KR100389711B1 - 사람gp39에대한인간화된항체,이들을함유하는조성물및이들의치료학적용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 gp39에 결합하는 인간화된 항체 및 치료학적 제제로서의 이들의 사용법에 관한 것이다. 이러한 인간화된 항체는 특히 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

Description

사람 gp39에 대한 인간화된 항체, 이들을 함유하는 조성물 및 이들의 치료학적 용도
면역계는 외래 항원에 대한 두 형태의 항원 특이적 반응을 발생시킬 수 있다. 세포 매개성 면역은 T 림프구에 의해 매개되는 면역계의 이펙터(effector) 기능을 나타내는 데 사용되는 용어이다. 체액성 면역은 B 림프구에 의한 항원 특이적 항체의 생성을 나타내는 데 사용되는 용어이다. 대부분의 항원에 대한 체액성 면역의 발생은 항체 생성 B 림프구 뿐만 아니라 헬퍼(helper) T(이후에는 Th로 언급됨) 림프구의 관여도 필요로 하는 것으로 오랫동안 인식되어 왔다 [참고 문헌 : Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:18-25 (1971); Claman and Chaperon, Transplant Rev., 1:92-119 (1969); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70:2624-2629(1973); Raff et al., Nature, 226;1257-1260 (1970)]. 특정 신호 또는 "헬프(help)"는 흉선 의존(이후에는 TD로 언급됨) 항원의 자극에 반응하여 Th 세포에 의해 제공된다. 일부 B 림프구 헬프는 Th 세포에 의해 방출된 가용성 분자(예를 들어, IL-4 및 IL-5와 같은 림포카인)에 의해 매개되지만, 또한 B 세포의 활성화는 B 세포와 T 세포 사이의 접촉 의존적 상호작용을 필요로 한다. [참고 문헌 : Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1765 (1989)]. 이것은 B 세포 활성화는 B 세포와 Th 세포상의 세포 표면 분자들 사이의 필수적인 상호작용을 수반함을 나타낸다. 이러한 상호작용은 활성화된 T 세포의 단리된 원형질 막이 B 세포 활성화에 필요한 헬퍼 기능을 제공할 수 있다는 관찰에 의해 추가로 지지된다. [참고 문헌 : Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146:1118-1124 (1991)].
또한, "T 세포 헬퍼 기능"이라 일컬어지는 접촉 의존성 작용에서, CD4+T 림프구가 B 림프구의 활성화 및 분화를 유도함으로써, 항체 분자의 특이성, 분비 및 아이소타입 코드화된 기능을 조절하여 체액성 면역 반응을 조절한다는 것이 공지되어 있다. [참고 문헌 : Mitchell et al., J. Exp. Med., 128:821 (1968); Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:68 (1971); White et al., J. Exp. Med., 14:664 (1978); Reinherz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:4061 (1979); Janeway et al., Innunol. Rev., 101:39 (1988); O'Brien et al. J. Innunol., 141:3335(1988); Rahemtulla et al., Nature, 353:180 (1991); and Grusby et al., Science, 253:1417 (1991)].
T 세포가 B 세포의 분화를 돕는 과정은 두 개의 상이한 단계, 즉, 유도 단계 및 이펙터 단계로 분할되어 있다; [참고 문헌: Vitetta et al., Adv. Innunol., 45:1 (1989); Noelle et al., Immunol. Today, 11:361 (1990)]. 유도 단계에서, 정지기 T 세포는 항원 프라임(prime)된 B 세포와 접촉하고, 이러한 결합은 클로노타입 T 세포 수용체(TCR)-CD4 복합체가 B 세포상의 Ia/Ag 복합체와 상호작용할 수 있게 해준다 [참고 문헌: Janeway et al., Immunol. Rev., 101:39 (1988); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 70:2624 (1973); Zinkernagel, Adv. Exp. Med., 66:527 (1976); Sprent, J. Exp. Med., 147:1159 (1978); Sprent, Immunol. Rev., 42:158 (1978); Jones et al., Nature, 292:547 (1981); Julius et al., Eur. J.Immunol., 18:375(1982); Chestnut et al., J. Immund., 126:1575 (1981); and Rogozinski et al., J. Immunol., 126:735 (1984)]. Ia/Ag의 TCR/CD4 인지는 안정한 T-B 동족 쌍을 형성시키고 이방향성 T 및 B 세포 활성화를 일으킨다 [참고 문헌: Sanders et al., J. Immunol., 137:2395 (1986); Snow et al., J. Immunol., 130:614(1983); Krusemeier et al., J.Immunol., 140:367 (1988); Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745 (1989); and Kupfer et al., Annu. Rev. Immunol., 7:309 (1987)]. 이펙터 단계에서, 활성화된 T 세포는 림포카인의 분비[참고 문헌 : Thompson et al., J. Immunol., 134:369 (1985)] 및 접촉 의존성 자극[참고 문헌 : Noelle et al., J. Immunol.,143:1807 (1989); Clement et al., J. Immunol., 140:3736 (1984); Crow et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol. 140:3736 (1988); Jover et al., Clin. Immunol. Immun., 53:90 (1989); Whalen et al., J. Immunol., 141:2230 (1988); Pollok et al., J. Immunol., 146:1633 (1991); and Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745 (1990)]에 의해 B 세포 분화를 유도하며, 상기 두 사항은 T 세포가 소량의 휴지 B 세포를 Ig 분비 세포로의 최종적인 분화를 유도하기 위해 필요하다[참고 문헌 : Clement et al., J. Immunol., 132:740 (1984); Martinez et al., Nature, 290:60 (1981); and Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:1612 (1980)].
T 세포 헬프의 유도 단계가 Ag에 의존적이고, MHC에 제한적임에도 불구하고 [참고 문헌 : Janeway et al., Immun. Rev., 101:34 (1988); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 10:2624 (1973); Zinkernagle, Adv. Exp. Med. Biol., 66:527 (1976)], T 헬퍼 세포 기능의 이펙터 단계는 Ag에 독립적이고, MHC에 비제한적일 수 있다 [참고 문헌 : Clement et al., J. Immunol., 132:740 (1984); Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736 (1988); Whalen et al., J. Immunol., 143:1715 (1988)]. 추가적인 대조적인 특징은 T 세포 헬프의 유도 단계가 종종 CD4 분자를 필요로 하고, 안티-CD4 mAb에 의해 억제되는 반면[참고 문헌 : Rogozinski et al., J.Immunol., 126:735 (1984)], 헬퍼 이펙터 기능은 CD4 분자를 필요로 하지 않고[참고 문헌 : Friedman et al., Cell Immunol., 103:105 (1986)], 안티-CD4mAb에 의해 억제되지 않는다[참고 문헌 : Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736 (1988); Whalen et al., J.Immunol., 143:1745 (1988); and Tohma et al., J. Immunol., 146:2547 (1991)]. 비특이적 헬퍼 이펙터 기능은 항원 특이적 동족 쌍을 갖는 T-B 세포 상호작용의 국부화되는 성질에 의해 특이적 B 세포 표적에 집중되는 것으로 믿어진다 [참고 문헌 : Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745 (1989); Kupfer et al., J. Exp. Med., 165:1565 (1987) and Poo et al., Nature, 332:378 (1988)].
최종 B 세포 분화가 T 세포로부터의 접촉 및 림포카인 매개성 자극 둘 모두를 필요로 함에도 불구하고, B 세포 분화의 중간 스테이지는 분비되는 인자의 부재하에서 활성화된 T 세포 표면에 의해 유도될 수 있다[참고 문헌 : Crow et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Sekita et al., Eur. J. Immunol., 18:1405 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025 (1990); Noelle et al., FASEB J, 5:2770 (1991)]. B 세포상의 이러한 중간 효과는 표면 CD23 발현[참고 문헌 : Crow et al., Cell Immunol., 121:94 (1989)], 세포 주기 진행과 관련된 효소[참고 문헌 : Pollok et al., J. Immunol., 146:1633 (1991)] 및 림포카인에 대한 반응성[참고 문헌 : Noelle et al., FASEB J. 5:2770 (1989)]의 유도를 포함한다. B 세포 활성화를 유도하는 활성화 유도된 T 세포 표면 분자의 일부가 최근 확인되었다. 또한, 기능 연구는 B 세포 활성화를 유도하는 활성화-유도된 T 세포 표면 분자의 일부 특징을 특징화하였다. 첫 번째, T 세포는 활성화 후, 4 내지 8시간내에 B 세포를 자극할 수 있는 능력을획득한다 [참고 문헌 : Bartlett et al., J. Immunol., 145:3956 (1990) and Tohma et al., J. Immunol., 146:2544 (1991)]. 둘째, 활성화된 T 세포의 표면과 관련된 B 세포 자극 활성은 파라포름알데히드 고정된 세포[참고 문헌 : Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Cros et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Pollok et al., J. Immunol., 146:1633 (1991); Tohma et al., J.Immunol., 146:2544 (1991); and Kubota et al., Immunol., 72:40 (1991)] 및 정제된 막 단편[참고 문헌 : Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025 (1990) and Martinez et al., Nature, 290:60 (1981)]상에 보존된다. 셋째, B 세포 자극 활성은 프로테아제 처리에 민감하다[참고 문헌 : Noelle et al., J. Immunol., 143:1807 (1989); Sekita et al., Eur. J. Immunol., 18:1405 (1988); and Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025 (1990)]. 넷 째, T 세포 활성화에 따른 이러한 표면 활성적인 구조를 획득하는 과정은 시클로헥시마이드(cycloheximide)에 의해 억제된다[참고 문헌 : Tohma et al., J. Immunol., 196:2349 (1991) and Hodgkin et al., J. Immunol., 195:2025 (1990)].
세포 표면 분자, 즉 CD40는 항체에 의해 가교될 경우, B 세포 증식을 유도하는 비성숙 및 성숙 B 림프구상에서 확인되었다[참고 문헌 : Valle et al., Eur. J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140:1425-1430 (1988); Gruder et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989)].
CD40은 분자적으로 클로닝되고, 특징화되었다[참고 문헌 : Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)].
CD40은 B 세포, 맞물려있는 수상 세포, 대식세포, 소포성 수상 세포, 및 흉선 상피상에 발현된다[참고 문헌 : Clark, Tissue Antigens 36:33 (1990); Alderson et al., J. Exp. Med., 178:669 (1993); Galy et al., J. Immunol. 142:772 (1992)]. 사람 CD40은 50kDa의 타입 Ⅰ형 막 단백질이며, 신경 성장 인자 수용체 패밀리에 속한다[참고 문헌 : Hollenbaugh et al., Immunol., Rev., 138:23 (1994)]. IL-10의 존재하에 CD40을 통한 시그널링은 IgA, IgM 및 IgG 생성을 유도하고, 이는 이소타입 스위칭이 이러한 상호작용을 통해 조절된다는 것은 나타내준다. CD40과 이의 리간드 사이의 상호작용은, B 세포의 프라임된 상태를 유도하며, 이는 B 세포가 후속 시그널에 대해 수용성이 되게 한다.
또한, CD40에 대한 리간드, 즉, gp39(또한 CD40 리간드 또는 CD40L로 불림)는 최근에 분자적으로 클로닝되고, 특징화되었다 [참고 문헌 : Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. gp39 단백질은 활성화되었지만 휴지상태가 아닌 CD4+Th 세포상에 발현된다[참고 문헌 : Spriggs et al., J. Exp., Med., 176:1543-1550 (1992); Lane et al., Eur.J. Immunol., 22:2573-2578(1992) and Roy et al., J. Immunol., 151:1-14 (1993)]. gp39 유전자로 트랜스펙션되어 이들의 표면상에서 gp39 단백질을 발현시키는 세포는 B 세포 증식을 시작케할 수 있고, 다른 자극 시그널과 함께 항체 생성을 유도할 수 있다[참고 문헌 : Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); and Hollenbaugh et al.,EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. 특히, CD40에 대한 리간드, 즉 gp39는 마우스[참고 문헌 : Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6550 (1992); Armitage et al., Nature, 357:80 (1992)] 및 사람[참고 문헌 : Hollenbaugh et al., Embo. J. 11:4313 (1992); Spriggs et al., J.Exp.Met., 176:1543 (1992)]에서 확인되었다. gp39는 타입 Ⅱ 형 막 단백질이며, TNF-α, TNF-β 및 FAS, CD27, CD30 및 4-1BB에 대한 리간드를 포함하는 새로운 유전자 슈퍼 패밀리의 일부이다.
gp39의 발현은 시험관내에서 안티-CD3 항체 또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와 이오노마이신(ionomycin)을 이용함으로써 CD4+T 세포상에서 쉽게 유도될 수 있다. 발현은 신속하고, 일시적이며, 6 내지 8 시간째에 피크를 이루고, 24 내지 48 시간째에 휴지 수준으로 되돌아 간다[참고 문헌 : Roy et al., J. Immunol., 151:2497 (1993)]. 생체내에서, gp39는 사람에서 림프 여포의 외투막 및 중심세포(centrocytic) 구역, 및 비장의 세동맥주위 림프초에서 CD40+B 세포와 결합된 형태로 CD4+T 세포상에 존재하는 것으로 보고되었다[참고 문헌 : Lederman et al., J. Immunol., 149:3807 (1992)]. gp39+T 세포는 IL-2, IL-4 및 IFN-γ를 생성한다[참고 문헌 : Van der Eetwegh et al., J. Exp. Med., 178:1555 (1993)].
체액성 면역의 조절에서의 gp39의 신규한 역할에 대한 특유한 통찰력은 인간 질환, 즉, X-연관된 하이퍼-IgM 신드롬(HIM)의 연구에 의해 제공되었다. HIM은 흉선 의존성 체액성 면역의 손실, 즉, IgG, IgA 및 IgE의 생성 불능에 의해 예시되는최중증 X-연관된 면역결핍증이다. gp39 유전자에서의 돌연변이는 비작용성 gp39 단백질의 발현 및 B 세포를 활성화시킬 수 없는 HIM 환자로부터의 헬퍼 T 세포를 초래한다[참고 문헌 : Allen et al., Science, 259:990 (1993); Aruffo et al., Cell, 72:291 (1993); DiSanto et al., Nature, 361:541 (1993); Korthauer et al., Nature, 361:539 (1993)]. 이러한 연구는 펩티드/MHC 클래스 Ⅱ 복합물의 T 세포 수용체 결합 후 초기에, gp39가 동족 헬퍼 T 세포상에서 유도되고, gp39의 B 세포상의 CD40로의 결합이 B 세포를 세포 주기로 이동시키고 분화시켜서, 면역글로불린(Ig) 분비 및 이소타입 스위칭을 일으킨다.
기능 연구 결과, 안티-gp39로의 마우스를 처리한 것은 흉선 비의존성 항원(TNP-Ficoll)이 아닌 흉선 의존성 항원(SRBC 및 TNP-KLH)에 대한 항체 반응을 완전하게 없애는 것으로 밝혀졌다[참고 문헌 : Foy et al., J. Exp. Med., 178:1567 (1993)]. 또한, 안티-gp39로의 처리는 콜라겐이 주입된 마우스에서 콜라겐 유도 관절염(CIA)의 발병을 억제하였다[참고 문헌 : Durie et al., Science, 261:1328 (1993)]. 최종적으로, 안티-gp39는 마우스 비장에서 기억 B 세포 및 배중심의 형성을 억제하였다[참고 문헌 : Foy et al., J. Exp. Med., 180:157 (1994)]. 총괄적으로, 이러한 데이터는 T 세포상의 gp39와 B 세포상의 CD40의 상호작용이 흉선 의존성 항원에 대한 항체 반응에 필수적이라는 광범위한 증거를 제공한다.
최근에, 많은 자가면역 질환의 뮤린(murine) 모델이 질환 발병에 대한 안티-gp39 투여의 잠재적 치료학적 가치를 평가하는데 이용되어 왔다. 이러한 모델에서 연구 결과의 간단한 내용을 하기에 기재하였다:
콜라겐-유도된 관절염 : CIA는 사람 자가면역 질환 류머티스 관절염(RA)에 대한 동물 모델이다[참고 문헌 : Trenthorn et al., J. Exp. Med., 146:857 (1997)]. 이러한 질환은 이종성 타입 Ⅱ 콜라겐의 투여에 의해 많은 종에서 유도될 수 있다[참고 문헌 : Courtenay et al., Nature, 283:665 (1980); Cathcart et al., Lab. Invest., 54:26 (1986)].
CIA 유도에서 안티-gp39의 효과를 연구하기 위해[참고 문헌 : Durie et al., Science, 261:1328 (1993)], 숫 DBA1/J 마우스의 꼬리의 기부에 완전 프로인트 애쥬번트에 에멀션화된 병아리 타입 Ⅱ 콜라겐을 피내 주입하였다. 그 후, 21 일 후에, 후속 자극을 수행하였다. 그 후, 마우스를 적절한 대조 항체 또는 안티-gp39로 처리하였다. 안티-gp39로 처리된 마우스 군은 면역화되고 비처리된 대조 마우스와 비교하여 안티-콜라겐 항체의 역가를 전혀 나타내지 않았다. 조직학적 분석은 안티-gp39 항체로 처리된 마우스가 염증의 표시 또는 면역화된 동물에서 관찰되는 질환의 통상적인 조직병리학적 징후 중 어느 하나도 나타내지 않았음을 나타내었다. 이러한 결과는 gp39-CD40 상호작용이 CIA의 유도에 절대적으로 필수적이라는 것을 나타낸다. 만약, T 세포와 B 세포 사이의 초기 동족 상호작용이 발생하지 않는다면, 자가항체 형성 및 결과적인 염증 반응과 같은 다운스트림 프로세스가 일어나지 않는다.
