과 키메라 및 인간화 변형체 1 24 내지 31 사이의 경쟁
24 내지 31과 이것의 키메라 및 인간화 변형체 사이의 결합의 유사성을 결정하기 위해, gp39에 결합시키기 위한 원래의 쥐과 동물 항체와 경쟁시키기 위한 유도체의 능력을 측정하는 데에 도움을 주는 연구를 수행하였다. 상기 연구로부터, 결합의 2/3 포화가 약 200 ng/㎖ 24 내지 31에서 도달됨을 확인하였다. 상기 양을 경쟁 검정에 사용하였다. H24 내지 31을 비오틴일화시켜서, 24 내지 31의 직접 결합만을 측정하였고, 24 내지 31의 감소된 결합으로서 경쟁을 측정하였다. 상이한 농도의 키메라 및 인간화 24 내지 31 변형체를 200 ng/㎖의 최종 농도로 비오틴일화된 쥐과 동물 24 내지 31과 혼합시키고, 글루타르알데히드를 갖는 플레이트에 고정된 gp39 CHO 세포로 피복시킨 ELISA 플레이트의 벽 내에 분포시켰다. 24 내지 31 결합 수준을 하기에 기술되는 바와 같이 아비딘-HRP를 사용하여 측정하였다.
프로토콜 :
1. 96-웰 플레이트 상의 각각의 웰에 50개의 폴리-1-리신을 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 가볍게 쳐서 폴리-1-리신을 제거하였다.
2. mgp39-CHO 세포를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리시킴으로써 HBSS로 3회 세척하였다. 세포를 HBSS 중에 2x106세포/㎖로 재현탁시켰다.
3. 50㎕의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 2000 rpm에서 원심분리시켰다.
4. 50㎕/웰의 얼음 냉각 0.5% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅시켰다.
5. 플레이트 및 얼룩을 가볍게 쳐서 과량의 글루타르알데히드를 제거하였다. 0.1% BSA를 갖는 150㎕/웰의 100 mM 글리신을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트는 즉시 사용하거나, 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 동결시킬 수 있다.
경쟁 검정
1. 플레이트를 해빙시키고, 글리신 완충제를 제거하였다.
2. 마우스 안티-gp39 비오틴을 PBS 중에서 200 ng/㎖ 까지 1% BSA로 희석시켰다.
3. 1㎍/㎖에서 출발하여 희석 완충제 중에서 시험 항체(마우스, 키메라 및 인간화 24 내지 31)를 연속적으로 희석시켰다 (1:2).
4. 50㎕의 희석된 시험 항체 및 마우스 안티-gp39 비오틴을 각각의 웰에 중복 전달하였다. 수개의 웰은 최대 대조군으로서 마우스 안티-gp39 비오틴을 갖는 50㎕ 희석 완충제를 함유해야 한다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅시켰다.
5. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
6. 스트렙트아비딘 HRP의 1:2000 희석물 50㎕/웰을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다.
7. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
8. 50㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가하고, 플레이트를 20-30분 동안 전개시켰다. 플레이트를 490 nm의 백그라운드 파장과 함께 405 nm의 파장에서 판독하였다.
9. 억제율(%)을 대조군 웰의 평균을 사용하여 계산하였다.
결과 및 결론 :
모든 3개의 항체가 비오틴 표지 24 내지 31과 동등하게 경쟁하였다 (도 10 참조). 경쟁 프로필은 검정의 범위 내에서, 모든 농도에서 본질적으로 상위에 있다. 이것은 시험된 인간화 항체(변형체 1)가 gp39 결합 친화성을 보유함을 나타낸다.
실시예 14
T 세포 의존성 B 세포 분화의 조절
인간화 24 내지 31이 쥐과 동물 24 내지 31의 생체외 기능 활성을 보유하는 지를 확인하기 위해, 인간화 24 내지 31을 "립스키(Lipsky)" 검정으로 쥐과 동물 24 내지 31과 비교하였다. 공여자 말초혈 단핵 세포를 2개의 분획, 즉 T 및 B 세포 분획으로 분리하였다. T 세포를 먼저 미토마이신 C로 처리하여 유사분열을 방지한 후, 안티-CD3 항체로 활성화시켰다. B 세포를 쥐과 동물 또는 인간화(변형체 1) 24 내지 31 항체와 함께 첨가하였다. 항체 비함유 포지티브 대조군 및 B 세포 비함유 네가티브 대조군을 실험에 포함시켰다. 10일간의 인큐베이션 후에, 상등액을 사람 IgM의 존재에 대해 시험하였다.
프로토콜 :
1. 96-웰 플레이트를 37℃에서 2시간 동안, 50㎕/웰의 무균 4㎍/㎖ 안티-CD3 항체(50mM Tris(pH 9) 중에서 희석시킴)로 피복시켰다.
2. T 및 B 세포를 림포-크윅(Lympho-Kwick) 시약을 사용하여 담황갈색 피복으로부터 선택적으로 분리시켰다. T 세포를 37℃에서 30분 동안 5x106세포당 미토마이신 C 50㎍/㎖로 활성화시켰다.
3. 플레이트를 무균 HBSS 또는 배지로 수회 세척하여 비접착 항체를 제거하였다.
4. 1x105정제 T 세포(2x106/㎖)를 각각의 웰에 첨가하였다.