최근에, gp39가 GM-CSF, IL-3 및 IFN-γ의 부재하에 TNF-α 및 IL-6을 생성하기 위해 단핵구를 활성화시키는데 중요하다는 것이 밝혀졌다[참고 문헌 : Alderson et al., J. Exp. Med., 178:669 (1993)]. TNF-α는 CIA 질환 진행[참고문헌 : Thorbecke et al., Eur. J. Immunol., 89:7375 (1992)] 및 RA[참고 문헌 : DiGiovane et al., Ann. Rheum. Dis., 47:68 (1988); Chu et al., Arthrit. Rheum., 39:1125 (1991); Brennan et al., Eur. J. Immunol., 22:1907 (1992)]에 관련되어 왔다. 따라서, 안티-gp39에 의한 TNF-α의 억제는 관절염 마우스의 관절에서 충분한 항염증 효과를 나타낼 수 있다. 안티-gp39에 의한 TNF-α 및 T 세포-B 세포 상호작용의 억제 둘 모두는 CIA의 징후에 기여할 수 있다.
실험에 의한 알레르기성 뇌척수염(EAE) : EAE는 중추 신경계(CNS)의 실험상의 자가면역 질환이며[참고 문헌 : Zamvil et al, Ann. Rev. Immunol., 8:579 (1990)], 사람 자가면역 질병, 즉, 다발성 경화증(MS)에 대한 질환 모델 [참고 문헌 : Alvord et al., "Experimental Allergic Model for Multiple Sclerosis" NY 511 (1984)]이다. CNS 또는 뇌염유발 프로테오리피드(PLP)로부터 정제된 미엘린 염기성 단백질의 면역화에 의해 포유 동물 종에서 쉽게 유도된다. SJL/J 마우스는 민감한 스트레인(H-2S)이며, EAE의 유도시에, 이러한 마우스는 급성 마비성 질환을 발병시키고, 급성 세포성 침윤물이 CNS내에서 확인가능하다.
클래슨과 공동 연구가(아직 발표되지 않은 데이터)는 SJL/J 마우스에서 EAE의 유도에 대한 안티-gp39의 효과를 연구하였다. 그들은 EAE 발병이 안티-gp39로 처리된 동물에서 완전하게 억압된다는 것을 발견하였다. 또한, 안티-PLP 항체 반응은 대조군 동물에서 수득된 반응과 비교하여 지연되고 감소되었다.
EAE는 T 세포를 통하여 매개되는 세포 매개성 자가면역 질환의 예이지만, 질환 진행에서 자가항체 필요 조건에 대한 직접적인 증거는 없다. gp39와 CD40의 상호작용의 간섭은 질환 유도 및 질환의 인입면역 전달을 예방한다.
만성(c) 및 급성(a) 이식편 대 숙주 질환(GVHD): 만성 및 급성 GVHD는 숙주 비대응 MHC 대립유전자에 응답하는 도너 세포로부터 유도된다. cGVHD(H-2d-->H-2bd)에서, 증가된 폴리클로날 면역글로불린 생성은 알로특이적(allospecific) 헬퍼 T 세포와 숙주 B 세포의 상호작용에 기인한 것이다. 안티-gp39 항체의 생체내 투여는 cGVHD 유도된 혈청 안티-DNA 자가항체, IgE 생성물, 시험관내의 자발적인 면역글로불린 생성, 관련된 비종대증 및 질환 전달 능력을 차단한다[참고 문헌 : Durie F.H. et al., J. Clin. Invest., 94:133 (1994)]. 항체 생성은 안티-gp39 투여가 종료된 후에 연장된 기간동안 억제된 상태로 남아있었다. aGVHD에서 유도된 안티-동종이계 세포독성 T 림프구(CTL) 반응은 또한 안티-gp39의 생체내 투여에 의해 억제되었다. 이러한 데이터는 CD40-gp39 상호작용이 GVHD의 두 형태 모두의 발생에서 중요하다는 것을 암시한다. CTL 반응이 억제되고, 안티-gp39로의 간단한 처리가 질환의 장기가 예방을 유도한다는 사실은 동종 세포 및 안티-gp39 항체의 공동 투여에 의한 T 세포 구획에서의 영구적 변화를 암시한다.
다양한 연구 기관은 gp39에 특이적인 뮤린 항체의 제조에 대해 보고해 왔으며, 이는 면역억제제로서 치료학적 유용성을 갖는 것으로 기재되어 있다. 예를 들어, 1993년 5월 27일에 공보된 WO 93/09812, 콜롬비아 유니버스티에 양도된 EP 0,555,880(1993년 8월 18일 공보), 다트머스 컬리지에 양도된 PCT US/94/09872(노엘레(Noelle) 등에 의해 1994년 9월 2일에 출원됨)에는 gp39에 특이적인 뮤린 항체 및 치료제로서의 이들의 용도가 기재되어 있다.
그러나, 뮤린 항체가 사람에서 치료학적 제제로서 적용되지만, 어느 면에서는 단점이 있다. 특히, 뮤린 항체가 이종이기 때문에, 이들은 사람에서 면역원성일 수 있다. 이는 종종 중화 항체 반응을 유도하며, 이는 예를 들어 만성 또는 재발성 질환의 치료를 위해 항체를 반복적으로 투여하는 것이 요망되는 경우 특히 문제시된다. 또한, 이들은 뮤린 불변 도메인을 함유하기 때문에, 사람 이펙터 기능을 나타내지 않을 수 있다.
이러한 문제를 없애거나 감소시키기 위해, 키메라 항체가 발표되었다. 키메라 항체는 통상적으로 두 개의 상이한 종의 두 개의 상이한 항체의 부분을 함유한다. 일반적으로, 이러한 항체는 사람 불변 영역 및 다른 종, 전형적으로 뮤린 가변 영역을 함유한다. 예를 들어, 일부 마우스/사람 키메라 항체는 모 마우스 항체의 결합 특성 및 사람 불변 영역과 관련된 이펙터 기능을 나타내는 것으로 보고되었다. 카빌리(Cabilly) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,816,567 호; 쇼에마커(Shoemaker) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,978,745호; 비에이버스(Beavers) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,975,369호; 보스(Boss) 등에 의한 미국 특허 번호 제 4,816,397호를 참고하고, 이들은 모두 본원에 참고 문헌으로 인용되었다. 일반적으로, 이러한 키메라 항체는 이미 존재하는 뮤린 하이브리도마로부터 추출된 DNA로부터의 게놈 유전자 라이브러리를 제조함으로써 작제된다[참고 문헌 : Nishimura et al., Cancer Research, 47:999 (1987)]. 그 후, 라이브러리는 정확한 항체 단편 재배열 패턴을 나타내는 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 가변 영역 유전자에 대해 스크리닝된다. 대안적으로, cDNA 라이브러리는 하이브리도마로부터 추출된 RNA로부터 제조되어 스크리닝되거나, 가변 영역이 중합효소 사슬 반응에 의해 수득된다. 그 후, 클로닝된 가변 영역 유전자는 적합한 중쇄 또는 경쇄 사람 불변 영역 유전자의 클로닝된 카세트를 함유하는 발현 벡터로 연결된다. 그 후, 키메라 유전자는 선택된 세포주 일반적으로, 뮤린 골수종 라인에서 발현된다. 이러한 키메라 항체는 사람 치료에 이용되어 왔다.
일반적으로 양도된 출원 번호 제 07/912,292 호에서, 사람 불변 영역 및 구세계 원숭이 가변 영역을 함유하는 "프리머타이지드"(상표명: Primatized) 항체가 기재되었다. 이러한 프리머타이지드 항체는 이들의 낮거나 약한 면역원성이 주어진 경우 사람에서 잘 관용된다.
인간화된 항체 또한 당해분야에 공지되어 있다. 이상적으로, "인간화"는 원래 분자의 항원 결합 특성을 완전하게 보유하는 덜 면역원인 항체를 유도한다. 원래의 항체의 항원 결합 특성을 모두 보유하기 위해서, 이들의 결합 부위의 구조가 "인간화된" 변형체로 정확하게 재생성되어야 한다. 이것은 비사람 항체의 결합 부위를 사람 프레임워크상에 하기의 방법으로 이식함으로써 달성될 수 있다: (a) 전체 비사람 가변 도메인을 사람 불변 영역에 그래프팅해서, 키메라 항체를 생성시키거나[참고 문헌 : Morrison et al., Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 81:6801 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 (1988)](리간드 결합 특성을 보존하지만, 비사람 가변 도메인의 면역원성을 보유함); (b) 중요한 프레임워크 잔기를보유하거나 보유함이 없이 단지 비사람 CDR을 사람 프레임워크 및 불변 영역에 그래프팅하거나[참고 문헌 : Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1539 (1988)]; 또는 (c) 전체 비사람 가변 도메인을 이식하지만(리간드 결합 특성을 보존하기 위해), 이들을 또한 노출된 잔기의 신중한 대체를 통해 사람 유사 표면으로 "클로킹(cloaking)"하는(항원성을 감소시키기 위해) 것이다[참고 문헌 : Padlan, Molec. Immunol. 28:489 (1991)].
본질적으로, CDR 그래프팅에 의한 인간화는 단지 CDR을 사람 단편, 즉, 사람 프레임워크 및 불변 영역에 이식하는 것을 포함한다. 이론상으로, 이는 사실상 면역원성을 제거시킨다(만약 알로타입 또는 유전자형 차이가 존재하는 경우는 제외). 그러나, 원래의 항체의 일부 프레임워크 잔기가 또한 보존되어야 한다는 것이 보고되었다[참고 문헌 : Riechmann et al., Nature, 332:323 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10,029 (1989)].
보존될 필요가 있는 상기 프레임워크 잔기는 컴퓨터 모델링에 의해 확인할 수 있다. 대안적으로, 중요한 프레임워크 잔기는 공지된 항체 결합 부위 구조를 비교함으로써 잠재적으로 확인될 수 있다[참고 문헌 : Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)].
항원 결합에 잠재적으로 영향을 끼치는 잔기는 여러 그룹으로 분리된다. 제 1 그룹은 결합 부위 표면과 인접하여, 항원과 직접 접촉할 수 있는 잔기를 포함한다. 이들은 아미노-말단 잔기 및 CDR에 근접해 있는 잔기를 포함한다. 제 2 그룹은 CDR 또는 반대 사슬과 접촉함으로써 CDR의 구조 또는 상대적인 정렬을 변형시킬 수있는 잔기를 포함한다. 제 3 그룹은 가변 도메인의 구조적 일체성에 영향을 끼칠 수 있는 묻혀진 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 상기 그룹 중의 잔기는 채택된 넘버링 시스템에 따라 동일한 위치(패드란(Padlan), 1994(Id.))에서 일반적으로 발견된다[참고 문헌 : Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5th ed., Pub. No.91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991].
그러나, 인간화된 항체가 사람에서의 이들의 잠재적인 낮은 면역원성때문에 바람직하지만, 이들의 생성은 예측할 수 없다. 예를 들어, 항체의 서열 변형은 항원 결합 기능의 상당한 손실 또는 전부의 손실, 또는 결합 특이성의 손실을 초래할 수 있다. 대안적으로, "인간화된 항체"는 서열 변형에 무관하게 사람에서 면역원성을 여전히 나타낼 수 있다.
따라서, 원하는 항원에 대한 신규한 인간화된 항체의 현저한 필요성이 여전히 당해분야에 존재한다. 특히, gp39에 특이적인 인간화된 항체의 필요성이 당해분야에 존재하는 데, 그 이유는 면역치료학적 제제로서의 이들의 잠재 능력 때문이다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 사람 gp39에 특이적인 인간화된 항체를 제공하는 데 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 목적은 gp39에 대한 뮤린 항체, 특히 사람 gp39에 결합하는 특정한 뮤린 항체인 24-31로부터 유도된 인간화된 항체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 사람 gp39에 특이적인 인간화된 항체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 목적은 사람 gp39에 특이적으로 결합하는 뮤린 항체인 24-31로부터 유도된 인간화된 항체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또 다른 발명의 특정한 목적은 예를 들어, 전신성 홍반성 루프스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 당뇨병과 같은 자가면역 질환, 및 이식편 대 숙주질환 및 이식편 거부반응과 같은 비자가면역 질환을 포함하는 gp39 발현의 조절 및/또는 gp39/CD40 결합 상호작용의 억제에 의해 치료될 수 있는 사람 질환을 치료하기 위해 사람 gp39에 대한 인간화된 항체를 사용하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대한 인간화된 항체를 코드화하는 핵산 서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 보다 특이적인 목적은 사람 gp39항원에 특이적으로 결합하는 뮤린 항체인 24-31로부터 유도된 인간화된 항체를 코드화하는 핵산서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대한 인간화된 항체, 특히 사람 gp39 항원에 대해 특이적으로 결합하는 뮤린 항체인 24-31로부터 유도된 인간화된 항체를 발현시키는 벡터를 제공하는 데 있다.
발명의 간단한 설명
본 발명의 가장 광범위한 구체예로서, 본 발명은 뮤린 24-31 항체의 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상 보유하는 인간화된 항체, 및/또는, 예를 들어, T 세포 의존 항체 생성을 측정하는 B 세포 검정에서, 뮤린 항체 24-31의 시험관내 기능 활성을 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 1/3 이상 보유하는 인간화된 항체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 인간화된 항체는 24-31 항체 농도의 3배 이하의 농도에서의 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성의 반극대 효능의 1/10이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상을 보유한다.
본 발명은 또한 뮤린 24-31 항체와 동일한 에피토프에 결합하고/거나, 뮤린 24-31 항체와 경쟁하여 CD40이 gp39에 결합하는 것을 억제하고/거나, 24-31 항체의 CDR'를 함유하는 인간화된 항체에 관한 것이다.
본 발명은 더욱 바람직하게는, 하기 기재된 인간화된 경쇄 가변 서열 및/또는 인간화된 중쇄 가변 서열을 함유하고:
하기 군으로부터 선택된 인간화된 중쇄 가변 서열을 함유하는 뮤린 24-31 항체로부터 유도된 인간화된 항체 뿐만 아니라 이들의 변이체 및 등가물에 관한 것이다:
본 발명의 상기 변이체 및 등가물은 gp39 항원 결합 친화성에 실질적으로 영향을 주지 않는 방식으로 상기 확인된 인간화된 중쇄 가변 서열 및/또는 경쇄 가변 서열 중의 하나 또는 수개의 아미노산 잔기가 치환, 추가 및/또는 결실에 의해 변형된 인간화된 면역글로불린 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 특히, 본 발명은 보존적 치환 돌연변이, 즉, 하나 이상의 아미노산이 유사한 아미노산으로 치환되는 변이를 함유하느 변이체 및 등가물을 포함한다. 예를 들어, 보존적 치환은 동일한 종류내에서의 아미노산의 치환으로서, 예를 들어, 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 중성 아미노산을 동일한 종류의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 보존적 아미노산 치환이 의미하는 바는 본 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직하게는, 이러한 변이체 및 등가물은 뮤린 24-31 모항체의 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3이상 함유할 것이며, 더욱 바람직하게는 뮤린 24-31 항체의 gp39 항원 결합 친화성을 약 1/3 이상 함유할 것이다. 또한, 그러한 변이체 및 등가물은 바람직하게는, 예를 들어, T 세포 의존성 항체 생성을 측정하는 B 세포 검정에서, 뮤린 항체 24-31의 시험관내 기능 활성을 1/10이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상 보유할 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 변이체 및 등가물은 예를 들어, T 세포 의존성 항체 생성을 측정하는 B 세포 검정에서, 뮤린 24-31 항체의 시험관내 기능 활성을 약 1/3 이상 보유할 것이다. 더욱 특히, 이러한 항체는 모 24-31 항체 농도의 약 3배 이하의 농도에서의 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성중의 반극대 효능을 보유할 것이다.
본 발명은 또한 인간화된 항체의 발현을 코드화하는 핵산서열 뿐만 아니라 제조합 숙주 세포에서 인간화된 항체를 생성시키는 발현 벡터에 관한 것이다. 가장 바람직한 구체예에서, 이러한 DNA 서열은 하기된 인간화된 중쇄 가변 서열 및/또는 인간화된 경쇄 가변 서열을 코드화할 것이며:
하기 군으로부터 선택된 인간화된 중쇄 가변 서열을 코드화할 것이다:
또한, 본 발명은 상기 서열의 등가물 및 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 gp39에 특이적인 상기 확인된 인간화된 항체의 약제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, gp39 발현의 조절 또는 gp39/CD40 상호작용을 억제에 의해 치료될 수 있는 질환을 치료하기 위한 본 발명의 인간화된 안티-gp39 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 특히 자가면역질환, 예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스 및 ITP의 치료에 사용되는 gp39에 특이적인 상기 확인된 인간화된 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명는 또한, 이식편 대 숙주질환 및 이식편 거부반응을 포함하는 비자가 면역질환의 치료에 사용되는 gp39에 대한 본 발명의 인간화된 항체의 용도에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 24-31로부터 유도된 인간화된 항체 및 키메라 항체를 발현시키는 데 사용된 IDEC 발현 벡터 N5KG1을 도시하는 도면이다.