5. 1x105정제 B 세포(5x106/㎖)를 각각의 웰에 첨가하였다. 50㎕ 안티-gp39 항체(10-0.1㎍/㎖)를 각각의 웰에 4회 첨가하였다. 대조군 웰은 하기 항체를 함유한다 : a) 0 항체, b) 0 항체, T 세포 비함유, 및 c) 0 항체, B 세포 비함유.
6. 플레이트를 12일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이팅시켰다.
7. 이중 웰 상에서 3H 티미딘 또는 임의의 다른 허용될 수 있는 방법을 사용하여 7일 후에 세포 성장을 평가하였다.
8. 12일 후에, 이중 웰로부터 상등액을 수집하고 ELISA를 수행하여 Ig 생성(IgM)을 결정하였다.
결과 및 결론 :
결과는 사람 IgM의 생성이 0.01㎍/㎖ 미만의 농도에서 인간화 24 내지 31에 의해 50% 억제됨을 보여주며, 이는 쥐과 동물 24 내지 31에 의해 얻어진 억제 수준과 유사하다 (도 11 참조). 인간화 항체는 상기 실험에서 T 세포 의존성 B 세포 분화(IgM 생성)을 억제하기 위한 능력을 보유한다.
실시예 15
인간화 24 내지 31, 변형체 2의 평가
본 실시예는 변형체 1과 비교하여 인간화 24 내지 31 변형체 2가 직접 결합 검정에서 유사한 gp39 결합 용량을 갖는 지를 측정하기 위해 수행하였다.
프로토콜 :
상기 실시예 13에서와 동일하다.
결과 및 결론 :
결과는 2개의 24 내지 31 변형체의 결합 용량이 본질적으로 상위에 있음을 보여준다 (도 12 참조). 이것은 2개의 변형체가 gp39에 대해 필적하는 결합 활성을 가짐을 제시한다.
실시예 16
본 실시예는 24 내지 31 및 2개의 인간화 변형체 1 및 2의 Kd를 측정하기 위해 수행하였다.
프로토콜 :
예정된 양의 3개의 항체(쥐과 동물, 변형체 1 또는 변형체 2 24 내지 31)를 IODO-BEADS(등폭상표)(피어스)를 사용하여125I로 표지화하였다. 항체 결합-125I를 세파덱스 G25/DEAE/암버라이트 칼럼 상에서 크기 분리에 의해 유리125I로부터 분리하였다.
쥐과 동물 gp39-CHO 세포에 대한125I 표지화 항체의 직적 결합을 일련의 희석으로 시험하여, 계수/㎍ 및 적합한 작용 농도(최대 결합 농도의 약 50%) 둘 모두를 측정하였다.
125I 표지화 항체를 혼합시키고, 일련의 희석으로 비표지화 항체와 인큐베이팅시켰다. 결합된 항체의 총량 및 유리 항체의 양을 기준으로 하여, 결합 대 비결합 그래프로부터 스캣챠드 플롯을 생성시켰다. 전체 항체 농도는 하나의 활성 자리에 대해 75kD의 표준 크기를 기준으로 한 것이다.
Kd를 "베스트 핏" 라인을 형성시킴으로써 계산하였다. 곡선의 기울기의 역수가 Kd이다. 상관 계수 γ2을 또한 계산하였다.
결과 :
스캣챠드 플롯을 분석하였다. 상기 분석으로부터의 Kd는 다음과 같다 : 변형체 2, Kd=14nM ; 쥐과 동물 24 내지 31, Kd=8.51nM; 변형체 1, Kd=5.6nM. 결과를 각각 도 13(쥐과 동물), 14(변형체 1) 및 15(변형체 2)에 도시하였다. 이들 결과는 상기 인간화 항체가 24 내지 31과 유사하게 gp39 항원을 결합시킨다는 추가의 증거를 제공한다.
실시예 17
H24 내지 31.1의 FcRI 결합
FcRI 결합을 사람 FcRI에 대해 코드화시킨 유전자로 형질감염된 CHO 세포주에서 수행하였다 (도 16). H24 내지 31.1에 의한 Fc 수용체에 대한 결합을 사람 gp39의 세포외 부분에 결합된 CD8의 세포외 부분으로 구성된 융합 단백질의 형태로 가용성 혜39의 존재 또는 부재하에 검정하였다. 도 16은 항원에 착화되는 경우에 H24 내지 31.1 만이 FCRI에 결합함을 도시하고 있다.
실시예 18
H24 내지 31.1의 FcRII 결합
FcRII 결합은 사람 FcRII에 대한 유전자 코딩으로 트랜스펙션된 마우스 섬유아세포계를 사용하여 수행하였다(도 17). H24 내지 31.1의 Fc 수용체로의 결합은 gp39의 세포외 부분에 결합된 CD 8의 세포외 부분으로 이루어진 융합 단백질의 형태로 가용성 GP39와 함께 또는 없이 검정하였다. 도 17은 항원에 착화되는 경우에 H24 내지 31.1 만이 FC 수용체 11에 결합함을 도시한 것이다.
실시예 19
보체 의존성 세포 독성에 있어서 H24 내지 31.1의 효과
H24 내지 31.1를 5% 토끼 보체의 존재하에서 다양한 농도로 gp39 + CHO 세포에 첨가하였다. CHO 세포의 성장을 알라마르 블루(alamar blue)로 관찰하였다. 도 18은 H24 내지 31.1가 약 0.5㎍/㎖에서 세포 성장을 50% 억제시킴을 나타내고 있다.