도 2a는 사람 PBL를 가용성 gp39-CD8, 재조합 사람 IL-4 및 뮤린 24-31 항체 또는 대조 뮤린 IgG1 모노클로날 항체와 접촉시키는 B 세포 증식 검정의 결과를 나타내는 도면으로서, 24-31 항체가 gp39에 의해 유도된 B 세포 증식을 억제함을 입증하고 있는 도면이다.
도 2b는 상이한 농도의 24-31 항체 및 IGD+B 세포의 존재하에 배양된 고정된 안티-CD3으로 활성화된 미토마이신 처리된 T 세포를 사용하는 B 세포 분화검정의 결과를 나타내는 도면으로서, 24-31 항체가 사람 B 세포에 의한 T 세포 의존성 폴리클로날 항체 생성을 억제함을 입증하고 있는 도면이다.
도 3은 gp39 트랜스펙턴트 및 비트랜스펙션된 CHO 세포의 FACS를 나타내는 도면이다.
도 4는 VL#1 또는 바람직한 인간화된 경쇄 가변 서열(1)로 일컬어지는 바람직한 인간화된 경쇄 가변 서열(상보성 결정영역을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 5는 VL#2 또는 바람직한 인간화된 경쇄 가변 서열(2)로 일컬어지는 바람직한 인간화된 경쇄 가변 서열(상보성 결정영역을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 6은 VH#1 또는 바람직한 인간화된 중쇄 가변 서열(1)로 일컬어지는 바람직한 인간화된 중쇄 가변 서열(상보성 결정영역을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 7은 24-31 항체의 경쇄 가변 서열(비인간화된)의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 8은 24-31 항체의 중쇄 가변 서열(비인간화된)의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타내는 도면이다.
도 9는 gp39 발현 CHO 세포에 대한 뮤린 24-31 항체, 키메라 24-31 항체 및 인간화된 24-31 항체의 결합을 비교한 도면이다.
도 10은 gp39 발현 CHO 세포에 대한 24-31 항체(비오틴) 및 인간화된, 키메라성 및 24-31 항체의 결합을 비교하는 경쟁검정의 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 미토마이신 C 처리된 T 세포의 존재하에 배양된 B 세포에 의한 사람IgM 생성에 대한 본 발명의 인간화된 24-31 항체 및 뮤린 24-31 항체의 효과를 측정하는 검정의 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 gp39 발현 CHO 세포에 대한 본 발명의 두가지의 인간화된 항체의 결합을 비교하는 검정 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 뮤린 24-31항체에 대한 스캐차아드 플롯(Scatchard plot)을 나타내는 도면이다.
도 14는 인간화된 변형체(version) 1에 대한 스캐차아드 플롯을 나타내는 도면이다.
도 15는 인간화된 변형체 2에 대한 스캐차아드 플롯을 나타내는 도면이다.
도 16은 gp39-CD8 융합 단백질의 존재하에서의 H24-31.1의 FcRI 결합을 나타내는 도면으로서, 항원에 복합체화될 때 H24-31.1만이 Fc 수용체 I과 결합함을 나타내는 도면이다.
도 17은 gp39-CD8 융합 단백질의 존재하에서의 H24-31.1의 FcRII 결합을 나타내는 도면으로서, 항원에 복합체화될 때 H24-31.1만이 Fc 수용체 II와 결합함을 나타내는 도면이다.
도 18은 알라마르 블루(Alamar Blue)를 사용한 보체 의존성 세포성 세포독성을 나타내는 도면으로서, H24-31.1이 약 0.5㎍/㎖농도에서 세포성장을 50% 억제함을 나타내는 도면이다.
도 19는 gp39+CHO 결합된 H24-31.1(인간화된 25-31 변형체 1)의 Clq 결합의 측정을 나타내는 도면이다. 특히, 다양한 농도의 H24-31.1로 표지된 gp39+CHO 세포가 과량의 사람 Clq(보체 인자 1)중에서 인큐베이션되며, 이어서, FITC 표지된 염소 안티-사람 Clq와 함께 인큐베이션된다. 이러한 샘플을 흐름 세포측정법(flow cytometry)으로 분석하여 세포의 Clq에 의한 상대적인 표지화를 측정하였다. 본 도면은 또한 세포의 Clq로의 표지화가 항체 농도에 좌우되고, H24-31.1 Fab 단편(Clq 결합없음)이 Clq와 결합하지 않았음을 나타낸다.
도 20은 T 세포 의존성 리콜 항원에 대한 T 세포 반응에 대한 H24-31.1의 효과를 나타내는 도면이다. 본 도면은 또한 TT 유도된 성장 및 IL-2 생성이 1㎍/㎖ 이하의 H24-31.1에 의해 약 40% 로 최대 억제됨을 나타내는 도면이다.
도 21은 T 세포 의존성 B 세포 분화에 대한 H24-31.1의 효과를 나타내는 도면이다. 본 도면은 또한 H24-31.1이 1ng/㎖에서 T 세포 의존성 IgG 생성을 약 85% 억제함을 나타낸다. 보다 높은 농도에서 나타난 IgG 생성의 명백한 증가는 본 시험에 의해 B 세포에 의해 생성된 항체와 H24-31.1을 구별할 수 없는 데에 기인한다.
도 22는 T 세포 의존성 B 세포 분화에 대한 H24-31.1 Fab의 효과를 나타내는 도면이다. T 세포 의존 B 세포 IgG 생성의 안티-gp39 항체 억제가 또한 도시되어 있다. 본 도면은 또한 전체 H24-31.1 항체와 Fab 단편 사이의 IgG 생성의 억제에 차이가 없음을 나타낸다.
도 23은 T 세포 의존성 리콜 항원에 대한 항원 특이적 B 세포 반응의 생성에 대한 H24-31.1의 효과를 나타낸다. 시험관내에서 3일 동안 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid)로 프라이밍된 사람 비장 세포를 약 1×107세포/SCID의농도로 SCID 마우스에 옮겼다. 6일 후에, 생성된 hu-SPL-SCID 마우스에 PBS(그룹 1) 또는 300㎍ H24-31.1(그룹 1 및 그룹 2)를 주입시켰다. 다음 날, Hu-SPL-SCID를 모두 테타누스 톡소이드로 부스팅시켰다. 그룹 3의 마우스는 3일 간격으로 300㎍ H24-31.1의 2번의 추가 주사를 각각 받았다. 마우스를 다양한 시점에서 채혈하고 사람 IgG 안티-테타누스 톡소이드 역가 수준을 ELISA로 측정한다. 본 도면은 또한 H24-31.1의 주입이 테타누스 톡소이드 특이적 반응을 약 90% 까지 억제시킴을 나타낸다(그룹 3). 전체 사람 IgG의 수준은 세 그룹에서 필적하였다.
도 24는 가용성 gp39-CD8에 의한 사람 B 세포의 증식을 나타내는 도면이다. 상이한 농도의 CD8-gp39가 4일간의 증식 검정에서 부화된 사람 B 세포와 IL-4와 함께 인큐베이션된다. gp39-CD8이 없이 B 세포와 IL-4 배양물중에서 수득된 CPM을 백그라운드로서 사용하여, gp39-CD8로 자극된 시험 배양물의 전체 CPM으로부터 감하였다. PWM과 IL-4와 함게 배양된 세포는 B 세포 증식에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. CPM은 삼중으로 시험된 샘플의 평균 CPM을 나타낸다.
도 25는 H24-31에 의한 B 세포 증식의 억제를 도시하는 도면이다. 상이한 농도의 H24-31.1 항체를 4일간의 증식 검정에서 IL-4(1000 U/㎖) 및 10 ㎍/㎖의 gp39-CD8과 함께 배양된 B 세포(1×105)과 함께 인큐베이션시켰다. PWM과 IL-4와 함께 배양된 세포를 B 세포 증식에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. CPM은 삼중으로 시험된 샘플의 평균 CPM을 나타낸다.
도 26은 24-31항체의 인간화된 변형체들에 의한 gp39에 결합하는 CD40-Ig의차단을 나타내는 도면이다. 본 도면은 또한 뮤린 24-31 항체 및 인간화된 24-31 항체가 CD4-Ig의 결합을 차단함을 나타낸다.
본 발명은 사람 gp39에 특이적인 인간화된 항체, 이러한 항체를 코드화하는 DNA, 이들의 제조 방법, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 치료학적 약제로서의 이러한 인간화된 항체의 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 항체는 예를 들어, 이식편 대 숙주질환을 포함하는 비자가면역 질환 뿐만 아니라 예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병 및 전신성 홍반성 루프스를 포함하는 자가 면역 질환을 치료하고 이식편 거부반응을 방지하는데 적용된다.
본 발명을 설명하게 전에, 본원에 사용되는 특정의 용어를 정의하고자 한다.
인간화된 항체- 용어 인간화된 항체는 모 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나 사실상 보유하지만, 사람에게는 덜 면역원성인 비사람 항체, 전형적으로 뮤린 항체로부터 유도되는 항체를 의미한다. (a) 전체 비사람 가변 도메인을 사람 불변영역상에 그래프팅하여 키메라 항체를 생성시키거나, (b) 중요한 프레임워크 잔기를 보유하거나 보유함이 없이 사람 프레임워크 영역 및 불변 영역에 비사람 CDR를 그래프팅하거나, (c) 전체 비사람 가변 도메인을 이식하고, 표면 잔기의 치환에 의해 사람 유사 부분으로 이들을 "클로킹"하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법이 문헌[Johnes et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855(1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536(1988); 및 Padlan, Molec. Immun., 28:489-498(1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169-217(1994)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
상보성 결정 영역, 또는 CDR- 본원에 사용된 용어 CDR은 카뱃(Kabat: 1991)등에 의해 설명된 천연 면역글로불린 결합부위의 자연적인 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 의미한다.
프레임워크 영역- 본원에 사용된 용어 FR은 CDR 사이에 위치하는 아미노산서열을 나타낸다. 항체의 이러한 부분은 적절한 배향으로 CDR을 고정(CDR이 항원과 결합하게 함)시키는 작용을 한다.
불변 영역- 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분. 본 발명에서, 뮤린 불변 영역은 사람 불변영역으로 치환된다. 본 발명의 키메라 또는 인간화된 항체의 불변 영역은 사람 면역글로불린으로부터 유도된다. 중쇄 불변 영역은 다섯가지의 이소타입: 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 또한, 다양한 서브클래스(예를 들어, 중쇄의 IgG 서브 클래스)의 중쇄가 상이한 이펙터 기능을 담당하며, 그로 인해서, 요망되는 중쇄 불변 영역을 선택함으로써, 요망되는 이펙터 기능을 지니는 키메라 항체가 생성될 수 있다. 바람직한 불변영역은 감마 1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이다. 감마 1(IgG1) 이소타입의 Fc 영역이 더욱 바람직하다. 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda)형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형일 수 있다.
키메라 항체- 키메라 항체는 전형적으로 상이한 종인 두 가지의 상이한 항체로부터 유도된 서열을 함유하는 항체이다. 가장 전형적으로는, 키메라항체는 사람 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로는 사람 불변영역 및 뮤린 가변 영역을 포함한다.
면역원성- 수용체에 투여된 경우에 면역반응(체액성 또는 세포성)을 유도할 수 있는 표적화 단백질 또는 치료학적 잔기의 능력의 측정치. 본 발명은 본 발명의 인간화된 항체 또는 이의 단편의 면역원성에 관한 것이다.
면역원성이 감소된 인간화된 항체 또는 키메라 항체- 본 용어는 모항체, 예를 들어, 24-31 항체에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 항체 또는 인간화된 항체를 의미한다.
모항체의 결합 특성을 사실상 보유하는 인간화된 항체- 본 용어는 인간화된 항체 또는 키메라 항체를 생성시키는데 사용된 모항체에 의해 인식된 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 인간화된 항체 또는 키메라 항체를 의미한다. 24-31 항체의 결합 특성을 사실상 보유하는 인간화된 항체 또는 키메라 항체는 사람 gp39에 결합할 것이다. 바람직하게는 인간화된 항체 또는 키메라 항체는 모항체와 동일하거나 사실상 동일한 항원 결합 친화성 및 결합성을 나타낼 것이다. 이상적으로는, 항체의 친화성은 모항체 친화성의 10% 이상, 바람직하게는, 약 30% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 친화성은 모항체의 50% 이상일 것이다. 항원 결합 친화성을 검정하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 반극대 결합 검정, 경쟁검정, 및 스캐차아드 분석을 포함한다. 적합한 항원 결합 검정이 본원에 기재되어 있다.
본 발명은 사람 gp39와 결합하는 신규한 인간화된 모노클로날 항체 및 치료제로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간화된 항체를 코드화하는 핵산서열 및 재조합 숙주 세포에서의 이들의 발현에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 사람 gp39에 특이적으로 결합하는 뮤린 24-31 항체로부터 유도된 인간화된 항체에 관한 것이다.
뮤린 24-31 항체는 시험관내 및 생체내에서 gp39를 기능적으로 불활성화시키는 사람 gp39에 대해 유도된 뮤린 항체이다. 따라서, 이러한 항체는 gp39의 불활성화 및/또는 gp39/CD40 상호작용의 조절 또는 억제가 바람직한 질환을 치료하는 데 잠재적으로 유용한 특성을 지닌다. 특히, 이러한 질환으로는 자가면역질환, 예컨대, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, ITP, 당뇨병, 및 전신성 홍반성 루푸스 뿐만 아니라 비자가면역질환, 예컨대, 이식편 대 숙주질환 및 이식편 거부반응이 포함된다.
그러나, 뮤린 24-31 항체가 치료제로서 효능적으로 적합하게 하는 기능적인 특성을 지니지만, 이러한 항체는 다수의 잠재적인 단점을 지니고 있다. 즉, 이러한 항체는 뮤린 기원을 지니므로 사람에게는 잠재적으로 면역원성을 나타낼 것이다. 또한, 이러한 항체는 뮤린 불변 서열을 함유하기 때문에, 완전한 범위의 사람 이펙터 기능을 나타내지 못할 것이며, 사람에게 투여되는 경우에 보다 신속하게 제거될 수 있다. 이러한 단점이 어떠한 질환상태 또는 환자의 치료에 있어서는 문제가 되지 않을 수 있지만, 치료하려는 질환이 만성 또는 재발성 성질을 지닌 경우에 상당히 우려된다. 재발성 또는 만성질환의 예에는, 예를 들어, 자가면역 질환이 포함되며, 숙주는 자가 항원에 대해 자가면역반응을 지속적으로 또는 만성적으로 나타낸다.
따라서, 뮤린 항체 24-31과 관련된 이러한 단점, 즉, 사람에서의 잠재적인 면역원성 및 사람 이펙터 기능의 저하를 완화시키기 위해서, 본 발명자들은 뮤린 24-31 항체의 개선된 인간화된 유도체를 생성시키고자 하였다. 이러한 사항이 본 발명의 목적이지만, 바람직한 결과는 통상적이거나 예측할 수 있는 성질의 것이 아니었다. 항체를 인간화하는 데는 변화시키려는 아미노산 서열을 주의해서 선택해야하며, 이를 치환하는 잔기를 신중하게 선택해야 한다. 그 이유는 항체 가변 영역의 변화가 수개의 아미노산 잔기와 연루되는 항체 가변 영역의 변화인 경우에도 항원 결합에 상당히 유해한 영향을 줄 수 있기 때문이다. 예를 들어, 인간화된 항체는 모 항체에 비해 실질적으로 감소된 항원 친화성 및/또는 항원-특이성을 나타낼 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 뮤린 항체를 포함한 항체의 인간화 방법이 문헌에 기재되어 있다. [참조 문헌; Padlan, Molec. Immunol., 31(3):169-217(1994); Padlan, Molec. Immunol., 28:484-498(1991); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]. 상기 문헌의 모든 내용은 본 발명에 참고 문헌으로 인용되었다. 이러한 방법에는 특히 CDR 그래프팅[참고 문헌; Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1539(1988)] 및 비필수 프레임워크 아미노산 잔기의 선택 및 적절한 치환변이에 의한 이들의 변화를 포함하는 보다 정교해진 방법[Padlan, Molec. Immunol., 28:489(1991) and Padlan, Molec. Immunol., 31:169(1994)]에 의한 인간화를 포함한다. 상기 참조문헌은 본 발명에서 이의 모든 내용을 참조로 인용한다.