실시예 20
H24 내지 31.1에 결합된 gp39+CHO의 C1q 결합의 측정
다양한 농도의 H24 내지 31.1로 표지화된 gp39+CHO 세포를 과량의 사람 C1q(보체 인자 1)중에서 인큐베이팅시키고, 이어서 FITC 표지화된 염소 항사람 C1q로 인큐베이팅시켰다. 이 샘플들을 플로우 시토메트리(flow cytometry)로 분석하여 C1q로의 세포의 상대적 표지화를 측정하였다(도 19). 도 19는 C1q로의 세포의 표지화가 항체 농도에 의존하며, H24 내지 31.1 Fab 단편(C1q 결합 없음)이 C1q에 결합하지 않음을 도시한 것이다.
실시예 21
T 세포 의존성 리콜 항원에 대한 T 세포 반응에서 H24 내지 31.1의 효과
사람 말초혈 림프구를 10% 사람 AB 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산을 포함하는 이스코베스 개질된 둘베코 매질(Iscoves Modified Dulbecco's media)에서 배양하였다(도 20). 하나를 제외하고 모든 배양액에 10㎍/㎖의 파상풍 톡소이드가 제공되었다. 파상풍 톡소이드로 프라임된 배양액 또한 0 내지 10㎍/㎖의 H24 내지 31.1가 제공되었다. 3일 후, IL-2 함량을 측정하기 위해 상청액을 취하였다. 추가 2일후, 모든 배양액에 1μCi3H-티미딘/㎖이 16 시간 동안 제공되었다. 세포를 수집하고, 성장의 척도로서 티미딘의 염색체로의 혼입을 시험하였다. 파상풍 톡소이드가 없는 배양액은 약 2ng/㎖인 검출 한계 미만의 양으로 EL-2를 가졌다. 이들 동일한 배양액은 약 300cpm인 눈에 띄지 않는 수준의 혼입된3H-티미딘을 가졌으며, H24 내지 31.1로 처리함에 의해 분명히 영향을 받지 않았다(미도시됨). 도 20은 TT 유도 성장 및 IL-2 생성이 1㎍/㎖ 이상의 H24 내지 31.1에 의해 최대로, 약 40% 억제되었다.
실시예 22
T 세포 의존성 B 세포 감별에 대한 H24.31.1의 효과
96웰 플레이트를 밤새 2㎍/㎖로 안티-CD3 항체로 피복하고 사용 전에 PBS로 강력하게 세척하였다. 담황갈색의 코우트로부터 말초혈 림프구를 T 세포 분획 및 B 세포 분획으로 분리하였다. T 세포를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅시키기 전에 1 시간 동안 미토마이신 C로 인큐베이팅시켰다. 이후, B 세포는 10% 태아 송아지 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산이 추가된 이스코베스 개질된 둘베코 매질중에 첨가하였다. 이 세포를 H24 내지 31.1의 존재하에서 0 내지 10 ㎍/㎖의 다양한 농도로 인큐베이팅하였다. 12일 후, 상청액을 취하여 사람 IgG의 존재를 시험하였다(도 21). 도면은 인간화된 H24 내지 31.1이 1ng/㎖에서 T 세포 의존성 IgG 생성을 약 85% 억제함을 나타내고 있다.
실시예 23
T 세포 의존성 B 세포 감별에 대한 H24.31.1 Fab의 효과
96웰 플레이트를 밤새 2㎍/㎖로 안티-CD3 항체로 피복하고 사용 전에 PBS로 강력하게 세척하였다. 담황갈색의 코우트로부터 말초혈 림프구를 T 세포 분획 및 B 세포 분획으로 분리하였다. T 세포를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅시키기 전에 1 시간 동안 미토마이신 C로 인큐베이팅시켰다. 이후, B 세포는 10% 태아 송아지 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산이 추가된 이스코베스 개질된 둘베코 매질중에 혼합하였다. 이 세포를 H24 내지 31.1 및 H24 내지 31.1 Fab의 존재하에서 0 내지 10 ㎍/㎖의 다양한 농도로 인큐베이팅하였다. 12일 후, 상청액을 취하여 사람 IgG의 존재를 시험하였다(도 22). 도면은 전체 H24 내지 31.1 항체 및 Fab 단편 간에 IgG 생성의 억제에 있어서 차이가 없음을 나타내고 있다.
실시예 24
T 세포 의존성 리콜 항원에 대한 항원 특이적 B 세포 반응발생에서의 H24 내지 31.1의 효과
시험관내 3일 동안 파상풍 톡소이드로 프라임된 사람 비장 세포를 약 1 X 107세포/SCID의 농도로 SCID 마우스에 전사하였다. 6일 후, 이에 따른 hu-SPL-SCID 마우스에 PBS(그룹 1) 또는 300㎍ H24 내지 31.1(그룹 1 및 2)를 주입하였다. 그룹 3의 마우스는 추가로 각각 3일 간격으로 300㎍의 H24 내지 31.1를 2회 주입하였다. 여러 시점에서 마우스의 혈액을 취하고, 사람 IgG 안티-파상풍 톡소이드 적정 농도의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다(도 23). 도 23은 H24 내지 31.1의 주입이 파상풍 톡소이드 특이적 반응의 발생을 약 90% 억제함을 나타내고 있다.
실시예 25
사람 B-세포 증식에 대한 H24 내지 31.1 항체의 효과
본 실험의 목적은 H24 내지 31.1 항체에 의한 B 세포 증식의 가용성 gp39-CD8 유도 억제를 증명하는 것이다.
담황갈색 코우트로부터의 림프구 제제는 제조업자(Cat# LK-25-B, LK-50-B, One Lambda, Inc., CA 91303)에 의해 추천된 원안에 따른 림포-퀵(Lympho-Kwik) 시약에 의해 B 세포(>90%)가 농후하게 되었다. 96 웰 각각에 1 X 105세포로 1000U/㎖의 IL4(Genzyme, Corp)에 의해 배양된 농후된 사람 B 세포를 4일 동안 다양한 농도의 H24 내지 31.1 항체 + 10㎍/㎖의 gp39-CD8로 인큐베이팅시켰다. 인큐베이션 도중 마지막 16시간 동안 배양액을 1μCi/웰의3H 티미딘으로 펄스(pulse)하고, 증식 세포에 의한 방사활성의 혼입을 측정하였다. 도 24는 투여량 의존 방식으로 gp39-CD8에 의한 B 세포 증식을 보여준다. 도 25는 H24 내지 31.1RK gp39-CD8 의존성 B 세포 증식을 억제함을 증명하고 있다.
용도
본 발명의 인간화된 안티-gp39 항체는 gp39 변화 및/또는 gp39-CD40 상호작용의 억제가 치료적으로 유익한 질병 상태를 치료하는 데 효과가 있다. 또한, 본 발명의 인간화된 안티-gp39 항체는 항원에 대한 항체 반응의 억제가 바람직한 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 상태에는 자가면역 및 비자가 면역 질병이 모두 포함된다.
B 세포에서 CD 40 신호화를 억제하는 안티-gp39 항체의 능력은 기능적으로 생체내에서 T 세포 의존성 항체 반응의 현저한 억제율로 해석된다. 따라서, 자가항체 생성에 의해 매개되는 자가면역 질병은 안티-gp39 항체 치료법이 유용한 것으로 기대할 수 있다. 이러한 질병에는 전신성 홍반성 루프스, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 중증군 무력증 및 항인슐린 및 항인슐린 수용체 항체를 갖는 당뇨병 환자의 아군이 포함된다. 또한, B 세포 및 수상돌기 세포에서의 CD40 신호화는 B7.1 및 B7.2 분자와 같은 공동 신호화 수용체의 상향조절에 필수적이다. 항 gp39 항체에 의한 이러한 CD40 신호화의 차단은 T 세포에 대한 항원 출현을 방해하고, 이 결과 T 세포 활성화 및 T 세포 매개 반응의 억제를 초래한다. CIA, EAE, NOD 마우스, GVHD 및 이식 거부와 같은 질병 모델에서 항 gp39 항체의 치료적 효능은 T 세포 매개된 반응에 대한 상기 항체의 억제 효과를 확인시켜 준다. 동물 모델에서의 효능에 의해 지지된 이러한 작용의 메카니즘을 바탕으로 하여 본 발명의 인간화된 항 gp39 항체의 치료적 효과는 RA, MS, 당뇨병, 건선, GVHD 및 이식 거부와 같은 질병에 연장된다.
본 발명의 인간화된 항체의 투여에 의해 치료가능한 특이적 상태로는 하기와 같은 질병이 포함된다:
알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 흑색극 세포증, 알레르기성 접촉 피부염, 애대슨병, 아토피 피부염, 원형탈모증, 범발성 탈모증, 아밀로이드증, 아나필락시양 자반병, 아나필락시양 반응, 무형성 빈형, 유전성 맥관부종, 특발성 맥과부종, 강직성 척추염, 두 개동맥염, 거세포동맥염, 타카야수동맥염, 측두동맥염, 천식, 혈관확작성 운동실조증, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 폴리엔도크린 부전증, 베체트 병, 베르거(Berger)병, 부에르거(Buerger)병, 수포성 유천포창, 만성 점막피부성 칸디다증, 카플랜(Caplan) 증후군, 심근경색후 증후군, 심낭막절개술 증후군, 심장염, 복강 스프루우, 샤가스병, 세디아크-히가시 증후군, 커그-스트라우스(Churg-Strauss) 병, 코간스 증후군, 한랭응집질환, CREST 증후군, 크론병, 한랭글로불린혈증, 잠복성 섬유성 폐포염, 포진성 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 다이아몬드-블랙팬(Diamond-Bladkfan) 증후군, 디조지(DiGeorge) 증후군, 원판상 홍반 루푸스, 호산구성 근막염, 상공막염, 드라이테마 엘리바툼 디우티넘(Drythema elevatum diutinum), 마그나튬(marginatum) 홍반, 다형 홍반, 결절 홍반, 가족성 지중해열, 펠티증후군, 폐 섬유증, 아나필락시양 사구체신염, 자가면역 사구체신염, 포스트-연쇄구균성 사구체신염, 포스트-이식 사구체신염, 막성 사구체신병증, 구드패스츄어 증후군, 이식편 대 숙주질환, 면역 중개 과립구감소증, 원형 육아종, 알레르기성 과립구증가증, 육아종증성 근염, 그레이브 병, 하시모토 갑상선염, 신생아의 용혈성 질환, 특발성 혈색소증, 헤노호-라쉔인 자반병, 만성 활성 및 만성 진행 간염, 조직구증 X, 과호산구증가 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 잡(Job) 증후군, 연소성 피부근염, 연소성 류머티스 관절염(연소성 만성 관절염), 카와사키 병, 각막염, 건성각결막염, 란드리-구일리안-바르-스트로홀(Landry-Guillain-Barre-Strohl) 증후군, 나종성 나병, 뢰플러 증후군, 릴리(Lyell) 증후군, 리메(Lyme) 병, 육아종성 림프종증, 전신성 비반 세포증, 혼합된 연결조직 병, 다발성 단신겸염, 머클-웰(Muckle-Well) 증후군, 피부점막림프절 증후군, 다중심세망조직구증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 균상종 진균병, 전신성 괴사성 맥관염, 신중 증후군, 중첩 증후군, 지방층염, 발작성 한성 혈색소뇨증, 발작성 야행성 혈색소뇨증, 천포창성 질병, 천포창, 청포창 홍반증, 낙엽상 천포창, 심상성 천포창, 비둘기 사육사병, 폐렴, 과민성, 결절성 다발 동맥염, 류머티스 다발성 근육통, 다발성 근염, 특발성 다발성 신경염, 포푸투칼계 다발성 신경병증, 전자 간증/자간, 원발 담즙성 간경변증, 진행성 전신 경화증(피부 경화증), 건선, 류머티스 건선, 폐포단백증, 폐포 섬유증, 레이노 현상/증후군, 레이델(Redel) 갑상선염, 라이터 증후군, 재발성 다발성 연골염, 류머티스 열, 류머티스관절염, 사르코이드증, 공막염, 경화성 담관염, 혈청병, 세자리 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 스틸(Still) 병, 아급성 경화성 범뇌염, 교간성 안염, 전신성 홍반성 루푸스, 이식 거부증, 궤양성 대장염, 비분환 연결조직 질환, 만성 두드러기, 한랭 두드러기, 포도막염, 백반, 웨버-크리스친 병, 베게너육아종증, 비스콧-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군.