상기 주지된 바와 같이, CDR 그래프팅 기술은, 어떠한 예에서는 성공적이지만, 생성되는 인간화된 항체의 친화성에 실질적으로 역효과를 미칠 수 있다. 이러한 결과는 어떠한 프레임워크 잔기가 항체 결합에 영향을 주거나 이에 필수적이고 적어도 영향을 주기 때문인 것으로 믿어진다. 본 발명의 기술(Padlan (1994)(Id.))은 항체 결합 부위의 보존에 중요한 것으로 여겨지는 뮤린 프레임워크 잔기만을 유지시키면서 분자의 표면 특성을 가능한 한 사람과 같이 유지시키기 때문에 더욱 정교하다. 따라서, 이러한 기술은 모항체의 항원 결합 특성을 보유하는 인간화된 항체를 생성시키는 효과를 지니고 있다. 이러한 이유로 하여, 이러한 기술은 사람 gp39에 특이적인 뮤린 항체 24-31로부터 유도된 인간화된 항체를 효능적으로 수득하는 수단으로서 본 발명자에 의해 선택되었다.
24-31 항체의 가변영역을 클로닝하면(하기 실시예에서 상세히 설명됨) 도 7 및 도 8에 각각 도시된 24-31항체에 의해 이용된 VL및 VH서열이 확인되었다. 서열화한 후에, 가변영역을 인간화하였다. 상기 주지되는 바와 같이, 이러한 과정은 본원에 참조로 인용된 패들란(1994)(Id.)의 방법에 따라서 실질적으로 수행되었다.
본 방법은 일반적으로 비사람 프레임워크를 사람 프레임워크 잔기로 치환하고, 항원 결합 특성을 보존시키는데 중요한 것으로 여겨지는 프레임워크 잔기만을 보유시키는 것을 포함한다. 이상적으로는, 이러한 방법은 이종 항체의 표면에 사람 유사 특성을 부여하여, 덜 면역원성이 되게 하면서 항원 결합 특성에 영향을 주는 내부 및 접촉 잔기를 보유하게 한다.
더욱 특히, 도 7 및 도 8에 도시된 24-31 VK및 VH서열은 "주형"으로 일컬어지는 보고된 서열의 사람 항체와 비교하여 인간화되었다.
특히, 24-31 VK이 주형으로서 하기 서열을 사용하여 인간화되었다:
(a) VL#1에 있어서, 사람 V-카파 서브그룹 I 서열, 예를 들어, DEN 등, 뿐만 아니라, 생식세포주 012[참조, Cox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836(1994)],및 VL#2에 있어서, 사람 V-카파 서브그룹 IV 서열, 예를 들어, LEN. 이러한 주형 서열은 공지되어 있으며, 문헌[Kabat et al. (1991)(Id.)] 또는 진뱅크(GenBank)에 보고되어 있다.
24-31 VH#1은 주형으로서 하기 서열을 사용하여 인간화되었다:
(a) 사람 VH서브그룹 IV 서열, 58p2 및
(b) (GenBank Accession No.) Z18320 및 생식세포주 3d75d [참고 문헌; S.van der Maarel et al., J. Immunol., 150:2858-2868(1993)].
이러한 주형 항체 중쇄 가변 서열은 공지되어 있으며, 문헌[Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest,"5th Ed., NIH (1991)] 및 진뱅크(GenBank)에 보고되어 있다.
주형 사람 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열은 24-31 전체와의 고도의 서열 상동성 뿐만 아니라 "중요한" 잔기, 즉, VL:VH경계면에 포함되는 것으로 사료되는 잔기; 상보성 결정 영역과 접촉되는 잔기, 또는 안쪽으로 향해있는 잔기를 포함한 다수의 기준을 기초로 하여 선택되었다. 또한, 주형은 24-31 FV의 정전하를 가능한 한 많이 보유하도록 선택되며, 글리신, 프롤린 및 항원 결합에 영향을 주는 것으로 사료되는 그밖의 특이적 아미노산 잔기를 보유하도록 선택되었다.
이러한 방법은 하기 표 1 및 표 2에 기재되는 24-31항체로부터 유도된 하기된 바람직하게 인간화된 VL및 VH중쇄 서열을 생성시킨다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은, 또한, 바람직한 인간화된 서열의 등가물 및 변이체, 예를 들어, gp39 결합에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환체를 함유하는 서열을 포함한다. 상보성 결정 영역이 도 7 및 도 8에 도시되어 있으며, 이들 영역은 모(비인간화된) 24-31 항체의 전체 가변 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 함유한다.
[표 1]
인간화된 24-31 VL 서열
[표 2]
인간화된 24-31 VH 서열
이를 통해서 알 수 있는 바와 같이, VH및 VL사슬에 대하여 네 개의 바람직한 인간화된 프레임워크 서열을 설계하였다. 따라서, 보존적 변형을 함유하는 등가물 및 변이체를 제외하고, 상기 확인된 인간화된 VH및 VL24-31 서열을 사용하여 합성될 수 있는 16개의 상이한 가능한 인간화된 24-31 항체가 존재한다.
이들 인간화된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 함유하는 인간화된 24-31 항체는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 바람직한 인간화된 가변 서열의 임의의 조합이라도 함유하는 인간화된 서열은 사람 gp39와 결합하는 인간화된 항체를 생성시킬 것으로 기대된다. 더욱이, 이들 서열을 기초로 하여, 표 1 및 표 2에 기재된 넘버링을 사용하는 선호도는 하기와 같을 것으로 기대된다:
(1) #1 VH와 #1 VL(변형체 1)
(2) #1 VH와 #2 VL(변형체 2)
(3) #2 VH와 #1 VL(변형체 3)
(4) #2 VH와 #2 VL(변형체 4)
상기 동정된 인간화된 VH및 VL서열은 예를 들어, 하나 이상의 추가 치환 변형의 도입, 및 또한 다른 아미노산의 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 항원(gp39) 결합에 역효과를 미치지 않는 추가의 변형이 선택될 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 카뱃 넘버링 도해(Kabat numbering scheme)(Kabat et al. (1991)(Id.))에 따라서 잔기 34, 43, 44 및 68 중 하나 이상의 잔기의 치환에 의해VH사슬의 추가 변형을 고려한다. 또한, 본 발명자들은 VL사슬 중의 잔기 85의 변형을 고려한다. 항체 결합 부위의 구조적인 특징을 기초로 하여, 상기 잔기의 변형이 항원 결합에 역효과를 미치지 않는다고 믿어진다. 더욱이, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환의 도입이 gp39 결합에 역효과를 미치지 않을 것으로 기대된다.
본 발명의 인간화된 24-31, VH및 VL서열을 보다 잘 기술하기 위해서, 바람직한 인간화된 프레임워크 서열이 또한 하기 표 3에 기재되어 있으며, 여기에는 이들 서열이 비인간화된 뮤린 24-31 VH및 VL프레임워크 서열 뿐만 아니라, 주형 사람 프레임워크 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열, 즉, 사람 DEN VK1, 사람 012/V36 배선, 사람 LEN VKIV, 사람 58p2, 사람 Z18320 및 사람 3d75d와 비교되어 있다.
[표 3a]
VK 프레임워크 영역 비교 - 인간화된 안티-gp39
FR1 FR2
사람 012/V3b 배선사람 DEN VKI뮤린 24-31인간화된 패들란 VL#1
FR3 FR4
사람 012/V3b 배선사람 DEN VKI뮤린 24-31패들란 VL#1
FR1 FR2
사람 LEN VKIV뮤린 24-31인간화된 패들란 VL#2
FR3 FR4
사람 LEN VKIV뮤린 24-31패들란 VL#2
FR1
사람 58p2뮤린 24-31인간화된 패들란 VH#1사람Z18320진뱅크사람 3d75d 배선인간화된 패들란 VL#2
[표 3b]
FR2 FR3
사람 58p2뮤린 24-31패들란 VH#1
사람 Z18320사람 3d75d패들란 VH#2
사람 58p2뮤린 24-31패들란 VH#1
사람 Z18320패들란 VH#2
인간화된 항체를 생성시키기 위해서, 상기 확인된 인간화된 VL및 VH서열을코딩시키는 DNA 서열이 합성된다. 주지된 바와 같이, 이들 네 개의 인간화된 VL서열과 네 개의 인간화된 VH서열을 고려하게 되면, 합성될 수 있는 16개의 가능한 인간화된 항원 결합 부위가 존재하게 된다. 또한, 다른 아미노산 잔기에 의한 인간화된 VH의 잔기 34, 43, 44 및 68, 및 인간화된 VL의 잔기 85의 가능한 치환 및/또는 보존적 치환 변이의 가능한 혼입을 고려하게 되면, 더욱 많은 가능한 인간화된 항원 결합 부위가 존재한다. 상보성 결정 영역 및 상응하는 DNA 서열을 포함하는 두 개의 바람직한 인간화된 경쇄 가변 서열(1) 및 (2), 및 바람직한 인간화된 중쇄 가변 서열(1)은 각각 도 4, 5 및 6에 도해되어 있다.
공지된 서열의 단백질을 코드화하는 DNA를 합성하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 방법을 사용하여, 본 발명의 인간화된 VL및 VH서열을 코드화하는 DNA 서열이 합성된 후, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터 시스템에서 발현된다. 이것은 사람 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현되어 기능성 (항원 결합) 항체를 생성시키는 본 발명의 인간화된 VL및 VH서열을 제공하는 어떠한 벡터 시스템에서도 효과적일 수 있다.
재조합 항체, 특히 인간화된 항체의 발현에 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포는 당해분야에 널리 공지되어 있다.
하기의 참고문헌은 본원에 참조로 인용되는 재조합 면역글로불린의 발현에 적합한 대표적인 방법 및 벡터가 기술되어 있다: [참고 문헌; Weidle et al.,Gene, 51:21-29 (1987); Dorai et al.,J. Immunol., 13(12):4232-4241 (1987); De Waele et al.,Eur. J. Biochem., 176:287-295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49:1738-1745 (1989); Wood et al.,J. Immunol., 145(a):3011-3016 (1990); Bulens et al.,Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington et al.,Biol. Technology, 10:169 (1992); King et al.,Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page et al.,Biol. Technology, 9:64 (1991); King et al.,Biochem. J., 290:723-729 (1993); Chaudary et al.,Nature, 339: 394-397 (1989); Jones et al.,Nature, 321:522-525 (1986); Morrison and Oi,Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12051-12055 (1994); Singer et al.,J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3): 215-219 (1994); Queen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma et al.,J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992)]. 더욱이, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터가 시판되고 있다.
작용성 면역글로불린을 발현시킬 수 있는 것으로 공지된 숙주 세포는 그 밖의 다른 숙주 세포중에서도 특히, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 골수종 세포와 같은 포유류 세포, 대장균과 같은 박테리아, 사카로마이스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 세포를 포함한다. 이들 중에서, CHO 세포는 면역글로불린을 효과적으로 발현시키고 분비시키는 이들의 능력 때문에 많은 연구자들에 의해 사용된다.
본질적으로, 인간화된 항체의 재조합 발현은 두가지 일반적인 방법 중의 한 방법에 의해 수행된다. 첫 번째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변 영역에 융합된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열 둘 모두를 발현시키는 단일 벡터로 트렌스펙션된다. 두 번째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변 영역에 융합된 중쇄 가변 서열 또는 경쇄 가변 서열을 각각 발현시키는 두 개의 벡터로 트렌스펙션된다.
사람의 불변 도메인 서열은 당해기술분야에 널리 공지되어 있으며, 문헌에 보고되어 있다. 바람직한 사람 VL서열은 카파 및 람다 경쇄 불변 서열을 포함한다. 바람직한 사람의 중쇄 불변 서열은 변경된 효과 또는 기능, 예를 들어 증강된 생체내 반감기 및 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 사람 감마 1, 사람 감마 2, 사람 감마 3, 사람 감마 4 및 이들의 변이된 변형체를을 포함한다.
사람 감마 4 불변 도메인의 바람직한 변형은 P 및/또는 E 변형을 포함하는데, 이들은 본원에 참조로 인용된 1995년 9월 6일에 출원되어 공동 양도된 대리 서류 제 012712-165호에 기술된 바와 같이 각각 위치 236에서 루신이 글루탐산으로 변화되고/되거나 위치 229에서 세린이 프롤린으로 변화되는 것 (카뱃 넘버링)이 언급되어 있다.
특히 바람직한 벡터 시스템은 공동으로 양도된 미국특허출원 제 08/476,237호(1995년 6월 7일 출원), 제 08/397,072호(1995년 1월 25일 출원), 제 08/147,696호(1993년 11월 3일 출원), 제 07/977,691호(1992년 11월 13일 출원), 제 07/912,122호(1992년 6월 10일 출원), 07/886,281호(1992년 3월 23일 출원) 및 제07/735,064호(1991년 7월 25일 출원)에 기술된 발현 벡터를 포함하며, 상기 문헌은 모두 본원에 참고 문헌으로 인용되었다.
특히, 이들 출원에는 하기의 요소를 포함하는 TCAE 5.2 및 TCAE 6으로 언급된, 재조합 항체를 생성시키기 위한 벡터 시스템이 기술되어 있다:
1) 직렬로 배열된 네 개의 전사 카셋트
(a) 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역. TCAE 5.2에서, 이것은 사람 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역(카뱃 넘버링 아미노산 108-214, 알로타입 Km 3)이고, TCAE 6에서는 사람 면역글로불린 경쇄 람다 불변 영역(카뱃 넘버링 아미노산 108-215, 유전자형 Oz 마이너스, Mcg 마이너스, Ke 마이너스 알로타입)이다.
(b) 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 두 구조물 모두에서 사람 면역글로불린 중쇄는 감마/불변 영역(카뱃 넘버링 아미노산 114-478 알로타입 Gm1a, Gm12)이다.
(c) DHFR (이의 고유의 진핵 프로모터 및 폴리아데닐화 영역을 함유함); 및
(d) NEO (또한 이의 고유의 진핵 프로모터 및 폴리아데닐화 영역을 또한 함유함).
2) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카셋트는 면역글로불린 사슬의 분비를 위한 합성 시그날 서열을 함유하며;
3) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카셋트는 번역 리딩 프레임을 보유하지만 면역글로불린 사슬에서 통상적으로 발견되는 아미노산을 변경시키지는 않는 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 삽입시켜주는 특정 DNA 링크를 함유한다.
아넥스(ANNEX) 2 벡터는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (네오) 개시 코돈에서 두 개의 상이한 변형을 함유하는 TCAE 벡터의 변형 벡터이다. 제 1 변형은 프레임 업스트림에 번역 개시 부위가 부가된 것이다. 제 2 변형은 네오 유전자의 개시 부위가 변형되어 덜 효과적으로 된 것이다. 네오스플라(NEOSPLA) 벡터는 아넥스 2 벡터의 변형 벡터이다. 네오 유전자는 합성 도너/억셉터 스플라이스 부위를 사용하여 두 부분으로 쪼개어 졌으며, 경쇄, 중쇄, 및 DHFR 유전자는 네오 인트론의 내부에 위치되었다.
바람직하게는, 이들 벡터는 CHO 세포에서 이용된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 상기된 벡터 시스템에서 발현된다.
그러나, 24-31 항체로부터 유도된 본 발명의 인간화된 항체 서열은 기능성 항체, 즉, gp39 항원과 결합하는 항체를 발현시키는 어떠한 벡터 시스템에서도 발현될 수 있다.
특히, 본 발명자들은 사람 카파 및 사람 감마 1 불변 영역을 함유하는 N5KG1 발현 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 24-31 항체로부터 유도된 천연(변형되지 않은) VL및 VH서열 뿐만 아니라 본 발명의 인간화된 VL및 VH서열을 발현시키기로 하였다. N5KG1 발현 벡터는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 원하는 경우에, 24-31 항체로부터 유도된 키메라 항체는, CHO 세포에서 발현될 경우, (CHO- gp39 트랜스펙턴트로의 입증된 결합에 의해) gp39와 결합한다. 또한, 24-31 항체로부터 유도된 본 발명의 수 개의 인간화된 항체는, 이러한 벡터 시스템을 사용하여 발현될 경우,기능성(gp39 결합) 항체를 생성시킨다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 상세하게 기술된다. 이들 실시예는 설명의 한 예로서 제공되며, 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
인간화를 위한 24-31 항체의 선택
동물 모델에서의 축적된 증거를 통해서 안티-gp39 투여가 다양한 자가면역 과정을 억제하며, 동종이식편 거부를 방지한다는 것을 알 수 있다. 이들 결과는 사람 gp39에 대한 항체가 자가면역 질환의 조절 및 사람의 동종이계 조직 및 기관의 이식에 있어 중요한 치료적 가치를 가질 수 있는 어쩔수 없는 증거를 제공한다. 사람 gp39에 특이적인 모노클로날 항체(mAb)는 문헌[Lederman et al., J. Immunol., 199:3817 (1992)]에 보고되어 있으며, 시험관내에서 gp39-CD40 상호작용을 차단하는데 있어 이의 기능 활성이 평가되어 있다. 사람 면역계에 대한 안티-gp39 항체의 기능성 영향을 보다 면밀하게 조사하기 위해서, 안티-사람 gp39 mAb의 패널을 발생시켰다. 이러한 패널로부터, 하나의 mAb가 우수한 것으로 나타났으며, 이것을 시험관내 및 생체내에서 gp39의 기능 비활성화에 대해서 광범위하게 시험하였다.