이들 중, 안티-gp30 항체의 투여에 의해 치료될거나 표출될 수 있는 바람직한 징후는 자가면역성 용혈성 빈혈, 무형성 빈혈, 측두 관절염, 진성 당뇨병, 펠티 증후군, 구드패스츄어 증후군, 이식편 대 수주질환, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 중증근무력증, 다발성 경화증, 결절성 다발동맥염, 건선, 류머티스 건선, 류머티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 천식, 알레르기성 질환 및 이식 거부증을 포함한다.
치료학적 효과를 유도하기에 유용한 항체의 양은 보통의 당업자에 잘 공지된 표준 기술에 의해 측정할 수 있다. 항체는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 완충제내에서 표준 기술에 의해 제공될 것이고, 어떠한 원하는 루트에 의해서나 투여될 수 있다. 현재 청구된 항체의 효능 및 사람에 의한 이들의 내성으로 인하여 사람에게 생기 다양한 질환 또는 질환 상태를 물리치기 위해 이들 항체를 각각 투여하는 것이 가능하다.
본 발명의 안티-gp39 사람화된 항체 (또는 이들의 단편)은 또한 면역 조정, 예를 들어 사람 또는 동물 면역 시스템의 억압을 유도하는데 사용된다. 그러므로 본 발명은 비독성의 유효량의 본 발명의 항체를 사람 또는 다른 동물에게 투여함으로써 사람 또는 다른 동물에서 이것의 필요에 따라 예방 또는 치료학적으로 면역 조정을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체가 면역억압 유도에서 이용되는 사실은 이들이 이식된 기관 또는 조직(예를 들어, 신장, 심장, 폐, 뼈골, 피부, 각막 등)에 대한 저항성 또는 거부의 치료 또는 예방, 자가면역, 염증, 세포 분열 및 과세포 분열 질환의 치료 또는 예방, 및 면역학적으로 매개된 피부 발현 질환 (예를 들어 류머티스양관절염, 홍반성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 병, 다발성 경화증, EAE, 중증근무력증, 제 I 형 당뇨병, 포도막염, 네프로시스 증후군, 건선, 아토피 피부염, 접촉 피부염, 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 펨플루구스, 수포성 유천포창, 수포성 표피 박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부 호산구증다증, 원형 탈모증 등의 치료 및 예방; 가역성 폐쇄성 기도 질환, 장 염증 및 알레르기(예를 들어, 체강 질환, 직장염, 호산구성 위소장염, 비반세포증, 크론 질환 및 궤양성 대장염)의 치료 및 식품 관련 알레르기(예를 들어 편두통, 비염 및 습진)의 치료에 유용한 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체는 면역조정이 바람직한 비자가 상태, 예를 들어, 이식편 대 숙주질환(GVHD), 이식 거부, 천식, 빈혈성 백혈병, HIV, 림프종 등의 치료에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 벡터 또는 재조합 바이러스(예를 들어, 치료 DNA를 함유하는)를 투여하기 전, 동시 또는 후에 투여되어 상기 벡터에 대한 숙주 면역(체액) 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
당업자들은 일반적인 실험에 의해 면역 억제를 유도하기 위해 효과적이고 비독성의 양의 항체를 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 효과적인 투여량은 일당 체중당 약 0.05 내지 100㎎일 것이다.
본 발명의 항체는 치료 또는 예방을 위해 이러한 효과를 얻기 위한 충분한 양으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 사람 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 이러한 본 발명의 항체는 종래의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 공지된 기법에 따른 희석제와 혼합되어 제조된 종래의 투여 형태로 사람 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 당업자들은 약제학적으로 허용가능한담체 또는 희석제의 형태 및 특성이 혼합하려는 활성 성분의 양, 투여 경료 및 기타 널리 공지된 변수에 의해 규정될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 항체(또는 이의 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구일 수 있으며, 흡입에 의해 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 비경구는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 또는 복강내 투여가 포함된다. 비경구 투여의 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 화합물을 사용하여 예방적으로 또는 치료적으로 면역 억제를 유도하기 위한 매일 비경구 및 경구 투여 치료법은 일반적으로 일당 체중 ㎏당 약 0.05 내지 100㎎이나, 바람직하게는 약 0.5 내지 10㎎이다.
본 발명의 항체는 또한 흡입에 의해 투여될 수 있다. "흡입"이란 비강내 및 경구 흡입 투여를 의미한다. 에어로졸 제형 또는 투여량 계측 흡입기와 같은 이러한 투여의 적합한 투여 형태가 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다. 사용하려는 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 일반적으로 약 10 내지 100㎎이다.
본 발명의 항체는 또한 국부적으로 투여될 수 있다. 국부적 투여란 비전신 투여를 의미하며, 외피, 구강 외측으로 본발명의 항체(또는 이의 단편) 화합물을 도포하고 귀, 눈 및 코와 혈류가 상당히 유입되지 않는 곳에 이러한 항체를 적하하는 것을 포함한다. 전신 투여는 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 치료 또는 예방 효과에 요구되는 항체의 양은 물론 선택된 항체, 치료하려는 상태의 심각도 및 치료중인 동물에 따라 다르며, 최종으로는 의사에 판단에 따른다. 본 발명의 항체의 적합한 국부 투여량은 일반적으로 일당 체중 ㎏당 약 1 내지 100㎎이다.
제형
항체 또는 이의 단편을 단독으로 투여할 수 있지만, 약제학적 제형으로서 제공하는 것이 바람직하다. 활성 성분은, 국부 투여에 대해서는 제형의 0.001% 내지 10% w/w, 예를 들어 제형의 1% 내지 2%를 포함할 수 있으나, 10% w/w 까지 포함할 수 있다. 그러나, 제형의 5% w/w를 초과하지 않는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1% 내지 1%를 포함할 수 있다.
본 발명의 국부 제형은 활성 성분과 함께 이에 대한 하나 이상의 허용가능한 담체 및 임의로 다른 치료 성분을 포함한다. 담체는 제형의 나머지 성분과 상용할 수 있다는 의미에서 허용가능하며, 수용자에게 유해하지 않아야 한다.
국부 투여에 적합한 제형에는 피부를 통해 치료가 요구되는 부위에 침투하기 적합한 액체 또는 반액체 제제, 예를 들어, 바르는 약, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기 적합한 점액이 포함된다.
본 발명에 따른 점액은 살균한 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있으며, 활성 성분을 살균 및/또는 살진균제 및/또는 기타 적합한 방부제, 및 바람직하게는 계면 활성제를 포함하는 적합한 수용액에 용해시키므로써 제조될 수 있다. 형성된 용액은 이후 여과에의해 분류되어 적합한 용기에 옮겨진 후 밀봉되고 오토클레이빙 또는 30분 동안 90 내지 100℃에서 유지시키므로써 살균된다. 다르게는, 상기 용액은 여과에 의해 살균되고, 방부 처리하므로써 용기에 옮겨질 수 있다. 점액에 내포되기에 적합한 살균 및 살진균제의 예로는 페닐수은 니트레이트 또는 아세테이트(0.02%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)가 있다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매로는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 바르기에 적합한 것들이 포함된다. 눈용 로션은 임의로 살균제를 포함하는 살균 수성 로션을 포함하며 점액의 제조 방법과 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 피부에 바르기 위한 로션 또는 바르는 약은 또한 알코올 또는 아세톤과 같은 피부의 건조를 촉진하고 서늘하게 하는 시제 및/또는 글리세롤과 같은 모이스처라이저(moisturizer) 또는 피마자유 또는 아라키스 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외용약에 대한 활성 성분의 반고체 제형이다. 이들은 활성 성분을 미세하게 분할되거나 분말화된 형태로, 단독으로, 또는 수성 또는 비수성 유체중의 용액 또는 현탁액으로 적합한 기계의 보조로, 유지성 또는 비유지성 기재와 함께 혼합하므로써 제조될 수 있다. 이러한 기재에는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속성 비누와 같은 탄화수소, 점액, 아몬드, 옥수수, 아라키스, 피마자 또는 올리브 오일과 같은 천연 오일, 양모지 또는 이들의 유도체, 또는 프로필렌 글리콜 또는 매크로골과 같은 알코올과 함께 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 비이온성 계면활성제, 양이온 또는 음이온성 계면활성제와 같은 적합한 계면활성제를 혼입시킬 수 있다. 천연 검, 셀룰로오스 유도체 또는 규소질 실리카와 같은 무기 물질과 같은 현탁제 및 라놀린과 같은 기타 성분이 포함될 수 있다.
당업자들은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 최적 양 및 각각의 투여 간격이 치료하려는 상태의 특성 및 범위, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치려하려는 특정 동물에 의해 결정될 것이며, 이러한 최적 조건은 종래의 기술에 의해 결정될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 당업자들은 치료의 최적 과정, 즉 한정된 날수 동안 매일 제공되는 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 투여 횟수가 종래의 치료 결정 시험 과정을 사용하여 당업자들에게 확인될 수 있음을 인지할 것이다.