보다 상세하게는, 사람 gp39 (gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질로 면역시킨 후, 활성화된 사람 말초 혈액 T 세포의 공격에 의해 6개의 뮤린(모두 IgG1) 안티-gp39 항체의 패널을 발생시켰다. 사람 말초 혈액 T 세포의 흐름 세포계수 분석을 통해 mAb가 활성화된 (PMA/이오노마이신), 그러나 휴면하지는 않는, CD3+T 세포상에 발현된 세포 표면 분자를 인지했다는 것과, 반응성의 패턴이 재조합 CD40 융합 단백질(CD40-Ig)에서 나타난 반응성 패턴과 유사하다는 것(데이타는 나타내지 않음)을 입증하였다. [35S] 대사적으로 표지된 활성화된 사람 말초 혈액 T 세포의 면역침전을 통해서 6개의 mAb 각각이 CD40-Ig에 의해 침전된 것과 유사한 크기(33kDa)의 분자를 침전시켰다는 것을 알 수 있었다. 최종적으로, CD40-Ig가 gp39에 결합하는 것이 항체의 존재하에서 차단되었는데, 이는 동일한 분자의 인지를 나타내며 추가로 이들의 특이성을 확인해준다. 모든 6개의 mAb가 gp39 기능을 차단할 수 있었지만, 광범위한 분석을 위해 하나의 mAb, 24-31 항체를 선택하였다.
실시예 2
T 세포 의존성 B 세포 증식 및 분화(Ig 생성)는 안티-gp39에 의해 차단된다.
리간드인 gp39에 의해 CD40을 통해 전달된 시그날이 B 세포 활성, 증식, 분화 및 이소타입 스위칭을 유발시킨다는 증거는 많은 연구를 통해 제공되었다. 안티-gp39 24-31 mAb가 gp39 기능을 차단하는지의 여부를 측정하기 위해서, 24-31의 존재 또는 부재하에 gp39(gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질과 함께 B 세포를 배양시키고,3H-티미딘 혼입에 의해 B 세포 증식 반응을 평가하였다. 도 2a에 도시된 결과는 gp39-CD8이 B 세포를 활발하게 증식시킨다는 것을 입증하였다. 안티-gp39 24-31 mAb 존재는 2.5μg/ml 정도의 낮은 농도에서 gp39-CD8에 의해 유도된 B 세포 증식을 완전하게 제거하였다. 24-31이 T 세포 유도된 B 세포 분화를 간섭하는 지의 여부를 결정하기 위해, 24-31의 존재 또는 부재하에 B 세포를 안티-CD3 활성화된 T세포와 공동 배양하였다. 12일 후에, 폴리클로날 IgM, IgG 및 IgA 생성을 평가하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 24-31의 첨가는 폴리클로날 IgM, IgG 및 IgA 항체 생성을 억제하였다 (90-99%). 이러한 결과는 T 세포 의존성 B 세포 분화에서 gp39-CD40 상호작용에 대한 요건을 수립하는 앞서의 문헌[Nishioka et al., J. Immunol., 153:1027 (1994)]을 확실하게 하며, gp39 기능을 차단하는데 있어서의 새로이 특징화된 안티-사람 gp39 24-31 mAb의 용도를 추가로 입증하였다.
실시예 3
안티-gp39는 사람 PBL로 재구성된 중증혼합면역결핍증에 걸린 마우스에서 생체내 파상풍 톡소이드 특이적 항체 생성을 차단한다.
많은 연구는 사람 면역계가 사람 말초 혈액 림프구로 인그래프팅(engrafting)된 중증혼합면역결핍증(scid)에 걸린 마우스(hu-PBL-scid mice)의 사용을 통해 실험적 조건하에서 생체내 연구될 수 있음을 수립하였다[참고문헌: Mosler et al., Nature, 335:256 (1988); McCune et al., Science, 241:1632 (1988)]. 장기간의 키메리즘(chimerism)은 사람 PBL의 주입에 의해 중증혼합면역결핍증에 걸린 마우스에 의해 달성되며, 항원 특이적 2차 항체 반응은 생체내에서 항원으로 자극된 hu-PBL-scid 마우스에서 검출되었다[참고문헌: Carlsson et al., J. Immunol., 148:1065 (1992); Duchosal et al, Cell Immunol., 139:468 (1992)]. 이러한 시스템은 사람 T 및 B 세포에 의해 유도되는 면역 반응에 대한 생체내 안티-gp39 투여의 면역억제 효과를 평가하기 위해 이용되었다.
그 결과가 도 2b에 도시되어 있는 실험을 통해서 24-31에 의한 gp39 기능의차단이 시험관내 사람 B 세포에 의한 T 세포 의존성 폴리클로날 Ig 생성을 억제한다는 사실을 입증하였다. 24-31이 생체내에서 항원 특이적 B 세포 항체 생성을 억제하는 지의 여부를 측정하기 위해서, 사람 PBL(hu-PBL-scid)로 복강내 주입되고, 파상풍 톡소이드(TT)로 면역 처리된 C.B-17 scid/scid 마우스를 24-31 또는 PBS로 처리하고, 이차 (IgG) 안티-TT 항체 반응을 평가하였다. TT로의 hu-PBL-scid 의 면역화는 대부분의 동물에서 면역화 후 14일 내에 검출가능한 정도의 IgG 안티-TT 항체를 유도하였다 (표 4). 그러나, 안티-gp39로 처리하였더니(24-31; 250μg/1일, 1주일당 2회), 시험한 10마리의 마우스 중 9마리의 마우스에서 이차 안티-TT 항체 반응이 완전히 제거되었으며, 이는 gp39 기능의 생체내 차단이 항원 특이적 체액성 반응의 억제를 또한 유발시켰음을 나타낸다.
[표 4]
파상풍 톡소이드로 면역처리된 C.B-17 scid/scid 마우스에 사람 PBL의 인그래프팅 이후의 2차 안티-파상풍 항체 반응의 제거*. 4 내지 6주 된 C.B-17-scid/scid 마우스에 20× 106사람 PBL 및 0.25ml 파상풍 톡소이드를 복강내 주입시켰다.
수용자 계통* 처리¶ 안티-파상풍 항체(O.D. ±SE)§(안티-파상풍 항체를 함유하는 마우스의 빈도)
7일 14일 21일 28일
C.B-17 scid/scid PBS <0.02 (0/10) 2.30±0.042(7/10)* 0.224±0.040(8/10)** 0.137+0.007(4/10)
안티-gp39 0.162(1/10) <0.02(0/10) <0.02 (0/10) <0.02 (0/10)
¶ 안티-gp39 24-31 또는 PBS (250μg/1회 주입)를 전체 실험에 걸쳐서 일주일에 두 번 복강내 투여하였다.§혈청내 사람 안티-파상풍 톡소이드 항체의 수준은 ELISA에 의해 1주일 마다 측정되었다. 1:10 희석비에서 0.100 O.D. 보다 큰 사람 안티-파상풍 톡소이드 항체의 혈청 수준을 갖는 모든 마우스는 양성으로 간주하였다. 단지 양성 마우스만이 표에 기재된 평균 ± SE 값의 계산에 사용되었다. 파상풍 톡소이드로 면역처리되지 않은 면역전 마우스로부터 혈청내 사람 안티-파상풍 톡소이드의 수준은 <0.02 O.D.였다. 데이타는 평균 ± SE로서 제시되어 있다.* 안티-gp39 처리된 군과 상당히 다름(p=0.222).** 안티-gp39 처리된 군과 상당히 다름(p<0.001)
실시예 4
안티-gp39 처리는 hu-PBL-scid 비장 세포의 항원 특이적 T 세포 증식 반응을 억제하지 않는다.
안티-gp39로 hu-PBL-scid 마우스의 처리가 생체내의 항원 특이적 T 세포의 반응성을 변형시키는 지의 여부를 측정하기 위해서, TT로 면역처리하고 24-31로 처리한 hu-PBL-scid 마우스로부터 비장 세포의 증식 반응을 시험관내에서 평가하였다. 대조군 또는 안티-gp39 치리된 hu-PBL-scid 마우스로부터의 비장 세포를 TT 와 함께 또는 배지 단독으로 배양시키고, 6일 경과 후,3H-티미딘 혼입에 의해 증식 반응을 평가하였다. 표 5에는 상기 실험의 결과가 요약되어 있다. 안티-gp39로 처리한 hu-PBL-scid 마우스는 처리하지 않은 hu-PBL-scid 마우스와 같이 시험관내에서의 TT로의 자극에 유사하게 반응하였다(5/10 대 3/10 마리의 마우스가 반응). NOD/LtSz-scid /scid 마우스를 수용자로서 사용한 실험은 유사한 결과를 생성시켰지만, 안티-TT 항체는 이들 마우스에서 검출할 수 없었다 (데이타는 도시되지 않음). 이들 데이터는 안티-gp39로의 처리가 hu-PBL-scid 마우스에서 항원 특이적 T 세포의 기능성 활성 또는 결실을 야기시키지 않는다는 것을 나타내며, 안티-gp39에 의한 TT 특이적 항체 반응의 억제가 T 세포 비활성화라기 보다는 gp39-CD40 상호작용 및 후속하는 B 세포 반응의 차단으로 인한 것이라는 주장을 뒷받침해준다.
[표 5]
안티-gp39 처리는 파상풍 톡소이드로 면역처리된 C.B-17-scid/scid 또는 NOD/LtSz-scid/scid 마우스내에 사람 PBL의 인그래프팅 이후의 안티-파상풍 T 세포 증식 반응을 변화시키지 않는다.
수용자 계통* 처리¶ 반응하는 마우스의 빈도§
C.B-17 scid/scid PBS안티-gp39 3/105/10
NOD/LtSz-scid/scid PBS안티-gp39 5/106/10
* 4 내지 6주 된 C.B-17-scid/scid 또는 NOD/LtSz-scid/scid 마우스에 20×106사람 PBL 및 0.25ml 파상풍 톡소이드를 복강내 주입시켰다.¶ 안티-gp39 24-31 또는 PBS(250μg/1회 주입)를 전체 실험에 걸쳐서 1주 당 2회 복강내로 투여하였다.§사람 PBL을 주입하고 파상풍 톡소이드로 면역처리한 마우스로부터의 비장 세포를 배지 단독 또는 파상풍 톡소이드(2.5 또는 5.0μg/ml)의 존재하에 1×105세포/ml의 농도에서 배양시켰다. 6일 경과후에3H-티미딘 혼입에 의해 증식을 평가하였다. "S.I. = cpm 파상풍 - cpm 배지/cpm 배지" 식을 사용하여 자극율을 계산하였다. 2.0 보다 큰 S.I.는 양성으로 간주된다.
실시예 5
gp39 CHO 트랜스펙턴트 세포주의 발생
최근에, 본 출원에서 제안된 인간화된 안티-gp39 24-31 결합 연구용 시약으로서 사용하기 위해 세포 표면 gp39를 구성적으로 발현시키는 CHO 트랜스펙턴트를 생성시켰다. 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)-활성화된 사람 PBL의 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 전장 gp39 유전자[참고문헌: Hollenbaugh et al,Immunol. Rev., 138:23 (1994)]를 증폭시키고, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 인핸서 요소의 전사 조절하에서 IDEC의 INPEP4 벡터로 클로닝시켰다. CHO 트랜스펙턴트를 정립하여 50nM 메토트렉세이트중에서 증폭시켰다. ELISA(데이타는 도시하지 않음) 및 FACS 분석에 의해 트랜스펙턴트, 50D4가 세포 표면 gp39를 발현시키는 것으로 밝혀졌다(도 3). 트랜스펙턴트는 또한 mgp39 CHO(막결합된 gp39 트랜스펙션된 CHO 세포)로서 언급된다.
실시예 6
CHO 발현 시스템을 사용하는 고도의 항체 발현
IDEC 독점 N5KG1 발현 벡터를 인간화된 안티-gp39 24-31 항체의 발현을 위해 CHO 세포에 사용하였다. 상기 벡터를 도 1에 개략적으로 도시하였다. 재조합 항체의 고도의 발현은 상기 벡터 및 유사한 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 구성적으로 수득하였다. 이들 인자를 사용하여, 고비율, 즉 5 내지 10%의 G418 내성 클론이 상당량(1 내지 10㎎/ℓ 항체)의 재조합 단백질을 발현시킴을 발견하였다. 이들은 일반적으로 단일 플라스미드 복사체 성분이며, 메토트렉세이트를 사용하여 쉽게 증폭되어 30 내지 100 pg/세포/일의 분비된 면역글로불린을 수득할 수 있다. 표 6은 상기 시스템을 사용하여 CHO 세포에서 발현되는 3개의 항체의 유전자 증폭 전 및 후에 수득되는 항체 수준을 기재한 것이다.
[표 6]
IDEC의 CHO 발현 기술을 사용한 항체 생성 수준
항체 증폭전 (㎎/ℓ) 스피너 플라스크에서의 증폭후 (㎎/ℓ) 발효기에서의 증폭후 (㎎/ℓ)
안티-CD4 γ1안티-CD4 γ4안티-CD20 1-23-45-10 100-110125-150200-300 950N.D.650
실시예 7
24-31 V K 및 V H DNA 서열의 클로닝
안티-gp39 24-31 VK및 VH유전자 단편을 클로닝시키고 서열화시켰다. 이들의 서열의 분석 후에, V 영역 유전자 단편의 인간화된 변형체를 설계하였다. 상응하는 DNA 서열을 합성하고, 사람 불변 영역 유전자를 함유하는 고수준 발현 벡터로 클로닝하였다. 그 다음, 인간화된 24-31 항체를 생성시키는 CHO 트랜스펙턴트를 형성시켰다. 안티-gp39 항체의 인간화된 변형체가 이의 gp39 결합 친화성을 보유하는 지를 확인하기 위해, 뮤린 및 인간화된 항체의 상대적 친화성을 직접 결합 및 경쟁 검정으로 비교하였다. 또한, gp39에 대한 CD40 결합을 차단하고 T 세포 의존성 항체 생성을 억제시킬 수 있는 인간화된 24-31의 능력을 평가하였다.
1. 24-31 VK및 VH유전자 단편의 클로닝
a. cDNA의 제조.
폴리A+mRNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 인비트로겐 코포레이션(Invitragen Corporation) 마이크로패스트 트랙(등록상표명: MicroFastTrack) mRNA 단리 킷을 사용하여, 24-31 하이브리도마 및 24-31 하이브리도마의 생성에 사용되는 융합 파트너인 NS 세포주 각각의 2×106세포로부터 준비하였다 [참고 문헌; Carroll et al., Mol. Immunol., 10:991 (1988)]. 제 1 가닥 cDNA를 50 pmol의 올리고-dT 및 5 유닛 M-MLV 역전사 효소(프로메가)[참고 문헌; Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd. Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]를 사용하여 합성시킨 후, 세파덱스 G-25 크로마토그래피 정제하였다.
b. VK및 VHcDNA의 PCR 증폭.
24-31 및 NS1 cDNA를 3' 불변 영역 프라이머와 조합된 형태로 VK또는 VH리더 서열에 대해 특이적인 5' 프라이머의 패널을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 5' VH프라이머의 패널은 존스(Jones) 및 벤딩(Bending)의 문헌[Bio/Technol., 9:88 (1991); Errata, Bio/Technol., 9:579 (1991)]에 기술된 것과 동일하였다. 5' VK프라이머의 패널(Jones et al., (Id.)을 변형시켜 Sal I 클로닝 부위 인식 서열(GTCGAC)을 Bgl II 인식 서열(AGATCT)로 전환시켜서, IDEC의 N5KG1 발현 벡터로의 증폭된 유전자 단편의 클로닝을 촉진시켰다 (도 1 참조). 3' VK및 VH프라이머는 각각 아미노산 위치 108-109(카뱃 등의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed., NIH (1991)]에 따라 번호를 매김)에서 Bsi WI 클로닝 부위 서열을 함유하고 위치 114-115에서 Nhe I 클로닝 부위 서열을 함유하며, 하기의 서열을 갖는다 :
TGCAGCATCCGTACGTTTGATTCCAGCTT(CK) 및
GGGGGTGTCGTGCTAGCTG(A/C)(G/A)GAGAC(G/A)GTGA(Cγ1).
상기 프라이머 패널은 C2B8 안티-CD20 항체[참고 문헌; Nishioka et al., J. Immunol., 153:1027 (1994)] 및 많은 다른 마우스 VK및 VH유전자 단편(도시되지 않음)을 증폭시키고 클로닝시키기 위해 양수인에 의해 이미 사용된 것이다.