더 이상 상술할 필요 없이 당업자들은 상기 설명을 사용하여 본 발명의 전체적으로 사용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기는 본 발명의 예시적 실시예인 것으로 해석되며, 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
캡슐 조성물
본 발명의 캡슐 형태의 약제 조성물을, 본 발명의 50㎎의 항체 또는 이들의 단편을 가지는 표준의 2 조각 경질 젤라틴 캡슐에 100㎎의 락토스, 32㎎의 탈크 및 8㎎의 마그네슘 스테아레이트를 채워 제조하였다.
주사용 비경구 조성물
주사하여 투여하기에 적합한 형태의 본 발명의 약제 조성물을, 10k(부피)의 프로필렌 글리콜 및 물중에서 1.5k(중량)의 본 발명의 항체 또는 단편을 교반하여 제조하였다.
연고 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
백색의 연질 파라핀으로 100.0g이 되도록
본 발명의 항체 또는 이의 단편을 소량의 비히클중에서 분산시켜 유연하고 균질한 생성물을 제조하였다. 이후, 붕괴가능한 금속 튜브에 상기 분산액을 충전하였다.
국부 크림 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
소르비탄 모노라우레이트 0.6g
폴리소르베이트 20 0.6g
세토스테아릴 알코올 1.2g
글리세린 6.0g
메틸 히드록시벤조에이트 0.2g
정제수 B.P. 100.00㎖가 되도록(B.P. = British Pharmacopeia)
메틸 히드록시벤조에이트 및 글리세린을 75℃하의 70㎖의 물중에서 용해시켰다. 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 75℃에서 함께 용해시키고, 수용액에 첨가하였다. 형성된 에멀션은 균질화시키고 지속적으로 교반하여 냉각시키고, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 나머지 물중에서 현탁액으로서 첨가하였다. 전체 현탁액을 균질화될 때까지 교반하였다.
눈용 점액 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 0.5g
메틸 히드록시벤조에이트 0.01g
프로필 히드록시벤조에이트 0.04g
정제수 B.P. 100.00㎖가 되도록
메틸 및 프로필 히드록시벤조에이트를 75℃에서 정제수 70ml에 용해시키고 생성된 용액을 냉각시킨다. 그 후 본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 첨가하고, 용액을 막 필터(구멍 크기: 0.022 Am)를 통해 여과시키고, 적당한 살균 용기내로 살균적으로 팩킹시킴으로써 살균시켰다.
흡입에 의해 투여하기 위한 조성물
용량이 15-20ml인 에어로졸 용기에, 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제 0.2-0.5k와 함께 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 10mg을 혼합시키고, 이 혼합물을 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플로오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄과 배합하여, 프레온과 같은 추진제중에 분산시키고 비강 또는 경구 흡입 투여에 적합한 적당한 에어로졸 용기내로 넣는다. 흡입에 의해 투여하기 위한 조성물. 용량이 15-20ml인 에어로졸 용기에, 에탄올(6-8ml)중에 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 10mg을 용해시키고, 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제 0.1-0.2k를 첨가하고, 이 혼합물을 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플로오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄과 배합하여, 프레온과 같은 추진제중에 분산시키고, 비강 또는 경구 흡입 투여에 적합한 적당한 에어로졸 용기내로 넣는다.
본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 특히 유용하다. 비경구 투여용 조성물은 공통적으로 본 발명의 항체 또는 이것의 단편의 용액 또는 허용될 수 있는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해되는 이것의 혼합액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4k 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 살균된 것이고 일반적으로 특정 물질이 유리된 것이다. 이러한 용액은 통상적인, 널리 공지된 살균 기술에 의해 살균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제와 같은 생리학적 조건에 접근시키는데 요구되는 약제학적으로 허용될 수 있는 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기 약제학적 제형물에서 본 발명의 항체 또는 이것의 단편의 농도의 범위는 클 수 있으며, 즉 액 0.5k 미만, 일반적으로 약 1 중량% 이상에서 15 또는 20 중량%까지 일 수 있고, 선택된 특정 투여 모드에 따라, 유체 부피, 점성도 등을 기준으로 우선 선택될 것이다.
이와 같이, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 살균 완충수 1ml, 및 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 50mg를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 살균 링거 용액 250ml, 및 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 150mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여될 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실질적인 방법은 널리 공지되어 있거나 당업자들에게 자명할 것이고, 예를 들어 본원에 참고 문헌으로서 혼용된 하기 문헌에서 상세하게 설명되고 있다 [참조 문헌:Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania].
본 발명의 항체 (또는 이것의 단편)은 사용하기 전에 저장 및 적합한 담체중에 재구성을 위해 동결건조될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역 글로불린에 효과적인 것으로 제시되어 있고 당해 분야의 공지된 동결 건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
의도된 결과에 의존하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방 및/또는 치료학적 처리를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 응용에서, 조성물을 이미 질환으로 고생하고 있는 환자에게, 충분한 양으로 투여하여, 질환 및 이것의 합병증을 고치거나 적어도 부분적으로 정지시킨다. 예방 응용에서, 본 발명의 항체 또는 이것의 혼합액을 함유하는 조성물을 질환에 걸리지 않은 환자에게 투여하여 환자의 저항성을 향상시킨다.
약제학적 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택된 복용 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 어느 경우에나, 본 발명의 약제학적 조성물은 환자를 효과적으로 치료하는데 충분한 본 발명의 변형된 항체 (또는 이것의 단편)의 양을 제공하여야 한다.
또한 본 발명의 항체가 항체와 같은 치료법에 유용한 펩티드 또는 비펩티드 화합물(모방체)의 디자인 및 합성에 유용할 수 있는 것이 주목되어야 한다.