24-31 VK및 VH유전자 단편의 증폭에 대한 정확한 프라이머 쌍을 측정하기 위해, 24-31 cDNA를 CK프라이머와 조합된 11개의 5'VK프라이머 중 하나 또는 Cγ1 프라이머와 조합된 12개의 5'VH프라이머 중 하나를 함유하는 23개의 개별적 반응에서 증폭시켰다. 비교를 위해, NS1 cDNA를 동일한 패널의 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 1㎕ cDNA(cDNA 샘플의 1/50)를 5 유닛의 Tag DNA 폴리머라아제(페르킨 엘머(Perkin Elmer)), 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 각각 0.25mM의 dCTP, dGTP, dATP 및 TTP, 50 pmol 3' 불변 영역 프라이머 및 50 pmol 5'프라이머를 함유하는 100㎕ 최종 부피로 증폭시켰다. 증폭 사이클은 95℃에서 1분 동안의 변성, 50℃에서 2분 동안의 어닐링 및 72℃에서 2분 동안의 신장을 34회 반복하는 것으로 구성된다. 증폭된 생성물을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. VK및 VH에 대한 독특한 증폭 생성물을 생성시키는 24-31 PCR 반응을 반복하고, 중복PCR 반응으로부터의 생성물을 클로닝시켰다. PCR 증폭 생성물을 아가로오스 겔 정제하고[참고 문헌; Sambrook et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1988)], Bgl II 및 Bsi WI(VK에 대해) 또는 Sal I 및 Nhe I (VH에 대해)으로 절단하였다. 생성물을 IDEC 벡터인 N5KG1 내로 순차적으로 연결시켰다 [참고 문헌; Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)].
E. Coli XL1-blue 세포(스트라타진)의 형질전환 후에, 플라스미드 DNA를 제조하고, VK및 VH서열을 중복 구성물로부터 수득하였다 (캘리포니아, 라 졸라에 소재하는 스크립스 리서치 인스티튜트 코어 패실리티(Scripps Research Institute Core Facility)에 의해 시퀀싱이 수행됨). NS1 융합 파트너의 내인성 경쇄 및 중쇄의 서열은 공지되어 있으며[참고 문헌; Carroll et al., Mol. Immunol., 10:991 (1988); Kabat et al., (1991) (Id.)], 이들을 사용하여 NS1 융합 파트너 V 영역과 24-31의 증폭으로부터 생성되는 PCR 생성물을 구별하였다.
실시예 8
인간화된 24-31 V 영역을 코드화하는 유전자 단편의 합성
인간화된 VL및 VH(1)로서 표 1 및 2에서 확인한 가장 바람직한 인간화된 24-31 VK및 VH서열을 함유하는 인간화된 변형체를 합성하였다. 상세하게는, 상기 확인된 인간화된 VK또는 VH영역을 코드화하는 4쌍의 오버랩핑 상보적 올리고누클레오티드(올리고)를 합성하고(미들랜드 케미칼즈), 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제하였다 [참고 문헌; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)]. 각각의 올리고는 길이상 염기가 약 100개이고, 20개 염기가 인접 상보적 올리고누클레오티드와 오버랩핑되었다. 각각 VK및 VH5' 올리고는 Bgl II 및 Sal I 클로닝 부위를 갖고, 3' 올리고는 Bsi WI 및 Nhe I 클로닝 부위를 갖는다. 각각의 가변 영역 유전자 단편을 하기의 과정을 이용하여 하기에 도해된 합성 올리고로부터 어셈블링시켰다 [참고 문헌; Watson et al., Recombinant DNA, 2nd Ed., Scientif. Amer. Books, NY, NY (1992)]. 상보적 올리고쌍(A+E, B+F, C+G, D+F)을 제조업자의 프로토콜에 따라 300 pmol의 각각의 프라이머 및 T4 폴리누클레오티드 키나아제(프로메가)를 사용하여 키나아제화시켰다. 올리고를 95℃로 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 어닐링시켰다. 어닐링된 올리고쌍을 6 유닛의 T4 DNA 리가아제(New England Biolabs)를 사용하여 연결시켰다 (A/E와 B/F, 및 C/G와 D/H). 적합한 5' 또는 3' 클로닝 부위 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 후에, 약 200개의 염기쌍 DNA 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후에 전기용출에 의해 정제하였다(Sambrook et al, (Id.)). 그 후, 합성 유전자 단편을 CMV 프로모터 및 인핸서 요소의 전사적 조절하에, IDEC 독점 고수준 발현 벡터인인 N5KG1 내에 삽입하였다. 연결 반응물은 각각 100:100:1의 몰비로 2개의 겔 정제된 단편(A/E/B/F 및 C/G/D/H) 및 N5KG1을 함유한다. XL1-블루 세포의 형질전환 후에, 플라스미드 DNA를 제조하고 합성 유전자 단편의 서열을 확인하였다. 생성된 구성물인 h24-31은 인간화 24-31 V 영역 단편 및 사람 카파 및 감마 1 불변 영역을 코드화시킨다. 제시된 바와 같이, 상기 항체는 "(1)" 서열로서 표 1 및 표 2에서 확인된 인간화된 중쇄 가변 서열 및 인간화된 경쇄 가변 서열을 함유하고, 최적 gp39 특성을 갖는 인간화된 항체를 제공하는 것으로 예측되는 변형체 1 또는 H24-31.1로서 언급된다. 또한, VH#1과 조합하여 VL#2를 함유하는 구성물(인간화된 24-31 또는 H24-31.2의 변형체 2)을 생성시켰다. IDEC 독점 벡터를 사용하는 유사한 구성물을 IDEC의 안티-CD20 [참고 문헌; Reff et al., Blood, 83:425 (1994)] 및 안티-CD4[참고 문헌; Newman et al., Biol. Technology, 10:1455 (1992)] 항체의 고도의 발현을 위해 사용하였다.
실시예 9
2. 인간화된 24-31의 생성 및 특징화
a. 인간화된 24-31을 생성시키는 CHO 트랜스펙턴트(변형체 1 및 변형체 2)의 생성
인간화된 24-31을 발현시키는 CHO 트랜스펙턴트(변형체 1 또는 변형체 2)를 선형화된 h24-31 DNA(변형체 1 또는 변형체 2)로 4x106개의 CHO 세포를 일렉트로포레이션시킨 후 G418 중에서 선택함으로써 생성시켰다. G418 내성 클론으로부터의세포 배양 상등액을 면역 글로불린을 포착하기 위해 염소 안티-사람 카파를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 면역 글로불린 생성에 대해 검정하였다. 면역 글로불린 결합을 사람 IgG에 대해 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 콘쥬게이트된 염소 항체와 인큐베이션시킨 후, 0.0175% H2O2를 포함하는 시트르산염 완충제(9 내지 34 g/l C6H8O7및 14.2 g/l Na2HPO4)(pH 5.0) 중의 HRP 기질인 0.4㎎/㎖ O-페닐렌-디아민(OPD)과 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 플레이트를 490 nm에서 분자 기기(Molecular Devices) "Vmax, 카이네틱 마이크로플레이트 리더(Vmax, kinetic microplate reader)" 분광기에서 판독하였다.
실시예 10
인간화된 24-31에 의한 gp39에 대한 CD40-Ig 결합의 차단
인간화된 안티-gp39가 gp39에 결합하는 것을 확인한 후에, 인간화된 안티-gp39가 이것의 수용체에 대한 리간드의 결합을 차단하는 능력을 보유함을 확인하기 위한 검정을 수행하였다. 이를 위해, 활성화된 사람 말초혈 T 세포, 또는 gp39-트랜스펙션된 CHO 세포인 50D4를 4℃에서 15분 동안 다양한 농도의 뮤린 24-31 및 인간화된 변형체 1 및 변형체 2 24-31으로 사전 처리하였다. 상기 사전 인큐베이션 후에, CD40-Ig-비오틴을 첨가하고, PE-아비딘을 사용한 흐름 세포계수법에 의해 결합을 측정하였다. 도 26은 변형체 1이 4㎍/㎖에서 CD40-Ig 결합을 50% 감소시키고, 뮤린 24-31이 약 12㎍/㎖에서 결합을 50% 감소시키고, 변형체 2가 20㎍/㎖ 이상에서 결합을 50% 감소시킴을 예시한다.
실시예 11
24-31에 의한 B 세포 증식 및 분화의 차단
뮤린 24-31이 gp39 기능을 차단하는지의 여부를 확인하기 위해, B 세포를 일정 용량 범위의 뮤린 24-31 또는 인간화된 24-31의 존재 또는 부재하에 gp39(gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질과 배양하였다. B 세포 증식 반응을 도 2A에 도시된 바와 같이3H-티미딘 혼입에 의해 검정하였다.
T 세포 의존성 B 세포 분화(Ig 생성)는 gp39에 대한 mAb에 의해 차단되었다. 뮤린 24-31 항체가 활성화된 사람 T 세포의 표면 상에서 발현되는 천연 gp39의 기능을 차단하는 데에 효과적인지를 확인하기 위해, T 세포 유도된 B 세포 분화를 억제하는 본 발명의 인간화된 24-31 항체의 능력을 검정하였다. B 세포를 인간화된 24-31 및 뮤린 24-31의 존재 또는 부재하에 안티-CD3 활성화된 T 세포와 공동 배양하였다. 폴리클로날 IgM, IgG 및 IgA 생성을 12일 후에 검정하였다 (도 2B 참조). 이들 결과로, 안티-gp39 24-31이 CD40 결합을 차단할 수 있고, CD40을 통한 T 세포 의존성 B 세포 활성화를 간섭할 수 있음이 확인되었다.
실시예 12
결합 능력
본 실시예는 항체의 농도와 관련하여 gp39 항원에 대한 뮤린, 키메라 및 인간화된 24-31 항체(변형체 1)의 반응성을 측정하기 위해 수행하였다.
프로토콜 :
플레이트 제조
1. 96-웰 플레이트 상의 각각의 웰에 폴리-1-리신 50을 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 가볍게 쳐서 폴리-1-리신을 제거하였다.
2. mgp39-CHO 세포(실시예 5에 기술된 세포 표면 막 gp39를 발현시키는 차이니즈 햄스터 난소세포)를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리시킴으로써 HBSS로 3회 세척하였다. 세포를 HBSS 중에 2x106세포/㎖로 재현탁시켰다.
3. 50㎕의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 2000 rpm에서 원심분리시켰다.
4. 50㎕/웰의 빙냉 0.5% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
5. 플레이트 및 블롯을 가볍게 쳐서 과량의 글루타르알데히드를 제거하였다. 0.1% BSA와 150㎕/웰의 100 mM 글리신을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트는 즉시 사용하거나, 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 동결시킬 수 있다.
결합 검정
1. 플레이트를 해동시키고, 글리신 완충제를 제거하였다.
2. 1㎍/㎖에서 출발하여 희석 완충제 중에서 시험 항체를 연속적으로 희석시켰다 (1:2). 50㎍/웰의 각각의 희석물을 2중으로 전달하였다. 실온에서 2시간 동안인큐베이션시켰다.
3. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
4. 염소 안티-사람 IgG HRP 또는 염소 안티-마우스 IgG HRP의 1:2000 희석물 50㎕/웰을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
5. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
6. 50㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가하고, 플레이트를 20-30분 동안 전개시켰다. 플레이트를 490 nm의 백그라운드 파장과 함께 405 nm의 파장에서 판독하였다.
7. 흡광도 대 항체 농도의 그래프를 플롯팅하였다.
결과 및 결론 :
항체의 농도에 대해 3개의 안티-gp39 항체(24-31의 뮤린, 키메라 및 인간화된 변형체 1)에 대한 결합 능력은 본질적으로 포개질 수 있다 (도 9 참조). 이것은 이들 항체가 사람 gp39에 대해 유사한 결합 용량을 가진다는 점을 잘 제시하는 것이며, 이는 인간화된 항체가 뮤린 24-31의 gp39 결합 친화성을 보유함을 나타내는 것이다.
실시예 13
비오틴 표지된 뮤린 24-31과 키메라 및 인간화된 변형체 1 24-31 사이의 경쟁
24-31과 이것의 키메라 및 인간화된 변형체 사이의 결합의 유사성을 측정하기 위해, gp39에 결합하는 데에 있어서 원래의 뮤린 항체와 경쟁할 수 있는 유도체의 능력을 측정하는 것을 목적으로 하는 연구를 수행하였다. 상기 연구로부터, 결합의 2/3 포화가 약 200 ng/㎖ 24-31에서 도달됨을 확인하였다. 상기 양은 경쟁 검정에 사용되었다. H24-31은 24-31의 직접 결합만이 측정되고 경쟁이 24-31의 감소된 결합으로서 경쟁을 측정되도록 비오틴일화되었다. 상이한 농도의 키메라 및 인간화된 24-31 변형체를 200 ng/㎖의 최종 농도로 비오틴일화된 뮤린 24-31과 혼합시키고, 글루타르알데히드를 갖는 플레이트에 고정된 gp39+CHO 세포로 코팅된 ELISA 플레이트의 웰 내에 분포시켰다. 24-31 결합의 수준을 하기에 기술되는 바와 같이 아비딘-HRP를 사용하여 측정하였다.
프로토콜 :
플레이트 제조법
1. 96-웰 플레이트 상의 각각의 웰에 폴리-1-리신 50을 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 가볍게 쳐서 폴리-1-리신을 제거하였다.
2. mgp39-CHO 세포를 5분 동안 1500 rpm으로 원심분리시킴으로써 HBSS로 3회 세척하였다. 세포를 HBSS 중에 2x106세포/㎖로 재현탁시켰다.
3. 50㎕의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 2000 rpm에서 원심분리시켰다.
4. 50㎕/웰의 빙냉 0.5% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다.
5. 플레이트 및 블롯을 가볍게 쳐서 과량의 글루타르알데히드를 제거하였다.0.1% BSA와 150㎕/웰의 100 mM 글리신을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트는 즉시 사용하거나, 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 동결시킬 수 있다.
경쟁 검정
1. 플레이트를 해동시키고, 글리신 완충제를 제거하였다.
2. 마우스 안티-gp39 비오틴을 PBS 중에서 200 ng/㎖ 까지 1% BSA로 희석시켰다.
3. 10㎍/㎖에서 출발하여 희석 완충제 중에서 시험 항체(마우스, 키메라 및 인간화된 24-31)를 연속적으로 희석시켰다 (1:2).
4. 50㎕의 희석된 시험 항체 및 마우스 안티-gp39 비오틴을 각각의 웰에 2중으로 전달하였다. 수개의 웰은 최대 대조군으로서 마우스 안티-gp39 비오틴과 함께 50㎕ 희석 완충제를 함유해야 한다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
5. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
6. 스트렙트아비딘 HRP의 1:2000 희석물 50㎕/웰을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
7. 플레이트를 흐르는 수돗물 중에서 10회 세척하였다.
8. 50㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가하고, 플레이트를 20-30분 동안 전개시켰다. 플레이트를 490 nm의 백그라운드 파장과 함께 405 nm의 파장에서 판독하였다.
9. 억제율(%)을 대조군 웰의 평균을 사용하여 계산하였다.
결과 및 결론 :
모든 3개의 항체가 비오틴 표지화된 24-31과 동등하게 잘 경쟁하였다 (도 10 참조). 경쟁 프로필은 검정의 제한 내에서, 모든 농도에서 본질적으로 포개질 수 있다. 이것은 시험된 인간화된 항체(변형체 1)가 gp39 결합 친화성을 보유함을 나타낸다.
실시예 14
T 세포 의존성 B 세포 분화의 조절
인간화된 24-31이 뮤린 24-31의 시험관내 기능 활성을 보유하는 지를 확인하기 위해, 인간화된 24-31을 "립스키(Lipsky)" 검정으로 뮤린 24-31과 비교하였다. 도너 말초혈 단핵 세포를 2개의 분획, 즉 T 및 B 세포 분획으로 분리하였다. T 세포를 먼저 미토마이신 C로 처리하여 유사분열을 방지한 후, 안티-CD3 항체로 활성화시켰다. B 세포를 뮤린 또는 인간화된(변형체 1) 24-31 항체와 함께 첨가하였다. 항체 비함유 양성 대조군 및 B 세포 비함유 음성 대조군을 실험에 포함시켰다. 10일간의 인큐베이션 후에, 상등액을 사람 IgM의 존재에 대해 시험하였다.
프로토콜 :
1. 96-웰 플레이트를 37℃에서 2시간 동안, 50㎕/웰의 무균 4㎍/㎖ 안티-CD3 항체(50mM Tris(pH 9) 중에서 희석시킴)로 코팅시켰다.
2. T 및 B 세포를 림포-크윅(Lympho-Kwick) 시약을 사용하여 버피 코트(buffy coat)로부터 선택적으로 정제시켰다. T 세포를 37℃에서 30분 동안 5x106세포당 미토마이신 C 50㎍/㎖로 활성화시켰다.
3. 플레이트를 무균 HBSS 또는 배지로 수회 세척하여 비접착 항체를 제거하였다.
4. 1x105의 정제 T 세포(2x106/㎖)를 각각의 웰에 첨가하였다.
5. 1x105의 정제 B 세포(5x106/㎖)를 각각의 웰에 첨가하였다. 50㎕ 안티-gp39 항체(10 내지 0.1㎍/㎖)를 각각의 웰에 4중으로 첨가하였다. 대조 웰은 하기 물질을 함유한다 : a) 0 항체, b) 0 항체, T 세포 비함유, 및 c) 0 항체, B 세포 비함유.