앞서 말한 것으로부터, 본 발명의 특정 구체예가 예시의 목적으로 본원에서 설명될 지라도, 다양한 개질이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구 범위에 의해 제한되지 않는다.

Claims (31)

  1. 쥐의 24 내지 31 항체와 경쟁하여, CD40이 gp39에 결합하는 것을 억제시킬 수 있는 인간화된 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 도 4 내지 도 8에 도시된 24 내지 31 항체의 상보성 결정 영역, 또는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 변이체 및 등가물을 함유하는 인간화된 항체.
  3. 쥐의 모노클로날 항체 24 내지 31로부터 유도된 인간화된 항체
  4. 쥐의 24 내지 31 항체의 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/3이상 보유하는 쥐의 모노클로날 항체 24 내지 31로부터 유도된 인간화된 항체.
  5. 모 쥐의 24 내지 31 항체 농도의 약 3배 이하의 농도에서의 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성중의 최대 효능의 절반을 보유하는 쥐의 모노클로날 항체 24 내지 31로부터 유도된 인간화된 항체.
  6. B-세포 검정이 T-세포 의존 항체 생성을 측정하는 제 5항의 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체가 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 경서열 및 gp39 항원을 결합시키는 생성된 인간화된 항체의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 상기 서열의 변이체 및 등가물을 함유하는 인간화된 항체:
  8. 제 1 항에 있어서, 항체가 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 중서열 및 gp39 항원을 결합시키는 생성된 인간화된 항체의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 상기 서열의 변이체 및 등가물을 함유하는 인간화된 항체:
  9. 제 1 항에 있어서, 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 경서열:
    및 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 중서열:
    및 gp39 항원을 결합시키는 생성된 인간화된 항체의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 상기 서열의 변이체 및 등가물을 함유하는 인간화된 항체.
  10. 제 5 항에 있어서, 인간화된 가변 경서열(1) 및 인간화된 가변 중서열(1)을 함유하는 인간화된 항체.
  11. 제 5 항에 있어서, 인간화된 가변 경서열(2) 및 인간화된 가변 중서열(1)을 함유하는 인간화된 항체.
  12. 제 5 항에 있어서, 인간화된 가변 경서열(1) 및 인간화된 가변 중서열(2)를 함유하는 인간화된 항체.
  13. 제 5 항에 있어서, 인간화된 가변 경서열(2) 및 인간화된 가변 중서열(2)를 함유하는 인간화된 항체.
  14. 제 1 항 내지 제 9 항중의 어느 한 항에 있어서, 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역 및 사람 감마 1 또는 감마 4 중쇄 불변 영역을 함유하는 인간화된 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 인간화된 항체를 코드화시키는 DNA 서열.
  16. 제 10 항에 따른 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터.
  17. 쥐의 모노클로날 항체 24 내지 31로부터 유도된 인간화된 항체를 함유하는 약제학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 인간화된 항체가 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 경서열 및 gp39 항원을 결합시키는 생성된 인간화된 항체의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 상기 서열의 변이체 및 등가물을 함유하는 약제학적 조성물:
  19. 제 17 항에 있어서, 인간화된 항체가 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 중서열 및 gp39 항원을 결합시키는 생성된 인간화된 항체의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 상기 서열의 변이체 및 등가물을 함유하는 약제학적 조성물:
  20. 제 17 항에 있어서, 인간화된 항체가 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 경서열:
    및 하기의 (1) 내지 (4) 군으로부터 선택된 인간화된 가변 중서열:
    및 gp39 항원을 결합시키는 생성된 인간화된 항체의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 상기 서열의 변이체 및 등가물을 함유하는 약제학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 인간화된 항체가 인간화된 가변 경서열(1) 및 인간화된 가변 중서열(1)을 함유하는 약제학적 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서, 인간화된 항체가 인간화된 가변 경서열(2) 및 인간화된 가변 중서열(1)을 함유하는 약제학적 조성물.
  23. 제 20 항에 있어서, 인간화된 항체가 인간화된 가변 경서열(1) 및 인간화된 가변 중서열(2)를 함유하는 약제학적 조성물.
  24. 제 20 항에 있어서, 인간화된 항체가 인간화된 가변 경서열(2) 및 인간화된 가변 중서열(2)를 함유하는 약제학적 조성물.
  25. 제 1 항 내지 제 13 항중의 어느 한 항에 따른 치료적 유효량의 인간화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, gp39 발현을 조정하거나 gp39/CD40 상호작용을 억제시킴으로써 치료가능한 질환을 치료하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 질환이 자가 면역 질환인 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 자가 면역 질병이 류머티스 관절염, 건선, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스 및 ITP로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 질환이 비자가 면역 질환인 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 질환이 이식편 대 숙주질환 또는 이식 거부반응인 방법.
  30. 제 25 항에 있어서, 질환이 류머티스 관절염, 홍반성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 병, 다발성 경화증, EAE, 중증근무력증, 제 I 형 당뇨병, 포도막염, 네프로시스 증후군, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 펨플루구스, 수포성 유천포창, 수포성 표피 박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부 호산구증다증, 원형 탈모증, 가역성 폐쇄성 기도 질환, 장 염증 및 알레르기(예를 들어, 체강 질환, 직장염, 호산구성 위소장염, 비반세포증, 크론 질환 및 궤양성 대장염) 및 식품 관련 알레르기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서, 질환이 천식, 백혈병, HIV 및 림프종으로부터 선택되는 방법.
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