6. 플레이트를 12일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션시켰다.
7. 이중 웰 상에서 3H 티미딘 또는 임의의 다른 허용될 수 있는 방법을 사용하여 7일 후에 세포 성장을 평가하였다.
8. 12일 후에, 이중 웰로부터 상등액을 수집하고 ELISA 검정을 수행하여 Ig 생성(IgM)을 측정하였다.
결과 및 결론 :
결과는 사람 IgM의 생성이 0.01㎍/㎖ 미만의 농도에서 인간화된 24-31에 의해 50% 억제됨을 보여주며, 이는 뮤린 24-31에 의해 얻어진 억제 수준과 유사하다 (도 11 참조). 인간화된 항체는 상기 실험에서 T 세포 의존성 B 세포 분화(IgM 생성)를 억제하는 능력을 보유한다.
실시예 15
인간화된 24-31, 변형체 2의 평가
본 실시예는 변형체 1과 비교하여 인간화된 24-31 변형체 2가 직접 결합 검정에서 유사한 gp39 결합 능력을 갖는 지를 측정하기 위해 수행하였다.
프로토콜 :
상기 실시예 13에서와 동일하다.
결과 및 결론 :
결과는 2개의 24-31 변형체의 결합 능력이 본질적으로 포개질 수 있음을 보여준다 (도 12 참조). 이는 2개의 변형체가 gp39에 대해 필적하는 결합 활성을 가짐을 제시한다.
실시예 16
본 실시예는 24-31 및 2개의 인간화된 변형체 1 및 2의 Kd를 측정하기 위해 수행하였다.
프로토콜 :
소정량의 각각의 3개의 항체(뮤린, 변형체 1 또는 변형체 2 24-31)를 아이오도-베아드스(등록상표명: IODO-BEADS)(피어스(Pierce))를 사용하여125I로 표지화하였다. 항체 결합된125I를 세파덱스 G25/DEAE/암버라이트 칼럼 상에서 크기 분리에 의해 유리125I로부터 분리하였다.
뮤린 gp39-CHO 세포에 대한125I 표지화된 항체의 직접 결합을 일련의 희석물로 시험하여, 카운트/㎍ 및 적합한 작업 농도(최대 결합 농도의 약 50%) 둘 모두를측정하였다.
125I 표지화된 항체를 일련의 희석물의 비표지화된 항체와 혼합시키고 인큐베이션시켰다. 결합된 항체의 총량 및 유리 항체의 양을 기준으로 하여, 결합 대 비결합 그래프로부터 스캐차아드 플롯을 생성시켰다. 전체 항체 농도는 하나의 활성 부위에 대해 75kD의 표준 크기를 기준으로 하였다.
Kd를 "베스트 핏(best fit)" 라인을 생성시킴으로써 계산하였다. 곡선의 기울기의 역수가 Kd이다. 상관 계수 γ2을 또한 계산하였다.
결과 :
스캐차아드 플롯을 분석하였다. 상기 분석으로부터의 Kd는 다음과 같다 : 변형체 2, Kd=14nM ; 뮤린 24-31, Kd=8.51nM; 변형체 1, Kd=5.6nM. 결과를 각각 도 13(뮤린), 14(변형체 1) 및 15(변형체 2)에 도시하였다. 이들 결과는 본 발명의 인간화된 항체가 24-31과 유사하게 gp39 항원과 결합한다는 추가의 증거를 제공한다.
실시예 17
H24-31.1의 FcRI 결합
FcRI 결합을 사람 FcRI를 코딩하는 유전자로 트랜스펙션된 CHO 세포주에서 수행하였다 (도 16). H24-31.1에 의한 Fc 수용체로의 결합을 사람 gp39의 세포외 부분에 결합된 CD8의 세포외 부분으로 구성된 융합 단백질의 형태로 가용성 gp39의 존재 또는 부재하에 검정하였다. 도 16은 항원에 복합체화되는 경우에 H24-31.1 만이 FCRI에 결합함을 도시한 것이다.
실시예 18
H24-31.1의 FcRII 결합
FcRII 결합을 사람 FcRII를 코딩하는 유전자로 트랜스펙션된 마우스 섬유아세포주를 사용하여 수행하였다(도 17). H24-31.1의 Fc 수용체로의 결합을 gp39의 세포외 부분에 결합된 CD8의 세포외 부분으로 구성된 융합 단백질의 형태로 가용성 gp39의 존재 또는 부재하에 검정하였다. 도 17은 항원에 복합체화되는 경우에 H24-31.1 만이 FC 수용체 11과 결합함을 도시한 것이다.
실시예 19
보체 의존성 세포성 세포독성에 있어서 H24-31.1의 효과
H24-31.1를 5% 토끼 보체의 존재하에서 다양한 농도로 gp39 + CHO 세포에 첨가하였다 (도 18). CHO 세포의 성장을 알라마르 블루(alamar blue)로 모니터하였다. 도 18은 H24-31.1이 약 0.5㎍/㎖에서 세포 성장을 50% 억제시킴을 나타내고 있다.
실시예 20
gp39+CHO 결합된 H24-31.1의 C1q 결합의 측정
다양한 농도의 H24-31.1로 표지화된 gp39+CHO 세포를 과량의 사람 C1q(보체 인자 1)중에서 인큐베이션시키고, 이어서 FITC 표지화된 염소 안티-사람 C1q와 인큐베이션시켰다. 이 샘플들을 흐름 세포측정법으로 분석하여 C1q에 의한 세포의 상대적 표지화를 측정하였다(도 19). 도 19는 C1q에 의한 세포의 표지화가 항체 농도에 의존적이며, H24-31.1 Fab 단편(C1q 결합 없음)이 C1q와 결합하지 않음을 도시한 것이다.
실시예 21
T 세포 의존성 리콜 항원에 대한 T 세포 반응에 대한 H24-31.1의 효과
사람 말초혈 림프구를 10% 사람 AB 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산을 포함하는 이스코베스 변형된 둘베코 배지(Iscoves Modified Dulbecco's media)에서 배양하였다(도 20). 하나를 제외하고 모든 배양액에 10㎍/㎖의 파상풍 톡소이드를 제공하였다. 파상풍 톡소이드로 프라임된 배양액도 0 내지 10㎍/㎖의 H24-31.1를 제공받았다. 3일 후, IL-2 함량을 측정하기 위해 상등액을 취하였다. 추가 2일후, 모든 배양액에 1μCi3H-티미딘/㎖을 16 시간 동안 제공하였다. 세포를 수집하고, 성장의 척도로서 티미딘의 염색체로의 혼입에 대해 시험하였다. 파상풍 톡소이드가 없는 배양액은 약 2ng/㎖인 검출 한계 미만으로 EL-2 수준을 가졌다. 이러한 동일한 배양액은 약 300cpm인 혼입된3H-티미딘의 백그라운드 수준을 가졌으며, H24-31.1로 처리함에 의해 분명히 영향을 받지 않았다(미도시됨). 도 20은 TT 유도된 성장 및 IL-2 생성이 1㎍/㎖ 이상의 H24-31.1에 의해 최대로 (약 40%) 억제되었음을 도시해준다.
실시예 22
T 세포 의존성 B 세포 분화에 대한 H24.31.1의 효과
96웰 플레이트를 밤새 2㎍/㎖로 안티-CD3 항체로 코팅하고 사용 전에 PBS로 강력하게 세척하였다. 버피 코트로부터의 말초혈 림프구를 T 세포 분획 및 B 세포분획으로 분리하였다. T 세포를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅시키기 전에 1 시간 동안 미토마이신 C와 인큐베이션시켰다. 이후, B 세포를 10% 우태아 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산이 추가된 이스코베스 변형된 둘베코 배지중에 첨가하였다. 이 세포를 H24-31.1의 존재하에서 0 내지 10 ㎍/㎖의 다양한 농도로 인큐베이션하였다. 12일 후, 상등액을 취하여 사람 IgG의 존재에 대해 시험하였다(도 21). 도면은 인간화된 H24-31.1이 1ng/㎖에서 T 세포 의존성 IgG 생성을 약 85% 억제함을 나타내고 있다.
실시예 23
T 세포 의존성 B 세포 분화에 대한 H24.31.1 Fab의 효과
96웰 플레이트를 밤새 2㎍/㎖로 안티-CD3 항체로 코팅하고 사용 전에 PBS로 강력하게 세척하였다. 버피 코트로부터의 말초혈 림프구를 T 세포 분획 및 B 세포 분획으로 분리하였다. T 세포를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅시키기 전에 1 시간 동안 미토마이신 C와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, B 세포를 10% 우태아 혈청, L-글루타민, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산이 추가된 이스코베스 변형된 둘베코 배지중에 혼합하였다. 이 세포를 H24-31.1 및 H24-31.1 Fab의 존재하에서 0 내지 10 ㎍/㎖의 다양한 농도로 인큐베이션하였다. 12일 후, 상등액을 취하여 사람 IgG의 존재에 대해 시험하였다(도 22). 도면은 전체 H24-31.1 항체 및 Fab 단편 간에 IgG 생성의 억제에 있어서 차이가 없음을 나타내고 있다.
실시예 24
T 세포 의존성 리콜 항원에 대한 항원 특이적 B 세포 반응 발생에 대한 H24-31.1의효과
시험관내에서 3일 동안 파상풍 톡소이드로 프라임된 사람 비장 세포를 약 1 X 107세포/SCID의 농도로 SCID 마우스에 이동시켰다. 6일 후, 생성된 hu-SPL-SCID 마우스에 PBS(그룹 1) 또는 300㎍ H24-31.1(그룹 1 및 2)를 주입하였다. 다음날, hu-SPL-SCID 마우스 모두에 파상풍 독소이드를 부스팅시켰다. 군 3의 마우스는 추가로 각각 3일 간격으로 300㎍의 H24-31.1를 2회 주입하였다. 여러 시점에서 마우스의 혈액을 취하고, 사람 IgG 안티-파상풍 톡소이드 역가의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다(도 23). 도 23은 H24-31.1의 주입이 파상풍 톡소이드 특이적 반응의 발생을 약 90% 억제함을 나타내고 있다.
실시예 25
사람 B 세포 증식에 대한 H24-31.1 항체의 효과
본 실험의 목적은 H24-31.1 항체에 의한 B 세포 증식의 가용성 gp39-CD8 유도의 억제를 증명하는 것이다.
버피 코트로부터의 림프구 제제를 제조업자(Cat# LK-25-B, LK-50-B, One Lambda, Inc., CA 91303)에 의해 추천된 프로토콜에 따른 림포-퀵(Lympho-Kwik) 시약에 의해 B 세포(>90%)에 대해 부화시켰다. 96 웰 각각 당 1 X 105세포로 1000U/㎖의 IL4(Genzyme, Corp)와 함께 배양된 부화된 사람 B 세포를 4일 동안 다양한 농도의 H24-31.1 항체와 10㎍/㎖의 gp39-CD8과 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 도중 마지막 16시간 동안 배양액을 1μCi/웰의3H 티미딘으로 펄싱(pulsing)하고, 증식세포에 의한 방사활성의 혼입을 측정하였다. 도 24는 투여량 의존 방식으로 gp39-CD8에 의한 B 세포 증식을 보여준다. 도 25는 H24-31.1이 gp39-CD8 의존성 B 세포 증식을 억제함을 증명하고 있다.
용도
본 발명의 인간화된 안티-gp39 항체는 gp39 조절 및/또는 gp39-CD40 상호작용의 억제가 치료적으로 유익한 질병 상태를 치료하는 데 효과가 있다. 더욱이, 본 발명의 인간화된 안티-gp39 항체는 항원에 대한 항체 반응의 억제가 바람직한 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질병으로는 자가면역 질환 및 비자가면역 질환 둘 모두가 포함된다.
B 세포에서 CD 40 시그널링을 억제할 수 있는 안티-gp39 항체의 능력은 기능적으로 생체내에서 T 세포 의존성 항체 반응의 현저한 억제율로 해석된다. 따라서, 자가항체 생성에 의해 매개되는 자가면역 질환은 안티-gp39 항체 치료법이 유용한 것으로 기대할 수 있다. 이러한 질환에는 전신성 홍반성 루프스, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 중증군 무력증 및 항인슐린 및 항인슐린 수용체 항체를 갖는 당뇨병 환자의 서브파퓰레이션(subpopulation)이 포함된다. 또한, B 세포 및 수상 세포에서의 CD40 시그널링은 B7.1 및 B7.2 분자와 같은 코-시그널링(co-signaling) 수용체의 상향조절에 필수적이다. 안티-gp39 항체에 의한 이러한 CD40 시그널링의 차단은 T 세포에 대한 항원 제공을 간섭하고, 이 결과 T 세포 활성화 및 T 세포 매개성 반응의 억제를 초래한다. CIA, EAE, NOD 마우스, GVHD 및 이식편 거부와 같은 질병 모델에서 안티-gp39 항체의 치료적 효능은 T 세포 매개된 반응에 대한 상기 항체의억제 효과를 확인시켜 준다. 동물 모델에서의 효능에 의해 지지된 이러한 작용의 메카니즘을 바탕으로 하여 본 발명의 인간화된 안티-gp39 항체의 치료적 효과는 RA, MS, 당뇨병, 건선, GVHD 및 이식 거부와 같은 질환으로 확장된다.
본 발명의 인간화된 항체의 투여에 의해 잠재적으로 치료가능한 특이적 질환으로는 하기와 같은 질환이 포함된다:
알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 흑색극 세포증, 알레르기성 접촉 피부염, 애디슨병, 아토피성 피부염, 원형탈모증, 범발성 탈모증, 아밀로이드증, 아나필락시양 자반병, 아나필락시양 반응, 무형성 빈형, 유전성 맥관부종, 특발성 맥관부종, 강직성 척추염, 두개 동맥염, 거세포 동맥염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염, 천식, 혈관확장성 운동실조증, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 폴리엔도크린 부전증, 베체트 병, 베르거(Berger)병, 부에르거(Buerger)병, 수포성 유천포창, 만성 점막피부성 칸디다증, 카플랜(Caplan) 증후군, 심근경색후 증후군, 심낭막절개후 증후군, 심장염, 복강 스프루우, 샤가스병, 세디아크-히가시 증후군, 커그-스트라우스(Churg-Strauss) 병, 코간스 증후군, 한랭응집질환, CREST 증후군, 크론병, 한랭글로불린혈증, 잠복성 섬유성 폐포염, 포진성 피부염, 피부근염, 진성 당뇨병, 다이아몬드-블랙팬(Diamond-Bladkfan) 증후군, 디조지(DiGeorge) 증후군, 원판상 홍반 루푸스, 호산구성 근막염, 상공막염, 드라이테마 엘리바툼 디우티넘(Drythema elevatum diutinum), 마그나튬(marginatum) 홍반, 다형 홍반, 결절 홍반, 가족성 지중해열, 펠티증후군, 폐 섬유증, 아나필락시양 사구체신염, 자가면역 사구체신염, 포스트-연쇄구균성 사구체신염, 포스트-이식 사구체신염, 막성 사구체신병증, 구드패스츄어 증후군, 이식편 대 숙주질환, 면역 매개 과립구감소증, 원형 육아종, 알레르기성 과립구증가증, 육아종증성 근염, 그레이브 병, 하시모토 갑상선염, 신생아의 용혈성 질환, 특발성 혈색소증, 헤노호-라쉔인 자반병, 만성 활성 및 만성 진행 간염, 조직구증 X, 과호산구증가 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 잡(Job) 증후군, 연소성 피부근염, 연소성 류머티스 관절염(연소성 만성 관절염), 카와사키 병, 각막염, 건성각결막염, 란드리-구일리안-바르-스트로홀(Landry-Guillain-Barre-Strohl) 증후군, 나종성 나병, 뢰플러 증후군, 릴리(Lyell) 증후군, 리메(Lyme) 병, 육아종성 림프종증, 전신성 비반 세포증, 혼합된 결합조직 병, 다발성 단신겸염, 머클-웰(Muckle-Well) 증후군, 피부점막림프절 증후군, 다중심세망조직구증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 균상종 진균병, 전신성 괴사성 맥관염, 신중 증후군, 중첩 증후군, 지방층염, 발작성 한성 혈색소뇨증, 발작성 야행성 혈색소뇨증, 천포창성 질병, 천포창, 청포창 홍반증, 낙엽상 천포창, 심상성 천포창, 비둘기 사육사병, 폐렴, 과민성, 결절성 다발 동맥염, 류머티스 다발성 근육통, 다발성 근염, 특발성 다발성 신경염, 포푸투칼계 다발성 신경병증, 전자 간증/자간, 원발 담즙성 간경변증, 진행성 전신 경화증(피부 경화증), 건선, 류머티스 건선, 폐포단백증, 폐포 섬유증, 레이노 현상/증후군, 레이델(Redel) 갑상선염, 라이터 증후군, 재발성 다발성 연골염, 류머티스 열, 류머티스관절염, 사르코이드증, 공막염, 경화성 담관염, 혈청병, 세자리 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 스틸(Still) 병, 아급성 경화성 범뇌염, 교간성 안염, 전신성 홍반성 루푸스, 이식 거부증, 궤양성 대장염, 비분화 연결조직 질환, 만성 두드러기, 한랭 두드러기, 포도막염, 백반, 웨버-크리스친 병, 베게너육아종증, 비스콧-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군.
이들 중, 안티-gp30 항체의 투여에 의해 치료될 수 있거나 표출될 수 있는 바람직한 적응증은 자가면역성 용혈성 빈혈, 무형성 빈혈, 측두 관절염, 진성 당뇨병, 펠티 증후군, 구드패스츄어 증후군, 이식편 대 숙주질환, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 중증근무력증, 다발성 경화증, 결절성 다발동맥염, 건선, 류머티스 건선, 류머티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 천식, 알레르기성 질환 및 이식 거부증을 포함한다.
치료학적 효과를 생성시키기에 유용한 항체의 양은 당업자에 잘 공지된 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 항체는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 완충제내에서 표준 기술에 의해 제공될 것이고, 어떠한 원하는 루트에 의해서나 투여될 수 있다. 현재 청구된 항체의 효능 및 사람에 의한 이들의 관용으로 인하여 사람의 다양한 질환 또는 질환 상태를 물리치기 위해 이들 항체를 반복 투여하는 것이 가능하다.
본 발명의 안티-gp39 인간화된 항체 (또는 이들의 단편)은 또한 면역조절, 예를 들어, 사람 또는 동물 면역계의 억압을 유도하는데 유용하다. 그러므로 본 발명은 비독성의 유효량의 본 발명의 항체를 사람 또는 다른 동물에게 투여함으로써 이를 필요로 하는 사람 또는 다른 동물에게서 예방학적 또는 치료학적으로 면역 조절을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체가 면역억제를 유도하는 데에 이용된다는 사실은 이들이 이식된 기관 또는 조직(예를 들어, 신장, 심장, 폐, 뼈골, 피부, 각막 등)에 대한 내성 또는 거부의 치료 또는 예방, 자가면역성, 염증성, 증식성 및 과증식성 질환의 치료 또는 예방, 및 면역학적으로 매개된 피부 발현 질환 (예를 들어, 류머티스양관절염, 홍반성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, EAE, 중증근무력증, 제 I 형 당뇨병, 포도막염, 신증후군, 건선, 아토피성 피부염, 접촉 피부염, 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 펨플루구스, 수포성 유천포창, 수포성 표피 박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부 호산구증다증, 원형 탈모증 등)의 치료 및 예방; 가역성 폐쇄성 기도 질환, 장 염증 및 알레르기(예를 들어, 복강 질환, 직장염, 호산구성 위소장염, 비반세포증, 크론 질환 및 궤양성 대장염)의 치료 및 식품 관련 알레르기(예를 들어 편두통, 비염 및 습진)의 치료에 유용하다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체는 면역조절이 바람직한 비자가 면역 질환, 예를 들어, 이식편 대 숙주질환(GVHD), 이식 거부, 천식, 빈혈성 백혈병, HIV, 림프종 등의 치료에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 벡터 또는 재조합 바이러스(예를 들어, 치료용 DNA를 함유하는)를 투여하기 전, 동시 또는 후에 투여되어 상기 벡터에 대한 숙주 면역(체액성) 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
당업자들은 일반적인 실험에 의해 면역 억제를 유도하기 위해 효과적이고 비독성량의 항체를 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 효과적인 투여량은 1일당 체중 1kg당 약 0.05 내지 100㎎일 것이다.
본 발명의 항체는 치료 또는 예방 정도로 이러한 효과를 얻기에 충분한 양으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 사람 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 이러한 본 발명의 항체는 이를 공지된 기법에 따라 종래의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합하여 제조한 통상적인의 제형으로 사람 또는 기타 동물에 투여될 수 있다. 당업자들은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특성이 혼합하려는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 널리 공지된 변수에 의해 규정될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 항체(또는 이의 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구일 수 있으며, 흡입에 의해 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 비경구는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 또는 복강내 투여가 포함된다. 비경구 투여의 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 화합물을 사용하여 예방적으로 또는 치료적으로 면역 억제를 유도하기 위한 매일 비경구 및 경구 투여량은 일반적으로 1일당 체중 ㎏당 약 0.05 내지 100㎎이나, 바람직하게는 약 0.5 내지 10㎎이다.
본 발명의 항체는 또한 흡입에 의해 투여될 수 있다. "흡입"이란 비강내 및 경구 흡입 투여를 의미한다. 에어로졸 제형 또는 계량된 투여량 흡입기와 같은 이러한 투여에 적합한 투여 형태가 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다. 사용하려는 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 일반적으로 약 10 내지 100㎎이다.
본 발명의 항체는 또한 국부적으로 투여될 수 있다. 국부적 투여란 비전신 투여를 의미하며, 외피, 구강 외측으로 본발명의 항체(또는 이의 단편) 화합물을도포하고 귀, 눈 및 코와 혈류가 상당히 유입되지 않는 곳에 이러한 항체를 적하하는 것을 포함한다. 전신 투여는 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 치료 또는 예방 효과에 요구되는 항체의 양은 물론 선택된 항체, 치료하려는 상태의 심각도 및 치료하려는 동물에 따라 다르며, 최종으로는 의사에 판단에 따른다. 본 발명의 항체의 적합한 국부 투여량은 일반적으로 일당 체중 ㎏당 약 1 내지 100㎎이다.
제형
항체 또는 이의 단편을 단독으로 투여할 수 있지만, 약제학적 제형으로서 제공하는 것이 바람직하다. 활성 성분은, 국부 투여에 대해서는 제형의 0.001% 내지 10 중량%, 예를 들어 제형의 1% 내지 2 중량%를 포함할 수 있으나, 10 중량%까지 포함할 수 있다. 그러나, 제형의 5 중량%를 초과하지 않는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는, 제형 0.1% 내지 1 중량%를 포함하는 것이다.
본 발명의 국부 제형은 활성 성분과 함께 이에 대한 하나 이상의 허용가능한 담체 및 임의로 다른 치료 성분을 포함한다. 담체는 제형의 나머지 성분과 상용할 수 있다는 의미에서 "허용가능"해야 하며, 수용자에게 유해하지 않아야 한다.
국부 투여에 적합한 제형에는 피부를 통해 치료가 요구되는 부위에 침투하기 적합한 액체 또는 반액체 제제, 예를 들어, 바르는 약, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기 적합한 점액이 포함된다.
본 발명에 따른 점액은 살균한 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있으며, 활성 성분을 살균 및/또는 살진균제 및/또는 기타 적합한 방부제, 및바람직하게는 계면 활성제를 포함하는 적합한 수용액에 용해시키므로써 제조될 수 있다. 생성된 용액은 이후 여과에 의해 분류되어 적합한 용기에 옮겨진 후 밀봉되고 오토클레이빙 또는 30분 동안 90 내지 100℃에서 유지시키므로써 살균된다. 다르게는, 상기 용액은 여과에 의해 살균되고, 방부 처리하므로써 용기에 옮겨질 수 있다. 점액에 내포되기에 적합한 살균 및 살진균제의 예로는 페닐수은 니트레이트 또는 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)가 있다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매로는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것들이 포함된다. 안구용 로션은 임의로 살균제를 포함하는 살균 수성 로션을 포함하며 점액의 제조 방법과 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 피부에 바르기 위한 로션 또는 바르는 약은 알코올 또는 아세톤과 같은 피부의 건조를 촉진하고 서늘하게 하는 시제 및/또는 글리세롤과 같은 모이스처라이저(moisturizer) 또는 피마자유 또는 아라키스 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외용약에 대한 활성 성분의 반고체 제형이다. 이들은 활성 성분을 미세하게 분할되거나 분말화된 형태로, 단독으로, 또는 수성 또는 비수성 유체중의 용액 또는 현탁액으로 적합한 기계의 보조로, 유지성 또는 비유지성 기재와 함께 혼합하므로써 제조될 수 있다. 이러한 기재에는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속성 비누와 같은 탄화수소, 점액, 아몬드, 옥수수, 아라키스, 피마자 또는 올리브 오일과 같은 천연 오일, 양모지 또는 이들의 유도체, 또는 프로필렌 글리콜 또는 매크로골과 같은 알코올과 함께 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 비이온성 계면활성제, 양이온 또는 음이온성 계면활성제와 같은 적합한 계면활성제를 혼입시킬 수 있다. 천연 검, 셀룰로오스 유도체 또는 규소질 실리카와 같은 무기 물질과 같은 현탁제 및 라놀린과 같은 기타 성분이 포함될 수 있다.
당업자들은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 최적 양 및 각각의 투여 간격이 치료하려는 상태의 특성 및 범위, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료하려는 특정 동물에 의해 결정될 것이며, 이러한 최적 조건은 종래의 기술에 의해 결정될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 당업자들은 치료의 최적 과정, 즉 한정된 날수 동안 매일 제공되는 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 투여 횟수가 종래의 치료 결정 시험 과정을 사용하여 당업자들에게 확인될 수 있음을 인지할 것이다.
더 이상 상술할 필요 없이 당업자들은 상기 설명을 사용하여 본 발명의 전체적으로 사용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기는 본 발명의 예시적 실시예인 것으로 해석되며, 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
캡슐 조성물
본 발명의 캡슐 형태의 약제 조성물을 분말 형태의 50㎎의 본 발명의 항체 또는 이들의 단편, 100㎎의 락토스, 32㎎의 탈크 및 8㎎의 마그네슘 스테아레이트를 표준의 2 조각 경질 젤라틴 캡슐에 채워 제조하였다.
주사용 비경구 조성물
주사하여 투여하기에 적합한 형태의 본 발명의 약제 조성물을, 10k(부피)의 프로필렌 글리콜 및 물중에서 1.5k(중량)의 본 발명의 항체 또는 단편을 교반하여 제조하였다.
연고 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
100.0g이 되도록 하는 양의 백색의 연질 파라핀
본 발명의 항체 또는 이의 단편을 소량의 비히클중에서 분산시켜 유연하고 균질한 생성물을 제조하였다. 이후, 찌부러질 수 있는 금속 튜브에 상기 분산액을 충전하였다.
국부 크림 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
팔로 왁스 GP 200 20.0g
라놀린산 무수물 2.0g
백색의 비스왁스 2.5g
메틸 히드록시벤조에이트 0.1g
100.0g이 되도록 하는 양의 증류수
팔로왁스, 비스왁스 및 라놀린을 60℃에서 함께 가열하였다. 메틸 히드록시벤조에이트 용액을 첨가하고, 고속의 교반으로 균질화시켰다. 온도를 SOOC로 떨어뜨렸다. 항체 또는 이의 단편을 첨가하고, 골고루 분산시키고, 조성물을 지속으로 교반시키면서 냉각시켰다.
국부 로션 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g
소르비탄 모노라우레이트 0.6g
폴리소르베이트 20 0.6g
세토스테아릴 알코올 1.2g
글리세린 6.0g
메틸 히드록시벤조에이트 0.2g
100.00㎖가 되도록 하는 양의 정제수 B.P.(B.P. = British Pharmacopeia)
메틸 히드록시벤조에이트 및 글리세린을 75℃에서 70㎖의 물중에서 용해시켰다. 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 75℃에서 함께 용해시키고, 수용액에 첨가하였다. 생성된 에멀션은 균질화시키고 지속적으로 교반하여 냉각시키고, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 나머지 물에 현탁액으로서 첨가하였다. 전체 현탁액을 균질화될 때까지 교반하였다.
안약 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 0.5g
메틸 히드록시벤조에이트 0.01g
프로필 히드록시벤조에이트 0.04g
100.00㎖가 되도록 하는 양의 정제수 B.P.
메틸 및 프로필 히드록시벤조에이트를 75℃에서 정제수 70ml에 용해시키고 생성된 용액을 냉각시켰다. 그 후 본 발명의 항체 또는 이것의 단편을 첨가하고,용액을 막 필터(구멍 크기: 0.022 Am)를 통해 여과 멸균시키고, 적당한 살균 용기내로 무균적으로 팩킹시켰다.
흡입에 의해 투여하기 위한 조성물
용량이 15 내지 20ml인 에어로졸 용기에, 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제 0.2 내지 0.5k와 함께 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 10mg을 혼합시키고, 이 혼합물을 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플로오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄과 배합하여 프레온과 같은 추진제중에 분산시키고, 비강 또는 경구 흡입 투여에 적합한 적당한 에어로졸 용기내로 넣는다. 흡입에 의해 투여하기 위한 조성물. 용량이 15 내지 20ml인 에어로졸 용기에, 에탄올(6-8ml)중에 본 발명의 항체 또는 이것의 단편 10mg을 용해시키고, 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제 0.1 내지 0.2k를 첨가하고, 이 혼합물을 바람직하게는 (1-2 디클로로테트라플로오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄과 배합하여, 프레온과 같은 추진제중에 분산시키고, 비강 또는 경구 흡입 투여에 적합한 적당한 에어로졸 용기내로 넣는다.
본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 특히 유용하다. 비경구 투여용 조성물은 공통적으로 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 용액 또는 허용될 수 있는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 이들의 혼합액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4k 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 살균된 것이고 일반적으로 특정 물질이 제거된 것이다. 이러한 용액은 통상적인, 널리 공지된 살균 기술에 의해 살균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제 등과 같은 생리학적 조건에 접근시키는데 요구되는 약제학적으로 허용될 수 있는 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기 약제학적 제형물에서 본 발명의 항체 또는 이것의 단편의 농도의 범위는 클 수 있으며, 즉 액 0.5k 미만, 일반적으로 약 1 중량% 이상에서 15 또는 20 중량%까지 일 수 있고, 선택된 특정 투여 모드에 따라, 유체 부피, 점성도 등을 기준으로 우선 선택될 것이다.
이와 같이, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 살균 완충수 1ml, 및 본 발명의 항체 또는 이의 단편 50mg를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 살균 링거 용액 250ml, 및 본 발명의 항체 또는 이의 단편 150mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여될 수 있는 조성물을 제조하기 위한 실질적인 방법은 널리 공지되어 있거나 당업자들에게 자명할 것이고, 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로서 인용된 하기 문헌에서 상세하게 설명되고 있다 [참조 문헌:Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania].
본 발명의 항체(또는 이의 단편)는 사용하기 전에 저장 및 적합한 담체중에 재구성을 위해 동결건조될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린에 효과적인 것으로 제시되어 있고, 당해 분야의 공지된 동결 건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
의도되는 결과에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방 및/또는 치료학적 처리를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 조성물을 이미 질환으로 고생하고 있는 환자에게, 충분한 양으로 투여하여, 질환 및 이것의 합병증을 고치거나 적어도 부분적으로 정지시킨다. 예방 적용에서, 본 발명의 항체 또는 이의 혼합액을 함유하는 조성물을 질환에 걸리지 않은 환자에게 투여하여 환자의 저항성을 향상시킨다.
약제학적 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택된 투여 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 어느 경우에나, 본 발명의 약제학적 조성물은 환자를 효과적으로 치료하는데 충분한 본 발명의 변형된 항체(또는 이의 단편)의 양을 제공하여야 한다.
또한, 본 발명의 항체가 항체와 같은 치료법에 유용한 펩티드 또는 비펩티드 화합물(모방체)의 설계 및 합성에 유용할 수 있는 것이 주목되어야 한다[참고 문헌; Saragovi, et al., science, 253:792-795 (1991)]..
앞서 말한 것으로부터, 본 발명의 특정 구체예가 예시의 목적으로 본원에서 설명될 지라도, 다양한 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구 범위에 의해 제한되지 않는다.

Claims (7)

  1. CD40 리간드와 특이적으로 결합하는 인간화된 항체로서, 도 4 또는 도 5에 도시된 핵산 서열에 의해 코드화되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 서열을 함유하고 도 6에 도시된 핵산 서열에 의해 코드화되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 서열을 함유하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 함유하고 사람 감마 1 또는 감마 4 중쇄 불변 영역을 함유함을 특징으로 하는 인간화된 항체.
  3. gp39 발현을 조절하거나 gp39/CD40 상호작용을 억제시킴으로써 치료되는 질병을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 제1항의 인간화된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 질병이 류머티스 관절염, 건선, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스 및 ITP로 구성된 군으로부터 선택된 자가 면역 질환임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 질병이 이식편 대 숙주 질환 또는 이식편 거부반응을 포함하는 비자가 면역 질환임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 질병이 류머티스 관절염, 홍반성 루푸스, 전신성 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, EAE, 중증근무력증, 제 I 형 당뇨병, 포도막염, 신증후군, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평 태선, 펨플루구스, 수포성 유천포창, 수포성 표피 박리증, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부 호산구증다증, 원형 탈모증, 가역성 폐쇄성 기도 질환, 복강 질환, 직장염, 호산구성 위소장염, 비반세포증, 크론 질환 및 궤양성 대장염을 포함하는 장 염증 및 알레르기, 및 식품 관련 알레르기로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 질병이 천식, 백혈병, HIV 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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